CAMPO TÉCNICO La presente invención pertenece al área farmacéutica, particularmente al campo de las composiciones medicinales de uso veterinario. La invención se refiere a una composición microbiana que comprende microorganismos probióticos para reducir la diarrea e incrementar la vitalidad de bovinos neonatos. DESCRIPCIÓN DEL ESTADO DE LA TECNICA

La FAO (Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación), define los probióticos como microorganismos vivos que al administrarse en dosis adecuadas, producen efectos benéficos en la salud del ente receptor [1]. Un producto probiótico se compone de microorganismos que sobreviven y se pueden implantar en diferentes órganos del tracto digestivo como el estómago, el intestino delgado o el colon, con el objetivo de mejorar el funcionamiento de la flora intestinal del hospedero, ayudando a degradar completamente los alimentos para su posterior absorción [2].

Adicionalmente, la presencia de probióticos en la flora intestinal puede inducir a que algunas proteínas sufran cambios conformacionales y con ello, activar mecanismos bioquímicos intracelulares que favorecen la producción de mediadores de inflamación, promoviendo la diferenciación celular o apoptosis celular y activar la respuesta inmune frente a cualquier posible infección [3].

Los mamíferos rumiantes tienen una morfología y una fisiología digestiva muy particular. La capacidad de los rumiantes para aprovechar los carbohidratos fibrosos de la dieta se debe al rumen, al retículo y al omaso, que son los órganos que anteceden el abomaso [4]. El rumen es una cámara de fermentación con ambiente anaeróbico y pH variable que permite una retención alta de partículas largas de forraje y estimula la rumia y el metabolismo corporal, manteniendo un ambiente apropiado para el crecimiento y reproducción de microorganismos.

Los microorganismos ruminales se ven favorecidos por la ausencia de oxígeno, producto de la hidrólisis de urea, proceso que requiere consumo de oxígeno por parte de las bacterias adheridas en la pared. Estos microorganismos tienen la capacidad de digerir polisacáridos complejos (v.g. celulosa, hemicelulosa, pectina) para producir carbohidratos y también aprovechan el nitrógeno no proteico para la síntesis de aminoácidos y proteínas [5].

La alimentación del ganado a base de pastos, provoca que las bacterias presentes en el rumen sean del tipo fibrolítico tales como Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminococcus flavefaciens y Fibrobacter succinogenes [5]. En contraste, si el ganado es alimentado con un alto porcentaje de concentrados, se favorece el crecimiento de bacterias acidolácticas tales como Lactobacillus sp y Streptococus bovis [6].

Al momento de nacer, el tracto gastrointestinal de los terneros es estéril y los microorganismos de la flora intestinal solo son introducidos a partir del contacto con sus madres. Sin embargo, en los nuevos sistemas de producción bovina, los terneros son separados de sus madres al nacer y alimentados con sustitutos de la leche, sin permitirles ni siquiera alimentarse del calostro, lo que altera notablemente el desarrollo de su flora intestinal. En consecuencia, en estos sistemas de producción, la principal causa de enfermedad en terneros hasta los tres meses de vida es la diarrea.

Para el tratamiento de la diarrea en bovinos, se pueden utilizar bien sea agentes antibióticos, los cuales pueden generar un fenómeno indeseable de resistencia antimicrobiana, o se pueden emplear productos probióticos a base microorganismos. Algunos productos comerciales de probióticos para ganado como Prokura®, Provita®, BioBoost® y Probios Calf®, contienen microorganismos aerobios no ruminales, tales como Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium bifidum, y Bacillus subtilis [7]. El documento US 3956482 describe una composición de microorganismos ruminales que comprende Megasphaera elsdenii, Streptococcus boviss, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium adolescentes, Bacteroides ruminicola y Butyrivibrio fibrisolvens, los cuales son adaptados en un medio nutritivo y administrados al animal durante las primeras 24 horas y/o en el período comprendido entre 80 y 140 días de nacido.

El documento WO 2012147044 divulga un método para reducir la producción de metano en rumiantes que comprende administrarle una mezcla de cepas de bacterias del género Propionibacterium y Lactobacillus, preferiblemente Propionibacterium jensenii P63, Lactobacillus plantarum Lpll5 y Lactobacillus rhamnosus Lr32. De igual forma, el documento señala que la administración de estos microorganismos también puede estimular el crecimiento del animal. La publicación "Bacterial direct-fed microbials in ruminant diets: performance response and mode of action " describe los efectos benéficos de la administración de composiciones de microorganismos tales como Lactobacillus, Enterococcus, Streptococcus y Bifidobacterium en la alimentación de animales bovinos [8]. Entre los efectos favorables, se mencionan la generación de una microflora intestinal adecuada, la prevención del establecimiento de organismos enteropatógenos y la ganancia diaria de peso.

Con el fin de mejorar la competitividad de los sistemas de lechería y de producción de carne bovina, es necesario desarrollar alternativas funcionales para el tratamiento de las diarreas y el reemplazo de los antibióticos. Indiscutiblemente, una buena alternativa es el desarrollo de productos probióticos que puedan ser administrados a los bovinos para prevenir enfermedades e incrementar la vitalidad.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se refiere a una composición microbiana que comprende al menos un microorganismo probiótico seleccionado del grupo que consiste de Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus flavefaciens, Streptococcus bovis y Butytrivibrio fibrisolvens, junto con coadyuvantes y un vehículo aceptable. La composición de la invención exhibe una eficacia adecuada en la reducción de incidencia de diarreas y promueve la ganancia de peso en los bovinos neonatos.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

FIG 1. Correspinde a resultados de la viabilidad Log (UFC/ml) de la composición microbiana del Ejemplo 2 almacenada a 4°C +/- 2°C durante 6 meses. Tratamientos con la misma letra no presentan diferencias significativas según prueba de Tukey (95%).

FIG 2. Corresponde a resultados de la viabilidad Log (UFC/ml) de la composición microbiana del Ejemplo 2 almacenada a 18°C +/- 2°C durante 6 meses. Tratamientos con la misma letra no presentan diferencias significativas según prueba de Tukey (95%).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Las composiciones microbianas de la invención comprenden al menos un microorganismo probiótico como ingrediente activo, coadyuvantes y un vehículo aceptable. Los microorganismos probióticos de acuerdo a la presente invención, pueden ser, entre otros, bacterias anaerobias facultativas o bacterias anaerobias estrictas. La definición, características y propiedades de cada una de ellas se pueden encontrar detalladamente en el texto Manual of Determinative Bacteriology [9] el cual se incorpora en su totalidad como referencia. En una modalidad preferida de la invención, las composiciones comprenden, como ingrediente activo, microorganismos anaerobios seleccionados del grupo que consiste de Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus flavefaciens, Streptococcus bovis y Butytrivibrio fibrisolven, los cuáles pueden ser cuantificados, sirviendo como unidades de medida, la concentración y viabilidad de los mismos. Preferiblemente, la concentración de cada uno de dichos microorganismos del ingrediente activo de la presente invención está entre 1x10 3 y 1x1011 UFC/ml, más preferiblemente entre lxl0 ⁶ y lxlO ¹⁰ UFC/ml, y aún más preferiblemente, lxlO ⁹ UFC/ml. El ingrediente activo puede estar contenido en agua, en un disolvente, en una mezcla de disolventes, en un medio de cultivo líquido, en un liofilizado, en una suspensión acuosa o en una pasta concentrada, bien sea en cantidades iguales o diferentes de cada uno de los microorganismos probióticos. Las composiciones de la invención incluyen, además del ingrediente activo, diferentes coadyuvantes con funciones específicas para darle forma y características propias a la presentación final (v.g. formar emulsiones, regular el pH, mejorar la estabilidad y aumentar la vida útil durante el almacenamiento). La concentración del ingrediente activo en las composiciones de la invención está preferiblemente entre 0,1% y 99,9 % (p/p), más preferiblemente entre 20,0% y 60,0 % (p/p) y aún más preferiblemente, al 40,0% (p/p).

Como coadyuvantes se incluyen todos aquellos conocidos en el campo técnico, entre los que se pueden mencionar, agua, solventes orgánicos, aceites minerales, aceites vegetales tales como aceite de soya, aceite de maíz, aceite de cañóla, aceite de oliva, aceite de coco, aceite de germen de trigo y sus mezclas, polisorbatos, polioles, polímeros, lípidos, lípidos saponificables, sustancias de soporte (v.g. caolines, talco, bentonitas, silicatos), diluyentes, agentes emulsionantes, agentes viscosantes, surfactantes, reguladores de pH, estabilizantes y colorantes. La concentración de los coadyuvantes en las composiciones de la invención, bien sea de manera individual o en su conjunto, está preferiblemente entre 0,01% y 99,99% (p/p) y más preferiblemente, entre 0,1% y 60,0 % (p/p). Los agentes emulsionantes incluyen, pero no se limitan a polisorbatos, ésteres de sorbitán, nonifenol, laurilsulfato de sodio y sus mezclas. Los agentes viscosantes incluyen, pero no se limitan a polímeros, gomas, hidrocoloides, sólidos finamente divididos, ceras y sus mezclas. Los agentes reguladores de pH incluyen pero no se limitan a carbonatas, fosfatos, citratos y boratos.

El término "vehículo aceptable" para efectos de la presente invención, se puede definir como una mezcla de sustancias (v.g. disolventes, soluciones, emulsiones y suspensiones) capaces de contener el ingrediente activo y/o los coadyuvantes, sin que se afecte su capacidad para realizar la función deseada.

Las composiciones de la invención pueden ser en forma de polvos, granulado soluble, granulado dispersable, tabletas dispersables, suspensión o emulsión. El término "granulado soluble" se pretende que incluya granulos para aplicación luego de la disolución del ingrediente activo en agua en forma de solución, conteniendo opcionalmente auxiliares de formulación insolubles. El término "granulado dispersable" se refiere a gránulos para aplicación en forma de suspensión, luego de su desintegración y dispersión en agua u otro solvente acuoso.

Para efectos de la presente invención, el término "tableta dispersable" se refiere a una formulación en forma de tabletas para ser usadas individualmente para formar una suspensión del ingrediente activo después de su desintegración en agua. El término "suspensión" se refiere a líquidos que contienen el ingrediente activo y los coadyuvantes suspendidos de manera estable, bien sea para ser aplicado directamente o diluido en agua. El término "emulsión" se pretende que incluya sistemas heterodispersos con diferentes grados de viscosidad, que dan lugar a sistemas líquidos o semisólidos, que pueden ser encapsulados o no, y utilizados para generar formas farmacéuticas sólidas.

Para preparar las composiciones de la invención se puede recurrir a cualquier método convencional descrito en el estado de la técnica de acuerdo a la forma farmacéutica deseada, los cuales se pueden encontrar detalladamente en los textos "Tecnología Farmacéutica industrial" o en "The Science and Practice of Pharmacy", los cuales se incorporan en su totalidad como referencia [10, 11]. En una modalidad preferida, se puede preparar una composición tipo emulsión mezclando una fase acuosa que contiene el ingrediente activo, con una fase oleosa que contiene agentes emulsificantes. Una vez mezcladas las dos fases, se gasifica la emulsión con C(¾ y se adicionan los reguladores de pH y los agentes estabilizantes.

Para determinar la concentración y/o viabilidad de los microorganismos probióticos presentes en las composiciones de la presente invención, se puede emplear cualquier técnica convencional conocida por un técnico en la materia. Una de ellas, es la técnica denominada "Roll tube" descrita en Rodríguez y cois., [12], la cual es específica para microorganismos anaerobios. En una modalidad preferida, la composición microbiana de la invención está en forma de emulsión, tiene como ingrediente activo microorganismos probióticos anaerobios y coadyuvantes tales como emulsificantes, polímeros y reguladores de pH que mejoran la viabilidad, eficacia y vida útil del producto. En una modalidad aún más preferida, la composición microbiana de la invención es una emulsión agua-aceite (W/O), donde los microorganismos anaerobios se encuentran en la fase acuosa de la emulsión (fase interna), recubiertos por la fase oleosa (fase externa) que les brinda protección frente al oxígeno del medio externo. La fase acuosa de la emulsión es un medio de cultivo adecuado que contiene los microorganismos, en tanto que la fase oleosa de la emulsión puede estar conformada, entre otros, por aceites vegetales, polisorbatos y lípidos saponificables que favorezcan la formación de la emulsión W/O.

El término "medio de cultivo adecuado" de acuerdo a la presente invención, se refiere a cualquier medio de cultivo que contenga las fuentes de nutrientes y oligoelementos necesarios para el crecimiento de los microorganismos anaerobios. En una modalidad preferida, el medio de cultivo adecuado comprende, glucosa, extracto de levadura, un indicador de anaerobiosis, bicarbonato de sodio, cisteína- HC1, ácidos grasos volátiles, KHPO4, KH2PO4, sulfato de amonio, NaCl, MgS0 ₄ y CaCi2 en concentraciones entre 0,0001 y 100,0 g/L de cada uno de ellos. Los siguientes ejemplos ilustran la invención, sin estar el concepto inventivo limitado a los mismos.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1: Obtención de cepas de Butyrivibrio fíbrisolvens (B9), Streptococcus bovis (CP, Ruminococcus flavefaciens (Rf) y Fibrobacter succinosenes (Fs) del ingrediente activo de la Composición Microbiana Se aislaron bacterias probióticas del rumen de bovinos de razas criollas Colombianas y foráneas y de un herbívoro salvaje. Butyrivibrio fíbrisolvens (B9) fue aislado de un bovino de la raza Holstein-Friesand, Streptococcus bovis (C2) fue aislado de un bovino de la Región del valle del cauca de la raza hartón del valle, Ruminococcus flavefaciens (Rf) fue aislado de un bovino de la raza Lucerna y Fibrobacter succinogenes (Fs) fue aislado del ciego de un Chigüiro de la región del Casanare (Colombia). Las cepas se reactivaron en un medio de cultivo rico en celobiosa- glucosa y se incubaron a 39 °C durante 3 días.

Las cepas se encuentran almacenadas en el Banco de Germoplasma de Microorganismos con Interés en Nutrición animal de CORPOICA (BGMINA).

EJEMPLO 2. Preparación de una Composición Microbiana tipo emulsión

Se preparó una composición en forma de emulsión W/O con una mezcla de Butyrivibrio fíbrisolvens (B9), Streptococcus bovis (C2), Ruminococcus flavefaciens (Rf) y Fibrobacter succinogenes (Fs), como ingrediente activo. Los microorganismos se obtuvieron de acuerdo al Ejemplo 1. Se dispusieron componentes de la fase oleosa (aceite de girasol, polisorbato 20 y lecitina) a una marmita, se mezcló con ayuda de un homogenizador Dynamic® y se gasificó con CO2 durante 10 minutos. Después de este tiempo, esta fase oleosa se mezcló con la fase acuosa (medio de cultivo de cada bacteria en relación 1 : 1) con ayuda de un homogenizador Dynamic® en el máximo nivel de agitación durante 5 minutos. La emulsión formada también se gasificó con C(¾. La Tabla 1 muestra las concentraciones de cada componente.

Tabla 1.

EJEMPLO 3. Determinación de parámetros de calidad de la Composición Microbiana

A una composición microbiana obtenida de acuerdo al Ejemplo 2, se le determinaron parámetros de calidad tales como concentración (expresada como UFC/mL), pH y contenido de contaminantes.

Para determinar la concentración se tomó 1 mi de cada muestra y se realizaron

-7 -8 -9

diluciones seriadas. A partir de las diluciones 1x10 ^" , 1x10 ^" y 1x10 ^" , se inocularon tubos con agar celobiosa fundido. A cada tubo sembrado se le realizó un "Rolling". Posteriormente, se dejó en incubación por 72 horas a una temperatura de 39°C y se realizó el conteo de unidades formadoras de colonia (UFC). Para evaluar el pH se utilizó un analizador electroquímico Consort C931 ^® , previamente calibrado con soluciones tampón de pH 4 y 7. Para establecer el contenido de contaminantes se tomó 1 mi de cada muestra y se realizaron diluciones seriadas (10 - ^" 1 a 10 - ^~ 2 ) en solución salina al 4%. Posteriormente, 0,1 mi de la dilución 1x10 ² se inocularon en cajas de Petri con medio Agar Nutritivo durante 24 horas a 37°C +/- 2°C para determinar las bacterias aerobias presentes y en medio PDA por 7 días a 25°C +/- 2°C y determinar los mohos filamentosos. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2.

Ejemplo 4. Ensayo de Estabilidad de la Composición Microbiana.

A una composición microbiana obtenida de acuerdo al Ejemplo 2, se le determinó su estabilidad bajo condiciones de almacenamiento. Las muestras fueron almacenadas a una Temperatura de 4°C +/- 2°C (TI) y de 18°C +/- 2°C (T2), durante 6 meses. Para llevar a cabo el ensayo, se envasaron 12 mi de la composición microbiana en una jeringa dosificadora de polipropileno de alta densidad, las cuales correspondieron a la unidad experimental de cada tratamiento. El estudio de estabilidad contó con un diseño experimental completamente al azar con medidas repetidas en el tiempo y todas las mediciones se realizaron por triplicado. Los resultados del estudio de estabilidad fueron sometidos a un análisis de varianza y posteriormente a comparaciones de medias mediante la prueba de Tukey (95%). En el tiempo cero y después de seis meses de almacenamiento, se tomaron tres muestras de cada tratamiento y se evaluó su viabilidad, la contaminación (bacterias aerobias y mohos) y el pH de acuerdo al Ejemplo 3. En la tabla 3 se presentan los valores de pH obtenidos en las tres muestras evaluadas a cada temperatura, los cuales se encuentran cercanos a 7,0. [10].

Tabla 3.

Los resultados de viabilidad obtenidos para cada uno de los tratamientos se ilustran en la FIG 1 y en la FIG 2. En la FIG 1 se observan los resultados de los tratamientos almacenados a 4°C, donde se evidencia que después de 6 meses de almacenamiento se presentó una reducción significativa de la viabilidad con respecto al tiempo cero.

g

Sin embargo, la concentración de los microorganismos no es inferior a 1x10 (Figura 1).

La viabilidad a 18°C también se redujo significativamente después de 6 meses de

g

almacenamiento, pero tampoco fue inferior a 1x10 (Figura 2). A las dos temperaturas de almacenamiento evaluadas, la reducción en la viabilidad de los microorganismos fue de 1 Logaritmo después de los 6 meses de almacenamiento. Inicialmente, en el tiempo cero, el contenido de bacterias aerobias y de hongos fue inferior a 10 UFC/mL para todos los tratamientos. Después de 2 meses de almacenamiento, a las dos temperaturas evaluadas, los tratamientos almacenados a 4°C +/-2°C presentaron un contenido de bacterias aerobias contaminantes y hongos inferior a lxlO ⁴ UFC/mL. De igual manera a temperatura de 18°C +/- 2°C se encontró que el contenido de contaminantes fúngicos y bacterias se mantienen en un rango de lxl0 ⁴ UFC/mL. En ninguno se encontró presencia de bacterias patógenas.

Ejemplo 4. Ensayo de actividad biológica de la Composición Microbiana bajo condiciones de campo

Ciento ochenta (180) terneras fueron asignadas al momento de su nacimiento de manera aleatoria a tres grupos experimentales:

Grupo 1 : Administración de composición microbiana fresca.

Grupo 2: Administración de composición microbiana almacenada durante 6 meses.

Grupo Control: No se le administró composición microbiana. En un diseño completo al azar con un factorial 3x2, se analizaron 2 variables: incidencia de diarrea y ganancia de peso corporal. Cada ternera de los grupos 1 y 2 recibió 12 dosis de 10 mL/día por vía oral de una composición microbiana según el Ejemplo 3. La composición microbiana se administró durante 10 días consecutivos, iniciando el día del nacimiento (DI), en tanto que las siguientes dos dosis se suministraron a los 15 y 30 días (DI 5 y D30).

Se determinó la ganancia de peso de las terneras mediante pesaje mensual con báscula electrónica, iniciando desde el DI hasta los tres meses de edad. La presencia de diarreas se determinó por observación directa en cada animal y se registró la frecuencia. La composición microbiana ensayada demostró que reduce la incidencia de diarreas y aumenta la ganancia de peso corporal en los animales evaluados. Los Resultados se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4.

Promedio de

Peso promedio Ganancia

Tratamiento Episodios de Significancia al destete (Kg) de Peso (g)

Diarreas/Animal

Grupo 1 112 800-900 2 P < 0.01

Grupo 2 105 800-900 2 P < 0.01

Control 99 500-600 7 P < 0.01

REFERENCIAS

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