Polyhydroxyalkanoate, vor allem Polyhydroxybuttersäure, werden durch zahlreiche Miko- organismen biosynthetisiert (Babel, W., Riis, V. und Hainich, E. : Plaste und Kautschuk [1990] 37, 109). Wirtschaftliches Interesse erlangten die Biopolymere aufgrund ihrer thermoplastischen Eigenschaften und ihrer Bioabbaubarkeit. Hohe zelluläre Produktkon- zentrationen sind vor allem bei den Bakteriengattungen Alcaligenes, Azotobacter, Pseu- domonas sowie Bacillus bekannt (Anderson, A. J. and Dawes, E. A. : Microbial Review [1990] 54, 450). Neuere Entwicklungen betreffen die Herstellung und Kultivierung re- kombinanter Stämme von Escherichia coli sowie transgener Pflanzen (Steinbüchel, A. : Current Opinion in Biotechnol [1992] 3, 291).

In bezug auf die Produktvielfalt sind biochemisch begründete Stoffwechselveränderungen ebenso in der Bearbeitung wie die Gewinnung von Derivaten.

Industriell produziert wird das Heteropolymer Polyhydroxybuttersäure-Polyhydroxyvaleri- ansäure (Hartley, P. : Energie [1991] 43, 48). Biotechnologisch relevante Verfahren ver- wenden anorganische Stickstoffquellen und Glucose, Saccharose, Melasse, Methanol so- wie Kohlenwasserstoffe als Kohlenstoffquellen. In der Patentanmeldung DE 196 30 175. 0 wird ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Polyhydroxybuttersäure durch Kul- tivierung eines Stammes von Methylobacterium auf Glycerol als Kohlenstoff-und Ener- giequelle dargestellt. Die Supplementation mit Inhaltsstoffen technischer Rohstoffe bzw.

Proteinhydrolysaten oder Aminosäuren in geringen Konzentrationen wurde beschrieben (Fujita, M., Nakamura, K., Kuroki, H., Yoshie, N. and Inoue, Y. : Int. J. Biol. Macromol.

[1993] 15, 253). Hohe Raum-Zeit-Ausbeuten werden durch fed-batch-Fermentationen mit bilanzierten Dosage-Regimen erreicht.

Wird Alcaligenes eutrophus als Produktionsstamm auf Glucose-Mineralsalz-Medium ein- gesetzt (z. B. EP 046 344, US 4477654), so wird eine zweiphasige Fermentation mit Wachstums-und Produktbildungsabschnitt vorgeschlagen. Eine derartige Prozeßcharakte- ristik führt zu zwei Einschränkungen des Verfahrens : Einerseits ist es erforderlich, den

Beginn der Produktsynthese durch spezielle Dosagenprofile der limitierenden Substrate reproduzierbar zu sichern. Andererseits hat das Auftreten eines produktfreien bzw. pro- duktarmen Wachstumsabschnittes eine verlängerte Fermentationszeit zur Folge.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein ökonomisch effektives Kultivierungsverfah- ren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoaten mit einer Verkürzung der Fermentations- zeit sowie Vereinfachung der Kultivierungsbedingungen zu entwickeln.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß der Kultivierungsprozeß mit dem Mikroorganismusstamm Ralstonia eutropha (Alcaligenes eutrophus) DSM 11348 in ei- nem Medium mit Stickstoff-und Kohlenstoffquellen sowie Mineralsalzen und Spurenele- menten durchgeführt wird. Der Stamm ist eine Mutante von Ralstonia eutropha (Alcaligenes eutrophus) DSM 531. Die Hinterlegung des Stammes DSM 11348 erfolgte am 19. 12. 1996 bei der Deutschen Stammsammlung von Mikroorganismen und Zellkultu- ren GmbH. (DSMZ), Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, gemäß"Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren".

Der erfindungsgemäße Mikroorganismusstamm Ralstonia eutropha DSM 11348 unter- scheidet sich vom Ausgangsstamm Ralstonia eutropha (Alcaligenes eutrophus) DSM 531 wie folgt : Bei Kultivierung im Schüttelkolben in Mineralsalzmedium ohne organische N-Quelle mit Glucose als C-Quelle (Temperatur 30 °C) wächst der Stamm DSM 11348 mit einer höhe- ren spezifischen Wachstumsrate von u = 0, 17 h-l im Vergleich mit dem Ausgangsstamm DSM 531 u = 0, 06 h-l). Bei Verwendung von a-Ketoglutarsäure (2 g/1) als C-Quelle be- trägt die maximale spezifische Wachstumsrate des Stammes DSM 11348 p = 0, 12 h-1 und die des Ausgangsstammes DSM 531 nur p = 0, 025 h''.

Die mutative Veränderung in der DNA von DSM 11348 gegenüber dem Ausgangsstamm DSM 531 wird folgendermaßen nachgewiesen : Die Gesamt-DNA der Stämme wird mit der Restriktionsendonuklease Sspl (Erkennungssequenz in der DNA : AAT. ATT) fragmentiert. Dabei entstehen DNA-Frag- mente mit einer Grolle von etwa 10 bis 500 kb (kb : Kilobasen), die mittels Pulsfeld-Gel- elektrophorese aufgetrennt werden. Im Größenbereich zwischen 100 und 145 kb sind beim

Ausgangsstamm DSM 531 DNA-Fragmente folgender Größe nachweisbar (kb) : 100 ; 106 ; 117, 5 ; 127, 4 ; 135, 2 ; 140 ; 144, 7.

Beim Bakterienstamm DSM 11348 liegen im Vergleich mit dem Ausgangsstamm DSM 531 folgende Veränderungen vor : Das Fragment 135, 2 kb Größe fehlt. Zusätzlich vorhanden ist ein DNA-Fragment mit einer Größe von 112, 4 kb.

Es wurde gefunden, daß durch den Einsatz des neuen Mikroorganismenstammes Ralstonia eutropha DSM 11348 in Bioprozessen die Biosynthese der Polyhydroxyalkanoate, vor- zugsweise der Polyhydroxybuttersäure, nicht von der Limitation des Stoffwechsels durch Ammonium oder Phosphat oder Sauerstoff abhängt, sondern wachstumsassoziiert verläuft.

Es zeigte sich überraschend, daß mit dem neuen Mikroorganismus Ralstonia eutropha DSM 11348 offenbar aufgrund seiner genetisch/biochemischen Konstitution hohe Po- lyhydroxyalkanoat-Konzentrationen ohne den üblichen zweiphasigen Bioprozeß erreicht werden. Da die Ammoniumsalze im Medium vollständig durch Proteinhydrolysaten in Form von Peptonen oder Aminosäuregemischen als organische Stickstoffquellen ersetzbar sind, stehen somit salzarme Medien für die mikrobielle Polyhydroxyalkanoat-Produktion zur Verfügung. Unter diesen Bedingungen kann der Bioprozeß auf den Medien mit kom- plexer Stickstoffquelle unter Zusatz von Glucose oder Glycerol oder Essigsäure als Koh- lenstoffquelle durchgeführt werden. Das Bioverfahrensregime auf der Grundlage dieses Mediumsprinzips erstreckt sich durchgängig von der Stammhaltung über die emerse und submerse Anzuchtpassagierung bis in die submerse Hauptfermentation.

Die Fermentation erfolgt nach einer volumenadäquaten Vorzucht in der submersen Haupt- kultur unter aeroben und kontaminationsfreien Bedingungen, indem der Stamm Ralstonia eutropha (Alcaligenes eutrophus) DSM 11348 in einem flüssigen Medium bei Temperatu- ren von 20 bis 37 °C sowie einer Acidität von pH 6, 0 bis 8, 0 für die Dauer von 24 bis 120 Std. kultiviert wird.

Der Ablauf des gesamten Verfahrens läßt sich allgemein wie folgt charakterisieren : Glycerolkonserven des oben genannten Stammes, die bei-18°C deponiert werden und bakterielles Zellmaterial in einer Konzentration von 6 bis 10 g Biotrockensubstanz (TS)/1 enthalten, dienen als Impfmaterial für die erste submerse Anzuchtpassage in 500 ml-Steilbrustflaschen mit 100 bis 150 ml Medium. Das Inoculum enthält Peptone bzw.

Proteinhydrolysate, Glucose bzw. Glycerol, KH2P04 und/oder K2HPO4 sowie eine Spu- rensalzmischung. Die Substratkombination wird qualitativ über alle Fermentationsstufen

beibehalten. Nach 42 bis 72stündiger Kultivierung bei 28 bis 32°C auf einem Rund- schwingtisch mit 180 bis 220 rpm hat das biologische Material eine Konzentration von 6 bis 12 gTS/1 erreicht. Nach Ausreifen der ersten Flüssigkeitskultur erfolgt gegebenenfalls die Beimpfung einer zweiten submersen Anzuchtpassage in einer Menge von 5 bis 10% des Ansatzvolumens. Die Kultivierung der zweiten Flüssigkeitspassage erfolgt entweder in 2, 5 Liter-Steilbrustflaschen mit 400 ml des Proteinhydrolysat-Mediums oder in gerührten und belüfteten Rührkesselreaktoren mit einem Fermentationsvolumen von 5 bis 25 1 bei üblichem biotechnischen Ausrüstungsgrad fur Rührung, Belüftung und pH-Statierung. Die Kultivierungszeit beträgt 20 bis 40 Std. bei einer Temperatur von 30 bis 32 °C. Für die Aciditätskorrektur werden NaOH (unterer pH-Grenzwert) sowie H2SO4 (oberer pH- Grenzwert) verwendet. Die Hauptkultur in einem Rührkesselreaktor mit gleichfalls übli- chem biotechnischen Ausrüstungsgrad wird in einer Menge von 5 bis 10 % des Medium- volumens mit der ausgereiften Vorkultur beimpft und für die Dauer von 24 bis 120 Std. unter Rührung, Belüftung, pH-Statierung und Nachdosage von Glucose oder Glycerol oder Essigsäure durchgeführt.

Als organische Stickstoffquellen sind Proteinhydrolysate als Peptone oder Aminosäure- gemische aus pflanzlichen Produkten (Sojaprotein), tierischen Produkten (Casein, Gela- tine, Fleisch) oder mikrobieller Biomasse geeignet. Der Proteinaufschluß erfolgt mit be- kannten technischen Verfahren durch mineralische oder enzymatische Hydrolyse. Die Proteinhydrolysate mit einem Gehalt an organischem Stickstoff von 8 bis 15 % werden im Medium in Konzentrationen von 10 bis 50 g/1 eingesetzt.

Als Kohlenstoffquelle wird entweder Glucose oder Glycerol oder Essigsäure verwendet.

Von den beiden erstgenannten Substraten wird jeweils nur eines nach separater Sterilisa- tion dem Medium in Konzentrationen von 10 bis 100 g/l zugesetzt. Während der Fermen- tation wird bei Erreichen von 10 bis 20 g Glucose/1 oder 10 bis 20 g Glycerol/1 eine Menge von 20 bis 50 g/l des betreffenden Substrates nachdosiert. Essigsäure kommt als 10 bis 90 % ige wäßrige Lösung zur Anwendung, indem sie dem Bioprozeß über das Dosageregime zur pH-Statierung recursiv zugeführt wird. Sie dient der Kompensation des adäquat zum Wachstum verlaufenden pH-Anstiegs, der durch die NH4-Freisetzung aus der organischen Stickstoffquelle und durch die Aufnahme der Säureanionen im Austausch gegen Hydroxyl- ionen zustande kommt.

Unter diesen Bedingungen erreichen die Fermentationsansätze, bezogen auf die Biotrok- kenmasse, nach 45 Std. Produktkonzentrationen von 50 bis 85 % Polyhydroxyalkanoat als Polyhydroxybuttersäure. Die Raum-Zeit-Ausbeute auf einem Pepton/Glucose-Medium beträgt im 2 1-Ma#stab 0, 91 g Produkt/l-Std. Die Isolierung des Produktes aus der Bio- masse erfolgt in bekannter Weise mit oder ohne Zellaufschlu#.

Die nachfolgenden Beispiele sollen das erfindungsgemäße Verfahren erläutern, aber in kei- ner Weise beschränken.

Experimenteller Teil Die in den Beispielen verwendete Spurensalzlösung hat folgende Zusammensetzung (g/l) : MgSO4 # 7H2O 71, 200 ZnSO4 # 7H2O 0, 440 MnSO4 6 H20 0, 812 CuSO4 5 H20 0, 785 Na2Mo04 2 H20 0, 252 FeSO4 7 H20 4, 980 H3BO3 1, 020 H2S04 1N 100 ml Aqua dest. ad 11 Beispiel I 1 ml einer Glycerolkonserve von Ralstonia eutropha (Alcaligenes eutrophus) DSM 11348 wird mit 1 ml physiologischer NaCI-Lösung resuspendiert und auf 100 ml Anzuchtmedium folgender Zusammensetzung in 500 ml-Steilbrustflaschen übertragen (g/1) : Glucose 20 ; Bactotrypton 10 ; KH2PO41 ; CaCl20, 015 ; Spurensalzlösung 2, 5 ml ; Aqua dest. ad 11 ; pH 6, 8 bis 7, 0 ; Sterilisation 20 min 120 °C. Die Anzuchtkulturen werden 36 Std. lang bei 30 °C auf einem Rundschwingtisch (200 rpm) geschüttelt. Als Reifekriterium zeigen sie eine Biotrockenmassekonzentration von 6, 5 bis 7, 5 g TS/l und eine Acidität von pH 6, 7 bis 6, 8. Sie dienen in einer Menge von 10 % als Impfmaterial fur 21 Hauptkulturmedium in einem 2, 5 1-Bioreaktor mit üblicher technischer Ausstattung für Rührung, Belüftung, Tem-

perierung und pH-Statierung. Das Medium weist folgende Zusammensetzung auf (g/1) : Glucose 100 ; Bactotrypton 20 ; KH2PO4 0, 5 ; Cal2 0, 015 ; Spurensalzlösung 2, 5 ml ; Aqua dest. ad 11 ; pH 6, 8 bis 7, 0 ; Sterilisation 20 min 120 °C. Die Drehzahl des 6-Blatt-Schei- benrührers beträgt 850 rpm, die Belüftungsrate liegt bei 0, 5 : 1 vvm, die Temperatur wird auf 30 °C eingestellt. Die Kultur wird auf einen Aciditätsbereich von pH 6, 8 bis 7, 1 mit 4 N NaOH (unterer Grenzwert) und 6 N H2S04 (oberer Grenzwert) geregelt. Zur 45. Std. wird Glucose in fester Form in einer Konzentration von 20 g/l zugesetzt. Zum Erntezeit- punkt nach 55 Std. erreicht die Kultur eine Biotrockenmasse-Konzentration von 55 g TS/l und eine Produktkonzentration von 91 % in der Biomasse.

Beispiel 2 1 ml einer Glycerolkonserve von Ralstonia eutropha (Alcaligenes eutrophus) DSM 11348 wird mit 1 ml physiologischer NaCl-Lösung resuspendiert und in einer Menge von 1 ml in 100 ml Anzuchtmedium folgender Zusammensetzung gebracht (g/1) : Glycerol 30 ; Soja- pepton 10 ; KH2P04 1 ; CaCl2 0, 015 ; Spurensalzlösung 2, 5 ml ; Aqua dest. ad 1 l ; pH 6, 8 bis 7, 0 ; Sterilisation 20 min 120 °C. Die 500 ml-Anzuchtkolben werden 28 Std. bei 30 °C auf einem Rundschwingtisch geschüttelt. Als Reifekriterium zeigen sie eine Biotrockenmasse- Konzentration von 1, 5 bis 2 g TS/l bei einer Acidität von pH 6, 9 bis 7, 1. Diese erste An- zuchtkultur dient in einer Menge von 10 % des Volumens als Impfmaterial für 11 Medium der zweiten Anzuchtkultur in einem 1, 5 1-Bioreaktor mit üblichem technischen Standard für Rührung, Belüftung, Temperierung und pH-Statierung. Das Medium weist folgende Zusammensetzung auf (g/1) : Glycerol 30 ; Casaminosäuren 20 ; KH2PO4 1 ; CaCl2 0, 030 ; Spurensalze 5 ml ; Aqua dest ad 11 ; pH 6, 8 bis 7, 0 ; Sterilisation 20 min 120°C.

Die Drehzahl des 4-Blatt-Scheibenrührers beträgt 400 rpm, die Belüftungsrate liegt bei 0, 5 : 1 wm, die Temperatur wird auf 30 °C eingestellt. Die Acidität der Kultur wird mit 4 N NaOH (unterer Grenzbereich) und 6 N H2S04 (oberer Grenzbereich) von pH 6, 8 bis 7, 1 geregelt. Nach einer Fermentationszeit von 22 Std. hat die Kultur 6, 5 g TS/l Biotrocken- masse erreicht und wird in einer Menge von 10% des Volumens auf 21 des Hauptkultur- mediums in einem 2, 5 I-Bioreaktor mit üblichem technischen Standard fur Rührung, Be- lüftung, Temperierung und pH-Statierung übertragen. Das Medium weist folgende Zu- sammensetzung auf (g/1) : Glycerol 50 ; Casaminosäuren 20, KH2PO4 0, 5 ; CaCl2 0, 030 ; Spurensalzlösung 5 ml ; Aqua dest. ad 11 ; pH 6, 8 bis 7, 0 ; Sterilisation 20 min 120 °C. Die

Drehzahl des 6-Blatt-Scheibenrührers beträgt 850 rpm, die Belüftungsrate liegt bei 0, 5 : 1 wm, die Temperatur wird auf 30 °C eingestellt. Die Acidität der Kultur wird mit 4 N NaOH (unterer Grenzwert) und H2S04 (oberer Grenzwert) auf pH 6, 8 bis 7, 1 geregelt.

Zur 23. Stunde werden 50 g Glycerol/l hinzugefiigt.

Der Fermentationsansatz erreicht zum Erntezeitpunkt nach 47 Std. eine Biotrockenmasse- Konzentration von 27 g TS/l und eine Produktkonzentration von 65 % in der Biomasse.

Beispiel 3 1 ml einer Glycerolkonserve von Ralstonia eutropha (Alcaligenes eutrophus) DSM 11348 wird mit 1 ml physiologischer NaCI-Lösung resuspendiert und davon 1 ml auf 100 ml An- zuchtmedium folgender Zusammensetzung übertragen (g/l) : Glucose 20 ; Bactotrypton 10 ; KH2PO4 1 ; CaCl2 0, 015 ; Spurensalzlösung 2, 5 ml ; Aqua dest. ad 11 ; pH 6, 8 bis 7, 0 ; Steri- lisation 20 min 120 °C. Die 500 ml-Anzuchtkolben werden 40 Std. lang bei 30 °C auf ei- nem Rundschwingtisch (200 rpm) geschüttelt. Als Reifekriterium weisen sie eine Biotrok- kenmasse-Konzentration von 6, 5 g TS/l und eine Acidität von pH 6, 8 auf. Sie dienen in einer Menge von 10 % des Volumens als Impfmaterial für 11 Hauptkulturmedium in einem 1, 5 1-Bioreaktor mit üblicher technischer Ausrüstung für Rührung, Belüftung, Temperie- rung und pH-Statierung. Das Medium weist folgende Zusammensetzung auf (g/l) : Soja- pepton 20 ; KHzPOa 0, 5 ; CaCl2 0, 015 ; Spurensalzlösung 2, 5 ml ; Aqua dest. ad 11 ; pH 6, 8 bis 7, 0 ; Sterilisation 20 min 120 °C. Die Drehzahl des 4-Blatt-Scheibenrührers beträgt 400 rpm, die Belüftungsrate liegt bei 0, 5 : 1 vvm, die Temperatur wird auf 30 °C eingestellt.

Die Acidität der Kultur wird mit 50 % iger Essigsäure auf pH # 7, 05 geregelt. Nach einer Fermentationszeit von 42 Std. erreicht die Kultur eine Biotrockenmassekonzentration von 15 g TS/I und eine Produktkonzentration von 50 % PHB in der Biomasse.