PROCEDIMIENTO MICROBIANO DE PRODUCCIóN DE ISóMEROS ESPECíFICOS DE áCIDOS LINOLEICOS CONJUGADOS.

SECTOR DE LA TéCNICA Esta Invención se refiere a un procedimiento de producción de ácidos linoleicos conjugados, particularmente el isómero cis-9, trans-11 , utilizando microorganismos. La utilización de dichos ácidos puede aplicarse a Ia bioalimentación y sector de Ia biotecnología.

ESTADO DE LA TéCNICA

Con el nombre de ácidos linoleicos conjugados (abreviadamente CLAs por las siglas en inglés de conjugated linoleic acids) se suele hacer referencia a toda una colección de isómeros posicionales y geométricos de ácidos grasos poliinsaturados (abreviadamente PUFAs por las siglas en inglés de βolyunsaturated fatty acids) con longitud de cadena de 18 átomos de carbono cuyos dobles enlaces, a diferencia del resto de PUFAs, están conjugados en Ia molécula al ocupar posiciones consecutivas.

El nombre que tienen los ácidos grasos con 18 átomos de carbono y dos dobles enlaces carbono=carbono es ácido octadecadienoico. De estas moléculas existen numerosos isómeros, tanto de posición de los dobles enlaces, denominados "isómeros de posición", como de Ia estereoquímica ("isómeros geométricos", cis o trans, Z o E). Entre todos ellos hay dos de importancia relevante. Se trata de los denominados cis-9, trans-11- y trans-10, cis-12-.

Las diferencias químicas entre el ácido linoleico y estos dos isómeros implican cambios drásticos en sus propiedades biológicas. En el caso de los CLAs se les atribuyen actividades funcionales de relevancia que pueden ser de radical interés para Ia industria agroalimentaria implicada en Ia producción de aditivos e ingredientes funcionales. Por ejemplo, se ha demostrado que los CLAs son capaces de actuar como agentes preventivos y terapéuticos en muchos modelos tumorales en animales de experimentación (Margot M eí al. (2003). J. Mammary Gland Biol. Neoplas. 8: 103- 118). Específicamente se ha demostrado Ia inhibición por CLAs de Ia inducción de carcinogénesis mamaria (Ip C eí al. (1991). Cáncer Res. 51.: 6118-6124; Ip eí al. (1997). Carcinogenesis 18: 755-759; Thompson H et al. (1997). Cáncer Res. 57: 5067- 5072; Ip C eí al. Cáncer Res. 54: 1212-1215; y Ip C eí al. Nutr. Cáncer 24: 149-157) y cáncer de colón en modelos de rata (Ha YL et al. (1990). Cáncer Res. 50: 1097-1101 ;

Park HS ef al. (2001). Br. J. Nutr. 86: 549-555; y Liew C ef al. (1995). Carcinogenesis 16: 3037-3043). Además se ha observado un efecto de CLAs en Ia reducción de tamaño y metástasis en modelos animales de cáncer de próstata, cáncer de pulmón y cáncer de mama. Utilizando modelos de cultivo in vitro de células cancerosas humanas se ha observado Ia inhibición de Ia proliferación tumoral usando el isómero cis-9-trans-11. Este isómero añadido en dieta es capaz por si sólo de reducir Ia aparición de carcinogenesis mamaria en ratas (Corl BA eí al. (2003). J Nutr. 133: 2893-2900). Además, durante los últimos meses se han empezado a desentrañar los mecanismos moleculares responsables de todos estos efectos anticancerígenos (Chujo H eí al. (2003). Cáncer Lett. 202: 81-87; Kim KH ef al. (2003). Nutrition 19: 772-777; Miller eí al. (2003). Br. J. Nutr. 90: 877-885; Kemp MQ ef al. (2003). J. Nutr. 133: 3670-3677; Chen BQ eí al. (2003). World J Gastroenterol. 9: 1909-1914; Park HS eí al. (2004). J. Nutr. Biochem. 15: 229-235; Tanmahasamut P eí al. (2004). J. Nutr. 134: 674-680 ; y Nichenametla S eí al. (2004). J. Toxico!. Environ. Health A 67: 469- 481).

A todo ello hay que sumar otras actividades biológicas bien conocidas de los CLAs. La más explotada desde el punto de vista comercial hace referencia al hecho de que su ingesta en dieta reduce las reservas de grasa en ratas (Park Y eí al. (1997). Lipids 32: 853-858; Delany JP eí al. (1999). Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 276: R1172-R1179 ; Tsuboyama N eí al. (2000). Diabetes 49: 1534-1542 ; y Ohnuki K eí al. (2001). Biosci. Biotechnoi. Biochem. 65: 2200-2204.), ratones (Stangl Gl. (2000). J. Nutr. 130: 1140-1146; Azain MJ et al. (2000). J. Nutr. 130: 1548-1554; Sugano M eí a/. (2001). Biosci. Biotechnoi. Biochem. 65: 2535-2541; Poulos SP eí al. (2001). J. Nutr. 131: 2722-2731 ; Sisk MB eí al. (2001). J. Nutr. 131: 1668-1674; y Ealey KN eí al. (2002). Lipids 37: 853-861), hamsters (de Deckere EA ef al. (1999). Br. J. Nutr. 82: 309-317) y cerdos (Ostrowska E eí al. (1999). J. Nutr. 129: 2037-2042; y Thiel-Cooper RL eí al. (2001). J. Anim. Sci. 79: 1821-1828). Por ello se utiliza en Ia formulación de algunos preparados nutricionales con Ia idea de convertir grasa en músculo (dieta para deportistas) o perder peso sin perder músculo (dietas de adelgazamiento).

Otras propiedades de los CLAs hacen referencia a su capacidad para inhibir Ia aterogénesis en hamsters y conejos (de Deckere EA ef al. (1999). Br. J. Nutr. 82: 309- 317; Lee KN eí al. (1994). Atherosclerosis 108: 19-25; Kritchevsky D ef al. (2000). J. Am. CoII. Nutr. 19: 472S-477S; y Wilson TA ef al. (2000). Nutr. Res. 20: 1795-1805,

32-34) y también, en ratas prediabéticas, a su capacidad para incrementar Ia sensibilidad a Ia insulina y mejorar Ia tolerancia a glucosa (Houseknecht KL βt al. (1998). Biochem. Biophys. Res. Commun. 244: 678-682; y Ryder JW et al. (2001). Diabetes 50.: 1149-1157). Sin embargo, dicho efecto es atribuible al isómero t-10-c-12 que induce esteatosis hepática, Io que desaconseja el uso del mismo (Clément L eí a/. (2002). J. Lipid Res. 43: 1400-1409).

La fuente biológica natural de ácido linoleico son los aceites vegetales. Por el contrario, Ia fuente biológica natural de los CLAs son los productos lácteos y Ia carne de rumiantes. En realidad en este último caso es una bacteria del rumen quién produce los CLAs y los fija en el tejido del animal. Se comercializa un combinado de CLAs para Ia industria alimentaria (una mezcla isomolar de los dos isómeros con un 80% de pureza) y también se venden los isómeros puros aunque su precio es muy elevado, probablemente por Ia dificultad de purificación de ambos isómeros.

Es posible sintetizar químicamente cada uno de los dos isómeros pero el proceso es complicado, caro y poco efectivo, de forma que tan sólo se obtiene un 50% de rendimiento con contaminaciones de los dos isómeros. Existen descripciones en Ia literatura que demuestran Ia posibilidad de utilizar Ia bacteria del rumen Butyvibrio fibrísolvens, o Ia enzima linoleoato isomerasa purificada desde Ia misma, para llevar a cabo una conversión enzimática de un ácido graso precursor en CLAs. También existen ejemplos sobre el uso de especies del género Lactobacillus o el empleo de lipasas de Candida cylindracea o Mucor miehei en Ia obtención selectiva de CLAs (Warvel, S; Borgdorf, R; Biotechnology Letters, 2000, 22: 1151-55), pero de nuevo todos estos procesos son poco efectivos.

Se ha descrito una forma de producir específicamente el isómero cis-9-trans- 11 , basada en crecer Ia levadura Saccharomyces cerevisiae modificada genéticamente (EUROSCARF) en presencia de ácido vaccénico (Patente española ES2204328-B) para que dicho ácido graso monosaturado se convierta específicamente en el isómero cis-9-trans-11- gracias a Ia acción de una δ ⁹ - desaturasa codificada en el genoma de este microorganismo. Es más, se ha descrito que en humanos Ia ingesta del isómero trans-11- del ácido vaccénico da lugar a su bioconversión en el isómero cis-9-trans-11- (Turpeinen et al. (2002). Am. J. Clin. Nutr. 76: 504-510).

Por Io tanto, el problema técnico que se plantea es Ia producción específica del isómero cis-9, trans-11-, de forma eficaz, dada su probada utilidad biológica e

inocuidad. En Ia presente invención se describen los ensayos de cinco cepas de bacterias, siete cepas de levaduras Saccharomyces cerβvisiae, siete cepas de levaduras distintas de las Saccharomyces y dos especies de hongos, para evaluar su capacidad de producción del isómero cis-9, trans-11 del ácido linoleico conjugado, tanto en presencia como en ausencia de ácido vaccenico. Los resultados son un nuevo procedimiento de obtención del ácido cis-9, trans-11 del ácido linoleico conjugado.

DESCRIPCIóN DE LA INVENCIóN

La presente invención describe varios procedimientos para Ia producción específica del isómero cis-9-trans-11 del ácido linoleico conjugado. El primero de ellos describe Ia incorporación del isómero trans-11 del ácido vaccénico como sustrato a medios de cultivo donde crece una bacteria, una levadura o un hongo filamentoso y Ia bioconversión microbiana de dicho sustrato en el isómero de interés medida por Ia generación de un nuevo enlace de configuración Z (cis) en Ia posición 9 de Ia cadena. El segundo trata sobre Ia producción endógena por parte de algunos microorganismos del isómero cis9-trans11 sin que existan precursores en el medio de cultivo. Además se describe Ia producción constitutiva del isómero trans-11 del ácido vaccénico por parte de algunas levaduras.

Descripción detallada de Ia invención

La presente invención se basa en varios hechos relativos al metabolismo microbiano de los ácidos grasos. Así, Ia adición como sustrato del isómero trans-11 del ácido vaccénico a distintos microorganismos permite Ia producción de un ácido graso poliinsaturado (el isómero cis-9-trans-11 del ácido linoleico conjugado) con una insaturación adicional de configuración Z (cis) en Ia posición 9 de Ia cadena de dicho sustrato originada por Ia actuación de Ia enzima δ ⁹ -desaturasa presente en todos los microorganismos ensayados. Aun más, determinados microorganismos son capaces de producir dicho isómero sin necesidad de sustrato precursor alguno al contener ácidos grasos (ácido vaccénico, ácido oléico u otros) en su citoplasma y/o membranas celulares que pueden actuar como sustratos de las actividades enzimáticas anteriormente mencionadas. En este sentido, se ha comprobado Ia producción

constitutiva del isómero trans-11 del ácido vaccénico por parte de algunos microorganismos.

Exposición detallada de Ia realización Sin que presuponga una limitación al ámbito de Ia aplicación de Ia presente invención tal y como se define en las presentes reivindicaciones, se describen a continuación ejemplos concretos de como llevar a cabo Ia invención.

Ejemplo 1

Procedimiento de producción del isómero cis-9-trans-11 del ácido linoleico conjugado con distintos microorganismos por incorporación del isómero trans-11 del ácido vaccénico como sustrato.

a) Cultivos de los distintos microorganismos con el isómero trans-11 del ácido vaccénico.

En Ia presente invención se han utilizado los microorganismos que se detallan en Ia tabla 1.

El precrecimiento para Ia generación de colonias aisladas de bacterias de las especies Lactobacillus pentosus y Leuconostoc citreum se realizó en placas de medio sólido MRS-Agar inoculando una estría e incubando a 3O ⁰ C durante 48 horas. Las colonias de las especies Bacillus subtilis y Escheríchia coli se precrecieron en placas de medio sólido MC-Agar incubando a 3O ⁰ C y 37 ⁰ C respectivamente, durante 24 horas. Las colonias de Ia especie Zymomonas mobilis se crecieron en medio sólido YPD-Agar incubando a 3O ⁰ C durante 48 horas. El precrecimiento de las levaduras del género Saccharomyces, así como de los géneros no-Saccharomyces, se realizó en placas de medio YPD-agar inoculando una estría de Ia suspensión microbiana e incubando a 3O ⁰ C durante 48 horas. De forma similar, el precrecimiento de las colonias de hongos de las especies Aspergillus niger y Penicilliυm roqueforti se realizó en placas de medio sólido PDA incubando a 3O ⁰ C y 19 ⁰ C respectivamente, durante 6 días.

Para preparar el medio de inducción, 5 μl de una solución etanólica 0,5 M del isómero trans-11 del ácido vaccénico se añadieron a 5 mi de medio líquido, usándose los mismos medios utilizados para Ia obtención de colonias o micelio pero sin agar y

con la adición de tergitol al 1% v/v. De esta forma, el isómero trans-11 del ácido vaccénico se encontraba a una concentración final de 0,5 mM. La mezcla se inoculó con una colonia aislada del microorganismo en cuestión y se incubó durante 48 horas a Ia temperatura correspondiente en cada caso y con una agitación de 200 rpm, a excepción de Ia cepa de Leuconostoc citreum que se incubó sin agitación.

b) Procedimiento de extracción del isómero cis-9-trans-11 del ácido linoleico conjugado.

El cultivo se trasvasó a un tubo de 10 mi y se centrifugó a 4000 rpm durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 1.5 mi de agua destilada y Ia suspensión se transfirió a un vial tipo eppendorf de 2 mi. Se centrifugó el cultivo en las mismas condiciones, repitiéndose otra vez Ia operación de lavado con el mismo volumen de agua destilada. Finalmente se centrifugó a 5000 rpm durante 5 minutos para eliminar totalmente el agua. A las células obtenidas se les añadió 1 mi de CHCI ₃ : MeOH (2:1) y Ia mezcla se dejó en incubación durante 1 hora. Finalmente, se centrifugó a 13200 rpm durante 15 segundos y se pasó el extracto orgánico a un nuevo vial de 2 mi donde se evaporó el disolvente.

El residuo de ácidos grasos se metilo por adición de 500 μl de una disolución 0.5N de KOH en MeOH, seguido de neutralización después de 30 minutos con 500 μl de HCI 1 N y extracción con 500 μl de hexano. La capa orgánica se separó y se concentró hasta un volumen aproximado de 20 μl.

A continuación se analizó el isómero cis-9-trans-11 del ácido linoleico conjugado. El éster metílico se analizó por cromatografía de gases-espectrometría de masas (CG-EM) en una columna apolar HP-VOC (0.2mm*30m*1.12μm) con el siguiente programa de temperaturas: 80 ⁰ C (0 min.); 2.5°C/min hasta 220 ⁰ C (0 min.); 2.0°C/min. hasta 260 ⁰ C (15 min.).

Resultados

Como se indica en Ia tabla 2, en todos los microorganismos se produjo en mayor o menor medida el isómero cis-9-trans-11- del ácido linoleico conjugado. En el caso de las bacterias β. subtilis y L. pentosus se detectaron producciones similares a las obtenidas en algunas levaduras del género Saccharomyces, mientras que en el

resto de especies bacterianas Ia producción fue mucho menor. En el caso de los hongos filamentosos, Ia producción del isómero cis-9-trans-11- fue baja. Por el contrario, en todas las especies levaduriformes no-Saccharomyces analizadas, excepto en el caso de T. delbrueckii, se detectaron elevados niveles de producción, particularmente en el caso de las especies P. anómala, P. jadinii y H. guillermondii.

Ejemplo 2

Procedimiento de producción del isómero cis-9-trans-11 del ácido linoleico conjugado con distintos microorganismos al crecer en medios de cultivo sin suplementación de ácidos grasos.

a) Cultivos de los distintos microorganismos sin el isómero trans-11 del ácido vaccénico. Como en el ejemplo anterior, se utilizaron los microorganismos que se detallan en Ia tabla 1.

El precrecimiento para Ia generación de colonias aisladas de bacterias de las especies Lactobacillus pentosus y Leuconostoc citreum se realizó en placas de medio sólido MRS-Agar inoculando una estría e incubando a 30 ⁰ C durante 48 horas. Las colonias de las especies Bacillus subtilis y Escheríchia coli se precrecieron en placas de medio sólido MC-Agar incubando a 3O ⁰ C y 37 ⁰ C respectivamente, durante 24 horas. Las colonias de Ia especie Zymomonas mobilis se crecieron en medio sólido YPD-Agar incubando a 3O ⁰ C durante 48 horas. El precrecimiento de las levaduras del género Saccharomyces, así como de los géneros no-Saccharomyces, se realizó en placas de medio YPD-agar inoculando una estría de Ia suspensión microbiana e incubando a 3O ⁰ C durante 48 horas. De forma similar, el precrecimiento de las colonias de hongos de las especies Aspergillus niger y Penicillium roqueforti se realizó en placas de medio sólido PDA incubando a 3O ⁰ C y 19 ⁰ C respectivamente, durante 6 días. Una colonia aislada del microorganismo en cuestión se inoculó en 5 mi de medio líquido con tergitol al 1% (v/v) y Ia mezcla se incubó durante 48 horas a Ia temperatura correspondiente para cada microorganismo y con una agitación de 200 rpm, a excepción de Ia cepa de Leuconostoc citreum que se incubó sin agitación.

b) Procedimiento de extracción del posible isómero cis-9-trans-11 del ácido linoleico conjugado producido.

El cultivo se trasvasó a un tubo de 10 mi y se centrifugó a 4000 rpm durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 1.5 mi de agua destilada y Ia suspensión se transfirió a un vial tipo eppendorf de 2 mi. Se centrifugó el cultivo en las mismas condiciones, repitiéndose otra vez Ia operación de lavado con el mismo volumen de agua destilada. Finalmente se centrifugó a 5000 rpm durante 5 minutos para eliminar totalmente el agua. A las células obtenidas se les añadió 1 mi de CHCI ₃ :MeOH (2:1) y Ia mezcla se dejó en incubación durante 1 hora.

Finalmente, se centrifugó a 13200 rpm durante 15 segundos y se pasó el extracto orgánico a un nuevo vial de 2 mi donde se evaporó el disolvente.

El residuo de ácidos grasos se metilo por adición de 500 μl de una disolución 0.5N de KOH en MeOH, seguido de neutralización después de 30 minutos con 500 μl de HCI 1N y extracción con 500 μl de hexano. La capa orgánica se separó y se concentró hasta un volumen aproximado de 20 μl.

A continuación se analizó el isómero cis-9-trans-11 del ácido linoleico conjugado. El éster metílico se analizó por cromatografía de gases-espectrometría de masas (CG-EM) en una columna apolar HP-VOC (0.2mm*30m*1.12μm) con el siguiente programa de temperaturas: 80 ⁰ C (0 min.); 2.5°C/min hasta 22O ⁰ C (0 min.);

2.0°C/min. hasta 260 ⁰ C (15 min.).

Resultados

Dadas las elevadas producciones del isómero cis-9-trans-11 detectadas en algunos de los microorganismos ensayados en el ejemplo anterior, sobretodo P. anómala y P. jadinii que producen más isómero (0,9748 mM y 0,6077 mM, respectivamente) que Ia cantidad de sustrato precursor trans-11 del ácido vaccénico adicionado (0.5 mM), se decidió ensayar Ia posible síntesis endógena de novo por parte de los microorganismos analizados. Para ello se crecieron en las mismas condiciones que en el ejemplo anterior pero sin el isómero trans-11 del ácido vaccénico en Ia formulación del medio.

Los resultados obtenidos se recogen en Ia tabla 3 e indican que tan sólo H. guillermondii y las especies del género Pichia analizadas en el experimento producen el isómero cis-9-trans-11 a niveles de relevancia, especialmente en el caso de P. anómala y P. jadinii. El resto de cepas ensayadas tiene unas producciones residuales del isómero en cuestión.

Ejemplo 3

Procedimiento de producción del isómero trans-11 del ácido vaccénico al crecer especies levaduriformes en medios de cultivo.

a) Cultivos de los distintos microorganismos.

Se utilizaron las cepas S. cerevisiae CECT 1176 y Pichia anómala CECT 10590 (tabla 1). El precrecimiento de las levaduras se realizó en placas de medio YPD-agar inoculando una estría de Ia suspensión microbiana e incubando a 3O ⁰ C durante 48 horas. Una colonia aislada del microorganismo en cuestión se inoculó en 5 mi de medio líquido YPD con tergitol al 1% (v/v). La mezcla se incubó durante 48 horas a Ia temperatura correspondiente para cada microorganismo con una agitación de 200 rpm.

b) Procedimiento de extracción del posible isómero trans-11 del ácido vaccénico.

El cultivo se trasvasó a un tubo de 10 mi y se centrifugó a 4000 rpm durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 1.5 mi de agua destilada y Ia suspensión se transfirió a un vial tipo eppendorf de 2 mi. Se centrifugó el cultivo en las mismas condiciones, repitiéndose otra vez Ia operación de lavado con el mismo volumen de agua destilada. Finalmente se centrifugó a 5000 rpm durante 5 minutos para eliminar totalmente el agua. A las células obtenidas se les añadió 1 mi de CHCI ₃ :MeOH (2:1) y Ia mezcla se dejó en incubación durante 1 hora. Finalmente, se centrifugó a 13200 rpm durante 15 segundos y se pasó el extracto orgánico a un nuevo vial de 2 mi donde se evaporó el disolvente.

El residuo de ácidos grasos se metilo por adición de 500 μl de una disolución 0.5N de KOH en MeOH, seguido de neutralización después de 30 minutos con 500 μl

de HCI 1N y extracción con 500 μl de hexano. La capa orgánica se separó y se concentró hasta un volumen aproximado de 20 μl.

A continuación se analizó el isómero trans-11 del ácido vaccénico. El éster metílico se analizó por cromatografía de gases-espectrometría de masas (CG-EM) en una columna apolar HP-VOC (0.2mm*30m*1.12μm) con el siguiente programa de temperaturas: 8O ⁰ C (0 min.); 2.5°C/min hasta 22O ⁰ C (0 min.); 2.0°C/min. hasta 26O ⁰ C

(15 min.).

Resultados

La tabla 4 muestra los resultados obtenidos. Como se puede observar, Ia levadura S. cerevisiae CECT 1176 produce una cantidad residual del isómero isómero trans-11 del ácido vaccénico. Por el contrario, Ia levadura P. anómala CECT 10590 produce aproximadamente 0,5 mM de dicho compuesto, definiendo unas condiciones de cultivo para Ia producción de este compuesto con posible actividad como ingrediente funcional. En cualquier caso, estos resultados sugieren que Ia producción del isómero 9-cis, 11-trans- de ácidos linoleicos conjugados por los microorganismos de Ia Tabla 1 se debe a que dichos microorganismos son en mayor o menor medida productores del ácido 11-trans-vaccénico.

Tabla 1. Microorganismos ensayados en Ia conversión del isómero trans-11 del ácido vaccénico en el isómero cis-9-trans-11 del ácido linoleico conjugado.

ESPECIE REFERENCIA USO CECT

Bacterias

Bacillus suhtilis CECT 371 Detección de antibióticos Escherichia coli CECT 405 Cepa de laboratorio Lactobacillus pentosus CECT 4023 Fermentación de encurtidos Leuconostoc citreum CECT 4018 Producción de dextrano Zymomonas mobilis CECT 947 Aislado de cerveza

Levaduras Saccharomyces

Saccharomyces cerevisiae CECT 1176 Cepa de laboratorio Saccharomyces cerevisiae CECT 1326 Levadura para producción de pan Saccharomyces cerevisiae CECT 1479 Levadura para producción de vino Saccharomyces cerevisiae CECT 1894 Levadura para producción de vino Saccharomyces cerevisiae CECT 1929 Levadura para producción de sidra Saccharomyces cerevisiae CECT 10094 Levadura de flor Saccharomyces cerevisiae CECT 12660 Levadura para producción de cava

Levaduras no-Saccharomyces

Candida stellata CECT 11046 Aislada de mosto de uva

Hanseniaspora guillermondii CECT 11102 Aislada de mosto de uva

Hanseniaspora uvarum CECT 11106 Aislada de mosto de uva

Pichia anómala CECT 10590 Aislada de mosto de uva

Pichia jadinii CECT 1060 Suplemento nutricional

Pichia membranaefaciens CECT 1115 Aislada de exudado de olmo

Torulaspora delbrueckii CECT 10558 Aislada de mosto de uva

Hongos

Aspergillus niger CECT 2088 Producción de enzimas Penicillium roqueforti CECT 2905 Producción de quesos

Tabla 2. Valores de producción del Isómero cis-9-trans-11 del ácido linolelco conjugado obtenidos por parte de distintos microorganismos al crecer en presencia de 0.5 mM del isómero trans-11 del ácido vaccénico. Los resultados en mM representan Ia media de tres experimentos independientes.

5

ESPECIE REFERENCIA CECT cis-9-trans-11 (mM)

Bacterias

Bacillus subtilis CECT 371 0,1129 Escherichia coli CECT 405 0,0413 Lactobacillus pentosus CECT 4023 0,1001 Leuconostoc citreum CECT 4018 0,0272 Zymomonas mobilis CECT 947 0,0304

Levaduras Saccharomyces

Saccharomyces cerevisiae CECT 1176 0,1799 Saccharomyces cerevisiae CECT 1326 0,1493 Saccharomyces cerevisiae CECT 1479 0,0401 Saccharomyces cerevisiae CECT 1894 0,1962 Saccharomyces cerevisiae CECT 1929 0,1582 Saccharomyces cerevisiae CECT 10094 0,0257 Saccharomyces cerevisiae CECT 12660 0,0506

Levaduras no-Saccharomyces

Candida stellata CECT 11046 0,1442

Hanseniaspora guillermondii CECT 11102 0,4280

Hanseniaspora uvarum CECT 11106 0,2116

Pichia anómala CECT 10590 0,9748

Pichia jadinii CECT 1060 0,6077

Pichia membranaefaciens CECT 1115 0,1154

Torulaspora delbrueckii CECT 10558 0,0525

Hongos

Aspergillus niger CECT 2088 0,0688 Penicillium roqueforti CECT 2905 0,0110

Tabla 3. Valores de producción del isómero cis-9-trans-11 del ácido linoleico conjugado obtenidos por parte de distintos microorganismos al crecer sin adición del isómero trans-11 del ácido vaccénico. Los resultados en mM representan Ia media de tres experimentos independientes.

5

ESPECIE REFERENCIA CECT cis-9-trans-11 (mM)

Bacterias

Bacillus subtilis CECT 371 0,0047 Escherichia coli CECT 405 0,0057 Lactobacillus pentosus CECT 4023 0,0139 Leuconostoc citreum CECT 4018 0,0197 Zymomonas mobilis CECT 947 0,0090

Levaduras Saccharomyces

Saccharomyces cerevisiae CECT 1176 0,0131 Saccharomyces cerevisiae CECT 1326 0,0209 Saccharomyces cerevisiae CECT 1479 0,0156 Saccharomyces cerevisiae CECT 1894 0,0052 Saccharomyces cerevisiae CECT 1929 0,0056 Saccharomyces cerevisiae CECT 10094 0,0036 Saccharomyces cerevisiae CECT 12660 0,0048

Levaduras no-Saccharomyces

Candida stellata CECT 11046 0,0130

Hanseniaspora guillermondii CECT 11102 0,0070

Hanseniaspora uvarum CECT 11106 0,0216

Pichia anómala CECT 10590 0,2030

Pichia jadinii CECT 1060 0,1875

Pichia membranaefaciens CECT 1115 0,0613

Torulaspora delbrυeckii CECT 10558 0,0058

Hongos

Aspergillus niger CECT 2088 0,0062 Penicillium roqueforti CECT 2905 0,0074

Tabla 4. Valores de producción del isómero trans-11 del ácido vaccénico obtenidos por parte de S. cerevisiae CECT 1176 y P. anómala CECT 10590. Los resultados en mM representan Ia media de tres experimentos independientes .

LEVADURA Isómero trans-11 del ácido vaccénico (mM)

S. cerevisiae CECT 1776 0,004

P. anómala CECT 10590 0,517

Utilización del isómero cis-9-trans-11 del ácido linoleico conjugado en Ia fabricación de biomasa de levadura panadera v de microflora de yogur.

En experimentos preliminares se ha llevado a cabo un procedimiento de producción de biomasa de levadura panadera cargada con el isómero cis-9-trans-11 del ácido linoleico conjugado Para ello se ha crecido Ia levadura Saccharomyces cerevisiae CECT 1326 en un fermentador de 300 litros conteniendo 200 litros de medio rico con melazas como fuente de carbono y el isómero trans-11 del ácido vaccénico a una concentración 0.5 mM. Las condiciones de fermentación fueron una temperatura de 30 ⁰ C con agitación durante 24 horas. Pasado este tiempo se recogió por centrifugación Ia biomasa levaduriforme enriquecida en el isómero cis-9-trans-11 que se lavó dos veces por resuspensión en tampón fosfato sódico 50 mM pH 6.8 y posterior centrifugación. La pasta de biomasa resultante se caracterizó en cuanto a su contenido en el isómero cis-9-trans-11 del ácido linoleico conjugado, determinándose una concentración de 0,16 mM. Con dichas levaduras se fabricó pan en un horno piloto siguiendo un protocolo industrial establecido. Sobre los panes producidos se evaluó Ia concentración del isómero cis-9-trans-11.

El procedimiento de extracción del isómero cis-9-trans-11 del ácido linoleico conjugado de muestras de pan se llevó a cabo de Ia siguiente forma: Se pesó entre 0.1-1g de pan al que se añadió 1 mi de CHCL ₃ :MeOH, (2:1), Ia mezcla se dejó en incubación durante 1 hora. Finalmente, se centrifugó a 13200 rpm durante 15 segundos y se pasó el extracto orgánico a un nuevo vial de 2 mi donde se evaporó el disolvente.

El residuo de ácidos grasos se metilo por adición de 50OjC/! de una disolución 0.5N de KOH en MeOH, seguido de neutralización después de 30 minutos con 500//I

de HCI 1N y extracción con 500//I de hexano. La capa orgánica se separó y se concentró hasta un volumen aproximado de 20//I.

A continuación se analizó el isómero cis-9-trans-11 del ácido linoleico conjugado. El éster metílico se analizó por cromatografía de gases-espectrometría de masas (CG-EM) en una columna apolar HP-VOC (0.2mm*30m*1.12μm) con el siguiente programa de temperaturas: 8O ⁰ C (0 min.); 2.5°C/min hasta 22O ⁰ C (0 min.);

2.0°C/m¡n. Hasta 26O ⁰ C (15 min.)

Así, se obtuvieron los siguientes resultados: Pan control 0.05878 ± 0.02521 (μg c9-t11/ g pan)

Pan c9-t11 0.31779 ± 0.07556 {μg c9-t11/ g pan)

Un valor específico dentro del rango de concentración del isómero c9-t11 obtenido fue de 0,35 μg/gramo de pan.

Siguiendo una metodología similar se ha llevado a cabo un procedimiento de producción de yogur enriquecido en ácidos linoleicos conjugados, caracterizado porque consiste en añadir al medio de crecimiento de las bacterias ácido lácticas correspondientes el isómero trans-11 del ácido vaccénico. El procedimiento de extracción del isómero c9-t11 de Ia muestra de yogurt se realizó con una mezcla de disolventes. Se pesó entre 0.1-1g de yogurt y se adicionó 1 mi de CHCI ₃ : MeOH (2:1) y se mantuvieron las muestras en agitación durante 1 hora. Pasado este tiempo se centrifugó y se recuperó Ia fase orgánica. Esta fase se llevó a sequedad y posteriormente se resuspendió en 500//I de una disolución 0.5N de KOH en metanol durante 30 minutos para metilar los ácidos grasos extraídos y obtener sus esteres metílicos. A continuación se neutralizó Ia solución con 500μl de HCI 1 N y finalmente se extrajeron los esteres metílicos de los ácido grasos con 500//I de hexano. Finalmente se concentraron hasta un volumen aproximado de 20//I y se analizaron los esteres metílicos por cromatografía de gases.

En este caso se obtuvieron los siguientes resultados:

Yogurt control 12.774 ± 1.957 (mg c9-t11/g yogurt)

Yogurt c9-t11 15.096 ± 1.030 (mg c9-t11/g yogurt)

También se han llevado a cabo producciones industriales de embutidos curados utilizando iniciadores de fermentación (bacterias ácido lácticas) cargadas con el isómero cis-9-trans-11 del ácido linoleico conjugado mediante precrecimiento en medios con el isómero trans-11 del ácido vaccénico.