DESCRIPTION

Titre : DISPOSITIF DE CULTURE MICROBIOLOGIQUE

La présente invention appartient au domaine de la microbiologie et concerne, plus particulièrement, la culture, la détection et/ou G identification de microorganismes possiblement présents dans un échantillon à analyser, à contrôler.

La présente invention a trait plus spécifiquement aux solutions alternatives proposées aux milieux de culture gélosés traditionnels, destinés notamment à la culture, la détection et/ou l'identification de microorganismes présents dans un échantillon à analyser.

Dans les domaines du diagnostic clinique et du contrôle microbiologique industriel tel que dans les industries agroalimentaire, pharmaceutique ou cosmétique, les milieux de culture gélosés en boite de Pétri, constituent depuis la fin du 19 ^e siècle un outil indispensable à la détection et à l'identification des microorganismes pathogènes.

Les milieux de culture gélosés connaissent cependant quelques inconvénients majeurs. En effet, lorsque les milieux de culture gélosés en boite de Pétri sont produits de manière artisanale, ils requièrent du temps (au moins une heure) et de nombreuses opérations (pesage des ingrédients, dissolutions, autoclavage, coulage, répartition en boîtes de Pétri). En particulier, dans les laboratoires d'analyse biologique de petite taille, la préparation de ces milieux de culture est un poste chronophage et à faible valeur ajoutée. De plus, ces milieux solides ou semi-solides sont extrêmement sensibles à toute forme de contamination biologique. Enfin, du fait de la grande difficulté pour en assurer la stérilité, les milieux gélosés « artisanaux » doivent être préparés de façon extemporanée ou quasi-extemporanée.

Il existe également des milieux gélosés produits industriellement. Ces milieux gélosés prêts à l'emploi ont des durées de péremption courtes, qui ne dépassent guère quelques mois. Cette durée de péremption limitée peut notamment s'expliquer pour partie par la présence d'eau dans les milieux. Par ailleurs, pour en garantir une stérilité optimale et un niveau de performances acceptable, ils sont soumis à des mesures draconiennes en termes de conditionnement (traitement stérilisant aux UV, double emballage...), d'acheminement et de conservation (un stockage entre 2°C et 8°C, à l'abri de la lumière). Ces nombreuses contraintes impactent sur les coûts de vente et d'utilisation des milieux gélosés industriels.

Pour remédier aux inconvénients précités, des alternatives aux milieux de culture gélosés ont été proposées. Il s'agit en particulier de dispositifs de culture microbiologique prêts à l'emploi, qui ont la particularité d'intégrer des compositions nutritives, éventuellement sélectives et/ou discriminantes, déshydratées et activables par simple (ré)hydratation. De ce fait, outre des modalités de conservation et/ou stockage peu contraignantes (à l'abri de l'humidité et des fortes températures), leur durée de péremption peut atteindre plusieurs années.

A ce titre, la société 3M Company propose une gamme de dispositifs de culture microbiologique industriels dénommée Petrifilm™. Ces dispositifs, notamment décrits dans EP0070310, EP0620844 ou encore EP0832180, sont formés de deux films étanches à l'eau, apposés l'un sur l'autre. A l'interface, la face interne de chacun des deux films est recouverte d'une composition adhésive permettant d'y faire adhérer une fine couche de poudre(s) hydrosoluble(s) à froid. Soit chaque face est recouverte d’une poudre différente, l’une correspondant à une composition de milieu de culture déshydratée et micronisée et l’autre correspondant à un agent gélifiant également micronisé. Soit les deux faces sont recouvertes d’une même poudre formée par un mélange entre une composition de milieu de culture déshydratée et un agent gélifiant, tous deux micronisés.

La réhydratation du milieu se fait par l'échantillon, ou ses dilutions décimales, ou par diluants appropriés (EPT, Tryptone-sel, Letheen, ...) pour les contrôles de surfaces.

Si ces dispositifs Petrifilm™ permettent effectivement une bonne fixation des cellules, ils présentent, par ailleurs, plusieurs inconvénients.

Tout d'abord, ce dispositif nécessite pour sa fabrication d’une étape d'adhésion des nutriments déshydratés sur les films qui ont dû être préalablement encollés. Ainsi une faible couche superficielle de milieu est disponible. Le volume de l'échantillon liquide nécessaire à l'analyse microbiologique ne peut alors excéder 1 ou 2 mL ce qui impacte le seuil de sensibilité de détection. Ensuite, de par son packaging, le Petrifilm™ ne permet pas non plus, d'avoir sur un même dispositif plusieurs milieux de cultures différents. De plus, ce dispositif reste limité dans ses applications et ne peut, par exemple, être utilisé en tant qu'écouvillonnages ou pansements. Et enfin, le Petrifilm™ nécessite obligatoirement l'aide d'un opérateur extérieur apportant l'échantillon aqueux.

La société 3M Company a également déposé la demande de brevet WO2017/019345 qui décrit un dispositif de détection microbienne. Ce dispositif comprend une poche étanche à l'eau qui comprend deux compartiments et une membrane poreuse de filtration disposée dans la poche entre les deux compartiments. Un agent gélifiant soluble dans l'eau, sec, est collé à la poche dans le premier compartiment et un pad absorbant est disposé dans le second compartiment sous la membrane de filtration. Un orifice pouvant être hermétiquement fermé permet de faire passer l'échantillon à analyser dans le premier compartiment. Une fois introduit dans le premier compartiment du dispositif, l'échantillon à analyser diffuse dans le second compartiment du dispositif en passant par la membrane de filtration puis par le pad absorbant. La membrane de filtration permet le passage du liquide du premier compartiment au deuxième compartiment et empêche le passage de particules d'une taille prédéterminée, notamment des microorganismes. L’agent gélifiant permet aux microorganismes présents dans l'échantillon de se développer au niveau de la membrane de filtration lors de l’incubation ce qui permettra par la suite de les dénombrer. Dans un mode de réalisation de cette invention, il est prévu de rajouter des nutriments à l’agent gélifiant dans le dispositif pour favoriser la culture des microorganismes. Le pad absorbant a pour rôle d’absorber la plupart du liquide de l'échantillon afin que l'agent gélifiant ne soit hydraté que par une fraction de l'échantillon liquide. L’échantillon liquide est conservé dans le second compartiment lors de l’incubation.

Ce dispositif présente de nombreux inconvénients. Tout d'abord, comme indiqué de cette demande, le dispositif n’est pas adapté pour l’analyse des volumes supérieurs à 150 mL. Le fait que l’échantillon soit conservé dans le second compartiment limite le volume d’échantillon à analyser. Or selon la Directive européenne n° 98/83/CE du 03/11/98 relative à la qualité des eaux destinées à la consommation humaine, les quantités d’échantillon à analyser sont supérieurs à 150 mL. A titre d’exemple, ce volume est de 250 mL pour des bactéries telles qu Ksche ri chia coli , les Entérocoques ou encore Pseudomonas aeruginosa. Ce dispositif présente également le désavantage de ne pas maîtriser le liquide résiduel présent sur la membrane en cas de volume d’échantillon trop important. Ceci ayant pour effet de générer des nappes de liquide et de provoquer ainsi une diffusion des microorganismes ce qui gênera la détection. A contrario un volume trop faible en échantillon risquerait de créer des bulles d’air dans le dispositif ce qui aura pour conséquence de gêner la mise en contact de l’agent gélifiant et des nutriments avec les microorganismes présents sur la membrane de filtration. Ces bulles d’air pourront également gêner la détection des microorganismes. Enfin ce dispositif présente également des inconvénients dans la gestion des déchets une fois utilisé et de par sa constitution présente également un risque de fuite, si les différents éléments de ce dispositifs sont mal scellés, d’un échantillon à haut risque d’être contaminé. La société japonaise Nissui Pharmaceutical CO., LTD, quant à elle, propose les dispositifs de culture Compact Dry™. Dans ces dispositifs le support de culture microbiologique est formé par une feuille en matériau fibreux absorbant, intégrant dans sa masse une composition nutritive déshydratée, éventuellement également sélective et/ou discriminante (cf. par exemple, EPI 179586).

Pour ce faire, une suspension alcoolique est préparée en mélangeant, dans de l'éthanol, une composition de milieu de culture, un adhésif soluble à la fois dans l'eau et dans l'éthanol (par exemple, le poly[oxyde d'éthylène] et l'hydroxypropylcellulose) et un agent gélifiant soluble dans l'eau mais insoluble dans l'éthanol (par exemple, la gomme de caroube, la gomme de guar, la carragénine, Phydroxyéthylcellulose). Cette suspension alcoolique est utilisée pour imprégner la feuille en matériau fibreux absorbant. Après séchage, ladite feuille forme un support de culture déshydraté, prêt à l'emploi, de longue conservation, activable par simple réhydratation.

Néanmoins, cette méthode, par la mise en solution dans l'eau ou dans un solvant, impacte négativement la durée de conservation du milieu de culture réhydratable. En effet, la mise en suspension de certains produits fragiles, tels que les enzymes, les substrats enzymatiques ou métaboliques, les antibiotiques, peut impacter sévèrement leur stabilité globale. Le chauffage nécessaire au séchage du milieu de culture peut également dénaturer et rendre inefficace les composants thermosensibles du milieu réactionnel. Cette méthode en phase aqueuse ne permet pas non plus de pouvoir maîtriser et faire varier la localisation du milieu réactionnel et/ou des différents additifs nécessaires à la révélation bactérienne.

Ainsi ces milieux de culture qui consistent soit à coller le milieu de culture sous forme déshydratée à un support, afin d'obtenir d'emblée un milieu de culture réhydratable, soit à apporter le milieu de culture sous une forme liquide dans le support puis à sécher l'ensemble, présentent des inconvénients. Afin d’y remédier la Demanderesse a proposé, dans la demande W02015/104501, des dispositifs de culture microbiologique imprégnés à sec par un milieu de culture déshydraté.

Ainsi dans la demande WO2015/104501 la Demanderesse propose des dispositifs de culture microbiologique prêts à l'emploi, dédiés à la détection, à l'identification et/ou à l'énumération de microorganismes. Ces dispositifs sont basés sur un support de culture en matériau fibreux et absorbant, incorporant dans son épaisseur une composition de milieu de culture. Ainsi un milieu de culture déshydratée sous forme de poudre est répandu sur le support de façon homogène puis le support est placé entre deux électrodes en appliquant un certain voltage pendant quelques secondes à une humidité relative. Ensuite le support est calandré en appliquant une pression. Le support est ainsi traversé par de milieu de culture sous forme de poudre.

Malgré des résultats biologiques probants, de tels supports de culture ont été jugés commercialement peu viables à l'heure actuelle, compte tenu, notamment, de la difficulté de mise en œuvre du protocole et du coût de fabrication encore élevé.

La présente invention a ainsi pour objet de proposer un dispositif de culture microbiologique qui, tout en offrant une durée de péremption longue, y compris à température ambiante, procure une réelle alternative aux milieux de culture gélosés traditionnels.

Un autre objectif de la présente invention est de pouvoir proposer un dispositif de culture microbiologique qui soit compatible avec les contraintes d'une exploitation industrielle et commerciale, notamment en termes de coût de production et donc de rentabilité. En effet, en plus d’offrir une durée de péremption longue, la présente invention permet de contrôler la quantité de milieu de culture utilisée en fonction du besoin et de simplifier la mise en œuvre du protocole. En particulier, la présente invention vise à proposer un dispositif de culture microbiologique de conception et de fabrication adaptées aux installations et moyens de production actuellement utilisés dans l'industrie des milieux et dispositifs de culture microbiologique.

La présente invention propose donc un dispositif de culture microbiologique comprenant tout ou partie d’un milieu de culture microbiologique déshydratée sous forme de poudre, caractérisé en ce que :

ledit dispositif comprend au moins deux pièces en matériau hydrophile et absorbant ayant une face supérieure au moins sensiblement plane, et comprenant entre deux pièces contigües ledit milieu de culture microbiologique déshydratée sous forme de poudre, et

ledit milieu de culture microbiologique déshydraté comprend au moins un agent gélifiant sous forme de poudre.

Un autre objet de l’invention concerne un dispositif de culture microbiologique comprenant tout ou partie d’un milieu de culture microbiologique déshydratée sous forme de poudre, caractérisé en ce que : ledit dispositif consiste en au moins deux pièces en matériau hydrophile et absorbant ayant une face supérieure au moins sensiblement plane, et consiste en entre deux pièces contigües ledit milieu de culture microbiologique déshydratée sous forme de poudre, et

ledit milieu de culture microbiologique déshydraté comprend au moins un agent gélifiant sous forme de poudre.

Lors de son utilisation, le dispositif de culture microbiologique selon l’invention doit être hydraté pour être activé. Pour ce faire, le dispositif de culture microbiologique est hydraté par un échantillon liquide qui se trouve être l’échantillon à analyser. Il est également possible d’hydrater le dispositif de culture microbiologique, dans un premier temps, avec un liquide pour l’activer puis de le mettre en contact avec l’échantillon à analyser dans un second temps. Ainsi la composition de milieu de culture comprenant l’agent gélifiant, tous deux initialement présents dans un état sec, sont ainsi solubilisés et activés.

Dans un système réhydraté, le milieu de culture microbiologique et le ou les agents gélifiant solubilisés, vont donner une consistance gélosée au dispositif de culture microbiologique, qui va permettre la distribution des ingrédients nutritifs et des agents actifs du milieu de culture au plus près des microorganismes, favorisant ainsi leur implantation et le cas échéant leur croissance et leur détection.

Avant d’aller plus loin dans la description de l’invention, les définitions ci- après sont données afin de faciliter la compréhension de l’exposé de l’invention.

Dans la présente invention, un milieu de culture microbiologique fait référence à une composition nutritive permettant la croissance et le développement de cellules, plus particulièrement des bactéries, des moisissures et/ou des levures. Ces milieux permettent de répondre aux besoins nutritionnels des microorganismes à cultiver.

Schématiquement, on trouve dans la composition de ces milieux de culture microbiologique :

de l’eau (généralement de l’eau distillée ou déionisée) stérile, au moins un glucide, à titre de source carbonée et d’énergie, ainsi que d’autres éléments nutritifs (notamment, acides aminés, facteurs de croissance, vitamines, minéraux, oligo-éléments, sels de fer, citrate de sodium, chlorure de sodium...) apportés sous la forme de compositions chimiquement complexes telles que des mélanges de peptones (de lait, de viande et/ou de fécules de pomme de terre, de maïs...), des extraits de levures, de sérum, et/ou des extraits de tissus d’origine animale ou végétale...

également divers sels, permettant d’établir une osmolarité adéquate au milieu, et de tamponner le pH.

Un milieu de culture microbiologique au sens de la présente invention peut éventuellement démontrer une certaine sélectivité à l’égard de microorganismes cibles, c’est- à-dire qu’il favorise le développement de ces microorganismes cibles plutôt que celui de la flore annexe, et/ou qu’il inhibe et/ou ralentit le développement de la flore annexe. Cet effet sélectif peut notamment être obtenu grâce à l’emploi d’agents à effet inhibiteur pour la flore annexe ou d’agents à effet activateur pour les microorganismes cibles. Egalement, un milieu de culture au sens de la présente invention peut éventuellement démontrer des aptitudes de discrimination permettant de différencier, de distinguer visuellement les différentes catégories de microorganismes poussant sur ce même milieu de culture. A cet effet, le milieu de culture intègre avantageusement une composante chromogénique et/ou fluorogénique permettant une observation visuelle des microorganismes en fonction d’activités métaboliques particulières qu’ils expriment.

La composition et la formulation de nombreux milieux de culture sont décrites notamment dans 1 e HANDBOOK OF MICROBIOLOGICAL MEDIA (2010 ; 4 ^eme Edition).

Dans le cadre de la présente invention, le milieu de culture est déshydraté et sous forme de poudre. On entend par poudre, des particules ayant une granulométrie de 1 à 200 pm. Une micronisation des composés minoritaires tels que les substrats, antibiotiques, est possible pour parfaire l'homogénéisation de la poudre.

Dans le cadre de la présente invention, le milieu de culture déshydraté est directement en contact avec les deux pièces en matériau hydrophile et absorbant.

Avantageusement, la quantité de milieu de culture déshydratée sous forme de poudre est comprise entre 0.009 g.cm ³ et 0.050 g.cm ³ de préférence entre 0.020 g. cm ³ et 0.036 g.cm ³ , plus préférentiellement entre 0.018 g.cm ³ et 0.022 g.cm ³

Ainsi la présente invention a pour avantage de permettre une croissance optimisée notamment due à la quantité optimale de milieu culture sans nécessiter de mettre le milieu de culture en excès pour permettre une croissance des microorganismes. Ceci pallie ainsi à l’un des inconvénients de l’art antérieur, en effet, un excès de nutriments qui composent le milieu de culture peut se révéler toxique pour les bactéries, empêchant ainsi leur croissance et leur détection. De plus cet ajout en excès du milieu de culture constitue également un inconvénient en termes de coût de production.

Dans le cadre de la présente invention, le milieu de culture comprend en outre au moins un agent gélifiant également sous forme de poudre. Une fois activé, réhydraté, par un échantillon aqueux ou par un liquide, le ou les agents gélifiants vont permettre de créer un ensemble présentant une certaine intégrité structurelle et cohérence mécanique. De plus, du fait de leur présence au contact du milieu de culture, le ou les agents gélifiants vont donner au dispositif microbiologique selon l’invention une consistance gélosée favorisant ainsi l’implantation des microorganismes et vont également permettre aux éléments constituants le milieu de culture, tels que les ingrédients nutritifs ou les agents actifs, de se retrouver au plus près des microorganismes.

Avantageusement, l’agent gélifiant est choisi parmi : une gomme de xanthane, l’alginate, une gomme de gellane, une gomme de galactomannane, de gomme de graine de caroube, l’amidon, et un mélange de ceux-ci.

Préférentiellement, le milieu de culture du dispositif selon l'invention comprend au moins un gélifiant dont la quantité est comprise entre 0.0030 g.cm ³ et 0.020 g.cm ³ .

On entend par échantillon un prélèvement, ou une petite partie ou petite quantité de ce prélèvement, effectué à des fins d’analyse. L’échantillon peut être un échantillon d’origine biologique contenant ou suspecté de contenir des microorganismes à détecter, dénombrer, identifier et/ou caractériser. Ces échantillons biologiques peuvent être d’origine humaine, animale, végétale ou environnementale. L’échantillon peut également avoir une origine industrielle et provenir de prélèvements opérés sur un produit manufacturé (par exemple un produit alimentaire) ou un produit en cours de fabrication, ou sur des instruments, des installations rencontrés dans un environnement industriel. Les secteurs industriels visés ici sont plus particulièrement les industries agroalimentaire, pharmaceutique, cosmétique et vétérinaire, les dispositifs médicaux, la microbiologie des contrôles environnementaux (eaux, air, surfaces).

Comme indiqué précédemment, dans le cadre de l’invention, l'échantillon est liquide et va permettre la réhydratation du dispositif de culture microbiologique, notamment la réhydratation du milieu de culture et des pièces en matériau hydrophile et absorbant. Ceci va permettre de conserver le dispositif humide et permettre ainsi la migration des nutriments dans ce dispositif.

Selon un autre mode de réalisation, un volume approprié de liquide est ajouté à l'échantillon et/ou au dispositif de culture microbiologique afin de réhydrater le milieu de culture, lorsque l'échantillon n'est pas liquide ou insuffisamment liquide. En pratique, l'homme du métier choisira le volume approprié de liquide ou de l'échantillon aqueux en fonction de sa viscosité, du diamètre, de la porosité et de la capacité d’absorption du support poreux, de la quantité de poudre (milieu de culture et agent gélifiant) ceci afin de réhydrater le dispositif et permettre la croissance des microorganismes.

Avantageusement, la réhydratation du dispositif de culture microbiologique nécessite un volume de liquide ou d'échantillon aqueux supérieur à 1 mL, préférentiellement supérieur à 3 mL, encore préférentiellement supérieur à 4 mL, ce qui permet d'améliorer la sensibilité de détection lorsque les microorganismes sont en faible concentration dans l'échantillon.

Selon la présente invention, l'échantillon peut comprendre une étape préalable de préparation, concentration ou dilution de l'échantillon.

Au sens de la présente invention, le terme microorganisme recouvre les bactéries à Gram positif ou Gram négatif, les levures, les moisissures, les amibes et plus généralement, les organismes unicellulaires, invisibles à l'œil nu, qui peuvent être manipulés et multipliés en laboratoire.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le microorganisme est une bactérie, à Gram positif ou négatif, une levure ou une moisissure.

A titre d’exemples de bactéries à Gram positif, on peut citer les bactéries des genres suivants : Enterococcus , Streptococcus, Lactobacillus , Bifidobacterium , Staphylococcus, Bacillus , Listeria , Clostridium , Mycobacteria , Nocardia , Corynebacteria , Micrococcus et Deinococcus.

A titre d’exemples de bactéries à Gram négatif on peut citer les bactéries des genres suivants : Salmonella , Escherichia coli et Pseudomonas.

A titre d’exemples de levures, on peut citer les levures des genres suivants : Candida , Cryptococcus , Saccharomyces et Trichosporon.

A titre d’exemples de moisissures, on peut citer les moisissures des genres suivants : Aspergillus, Pénicillium , Cladosporium. Selon la présente invention, le dispositif de culture microbiologique comprend ou consiste en au moins deux pièces en matériau hydrophile et absorbant.

De nombreux matériaux absorbants, hydrophiles et non hydrosolubles, peuvent être utilisés pour réaliser la pièce en matériau absorbant d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention. Ces matériaux sont principalement choisis pour leur pouvoir absorbant, leur capacité de rétention des liquides aqueux et leur faculté à laisser les liquides aqueux les traverser dans tous les sens .

Avantageusement et selon l'invention, ladite pièce en matériau absorbant est réalisée à partir d'un substrat de fibres courtes non-tissées, constituant un ensemble ayant une intégrité structurelle et une cohérence mécanique. Les substrats particulièrement adaptés sont en fibre cellulosique naturelle (comme le coton) ou synthétique (comme la rayonne), en fibre cellulosique modifiée (par exemple, la carboxyméthylcellulose, la nitrocellulose), en fibre de polymères chimiques absorbants (tels que les sels de polyacrylate, les copolymères acrylate/acrylamide). Selon un mode de réalisation préféré, ladite pièce en matériau absorbant est en textile non-tissé réalisé en fibres de cellulose.

Dans le cadre de la présente invention, les pièces en matériau hydrophile et absorbant d’un même dispositif peuvent avoir la même masse volumique ou avoir une masse volumique différente. De même, les pièces en matériau hydrophile et absorbant d’un même dispositif de culture microbiologique selon l’invention peuvent présenter une épaisseur identique ou différente.

Avantageusement, la pièce en matériau hydrophile et absorbant aura une masse volumique comprise entre comprise entre 0,045 g.cm ³ et 0, 10 g. cm ³ , préférentiellement entre 0,05 g.cm ³ et 0,07 g.cm ³ .

Les pièces en matériau hydrophile et absorbant d’un même dispositif de culture microbiologique selon l’invention peuvent présenter une épaisseur comprise entre 0,5 mm et 2 mm. Préférentiellement, la pièce en matériau hydrophile et absorbant a une épaisseur de 0,8 mm à 1,8 mm, encore préférentiellement de 1 à 1,5 mm. La surface de la pièce en matériau hydrophile et absorbant est comprise entre 1 cm ² et 40 cm ² préférentiellement entre 10 cm ² et 30 cm ² , plus préférentiellement entre 15 cm ² et 25 cm ² .

La pièce en matériau hydrophile et absorbant est apte à retenir un volume d'eau supérieur à 2 mL, préférentiellement supérieur à 3 mL. Ainsi, un support poreux de 25 cm ² de surface et une épaisseur de 1 mm après calandrage aura la capacité à retenir un volume d'eau de 3 mL.

Avantageusement, et selon l’invention, le dispositif de culture microbiologique a subi une opération de calandrage. Le calandrage, par la pression et la température de chauffe générées, permet la rétention et le maintien stable dans le temps du milieu réactionnel déshydraté comprenant le ou les agents gélifiants dans le dispositif de culture microbiologique, en assurant la rétention des différents éléments tels que les éléments nutritifs entre les pièces en matériau hydrophile et absorbant. Il permet également l'obtention d'une surface supérieure rigoureusement lisse et plane du dispositif de culture microbiologique.

Préférentiellement le calandrage se fait à une température supérieure à la température ambiante, préférentiellement à une température comprise entre 30°C et 60°C. Une température inférieure à 60°C permet de ne pas dénaturer les composés thermolabiles du milieu de culture. Le calandrage permet, outre l'accélération de la réhydratation du dispositif de culture microbiologique par rapport à un dispositif de culture microbiologique non- calandré, une compression des fibres constituant le dispositif de culture microbiologique. Cette compression, associée à la présence du milieu déshydraté au sein du dispositif permet une rehydratation simultanée dans toutes les zones du dispositif placées horizontalement et préserve ainsi la répartition des substances.

Le calandrage permet ainsi de maintenir le milieu réactionnel à l'intérieur du dispositif de culture microbiologique et rend sa manipulation aisée.

De façon préférentielle, le dispositif comprend au moins une couche supérieure protectrice. Préférentiellement, la ou les couches protectrices sont disposées sur la face de la pièce en matériau hydrophile et absorbant qui n’est pas en contact avec le milieu de culture. Dans ce mode de réalisation, aucune autre couche n'est disposée entre couche protectrice et la face de la ou des pièces en matériau hydrophile et absorbant. De préférence la couche protectrice est placée directement sur le dispositif de culture microbiologique. L’Homme du métier saura définir un espace suffisant entre la couche protectrice et le dispositif de culture pour avoir suffisamment d’oxygène pour permettre la croissance microbienne.

La couche protectrice peut être translucide ou transparente permettant la visibilité des colonies au travers de cette couche. Cette dernière doit être compatible avec la physiologie microbienne. Elle permet notament d'éviter les contaminations au cours de l'incubation. Elle est imperméable aux bactéries et limite la perte de vapeur d'eau. En effet, le dispositif est incubé pendant un temps et à une température prédéterminés permettant la croissance des microorganismes indépendamment des conditions d'humidité ambiante. Ainsi, la nature de la couche supérieure est choisie de façon à permettre les échanges gazeux nécessaires à la croissance des microorganismes tout en permettant une hydratation locale.

Selon un autre mode de réalisation préférentielle de l’invention, le dispositif comprend une membrane de filtration microbiologique qui recouvre au moins l’une des pièce en matériau hydrophile et absorbant supérieure du dispositif. Autrement dit la une membrane de filtration microbiologique recouvre la face d’un moins une des pièces en matériau hydrophile et absorbant qui n’est pas en contact avec le milieu de culture.

Selon la présente invention une membrane de filtration microbiologique est un filtre qui est perméable à l'eau et qui retient les microorganismes, notamment à sa surface. Cette membrane est également perméable aux éléments nutritifs du milieu de culture et aux éventuels éléments additifs compris dans ce milieu de culture situé, entre deux pièces sous la membrane de filtration microbiologique. Cette membrane peut comprendre un corps poreux qui peut être constitué par un matériau qui par sa nature, sa taille, son arrangement stérique possède ces propriétés. Ce corps poreux peut avoir ces propriétés par l'aménagement de pores. La membrane de filtration microbiologique peut par exemple être à base de un ou plusieurs matériaux, ou dérivés de ces matériaux, parmi le latex, le polytetrafluoroethylene, le poly(vinylidene) fluoride, le polycarbonate, le polystyrène, le polyamide, le polysulphone, le polyethersulfone, la cellulose, un mélange de celluloses et nitrocellulose. Préférentiellement la membrane de filtration microbiologique est réalisée sous la forme d'une membrane poreuse perméable aux éléments nutritifs et des éventuels éléments additifs compris dans le milieu de culture, et apte à retenir les microorganismes à sa surface. De préférence, la membrane de filtration microbiologique recouvre toute la surface supérieure du dispositif de culture microbiologique. Les membranes de microfiltration de l'eau (et d'une manière générale des liquides) actuellement commercialisées présentent généralement les propriétés requises pour être utilisées comme membrane de filtration microbiologique. Elles permettent d'obtenir une très bonne résistance au déchirement lors de la manipulation, une porosité maîtrisée, une surface lisse, une fine épaisseur et la plupart du temps une forte hydrophilie. Leur couleur, généralement blanche, mais peut également être noire, permet d'optimiser la différentiation de colonies colorées sur leur surface. La capacité de filtration et l'hydrophilie d'une telle membrane de filtration, quant à elles, sont mises à profit pour permettre et optimiser le passage des éléments nutritifs et des éventuels éléments additifs présents dans le milieu de culture (éventuellement après sa réhydratation) vers une surface supérieure de la membrane de filtration microbiologique tout en empêchant ou limitant la migration en sens inverse des microorganismes filtrés à la surface supérieure de la membrane de filtration microbiologique.

Aux fins de la présente demande, les susdites membranes de filtration sont indifféremment désignées membranes de filtration, membranes de microfiltration ou encore membranes filtrantes, ces expressions étant synonymes les unes des autres. Ces membranes de filtration sont comprises dans le groupe constitué par les membranes poreuses.

La membrane de filtration microbiologique permet le passage des éléments du milieu nutritif et des agents sélectifs ou réactifs tout en empêchant ou limitant la migration des microorganismes vers les couches sous-jacentes, notamment dans les pièces en matériau hydrophile et absorbant. Avantageusement, la membrane de filtration microbiologique comporte des pores dont le diamètre est compris entre 0,01 et 0,8 pm préférentiellement entre 0,2 pm et 0,6 pm de manière à retenir les microorganismes sur sa surface. Selon un mode de réalisation particulier, la membrane de filtration microbiologique comporte des pores dont le diamètre est compris entre 0,25 pm et 0,5 pm, par exemple entre 0,3 pm et 0,45 pm, ou encore entre 0,35 pm et 0,4 pm. Alternativement, il peut s'agir d'une couche ne présentant pas de pores mesurables comme une membrane de dialyse.

Par exemple, la membrane de filtration microbiologique peut être une membrane de filtration Fisherbrand™ General Filtration Membrane Filters commercialisées par Fisher Scientific Company L.L.C, 300 Industry Drive, Pittsburgh, PA 15275, USA, ou encore une membrane de filtration Nitocellulose Membrane Filters, fabriquée par Zefon International, Inc., 5350 SW I ^st Lane, Ocala, FL 34474, USA, ou des membranes analogues.

Dans le mode de réalisation de l’invention où le dispositif comprend une membrane de filtration microbiologique qui recouvre au moins l’une des pièce en matériau hydrophile et absorbant, ledit dispositif ne comprend pas une couche supérieure protectrice.

Selon un mode de réalisation préférentielle de l’invention, la pièce en matériau hydrophile et absorbant supérieure du dispositif est recouverte par une couche superficielle. Tout comme pour la membrane de filtration microbiologique, la couche superficielle recouvre la face d’au moins une des pièces en matériau hydrophile et absorbant qui n’est pas en contact avec le milieu de culture. Cette couche superficielle a pour fonction de bloquer la diffusion des microorganismes vers les couches sous-jacentes mais également pour certaines applications de permettre les opérations d’isolement et d’étalement des cellules. Cette couche superficielle est également déshydratée.

Une couche superficielle déshydratée selon l’invention peut notamment être telle que décrite dans les demandes W02014/013089, WO 2015/107228 ou encore WO2018/197805.

Dans la demande W02014/013089, cette couche superficielle déshydratée est une membrane de (micro)filtration aux pores étroites, réalisée en latex, en polytétrafluoroéthylène, en poly(vinylidène) fluoride, en polycarbonate, en polystyrène, en polyamide, en polysulfone, en polyéthersulfone, cellulose et/ou en nitrocellulose. Dans le cas de WO2015/107228, la couche superficielle est obtenue à partir d’un mélange de pigments de kaolin, de talc, de dioxyde de titane, et/ou de carbonate de calcium, et d’un liant de type latex styrène butadiène, latex styrène acrylique ou carboxyle méthyle cellulose. Dans le cas de WO2018/197805, la couche superficielle consiste en un hydrogel polysaccharidique déshydraté ayant la particularité d’être réhydratable à température ambiante.

Ces couches superficielles déshydratées ainsi décrites peuvent donc être reprises telles quelles pour être utilisées dans la conception des dispositifs de culture microbiologique selon la présente invention.

La couche superficielle déshydratée selon l’invention, procure à la surface du dispositif de culture microbiologique un effet de lubrification qui facilite les opérations mécaniques d'étalement et de dispersion des cellules. Egalement, par sa consistance gélosée, elle favorise l'implantation des microorganismes au plus près des ingrédients nutritifs et des agents actifs du milieu de culture. Quant au dispositif microbiologique sous-jacent, outre son rôle dans la conservation et la distribution de la composition de milieu de culture, sa structure participe à la rigidité et la fermeté globales de la surface du dispositif de culture microbiologique, assurant sa compatibilité à l'égard des forces de pression et de friction qu'exercent les outils et instrumentations utilisés pour étaler et disperser les cellules.

Selon un autre mode de réalisation particulier de l’invention, lorsque le dispositif de culture microbiologique comprend une membrane de filtration microbiologique ou une couche superficielle qui recouvre la face d’au moins une des pièces en matériau hydrophile et absorbant du dispositif microbiologique, ce dernier peut également comprendre une membrane perméable intercalaire entre la pièce en matériau hydrophile et absorbant et la membrane de filtration microbiologique ou la couche superficielle.

La composition, la conception et l'épaisseur de cette membrane perméable intercalaire sont choisies de sorte que cette dernière entrave le moins possible le passage de G échantillon aqueux à travers les différentes couches du dispositif de culture microbiologique. A cet égard, elle peut être réalisée à partir d'un substrat en fibre cellulosique naturelle (comme le coton) ou synthétique (comme la rayonne), en fibre cellulosique modifiée (par exemple, la carboxyméthylcellulose, la nitrocellulose), en fibre de polymères chimiques absorbants (tels que les sels de polyacrylate, les copolymères acrylate/acrylamide) ou en fibres protéiques stables (comme la soie, la laine).

Dans le cadre de la présente invention, cette membrane perméable, optionnelle, peut être utilisée à des fins très diverses, comme par exemple :

pour apporter un renfort mécanique et/ou une rigidité supplémentaire à l'ensemble du système,

pour faire office de couche réservoir pour la conservation de composés particuliers, destinés à être mélangés à la composition de milieu de culture solubilisée en provenance du dispositif de culture microbiologique, ou

pour améliorer le contraste et l'observation des colonies poussant à la surface du dispositif de culture microbiologique.

Selon un mode particulier de réalisation, ladite membrane perméable intercalaire est utilisée en vue d'améliorer le contraste et l'observation des colonies poussant à la surface du dispositif de culture microbiologique. A cet effet, elle est choisie suffisamment opaque à la lumière et d'une grande blancheur (par exemple, une blancheur CIE au moins égale à 65).

La conception des dispositifs de culture microbiologique selon l'invention et les modalités d'utilisation de ceux-ci permettent aux principaux éléments constitutifs, tels que notamment :

les au moins deux pièces en matériau hydrophile et absorbant comprenant entres elles un milieu de culture microbiologique déshydratée sous forme de poudre, et optionnellement

la membrane perméable intercalaire et/ou

la membrane de filtration, ou la couche superficielle déshydratée,

de pouvoir avantageusement être fabriqués, conditionnés et stockés séparément et de manière totalement indépendante. Ceci représente un réel atout industriel, tant d'un point de vue commercial que logistique. Ceci représente également un avantage significatif pour l'utilisateur qui dispose de la possibilité de combiner à dessein les différents éléments constitutifs du dispositif de culture microbiologique selon l'invention, et d'adapter par lui- même le dispositif de culture microbiologique aux microorganismes auxquels il porte un intérêt tout particulier.

De façon similaire, un dispositif de culture microbiologique selon l'invention peut être conditionné et commercialisé sous différentes formes, notamment :

un dispositif de culture microbiologique, composite, préalablement monté et assemblé, dans lequel il est surmontée d’une membrane de filtration microbiologique avec ou non une membrane perméable intercalaire ;

un dispositif de culture microbiologique, composite, préalablement monté et assemblé, dans lequel il est surmontée d’une couche superficielle déshydratée avec ou non une membrane perméable intercalaire ;

un dispositif de culture microbiologique en kit, que l'utilisateur assemblera par lui-même ; un tel kit comprend au moins un dispositif de culture microbiologique selon l'invention, avec optionnellement au moins une membrane perméable intercalaire et/ou au moins une membrane de filtration microbiologique ou au moins une couche superficielle déshydratée.

Dans un mode de réalisation particulier, le dispositif de culture microbiologique selon l'invention est utilisé en tant que support hydratant comprenant un milieu réactionnel dans un dispositif d’analyse pour hydrater, par un échantillon liquide, ce support hydratant. Un tel dispositif est décrit, par exemple, dans la demande WO2016/193647.

Dans un autre mode de réalisation particulier, le dispositif de culture microbiologique selon l'invention est utilisé dans un dispositif de contrôle microbiologique, pour contrôler un liquide. Un tel dispositif est décrit, par exemple, dans la demande WO2018/189478 ou encore dans la demande PCT/FR2020/000076.

Dans ce dernier mode de réalisation, le dispositif de contrôle microbiologique peut être couplé à une membrane de filtration, telle que décrite ci-dessus, dans le dispositif de contrôle microbiologique. Ce dispositif de contrôle microbiologique permet de réaliser des opérations de contrôle simplifiées d’un liquide à analyser susceptible de contenir au moins un microorganisme, et ce même en dehors d’un laboratoire microbiologique, y compris dans une environnement industriel.

L’invention concerne également un procédé de détection et/ou d’identification et/ou d’énumération, d'au moins un microorganisme cible dans un échantillon aqueux susceptible de le contenir, comprenant les étapes suivantes :

a. fournir un dispositif de culture microbiologique pour la détection et/ou l'identification et/ou l'énumération de microorganismes selon l’invention, b. mettre en contact ledit échantillon aqueux avec ledit dispositif de culture microbiologique selon l’invention,

c. incuber le dispositif de culture microbiologique,

d. détecter et/ou identifier et/ou énumérer la ou les colonies de microorganismes au sein du dispositif de culture microbiologique, lorsque les microorganismes recherchés sont présents dans l'échantillon.

Selon l'invention, le dispositif de culture microbiologique est mis en contact avec l'échantillon.

L'échantillon aqueux peut être ajouté manuellement à l'aide d'une pipette, d’une seringue ou automatiquement dans le dispositif. Il peut également être contenu dans au moins un réservoir intégré au dispositif et/ou des canaux permettant la réhydratation du dispositif de culture microbiologique. Il se répand alors dans le dispositif de culture microbiologique par simple pression du réservoir.

Dans un mode de réalisation, il n'y a pas d'intervention humaine et l'échantillon aqueux provient directement d'une zone productrice du liquide à tester. Il peut s'agir par exemple d'une plaie exsudative, de denrées alimentaires relarguant des liquides pendant leur stockage. L'échantillon, de par sa nature, va libérer une partie de ses liquides constitutifs qui vont au cours du temps imbiber le dispositif de culture microbiologique. La zone productrice de l’échantillon à tester peut également être une zone périnéale des humains ou animaux excrétant de l'urine. Le dispositif de culture microbiologique est alors mis à proximité de cette zone et est imprégné progressivement par l'échantillon aqueux produit.

Dans un autre mode de réalisation, la mise en contact de l'échantillon avec le dispositif de culture microbiologique se fait par prélèvement de l'échantillon à l'aide du dispositif de culture microbiologique. Le dispositif de culture microbiologique est alors utilisé comme écouvillon et l'opérateur devra placer ce dernier dans un tube contenant la quantité adéquat de liquide si l'échantillon n'est pas aqueux ou insuffisamment aqueux.

Le dispositif est ensuite incubé in situ (cas du pansements, de la couche culotte..) ou en incubateur durant un laps de temps suffisant pour permettre la détection des colonies microbiennes au sein de du dispositif de culture microbiologique.

Selon un mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention est un procédé de détection qui peut être mis en œuvre par lecture visuelle ou optique du dispositif de culture microbiologique.

L’invention concerne également l’utilisation d'un dispositif de culture microbiologique selon l’invention, pour détecter et/ou identifier et/ou énumérer au moins un microorganisme cible dans un échantillon susceptible de le contenir.

Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation d'un dispositif comprenant une tige à l'extrémité de laquelle ledit support poreux est fixé, en tant qu'écouvillon.

Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'un dispositif selon l'invention en tant que pansement.

Suivant un autre mode de réalisation, l'invention concerne également l'utilisation d'un dispositif selon l'invention en tant que couche culotte.

Encore dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'un dispositif selon l'invention en tant que conditionnement de denrées alimentaires.

D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront au vu de la description qui va suivre et des exemples développés ci-après, qui se réfèrent aux figures annexées et dans lesquelles :

[Fig. l] est une représentation schématisée d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention ;

[Fig.2] est une représentation schématisée d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention comprenant en outre une membrane de filtration microbiologique ;

[Fig.3] est une représentation schématisée d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention comprenant en outre une couche superficielle ; [Fig.4] est une représentation schématisée d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention comprenant en outre une membrane de filtration microbiologique et une membrane intercalaire perméable ;

[Fig.5] est une représentation schématisée d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention comprenant en outre une couche superficielle et une membrane intercalaire perméable ;

[Fig.6] est une représentation schématisée d’un dispositif de culture microbiologique IA selon l'invention avant et après hydratation par l’échantillon aqueux ;

[Fig.7] est une représentation schématisée d’un dispositif de culture microbiologique IB ou 1D selon l'invention avant et après hydratation par l’échantillon aqueux ;

[Fig.8] est une représentation schématisée d’un dispositif de culture microbiologique IC ou 1E selon l'invention avant et après hydratation par l’eau ;

[Fig.9] est une représentation schématisée en perspective éclatée d’un dispositif de contrôle microbiologique pour contrôler un liquide comprenant un dispositif de culture microbiologique selon l'invention et une membrane de filtration microbiologique ;

[Fig.10] est une représentation schématisée en perspective du dispositif de contrôle microbiologique, assemblé ;

[Fig.11], photographies de cultures d'Escherichia coli effectuées sur le dispositif de culture microbiologique 1 A, selon l’invention.

[Fig.12], photographies de cultures d Escherichia coli effectuées sur le dispositif de culture microbiologique 1 A, selon l’invention.

[Fig.13], photographies de cultures et d’isolements d Escherichia coli et d nterococcus faecalis effectués sur le dispositif de culture microbiologique IC selon l’invention.

Ces exemples ont pour but de faciliter la compréhension de l'invention, sa mise en œuvre et son utilisation. Ces exemples sont donnés à titre explicatif et ne sauraient limiter la portée de l'invention. EXEMPLES

I. Dispositifs de culture microbiologique selon l'invention et principe général d'utilisation

Tel que représenté à la Figure 1, un dispositif de culture microbiologique 1 A selon l'invention se compose, en premier lieu, deux pièces en matériau hydrophile et absorbant 2 et 2’, plus ou moins épaisses et d'un milieu de culture microbiologique déshydratée 3 sous forme de poudre comprenant au moins un agent gélifiant 4 sous forme de poudre également. Dans les exemples représentés, ces pièces en matériau absorbant 2 et 2’ sont de forme sensiblement circulaires.

Les pièces en matériau absorbant 2 et 2’, réalisées en matériau hydrophile et non hydrosoluble, comprennent entre deux pièces contiguës une composition de milieu de culture déshydratée 3 sous forme de poudre. Cette composition de milieu de culture comprend au moins un agent gélifiant 4 sous forme de poudre.

Sur la Figure 2, le dispositif de culture microbiologique IB selon un mode de réalisation de l’invention comprend deux pièces en matériau absorbant 2 et 2’, un milieu de culture 3 sous forme de poudre comprenant lui-même au moins un agent gélifiant 4 sous forme de poudre et une membrane de filtration microbiologique 5.

La membrane de filtration microbiologique est réalisée sous la forme d'une membrane poreuse perméable aux éléments nutritifs et des éventuels éléments additifs compris dans le milieu de culture, et apte à retenir les microorganismes à sa surface.

Sur la figure 3, le dispositif de culture microbiologique IC selon un autre mode de réalisation de l’invention comprend deux pièces en matériau absorbant 2 et 2’, un milieu de culture 3 sous forme de poudre comprenant lui-même au moins un agent gélifiant 4 sous forme de poudre et une couche superficielle déshydratée 6.

La couche superficielle déshydratée 6 est un feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté. Il est formé par séchage/déshydratation d'une couche d'hydrogel polysaccharidique, et sa structure mécanique peut être renforcée au moyen d'une armature fibreuse, par exemple un tissé.

Sur la figure 4, le dispositif de culture microbiologique 1D selon encore un autre mode de réalisation de l’invention comprend deux pièces en matériau hydrophile et absorbant 2 et 2’, un milieu de culture 3 sous forme de poudre comprenant lui-même au moins un agent gélifiant 4 sous forme de poudre, une membrane de filtration microbiologique 5 et une membrane perméable intercalaire 7. Cette dernière a une blancheur CIE au moins égale à 65.

Sur la figure 5, le dispositif de culture microbiologique 1E selon encore un autre mode de réalisation de l’invention comprend deux pièces en matériau hydrophile et absorbant 2 et 2’, un milieu de culture 3 sous forme de poudre comprenant lui-même au moins un agent gélifiant 4 sous forme de poudre, une couche superficielle déshydratée 6 et une membrane perméable intercalaire 7.

La couche superficielle déshydratée 6 est un feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté et la membrane perméable intercalaire 7 a une blancheur CIE au moins égale à 65.

Les dispositifs de culture microbiologique IA, IB, IC, 1D et 1E selon l’invention, peuvent être fournis déjà préassemblés, solidarisés, ou bien alors sous la forme d’éléments distincts et indépendants : les pièces en matériau hydrophile et absorbant, la membrane de filtration, la couche superficielle, la membrane perméable intercalaire et les poudres de milieux de culture et d’agents gélifiant.

A titre de caractéristique secondaire, un réceptacle 8 (Figures 6, 7 ou 8) est associé au dispositif de culture microbiologique pour en faciliter la manipulation, notamment pour l'étape de réhydratation et activation du dispositif, et pour tout déplacement (par exemple, un transfert de la paillasse à l'incubateur). L'utilisation d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention nécessite une activation du dispositif grâce à une hydratation par un échantillon aqueux 9.

Ainsi sur la Figure 6, le dispositif de culture microbiologique IA selon l'invention est placé à l'intérieur du réceptacle 8, avec l’une des deux pièces en matériau hydrophile et absorbant 2 ou 2’ tournée vers le haut. Le réceptacle 8 étant de plus grande surface que celle du dispositif de culture, on verse l’échantillon 9 sur le dispositif microbiologique dans le réceptacle 8. Le volume d'eau utilisé est plus ou moins calibré pour pouvoir humidifier suffisamment le dispositif IA et solubiliser la composition de milieu de culture qu'elle renferme.

Sur la Figure 7, le dispositif de culture microbiologique IB ou 1D est placé à l'intérieur du réceptacle 8, avec la membrane de filtration microbiologique 5 tournée vers le haut. Comme précédemment, on verse l’échantillon 9 sur cette membrane de filtration microbiologique 5 positionnée sur le dispositif microbiologique dans le réceptacle 8. Le volume d'eau utilisé est plus ou moins calibré pour pouvoir humidifier suffisamment le dispositif et solubiliser la composition de milieu de culture qu'elle renferme.

Au cours de l'activation d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention, l'hydratation des différents dispositifs de culture microbiologique, décrits ci- dessus, permet, de solubiliser la composition de milieu de culture 3 ainsi que l’agent gélifiant 4 contenus entre deux pièces en matériau hydrophile et absorbant.

Sur la Figure 8, le dispositif de culture microbiologique IC ou 1E, selon l'invention est placé à l'intérieur du réceptacle 8, avec le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 6 tourné vers le haut. Puis on verse l'eau 9’ dans le réceptacle 9 en prenant soin de ne pas en verser directement sur le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 6. Le volume d'eau utilisé est plus ou moins calibré pour pouvoir humidifier suffisamment la pièce en matériau absorbant 1 et solubiliser la composition de milieu de culture qu'elle renferme.

Une autre façon d'opérer consiste à verser dans le fond du réceptacle 8, le volume d'eau approprié, puis d'y déposer le dispositif de culture microbiologique surmonté du feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 6. On prendra soin de ne pas placer le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 6 directement en contact avec l'eau libre, de façon à ce que le dispositif soit effectivement hydraté uniquement par la pièce en matériau absorbant 2

Lorsque le dispositif de culture microbiologique selon l'invention est fourni avec le dispositif de culture microbiologique et le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 2 sous la forme de deux éléments mécaniquement indépendants, l'étape d'hydratation peut alors être réalisée d'une troisième manière le dispositif de culture microbiologique, sans le feuillet, est alors placé à l'intérieur du réceptacle 8. Dans le réceptacle 8 et éventuellement directement sur ce dispositif de culture microbiologique, on verse une quantité d'eau 9’ suffisante pour bien imbiber le dispositif de culture microbiologique. On vient ensuite en recouvrir la surface avec le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 6

Au cours de l'activation d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention, l'hydratation par les pièces en matériau hydrophile et absorbant 2 et 2’ permettent, dans un premier temps, de solubiliser la composition de milieu de culture contenue entre ces deux pièces. Dans un deuxième temps, cette activation se poursuit par l'hydratation du feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 6, positionné sur la surface le dispositif de culture microbiologique. Cette réhydratation du feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 6 fait apparaître, à la surface de la pièce en matériau hydrophile et absorbant 2, une couche d'hydrogel polysaccharidique réhydraté et gonflé, non pas simplement par l'eau provenant de la pièce en matériau absorbant 2 mais plutôt par une solution de milieu de culture compris entre les deux pièce en matériau hydrophile et absorbant 2 et 2’.

Ainsi activé, par sa consistance et sa texture bien particulières, le dispositif de culture microbiologique selon l'invention permet de créer une surface de culture, à la fois lubrifiée et adhérente pour les cellules, apte à recevoir les microorganismes et de permettre le cas échéant leur isolement par des opérations et moyens mécaniques habituellement utilisés pour étaler les cellules sur la surface d'un milieu gélosé classique. Par ailleurs, du fait de sa grande exposition aux échanges gazeux et aux phénomènes d'assèchement et à ses propriétés hyper-absorbantes, ce dispositif va pouvoir s'auto-suffire, tout au long de la période d'incubation et de façon continue, de la solution de milieu de culture.

Une fois l'échantillon inoculé sur le dispositif, l'ensemble est incubé à une température et pour une durée établies, avant lecture des résultats.

Lorsque le dispositif microbiologique selon l’invention comprend une couche superficielle, tel qu’un feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 6, des opérations d'étalement et de dispersion des cellules peuvent être réalisées au moyen d'une oese, par exemple.

IL Eléments constitutifs d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention

1. Pièces en matériau hydrophile et absorbant

S'agissant des pièces en matériau absorbant 2 et 2’ entrant dans la constitution d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention, celles-ci sont façonnées à partir d'un support tridimensionnel, de structure ouverte, poreuse, apte à recevoir en son sein, aussi bien un liquide (en particulier, un échantillon aqueux) que des particules solides de granulométrie adaptée.

Pour les exemples et les essais qui vont suivre, les dispositifs de culture microbiologique testés comprennent deux pièces en matériau hydrophile et absorbant, confectionnées à partir du non-tissé Airlaid SCA95NN81, de la compagnie SCA (Suède). Il s’agit d’un non-tissé bicomposant PET/CoPET (Polyester/coPolyester). Deux pièces en matériau hydrophile et absorbant de masse surfacique et d’épaisseur différentes ont été utilisées. Le premier se caractérise par une masse surfacique de l'ordre de 95 g.m ² pour une épaisseur de 2 mm. Le second possède une masse surfacique de l'ordre de 50 g.m ² pour une épaisseur de 0,76 mm. A partir de ces non-tissé, des pièces circulaires d'à peu près 45 mm de diamètre ont été découpées.

2. Milieu de culture formulés sous forme de poudre

En vue de tester les dispositifs de culture microbiologique selon l'invention, un milieu de culture gélosé distribués par la société bioMérieux (France), a été utilisé. Il s'agit plus particulièrement d’un milieu de la gamme chromID ^® , le chromID ^® CPS Elite. Ce milieu est utilisé pour l’isolement, la numération et l’identification directe de Escherichia coli , d'Enterocoques, de Proteus et du groupe KESC ( Klebsiella , Enterobacter , Serratia, Citrobacter )

Les dispositifs de culture microbiologique selon l'invention, ainsi élaborés, ont alors pu être testés pour la détection, l'isolement, la numération ou encore l’identification de bactéries telles que Escherichia coli et Enterococcus faecalis.

3. Agent gélifiant sous forme de poudre

En vue de tester les dispositifs de culture microbiologique selon l'invention, la gomme de xanthane Mataxan 25 pm (Alliance gums & industries, ref. M14015) a été utilisée en tant qu’ agent gélifiant 4.

4. Membrane de filtration microbiologique

La membrane de filtration microbiologique 5 entre dans la composition des dispositifs de culture microbiologique IB et 1D selon certains modes de réalisation de l’invention. Elle est également utilisée dans le cadre d’un dispositif de contrôle microbiologique 10 selon l’invention. Cette membrane de filtration microbiologique 5 est un filtre qui est perméable à l'eau et qui retient les microorganismes, notamment à sa surface. Cette membrane est également perméable aux éléments nutritifs du milieu de culture et aux éventuels éléments additifs compris dans ce milieu de culture situé, entre les deux pièces en matériau hydrophile et absorbant 2 et 2’, sous la membrane de filtration microbiologique. Dans les exemples qui vont suivre, la membrane de filtration microbiologique 5 présente la forme d’un disque sensiblement plan et constituée d'un mélange d'esters de cellulose (nitrate et acétate). Il s’agit de la membrane de filtration Nitocellulose Membrane Filters, fabriquée par Zefon International, Inc., 5350 SW I ^st Lane, Ocala, FL 34474, USA.

5. Couche superficielle déshydratée

La couche superficielle 6, qui sera un d'hydrogel polysaccharidique déshydraté dans les exemples qui vont suivre, entre dans la constitution des dispositifs de culture microbiologique IC ou 1E selon certains modes de réalisation de l’invention. Le feuillet d'hydrogel polysaccharidique est conçu avant tout de telle façon que, une fois réhydratés, il puisse offrir aux microorganismes un support adapté à leur croissance et développement. La composition et la consistance de ces feuillets d'hydrogel polysaccharidique déshydraté ont également été spécifiquement étudiées pour obtenir des surfaces adaptées aux opérations d'isolement et d'étalement des cellules, que ces feuillets d'hydrogel polysaccharidique soient dans un état réhydraté ou déshydraté.

Voici par exemple un procédé de préparation d’un hydrogel pouvant être utilisé dans le cadre de la présente invention :

a. Préparation des hydrogels polysaccharidiques :

faire chauffer 500 mL d'eau distillée stérile dans un flacon en verre sur plaque chauffante ;

rajouter le(s) gélifîant(s) en quantité définie et attendre que le mélange soit homogène et translucide en continuant de chauffer (porter à ébullition ou proche de Pébulition) ;

après dissolution complète, rajouter le glycérol, homogénéiser et ajouter le(s) sel(s) de cation divalent servant de liant et d'agent durcisseur, homogénéiser et porter à ébullition ;

répartir 5 à 15 mL (selon l'épaisseur souhaitée pour le feuillet) du mélange encore chaud dans des boîtes de Pétri de 47 mm de diamètre ;

laisser refroidir et durcir sur la paillasse, jusqu'à reprise en masse du gélifiant. Démouler les pièces d'hydrogel, à l'aide d'un scalpel si nécessaire. b. Déshydratation des hydrogels polysaccharidiques : enserrer les pièces d'hydrogels entre deux feuilles de papier absorbant ; placer l'ensemble au four, à une température de l'ordre de 40°C, pendant 1 à 6 heures ; l'opération peut également être effectuée pendant au moins une nuit, dans une étuve à chaleur sèche, portée à 32°C.

Dans le cadre de la présente invention, les feuillets d'hydrogel polysaccharidique déshydraté d'un dispositif de culture de microbiologique peuvent être déclinés sous différentes versions, en faisant varier, notamment :

la nature du gélifiant polysaccharidique (par exemple, gomme de gellane, gomme de xanthane, gommes de galactomannane, amidon, alginate de sodium, pectine, méthylcellulose et hydroxyméthylcellulose) ;

la proportion entre l'eau et le gélifiant, utilisée lors de l'étape de préparation des hydrogels polysaccharidiques ;

la nature et la quantité des éventuels agents durcisseurs utilisés dans la préparation des hydrogels polysaccharidiques ;

la nature et la quantité des additifs éventuellement utilisés pour améliorer les propriétés physico-chimiques des hydrogels polysaccharidiques (hydratés) et/ou des feuillets d'hydrogel polysaccharidique déshydraté.

6. Membrane perméable intercalaire

En vue d'améliorer le contraste et l'observation des colonies poussant à la surface du dispositif de culture microbiologique, une membrane opaque à la lumière et d'une grande blancheur (par exemple, une blancheur CIE au moins égale à 65) peut être intercalée entre soit la pièce en matériau hydrophile supérieure et absorbant et le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté soit entre la pièce en matériau hydrophile supérieure et la membrane de filtration microbiologique. Cette membrane perméable intercalaire 7 peut consister en une feuille de papier absorbant, de composition cellulosique.

III. Dispositifs de culture microbiologique selon l'invention dans un dispositif de contrôle microbiologique

Sur la Figure 9, un mode de réalisation de l’invention dans lequel le dispositif de culture microbiologique 1 A et une membrane de filtration 5 sont compris dans un dispositif de contrôle microbiologique 10. Ce dispositif de contrôle microbiologique permet de réaliser des opérations de contrôle simplifiées d’un liquide à analyser susceptible de contenir au moins un microorganisme, et ce même en dehors d’un laboratoire microbiologique, y compris dans un environnement industriel.

Ce dispositif de contrôle microbiologique 10 comporte au moins un corps principal 11 et un couvercle 12. Le corps principal 11 et le couvercle 12 sont formés de pièces distinctes qui sont assemblées l'une à l'autre pour former l'enceinte du dispositif de contrôle microbiologique. Le couvercle 12 vient refermer le corps principal 11 pour délimiter l’espace interne fermé 13 du dispositif de contrôle microbiologique 10. Le couvercle 12 présente donc une forme complémentaire de celle du corps principal 11 pour assurer la fermeture de ce dernier.

Ce dispositif de contrôle microbiologique 10 correspond au dispositif tel que décrit dans la demande WO2018/189478 déposée par la demanderesse et ce pour tous les modes de réalisation décrit dans cette même demande.

Ainsi, tout comme le dispositif décrit dans la demande WO2018/189478, le dispositif de contrôle microbiologique 10 dans le cadre de la présente invention comporte une membrane de filtration microbiologique 5 qui est disposée dans l'espace interne fermé 13 et qui sépare l'espace interne fermé en deux compartiments.

La membrane de filtration microbiologique 5 s'étend dans l'espace interne fermé 12 sensiblement transversalement, selon toute la section de l'espace interne fermé. Dans l'exemple, la membrane de filtration microbiologique 5 présente une forme sensiblement plane, ici la forme d'un disque. Il est de préférence agencé perpendiculairement à l'axe central du corps principal 11.

Le dispositif de contrôle microbiologique comporte, à l'intérieur de l'espace interne fermé 13, un dispositif de culture microbiologique IA selon l’invention, le dispositif microbiologique IA étant en contact avec la membrane de filtration microbiologique 5.

Dans ce mode de réalisation illustré, le dispositif de culture microbiologique IA est un élément distinct de la membrane de filtration microbiologique 5, tout en étant en contact avec la membrane de filtration microbiologique 5. Le dispositif de culture microbiologique IA et la membrane de filtration microbiologique 5 sont mis en contact l'un avec l'autre au sein du dispositif de contrôle microbiologique une fois celui-ci assemblé. Dans ce cas, le dispositif de culture microbiologique 1 A est situé de préférence, en-dessous la membrane de filtration microbiologique 5. Cependant, rien n'empêche de prévoir que le dispositif de culture microbiologique IA soit situé au-dessus de la membrane de filtration microbiologique 5. Dans ce cas particulier, le dispositif de culture microbiologique IA comprend avantageusement au moins un substrat chromogénique et/ou fluorogénique apte à permettre une détection directe ou indirecte d'une activité enzymatique ou métabolique des micro-organismes cibles. Le signal visuel généré par ledit au moins un substrat est alors visible au travers d'au moins une partie de l'épaisseur du dispositif de culture microbiologique IA.

Dans un autre mode réalisation le dispositif de contrôle microbiologique comporte, à l'intérieur de l'espace interne fermé 13, le dispositif de culture microbiologique IA et la membrane de filtration microbiologique 5 déjà assemblés préalablement ce qui correspond à un dispositif de culture microbiologique IB selon l’invention tel que décrit plus haut et sur la Figure 2.

Dans l’exemple illustré, le dispositif de culture microbiologique IA présente une forme sensiblement plane, ici la forme d'un disque. Le dispositif de culture microbiologique 1 A présente un bord périphérique qui, de préférence, coïncide avec le bord périphérique de la membrane de filtration microbiologique 5. Ainsi, le dispositif de culture microbiologique IA et la membrane de filtration microbiologique 5 présentent la même forme.

Le dispositif de contrôle microbiologique 10 selon l'invention comporte un port d'entrée 14 pour le liquide à analyser. Le port d'entrée 14 permet, lorsque le dispositif de contrôle microbiologique 10 est assemblé de telle sorte que l'enceinte délimite l'espace interne fermé 13, par exemple lorsque le couvercle 12 est assemblé avec corps principal 11, d'introduire le liquide à analyser à l'intérieur de l'espace interne fermé délimité par l'enceinte, en provenance de l'extérieur de l'espace interne fermé 13.

Dans cet exemple de réalisation illustré, le port d'entrée 14 comprend

une portion interne 15 qui débouche dans l'espace interne fermé 13 ; une portion externe 16 de raccordement à un contenant de liquide à analyser, le contenant pouvant être par exemple une seringue, une tubulure, une poche, un entonnoir etc.. ; et un obturateur 17 qui, dans cet exemple de réalisation, est interposé entre la portion interne 15 et la portion externe 16 du port d'entrée, de manière à obturer le port d'entrée 14, empêchant, dans un état fermé de l'obturateur 17, toute circulation gazeuse entre l'espace interne fermé 13 du dispositif de contrôle microbiologique 10 et l'extérieur au travers du port d'entrée 14.

Dans cet exemple illustré, le port d'entrée 14 est agencé selon l'axe central, verticalement. Le port d'entrée est avantageusement agencé sur le couvercle 12.

IV. Evaluation des dispositifs de culture microbiologique selon l'invention

1. Dispositif de culture microbiologique 1 A

Des essais ont été menés en vue d'évaluer la capacité du dispositif de culture microbiologique 1 A selon l’invention à pouvoir constituer un support performant permettant la culture, la détection et/ou l’identification de microorganismes possiblement présents dans un échantillon à analyser, à contrôler.

Dans ce contexte, une culture microbienne a été réalisée avec une souche d’ Escherichia coli. La composition de milieu de culture déshydratée doit être choisie pour permettre à la croissance et le développement des bactéries d'intérêt, et doit intégrer des composantes chromogéniques facilitant l'identification visuelle de ces bactéries d'intérêt.

Pour ce faire, le milieu de culture chromID ^® CPS Elite est utilisé. Ce milieu de culture, commercialisé par la société bioMérieux, peut-être utilisé pour l’isolement, la numération et l’identification directe de la bactérie Escherichia coli.

Ainsi le dispositif de culture microbiologique 1 A, dans le cadre de cet exemple, se compose de :

deux pièces en matériau hydrophile et absorbant, chaque pièce ayant une épaisseur de 2 mm, confectionnées à partir du non-tissé Airlaid SCA95NN81, de la compagnie SCA (Suède), et

un milieu de culture chromID ^® CPS Elite comprenant de la gomme xanthane Mataxan 25pm (Alliance gums & industries, ref. M14015)

Dans le cadre de cet exemple, deux conditions expérimentales sont étudiées. Dans la première, on utilise 32 g de milieu de culture chromID ^® CPS Elite et 40 g de gomme xanthane.Dans la seconde, on utilise 32 g de milieu de culture chromID ^® CPS Elite et 20 g de gomme xanthane.

Les dispositifs sont, ensuite, calandrés à XX°C en appliquant une pression de XX kg. cm ² pendant une durée de XX secondes.

Puis ces dispositifs sont placés dans une boîte de Pétri de 90 mm de diamètre, puis humidifiés avec 1 mL d’une suspension d’ Escherichia coli ayant une charge bactérienne théorique 1.10 ⁷ UFC/mL. L’ensemble est alors incubé à 37°C pendant 24 heures.

Pour chaque condition expérimentale, l’expérience a été réalisée trois fois.

Aux Figures 11 et 12, sont exposées des photographies de cultures d Escherichia coli effectués sur le dispositif de culture microbiologique IA dont les caractéristiques sont décrites ci-dessus.

A la Figure 11, le dispositif de culture microbiologique 1 A comprend 32 g de milieu de culture chromID ^® CPS Elite et 40 g de gomme xanthane. Et à la Figure 12, 32 g de milieu de culture chromID ^® CPS Elite et 20 g de gomme xanthane.

Dans les conditions deux conditions expérimentales, les résultats obtenus sont très similaires. Les colonies d Έ. coli poussent à l’intérieur des deux pièces en matériau hydrophile et absorbant. Elles présentent une très belle taille et une très belle coloration. Leur morphotype correspond à celle des colonies d Έ. coli poussant sur une gélose chromogénique de référence telle que le chromID ^® CPS Elite.

Ainsi ce dispositif de culture microbiologique IA selon l’invention constitue un support de culture microbiologique performant permettant la culture, la détection et l’identification de microorganismes présents dans un échantillon à analyser.

2. Dispositif de culture microbiologique IC

Le dispositif de culture microbiologique IC selon l’invention comprend, en plus du dispositif 1 A, une couche superficielle, qui est un feuillet hydrogel polysaccharidique déshydraté. Ce feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté doit présenter une surface pleine, une intégrité structurelle et la tenue mécanique satisfaisante.

Des essais ont été menés en vue d'évaluer la capacité de tels dispositifs à pouvoir constituer des supports de culture microbiologique à la fois performants et compatibles avec les opérations et les moyens mécaniques d'étalement et de dispersion des cellules. Des cultures bactériennes ont été réalisées notamment avec des souches d 'Escherichia coli et d 'Enterococcus faecalis. En fonction des bactéries d'intérêt à cultiver, le dispositif de culture microbiologique comprend une composition de milieu de culture déshydratée particulière. La particularité de cette composition de milieu de culture déshydratée réside dans le fait qu'elle a été choisie pour pouvoir être adaptée à la croissance et au développement des bactéries d'intérêt, et qu'elles intègrent des composantes chromogéniques facilitant l'identification visuelle de ces bactéries d'intérêt.

Pour ce faire, le même milieu de culture que précédemment est utilisé, à savoir le milieu de culture chromID ^® CPS Elite. Ce milieu permet risolement, la numération et G identification directe de E. coli , et présomptive d! Entérocoques.

Ainsi, le dispositif de culture microbiologique IC, dans cet exemple, se compose de :

deux pièces en matériau hydrophile et absorbant, chaque pièce ayant une épaisseur de 2 mm, confectionnées à partir du non-tissé Airlaid SCA95NN81, de la compagnie SCA (Suède),

un milieu de culture chromID ^® CPS Elite comprenant de la gomme xanthane, et

un feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté.

Dans le cadre de cet exemple, on utilise 32 g de milieu de culture chromID ^® CPS Elite et 20 g de gomme xanthane.

Ce dispositif, tel que décrit ci-dessus, est calandré à 60°C en appliquant une pression de0,4 kg. cm ² pendant une durée de 60 secondes.

Le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté a été préparé comme décrit précédemment (cf. II Eléments constitutifs d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention , 5. Couche superficielle déshydratée).

Ce dispositif IC, tel que décrit ci-dessus, est placé dans des boîtes de Pétri de 90 mm de diamètre, puis humidifiées avec 7-8 mL d'eau distillée stérile. Une fois l'hydratation de la pièce en matériau absorbant réalisée, le milieu de culture activé et la couche d'hydrogel polysaccharidique régénérée, le dispositif de culture microbiologique est ensemencé par 100 pL avec une suspension comprenant 10.10 ⁴ UFC/mL d 'Escherichia coli et 10.10 ⁴ UFC/mL d Enterococcus faecalis. Cette suspension est déposée au moyen d'une première oëse sur le premier cadran de la surface d'hydrogel. Le deuxième cadran est ensemencé avec une nouvelle oëse en étirant plusieurs stries à partir du premier cadran. Le troisième cadran est ensemencé comme le deuxième sans changer d'oëse. Le quatrième cadran est ensemencé par des stries non étirées à partir du second cadran.

Les boîtes sont placées dans une jarre avec un peu d'eau de façon à ce que les dispositifs de culture microbiologique ne se dessèchent pas. L'ensemble est alors incubé à 37°C pendant, 24 heures.

Aux Figures 13 et 14, sont exposées des photographies de cultures et d’isolements d 'Escherichia coli et d 'Enterococcus faecalis effectuées sur le dispositif de culture microbiologique IC dont les caractéristiques sont décrites ci-dessus.

Les résultats obtenus sont très similaires. Les colonies d 'Escherichia coli et d' Enterococcus faecalis poussent à la surface du feuillet d'hydrogel. Elles présentent une très belle taille et une très belle coloration. Leur morphotype correspond à celle des colonies d 'Escherichia coli et d' Enterococcus faecalis poussant sur une gélose chromogénique de référence telle que le chromID ^® CPS Elite.

De plus, ces expérimentations ont permis de montrer que le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté présentait une surface pleine, une intégrité structurelle et la tenue mécanique satisfaisante (non représenté).

3. Dispositifs de culture microbiologique selon l'invention dans un dispositif de contrôle microbiologique

Pour finir, le dispositif de culture microbiologique selon l'invention intégré dans un dispositif de contrôle microbiologique a été étudié.

Ainsi, selon un mode de réalisation de l’invention, le dispositif de culture microbiologique IA et une membrane de filtration microbiologique sont compris dans un dispositif de contrôle microbiologique.

Ce dispositif de contrôle microbiologique permet de réaliser des opérations de contrôle simplifiées d’un liquide à analyser susceptible de contenir au moins un microorganisme, et ce même en dehors d’un laboratoire microbiologique, y compris dans une environnement industriel. Dans le cas présent, le dispositif de culture microbiologique n’est pas le siège de la croissance mais permet la croissance sur la membrane de filtration microbiologique positionnée sur l’une des pièces en matériau absorbant.

Les essais, ci-dessous, ont été menés en vue d'évaluer la capacité du dispositif de culture microbiologique à :

pouvoir retenir le milieu de culture lors du passage du liquide à analyser, résistant ainsi, au lessivage de ce milieu de culture, et

permettre la mise à disposition des ingrédients nutritifs et des agents actifs du milieu de culture aux microorganismes capturés sur le filtre et permettre ainsi la croissance de ces microorganismes capturés.

Ainsi afin de démontrer que le dispositif selon l’invention possède ces propriétés, il a été vérifié la croissance effective de bactéries sur la membrane de filtration positionné sur le dispositif et ce après le passage d’un échantillon d’eau ensemencée avec une quantité connue de bactéries cibles.

Différentes conditions expérimentales ont été étudiées, en faisant varier la quantité de gomme de xanthane et l’épaisseur des pièces en matériau hydrophile et absorbant, confectionnées à partir du non-tissé Airlaid SCA95NN81, de la compagnie SCA (Suède).

Tout comme précédemment, le milieu de culture sera le chromID ^® CPS Elite, commercialisé par la société bioMérieux.

Les dispositifs sont calandrés à 50°C en appliquant une pression de 10 kg.cm ² pendant une durée de 30 secondes.

La membrane de filtration utilisée est membrane constituée d'un mélange d'esters de cellulose (nitrate et acétate). Il s’agit de la membrane de filtration Fisherbrand™ General Filtration Membrane Filters commercialisées par Fisher Scientific Company L.L.C, 300 Industry Drive, Pittsburgh, PA 15275, USA.

Dans le cadre de cet exemple, le liquide à analyser est une solution d’eau minérale de la marque EVIAN dans laquelle a été inoculée une culture bactérienne constituée d’une souche d 'Escherichia coli et d’une souche ά' Enter ococcus faecalis. Ainsi, 100 mL de la solution d’eau minérale inoculée comprenant soit 25 UFC/100mL soit 50 UFC/100mL pour chaque bactérie sont analysés.

Ainsi, l'introduction de la solution à analyser dans le dispositif de contrôle microbiologique selon l'invention, au travers du port d'entrée, permet à la solution d'être introduite tout d'abord dans l'espace interne fermé, la solution à analyser venant alors naturellement au contact de la membrane de filtration microbiologique. La solution à analyser est donc filtrée au travers de la membrane de filtration microbiologique, de sorte que certains au moins des éventuels microorganismes, notamment ceux ciblés pour le contrôle envisagé, sont retenus par la membrane de filtration microbiologique. Au contraire, la partie liquide de la solution à analyser migre en direction vers le fond de l'espace interne fermé. Le liquide à analyser permet la réhydratation du dispositif de culture microbiologique selon l’invention.

Comme le dispositif de culture microbiologique est au contact de la membrane de filtration, les éléments nutritifs et les éventuels éléments additifs de celle-ci peuvent migrer en direction des microorganismes qui sont retenus par la membrane de filtration microbiologique.

Par la suite, le dispositif de contrôle microbiologique est mis dans un environnement, notamment de température, favorable, pour obtenir une incubation des microorganismes à l'intérieur du dispositif de contrôle microbiologique lui- même, sans qu'il soit nécessaire d'ouvrir celui-ci et sans qu'il soit nécessaire de retirer la membrane de filtration microbiologique de l'enceinte du dispositif de contrôle microbiologique.

Ainsi, l'utilisation d'un dispositif de contrôle microbiologique selon l'invention, après l'étape d'introduction de la solution à analyser à l'intérieur de l'espace interne fermé du dispositif de contrôle microbiologique, comprend les étapes ultérieures consistant à :

refermer l'obturateur du port d'entrée ;

faire incuber à 37°C pendant 18-24 heures, dans le dispositif de contrôle microbiologique, un éventuel microorganisme contenu initialement dans la solution à analyser.

Après cette période d'incubation, l’étape de contrôle consistant à détecter, dénombrer, identifier et caractériser un éventuel microorganisme contenu initialement dans la solution à analyser se fait par vision au travers d'une portion transparente de l'enceinte du dispositif de contrôle microbiologique. Là encore, cette étape de contrôle peut être réalisée sans qu'il soit nécessaire d'ouvrir le dispositif de contrôle microbiologique, la membrane de filtration microbiologique, sur laquelle se trouvent les éventuels microorganismes, restant donc à l'intérieur de l'espace interne fermé du dispositif de contrôle microbiologique.

Afin de valider l’utilisation d’un dispositif de culture microbiologique selon l'invention dans un dispositif de contrôle microbiologique, cette utilisation a été comparée à utilisation du dispositif de culture microbiologique selon l'invention dans un système de filtration Milliflex ^® . Le système de filtration Milliflex ^® , commercialisé par Merck, est composé d'une pompe à vide Milliflex ^® et d’un entonnoir de filtration Milliflex ^® . Il s’agit d’une solution de filtration classique.

Résultats :

Dans le tableau 1 ci-dessous les résultats de quantification pour un dispositif de culture microbiologique selon l’invention compris dans le dispositif de contrôle microbiologique. Dans ce dispositif de culture microbiologique les deux pièces en matériau hydrophile et absorbant présentent une épaisseur identique de 2 mm.

[Tableau 1] :

Dans le tableau 2 ci-dessous les résultats de quantification pour un dispositif de culture microbiologique selon l’invention compris dans le dispositif de contrôle microbiologique. Dans ce dispositif de culture microbiologique les deux pièces en matériau hydrophile et absorbant présentent une épaisseur différente, la pièce supérieure, qui sera la première en contact avec la solution à analyser et qui en contact avec la membrane de filtration, présente une épaisseur de 0,76 mm, la pièce inférieure présente une épaisseur de 2 mm.

[Tableau 2] :

Dans le tableau 3 ci-dessous les résultats de quantification pour un dispositif de culture microbiologique selon l’invention compris un système de filtration Milliflex ^® . Chaque pièce en matérieau hydrophile et absorbant présente une épaisseur de 2 mm par pièce. Le dispositif comprend une quantité de gomme de xanthane de 20 g.

[Tableau 3] :

Conclusions :

Les résultats obtenus avec le dispositif de culture microbiologique intégré dans un dispositif de contrôle microbiologique, montrent tout d’abord qu’en absence de gomme de xanthane il n’y a pas de croissance des bactéries sur la membrane de filtration. Ceci démontre que la gomme de xanthane permet dans un premier temps de retenir le milieu de culture lors du passage d’un grand volume de solution à analyser, résistant ainsi, au lessivage de ce milieu de culture et puis dans un second temps permet, lors de l’incubation, de mettre à disposition les éléments nutritifs et des agents actifs du milieu de culture aux microorganismes capturés sur le filtre.

Ensuite, ces résultats montrent que même en faisait varier l’épaisseur des pièces en matériau hydrophile et absorbant, il y a croissance microbiologique.

Enfin, le tableau 3 montre que le dispositif de culture microbiologique intégré dans un dispositif de contrôle microbiologique selon l’invention présente des performances similaires voire meilleurs que dispositif de culture microbiologique intégré un système de filtration Milliflex ^® .

Ainsi contre toute attente, le dispositif selon la présente invention permet une rétention du milieu de culture lors du passage d’un grand volume de liquide à analyser tout en permettant le relargage des nutriments et des agents actifs du milieu de culture solubilisés pendant l’incubation. Par conséquent, les inventeurs ont démontré que le dispositif de culture microbiologique intégré à un dispositif de contrôle microbiologique permet de détecter, dénombrer, identifier et/ou caractériser un éventuel microorganisme contenu dans un liquide à analyser, permettant, ainsi son contrôle.