Le Campion, Laurence (Résidence Jardin des Facultés 74 Bld Jeanne d'Arc Marseille, F-13005, FR)
CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (3 rue Michel Ange Paris Cedex 16, F-75794, FR)
Ouazzani, Jamal (2 rue de Lisbonne Massy, F-91300, FR)
Le Campion, Laurence (Résidence Jardin des Facultés 74 Bld Jeanne d'Arc Marseille, F-13005, FR)
| 1. | Procédé microbiologique d'élimination d'au moins un composé nitroaromatique présent dans une solution ou dans un sol, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en contact de ladite solution ou dudit sol avec une biomasse d'une souche Penicillium dans des conditions adéquates pour une minéralisation dudit composé nitroaromatique par la souche Penicillium. |
| 2. | Procédé selon la revendication 1 d'élimination d'au moins un composé nitroaromatique présent dans un sol, comprenant en outre une étape d'inondation dudit sol avec une solution aqueuse, de manière à former une solution de composé nitroaromatique. |
| 3. | Procédé selon la revendication 1 d'élimination d'au moins un composé nitroaromatique présent dans une solution, dans lequel la mise en contact est réalisée soit par mélange de la biomasse et de la solution du composé nitroaromatique, soit par passage de ladite solution à travers la biomasse, ladite biomasse étant retenue, dans ou sur, un support de manière à pouvoir tre traversée par ladite solution, pour permettre la minéralisation du composé nitroaromatique qu'elle contient. |
| 4. | Procédé selon la revendication 1 ou 3 d'élimination d'au moins un composé nitroaromatique présent dans une solution, dans lequel la solution de composé nitroaromatique est une solution aqueuse de ce composé. |
| 5. | Procédé selon la revendication 1,3 ou 4, dans lequel la solution de composé nitroaromatique est une solution de laboratoire, un effluent industriel ou une eau de ruissellement. |
| 6. | Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel l'étape de mise en contact est effectuée à une température permissive pour le métabolisme de la souche de Penicillium. |
| 7. | Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel la mise en contact est effectuée en présence d'une source de carbone pour la souche de Penicillium. |
| 8. | Procédé selon la revendication 7, dans lequel la source de carbone est choisie dans le groupe comprenant du glucose, des polymères de glucose, de la mélasse et des hydrolysats de mais. |
| 9. | Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel la mise en contact est effectuée en présence de glucose à une concentration de 0,5 à 50 g de glucose/1 de ladite solution. |
| 10. | Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel la biomasse de Penicillium est mise en contact avec la solution de composé nitroaromatique à une concentration de 50 à 800 g en poids frais de biomasse par litre de solution dudit composé. |
| 11. | Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel le, au moins un, composé nitroaromatique est un composé comprenant au moins un cycle aromatique comportant au moins un groupe nitro, et éventuellement au moins une fonction choisie dans le groupe comprenantOH,COOH, un halogène, NH2, un ose cyclique ou linéaire, un alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone ou un aryle, non substitués ou substitués, par au moins une fonction choisie dans le groupe comprenantOH,COOH, un halogène,NH2,OH. |
| 12. | Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel le, au moins un, composé nitroaromatique est un composé choisi parmi du nitrotoluène, du dinitrotoluène, du trinitrotoluène, et leurs dérivés, ou un mélange de ces composés. |
| 13. | Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, comprenant en outre, avant l'étape de mise en contact, une étape de neutralisation du pH de la solution de composé nitroaromatique ou du sol de manière à ce que la mise en contact avec la souche de Penicillium puisse tre effectuée à un pH de 4,5 à 6,5. |
| 14. | Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la souche de Penicillium est la souche Penicillium sp. LCM déposée sous le numéro 12081 à la CNCM tenue par l'Institut Pasteur en France. |
| 15. | Souche de type Penicillium sp. déposée sous le numéro 12081 à la CNCM tenue par l'Institut Pasteur en France. |
Le procédé de l'invention est par exemple très utile pour traiter une solution, telle que par exemple un effluent industriel, ou un sol, pollué par un composé nitroaromatique, par exemple par du dinitrotoluène (DNT) ou du trinitrotoluène (TNT).
Art antérieur Différentes voies de dégradation de composés nitroaromatiques ont été explorées dans l'art antérieur. Ces voies sont essentiellement soit biologiques, soit chimiques.
Par exemple, en 1998, KALAFUT et al. ont étudié la transformation du TNT par trois bactéries aérobies : Pseudomonas aeruginosa, Bacillus sp. et Staphylococcus sp.. Il a montré que ces trois souches transformaient le TNT mais ne pouvaient pas l'utiliser comme seule source ni de carbone ni d'azote. L'étude est rapportée dans le document KALAFUT, T. et al.,"Biotransformation patterns of 2,4,6-trinitrotoluène by aerobie bacteria", Cur. Microbiol., 1998,36,45-54.
En 1998, BOOPATHY et al. ont mis au point un bioréacteur aérobie/anoxie à l'échelle du laboratoire pour la décontamination d'un sol contaminé par le TNT.
Ce procédé peut tre réalisé en système"batch"ou en semi-continu. Le traitement en batch permet une transformation du TNT, mais certains métabolites s'accumulent. Par contre, en semi-continu (changement de 10% de sol régulièrement), la dégradation du TNT (8 g/kg de sol) est complète. Le bilan, après 14 jours d'incubation, indique que seulement 23% du TNT ont été minéralisés, 27% assimilés, et 8% se retrouvent adsorbés sur le sol. Le pourcentage restant correspond à la formation de métabolites tels que les amino- dinitrotoluènes (4%), le 2,4-diamino-6-nitrotoluène (3%) et le 2,3-butanediol issus du clivage du cycle (30%). Des additions successives de sol une, deux ou trois fois par semaine n'affectent pas la vitesse de dégradation du TNT. De plus, ce réacteur permet un maintien de la population bactérienne, avec comme seul co-substrat nécessaire, 0,3% de mélasse. En utilisant le mme procédé, il est possible d'éliminer d'autres contaminants du sol, tels que l'hexahydro-1, 3,5- trinitro-1, 3,4-triazine (RDX), l'octahydro-1, 3,5,7- tétranitro-1, 3,5,7-tétrazocine (HMX), le trinitrotoluène et le 2,4-dinitrotoluène. Ces résultats sont rapportés dans BOOPTHY, R. et al."A laboratory study of the bioremediation of 2,4,6-trinitrotoluene- contaminated soil using aerobic/anoxic soil slurry reactor", Water Environment Research, 1998.
En 1998, VORBECK et al. ont étudié la réduction microbiologique des groupements nitro du TNT et l'hydrogénation microbiologique du cycle aromatique. En raison de la déficience en électrons due à la présence
des groupements nitro attracteurs d'électrons, la première transformation microbienne du TNT est une nitro-réduction. L'hydrogénation du cycle aromatique décrite pour l'acide picrique, reste minoritaire. Deux bactéries ont été isolées d'un milieu aérobie, enrichi en TNT comme seule source d'azote : la souche TNT-8 (gram-) et la souche TNT-32 (gram+). Elles catalysent la nitro-réduction du TNT. Par contre, les souches Rhodococcus erythropolis HL PM-1 (croissant sur l'acide picrique) et Mycobacterium sp. HL 4-NT-1 (croissant sur le 4-nitrotoluène) possèdent des systèmes enzymatiques qui catalysent l'hydrogénation du TNT, et par conséquent l'addition d'un ion hydrure sur le cycle aromatique. Le complexe hydrure-Meisenheimer du TNT (H--TNT) ainsi formé est alors converti en un métabolite jaune non dégradable, identifié par RMN.
Dans ce cas, aucune dénitration réductive du TNT n'a été observé. La minéralisation du TNT n'a pas été étudiée. Ces résultats sont rapportés dans VORBECK, C. et al.,"Initial Reductive reactions in aerobic microbial metabolism of 2,4,6-trinitrotoluène", Appl.
Environ. Microbiol., 1998,64 (1), 246-252.
Mais aucun des micro-organismes décrits dans ces documents ne permet une minéralisation totale ou quasi- totale du TNT.
Les voies chimiques de dégradation présentent quant à elles de nombreux inconvénients liés à l'utilisation de réactifs chimiques. Ces inconvénients sont notamment le coût des réactifs chimiques et la pollution engendrée par ces réactifs dans les solutions et les sols traités.
Exposé de l'invention La présente invention a précisément pour but de fournir un procédé qui permet une élimination totale ou quasi-totale d'un composé nitroaromatique dans une solution ou dans un sol, par minéralisation dudit composé.
Ainsi, le procédé de la présente invention est un procédé qui peut tre utilisé pour traiter une solution ou un sol contenant un ou des composé (s) nitroaromatique (s) indésirable (s) car polluant (s).
Le procédé de l'invention est un procédé microbiologique d'élimination d'au moins un composé nitroaromatique présent dans une solution ou dans un sol, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend une mise en contact de ladite solution ou dudit sol avec une biomasse d'une souche Penicillium dans des conditions adéquates pour une minéralisation du composé nitroaromatique par la souche Pénicillium.
Par"le composé nitroaromatique"ou par"solution de composé nitroaromatique", il faudra comprendre ci- après"le ou les composé (s) nitroaromatique (s)" et "solution du ou des composé (s) nitroaromatique (s)" respectivement.
Selon l'invention, la solution de composé nitroaromatique peut tre par exemple une solution de laboratoire, un effluent industriel, ou une eau de ruissellement, contenant un ou plusieurs composé (s) nitroaromatique (s) et, dans laquelle, ou dans lequel, de préférence, la souche de Penicillium peut métaboliser le composé nitroaromatique.
Avantageusement, selon le procédé de l'invention, cette solution est une solution aqueuse.
Selon l'invention, le, au moins un, composé nitroaromatique peut tre un composé comprenant au moins un cycle aromatique comportant au moins un groupe nitro, et éventuellement au moins une fonction choisie dans le groupe comprenant-OH,-COOH, un halogène, -NH2, un ose cyclique ou linéaire, un alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone ou un aryle, non substitués ou substitués, par au moins une fonction choisie dans le groupe comprenant-OH,-COOH, un halogène,-NH2,-OH.
Par exemple, le, au moins un, composé nitroaromatique peut tre un composé choisi parmi du nitrotoluène, du dinitrotoluène, du trinitrotoluène, et leurs dérivés, ou un mélange de ces composés.
Selon l'invention, le procédé de la présente invention peut comprendre en outre, avant l'étape de mise en contact, une étape de neutralisation du pH de la solution de composé nitroaromatique ou du sol de manière à ce que la mise en contact avec la biomasse, par exemple une souche de Penicillium, puisse tre effectuée à un pH de 4,5 à 6,5.
Selon l'invention, la mise en contact peut par exemple tre effectuée en présence de glucose à une concentration de 0,5 à 50 g de glucose/1 de ladite solution.
Selon l'invention, la souche de Penicillium peut tre une souche commune de Penicillium. Par exemple, la souche de Penicillium sp. LCM déposée sous le numéro 1-2081 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) tenue par l'Institut Pasteur en France peut tre utilisée dans le procédé conforme à la présente invention. Aussi, l'invention se rapporte également à la souche de Penicillium sp. LCM déposée sous le numéro 1-2081 à la CNCM tenue par l'Institut Pasteur en France.
Selon l'invention, la biomasse de la souche de Penicillium peut tre obtenue à partir des procédés classiques de la microbiologie pour former une biomasse, par exemple par culture du Penicillium dans un milieu de culture de préférence riche, solide ou liquide, de préférence liquide, à une température et à un pH adéquats pour permettre un métabolisme optimal de la souche de Pénicillium.
Un milieu de culture utilisable pour développer la biomasse, est donné dans les exemples ci-dessous.
Lorsqu'une quantité suffisante de biomasse est obtenue, et lorsque le milieu de culture est liquide, cette biomasse peut par exemple tre récupérée par filtration ou par centrifugation, avantageusement par filtration.
De préférence, dans le procédé conforme à la présente invention, la biomasse est utilisée fraîche, ce qui n'exclut pas toute autre utilisation.
La biomasse mise en contact avec la solution ou le sol doit tre en quantité suffisante pour permettre la minéralisation dudit composé nitroaromatique. La quantité de biomasse peut tre déterminée par exemple en fonction de la quantité de composés nitroaromatiques
à minéraliser ou de la vitesse de minéralisation souhaitée. Cette quantité de biomasse peut par exemple tre déterminée à partir d'échantillons de la solution de composé nitroaromatique mélangés à des quantités variables de biomasse, à une température et à un pH adéquats pour permettre un métabolisme de préférence optimal de la souche de Penicillium.
Selon l'invention, la mise en contact peut tre réalisée soit par mélange de la biomasse et de la solution du composé nitroaromatique, soit par passage de ladite solution à travers la biomasse, ladite biomasse étant retenue dans, ou sur, un support de manière à pouvoir tre traversée par ladite solution, pour permettre la minéralisation du composé nitroaromatique qu'elle contient.
Lorsque la mise en contact est réalisée par mélange de la biomasse avec la solution du composé nitroaromatique, cette mise en contact peut tre réalisée par exemple dans un réacteur classique tel qu'un fermenteur, comprenant par exemple notamment un dispositif de brassage ou mélange de la solution et de la biomasse et un dispositif de chauffage. Ce type de mise en contact est utile par exemple pour un système semi-continu, ou système"batch", de traitement d'une solution de composé nitroaromatique utilisant le procédé de la présente invention.
Lorsque la mise en contact est réalisée par passage de la solution de composé nitroaromatique à travers la biomasse, la biomasse peut tre retenue dans, ou sur, un support. En effet, avantageusement, le Penicillium en culture forme des agrégats ou pelotes ("pelets"en anglais), ce qui permet de le séparer facilement d'une solution, par exemple par filtration.
Selon l'invention, le support peut tre par exemple une colonne ou un réacteur classique permettant un passage en continu de la solution du composé nitroaromatique à travers la biomasse, sans entraîner cette dernière. La biomasse peut tre retenue par exemple au moyen d'une grille, d'un tissu, ou d'une maille de fibres organiques ou inorganiques qui laisse passer la solution, mais pas la biomasse. Cette colonne ou ce réacteur peut également comprendre un dispositif de brassage de la solution et de la biomasse, et un dispositif de chauffage. Ce type de mise en contact est utile par exemple pour un système de traitement en continu d'une solution d'un composé nitroaromatique utilisant le procédé de la présente invention.
Lorsque la solution à traiter est une eau de ruissellement, cette mise en contact peut tre effectuée par simple dispersion de la biomasse de la souche de Penicillium dans l'eau de ruissellement.
Selon l'invention, lors de la mise en contact avec une solution de composé nitroaromatique, la biomasse peut tre mélangée à la solution dudit composé au moyen d'un agitateur classique, par exemple un agitateur rotatif, et à une vitesse d'agitation adéquate, par exemple de 50 à 250 rpm. L'agitation peut tre maintenue pendant toute la durée de mise en contact entre la biomasse de Penicillium et la solution du composé nitroaromatique de manière à optimiser cette mise en contact.
Selon l'invention, l'étape de mise en contact est effectuée dans des conditions adéquates pour une minéralisation du (des) composé (s) nitroaromatique (s) par la souche de Penicillium. Des essais classiques préalables de croissance de Penicillium sur des
échantillons de la solution du composé nitroaromatique à différentes température, les autres paramètres, par exemple le pH, étant constants permettent de déterminer cette température permissive. Il est à noter que Penicillium peut se développer mme à une température d'environ 4°C. Ainsi, le procédé de la présente invention présente notamment l'avantage d'tre utilisable dans une large gamme de température.
Cette température permissive peut tre par exemple d'environ 10 à 35°C, par exemple de 15 à 35°C. Les inventeurs ont noté une bonne minéralisation à une température de 20 à 30°C, en particulier à une température de 25 à 28°C. Avantageusement, la température peut tre maintenue sensiblement constante au cours de la mise en contact de manière à optimiser la minéralisation.
Selon l'invention, l'étape de mise en contact est de préférence effectuée à un pH permissif pour le métabolisme de la souche de Penicillium. Des essais tels que ceux précités mais à température constante et à différents pH peuvent tre réalisés pour déterminer ce pH permissif. Généralement, ce pH peut tre de 5 à 7,5, par exemple de 5 à 6, par exemple d'environ 5,5.
Le pH de la solution varie bien entendu au cours du procédé de l'invention car des groupes nitro du composé nitroaromatique peuvent tre réduits lors de la minéralisation de ce dernier. Cette variation du pH n'est pas gnante pour le procédé de la présente invention.
Cependant, selon une variante de la présente invention, le pH de la solution peut tre maintenu sensiblement constant au cours de l'étape de mise en contact, aux valeurs précitées, au moyen d'un tampon
classique tel qu'un tampon phosphate ou citrate. Ce tampon peut tre ajouté au sol ou à la solution avant ou pendant l'étape de mise en contact du procédé conforme à la présente invention.
Selon l'invention, la mise en contact peut tre effectuée en présence d'une source de carbone pour la souche de Penicillium. Cette source de carbone est un inducteur du métabolisme général de Penicillium, et il favorise la minéralisation du composé nitroaromatique par ce micro-organisme. Cette source de carbone peut tre ajoutée en une quantité suffisante pour optimiser le métabolisme de Penicillium, en particulier la minéralisation du composé nitroaromatique. Cette source de carbone peut tre par exemple choisie dans le groupe comprenant du glucose, des polymères de glucose, de la mélasse, des hydrolysats de mais, etc... Les polymères de glucose comprennent par exemple l'amidon. La source de carbone peut tre ajoutée par exemple à la solution à traiter dans le réacteur, ou lorsqu'il s'agit d'une eau de ruissellement, ou d'un sol, directement dans ladite eau ou sur ledit sol.
Dans un système de traitement d'une solution en continu, le réacteur peut comporter en outre un dispositif d'alimentation du réacteur en source de carbone.
Selon l'invention, lorsque la source de carbone est du glucose, et que la solution du composé nitroaromatique est une solution saturée de ce composé par exemple une solution saturée de TNT, de DNT, d'un dérivé de ceux-ci ou d'un mélange de ceux-ci ou de leurs dérivés, la concentration du glucose lors de la mise en contact, dans la solution, peut tre avantageusement de 2 à 25 g/1, par exemple de 15 g/1.
Une concentration optimale de la source de carbone peut tre déterminée par exemple par des essais du procédé de l'invention, sur des échantillons de la solution du composé nitroaromatique tels que ceux précités.
Selon l'invention, les conditions adéquates énoncées précédemment peuvent également comprendre l'adjonction d'additifs régulateurs ou inducteurs du métabolisme de Penicillium dans la solution ou sur le sol à traiter, tels que du sulfate de magnésium, du nitrate de sodium, du chlorure de potassium, du sulfate de fer, etc..., des oligo-éléments, et de manière générale tout additif connu favorisant le métabolisme de Penicillium.
Avantageusement, selon le procédé de l'invention, la mise en contact est réalisée de telle manière qu'il y a un contact optimum entre Penicillium et la solution et se fera de préférence sous agitation lorsqu'elle est réalisée dans un réacteur.
Un excès de biomasse de Penicillium peut entraîner la formation d'un agrégat, ou"gâteau", qui peut nuire à un contact optimum entre le micro-organisme et la solution.
Avantageusement, selon la présente invention, la biomasse de Penicillium est mise en contact avec la solution du composé nitroaromatique à une concentration de 50 à 800 g en poids frais de biomasse par litre de solution dudit composé, par exemple environ 150 g/1.
Lorsque le procédé de la présente invention se rapporte à un procédé d'élimination d'un composé nitroaromatique présent dans un sol les conditions adéquates pour une minéralisation du, au moins un,
composé nitroaromatique présent dans ledit sol par la souche de Penicillium sont bien entendu les conditions favorables au métabolisme de la souche de Penicillium pour minéraliser le composé nitroaromatique à éliminer.
Ces conditions sont notamment celles précédemment décrites.
Il est à noter de plus que la souche de Penicillium se développe mieux en milieu humide.
Aussi, avantageusement, ce procédé de l'invention peut comprendre en outre, avant, pendant ou après l'étape de mise en contact du sol à traiter avec la biomasse, une étape d'inondation dudit sol avec une solution aqueuse, de manière à former une solution du composé nitroaromatique.
Le procédé de minéralisation d'un composé nitroaromatique en solution conforme à l'invention et tel qu'il est précédemment décrit peut alors tre appliqué.
L'homme du métier comprendra aisément que l'humidification du sol peut tre naturelle, notamment par les eaux de pluies. Dans ce cas, l'étape d'inondation dudit sol avec une solution aqueuse se fera naturellement avec l'eau d'une pluie.
Selon l'invention, la mise en contact du sol, ou de la solution formée par inondation du sol, peut tre effectuée par dispersion d'une souche de Penicillium sur le sol à traiter, avantageusement d'une biomasse de la souche de Penicillium, avant ou après l'inondation dudit sol. Le sol peut bien entendu tre inondé avec une solution aqueuse contenant la biomasse de Penicillium.
Une source de carbone, un tampon de pH et un additif tels que ceux précités peuvent également tre
dispersés sur le sol avant ou lors de la mise en contact avec la souche de Penicillium.
Le procédé de l'invention est très avantageux par rapport aux procédés de l'art antérieur. En effet, les inventeurs ont notamment montré que la souche de Penicillium permet de minéraliser aisément plus de 75% d'un composé aromatique tel que ceux précités, par exemple du TNT, du DNT et leurs dérivés, alors que les procédés microbiologiques de l'art antérieur dépassent rarement les 10% de minéralisation de ces composés.
Cette minéralisation correspond à une dégradation, ou biodégradation, totale ou quasi-totale du composé nitroaromatique.
De plus, de manière inattendue, le procédé de l'invention permet de traiter une solution avec les résultats ci-dessus mme lorsqu'elle est saturée en composé nitroaromatique, c'est-à-dire qu'elle contient environ 100 mg/l, et jusqu'à 120 mg/1, de composé nitroaromatique, par exemple du TNT, du DNT et leurs dérivés. Cette concentration est très forte et s'opposait a priori à l'utilisation d'un micro- organisme pour éliminer ces composés.
De plus, le procédé de l'invention est un procédé non polluant car il génère peu ou pas de métabolites intermédiaires à partir du (des) composé (s) nitroaromatique (s), il ne nécessite pas de produits chimiques polluants, et il utilise un micro-organisme qui est inoffensif.
De plus, le procédé de l'invention est un procédé très économique, car il utilise une souche de micro- organisme qui n'est pas chère, qui est disponible dans
le commerce, et qui se développe facilement, mme à des températures voisines de 4°C.
De plus, Penicillium a tendance à former des pelotes ("pelets"en anglais), qui peuvent tre extraites très facilement d'une solution, par exemple par simple filtration, ce qui facilite les traitements de solutions, tels que des effluents industriels, par exemple en continu.
De nombreux autres avantages et caractéristiques de la présente invention pourront encore se révéler à l'homme de l'art à la lecture des exemples illustratifs et non limitatifs qui suivent, en référence aux figures en annexe.
Brève description des figures en annexe -les figures 1A et 1B sont des représentations graphiques illustrant l'effet du glucose sur la minéralisation du TNT par le procédé de la présente invention, le graphique 1A représentant la minéralisation du TNT sans glucose et le graphique 1B la minéralisation du TNT en présence de glucose ; -les figures 1C et 1D sont des représentations graphiques de cinétiques de formation de nitrites en présence (figure 1D) ou en absence (figure 1C) de glucose ; -la figure 2 est une représentation graphique de l'effet de la concentration en TNT dans la solution sur la minéralisation de ce dernier par le procédé de la présente invention en fonction du temps en jours ;
-la figure 3 est une représentation graphique de la dégradation de TNT dans une solution selon le procédé de l'invention ; et -la figure 4 est un schéma illustrant une identification des métabolites extractibles formés lors de la minéralisation du TNT par le procédé de l'invention, par une analyse effectuée sur couche mince de silice couplée à un scanner de radioactivité sur plaques.
Exemples Exemple 1 : préparation d'une biomasse de Penicillium Le milieu de culture utilisé pour la préparation de la biomasse est constitué de 0,5 g/l de KH2PO4, de 0,1 g/l de K2HO4, de 30 g/l de glucose, de 10 g/l d'hydrolysat de mais de la marque de commerce Corn Steep (offert par la Société des Produits du Maïs), de 0,5 g/l de MgS04, de 2 g/l de NaNO3, de 0,5 g/l de Kcl et de 0,02 g/l de FeS04.
La souche de Penicillium utilisée, appelée Penicillium sp. LCM par les présents inventeurs, a été déposée sous le numéro 1-2081 à la CNCM (Institut Pasteur, France).
Les cultures sont réalisées dans des erlenmeyers et agités durant trois jours à 250 tours par minute à une température de 27°C.
La biomasse formée est ensuite récupérée par filtration.
Exemple 2 : élimination de composés nitroaromatiques présents dans une solution selon le procédé de la présente invention Conditions d'incubation et d'analyse de la biodégradation des composés nitroaromatiques Les composés nitroaromatiques dans cet exemple sont du trinitrotoluène (TNT), du 2,4-dinitrotoluène, et du 2,6-dinitrotoluène.
Une solution de TNT à 62 g/l dans l'acétone nous a été fournie par la Société Nationale des Poudres et Explosifs (Vert-Le-Petit, France).
Le TNT uniformément marqué au 14C provient de Chemsyn Science Laboratoires, USA et il présente les caractéristiques suivantes : 21,5 mCi/mmole-100 uCi/ml dans l'eau.
Le 2,4-dinitrotoluène provient de la Société Rhône-Poulenc (France), et le 2, 6-dinitrotoluène de la Société Aldrich (catalogue Aldrich).
La dégradation des composés nitroaromatiques est effectuée avec biomasse fraîche préparée dans l'exemple 1, sur une table à agitation rotative à 250 tours/minute, dans une pièce thermostatée à 27°C.
Le composé nitroaromatique est ajouté à raison de 0,05 ou 0,1 g/l dans 7,5 g de biomasse fraîche remis en suspension dans 50 ml d'eau distillée glucose à 1,5% (15 g de glucose/litre de solution). La biomasse fraîche est donc à une concentration de 150 g pour 1 litre de solution.
Dans le cadre de l'étude de la minéralisation du composé nitroaromatique, les expériences sont réalisées en présence de traceurs radiomarqués (50 ul).
Le suivi de la dégradation du TNT radiomarqué ou non, ou des dinitrotoluènes 2,4 ou 2,6, est réalisé par Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP) à ) =254 nm sur une colonne de graphite poreux Hypercab (marque de commerce) fournie par la Société Shandon, FRANCE, éluée avec 80% d'acétonitrile, 0,05% d'acide trifluoroacétique et de l'eau.
Le système chromatographique est composé d'un injecteur Waters 717 (marque de commerce), d'une pompe Waters 600E (marque de commerce) (débit 1 ml/min), d'un détecteur W Waters 486 (marque de commerce) opérant à 220 nm fournis par la Société WATER, FRANCE et d'un détecteur de radioactivité Monitor LB 506 C-1 (marque de commerce) fourni par la Société Berthold, FRANCE.
La radioactivité totale est mesurée par comptage à l'aide d'un capteur à scintillation liquide LKB 1214 Rackbeta (marque de commerce) fournie par la Société Wallac.
La concentration en nitrite est déterminée par la méthode de Griess. Dans des plaques Elisa 96 puits, 50 ul d'échantillon à doser sont mélangés à 50 pi du réactif de Griess (5% sulfanilamide dans HC1 2M+0,5% de N-1-naphtyléthylènediamine dans HC1 2M, pourcentages exprimés en V/V) dans des microplaques.
Après 20 minutes à température ambiante, l'absorbance à 540 nm est mesurée par un lecteur de plaque Elisa fourni par la Société Dynatech.
Les nitrites et nitrates ont également été analysés par CLHP sur une colonne Hypersyl ODS (marque de commerce) fournie par la Société Shandon : 5 mm, 4,6x250 mm) par appariement d'ions : 10% MeOH/PiC A (Waters) 5 mM, à 210 nm. Les temps de rétention sont de 4,9 minutes pour les nitrites et de 6,0 minutes pour
les nitrates. Les concentrations sont évaluées par rapport à une courbe d'étalonnage de 0 à 200 uM.
Le TNT est analysé par chromatographie sur couche mince (CCM) sur plaque de silice, en présence de l'éluant acétate d'éthyl (Rf = 0,87). La radioactivité associée aux différentes tâches CCM a été mesurée à l'aide d'un analyseur linéaire automatique de couche mince Tracemaster 20 (marque de commerce) fourni par la Société Berthold.
Extraction des produits de transformation Le milieu d'incubation est centrifugé 15 minutes à 10 000 tours/min à 4°C, puis extrait trois fois à l'acétate d'éthyle. La phase organique récupérée est séchée sur MgS04. Après filtration, le solvant est éliminé au rotavapor. Une purification sur plaque de silice semi-préparative est réalisée sur support gel de silice. Les différentes fractions de silice chargées en produits de transformation sont récupérées et reprises dans l'acétate d'éthyle. La silice est éliminée par filtration et le filtrat est évaporé et séché. Les fractions ainsi récupérées sont ensuite analysées.
1-Effet du glucose sur la minéralisation du TNT par le procédé de l'invention Les essais ont été réalisés dans des solutions comprenant 100 mg/1 de TNT, 150 g/l de biomasse fraîche, et une concentration en glucose en g/l variable. La radioactivité à l'issue de 5 jours a été mesurée dans chaque essai.
Les figures 1A et 1B en annexe sont des graphiques illustrant les résultats de ces mesures sur lesquels l'ordonnée représente la radioactivité au bout de 16
jours en coups par minute (CpmxlO3)/ml dans la solution.
Sur les figures 1A et 1B, représente la radioactivité initiale dans la solution, représente la radioactivité totale, représente la radioactivité totale en présence de Hcl, représente la radioactivité associée au surnagent, et représente la radioactivité associée à la biomasse.
Ces figures 1A et 1B montrent que le glucose favorise la minéralisation du TNT : 46,7% de minéralisation en absence de glucose contre 66,7% en présence de glucose en 16 jours d'incubation dans les conditions précitées. La radioactivité initialement associée au TNT est assimilée de manière plus importante en milieu non enrichie en source de carbone.
Le glucose favorise donc la minéralisation du TNT.
Lors de ces expériences, la concentration en nitrite a été mesurée. La présence de glucose dans le milieu d'incubation inhibe totalement la formation de NO2-. Par contre, en absence de glucose, on atteint des concentrations en nitrites voisines de 230 uM, correspondant à 17,4% des nitrites susceptibles de se former à partir du TNT par dénitrification.
Il semble donc que la dénitrification qui se déroule dans des conditions oxydatives, c'est-à-dire en l'absence d'équivalents réducteurs, c'est-à-dire de glucose, n'est pas forcément propice à la minéralisation qui semble tre favorisée dans des conditions réductrices, c'est-à-dire en présence de glucose.
Des mesures de cinétique de la formation de nitrites en présence ou en absence de glucose ont été réalisées sur les solutions précédemment décrites.
Les résultats de ces mesures ont été reportés sur les figures 1C et 1D en annexe : la figure 1C illustrant la cinétique de formation des nitriques en zip dans la solution en absence de glucose en fonction du temps en jours, et la figure 1D illustrant la cinétique de formation des nitrites en uM dans la solution en présence de glucose en fonction de temps en jours.
D'après ces résultats, il semble donc que la dénitrification, qui se déroule dans des conditions oxydatives, c'est-à-dire en l'absence de glucose, n'est pas forcément propice à la minéralisation qui semble tre favorisée dans les conditions réductrices, c'est- à-dire en présence de glucose.
A partir du cinquième jour d'incubation, la minéralisation de TNT par Penicillium sp. LCM se stabilise. Cette stabilisation est brutale et intervient à un moment où la biomasse semble peu détériorée. Un déficit en nutriments, une toxicité du TNT ou de ses métabolites vis-à-vis du micro- organisme, ou encore une perte de viabilité de la souche peut conduire à une diminution de l'activité catalytique et expliquer cette inhibition.
2-Effet de la concentration initiale en TNT sur la minéralisation du TNT par le procédé de l'invention La solubilité maximale du TNT dans l'eau à température ambiante est de 100 mg/1 (saturation à température ambiante). Afin de vérifier si cette concentration n'est pas trop élevée pour permettre une
minéralisation totale du TNT ou de ses dérivés les 2,4 et 2,6-DNT, nous avons réalisé des incubations à 50 mg/1 et à 100 mg/1 de TNT. Les essais ont été réalisés à 27°C, sous agitation à 150 rpm, en présence de 150 g/l de biomasse fraîche de Penicillium et de 15 g/l de glucose.
Les résultats de ces mesures ont été reportés dans le tableau II suivant.
Tableau II temps en ; 0 1 2 3 4 7 solution à Cpm* 50 mg TNT/1 103/ml 48 41 44 19 14 15 solution à Cpm* 100 mg TNT/1 103/ml 46 47 44 29 16 15 Cpm*= coups par minute-déterminé par une mesure de la radioactivité.
La figure 2 en annexe est un graphique réalisé à partir de ces mesures sur lequel l'abscisse représente le temps en jours et l'ordonnée la mesure de la radioactivité en coups par minute (Cpm) xl03/ml. Ces résultats montrent qu'à 50 mg de TNT/1 (courbe référencée 2A sur la figure 2) et qu'à 100 mg de TNT/1 (courbe référencée 2B sur la figure 2), le pourcentage de minéralisation du TNT par Penicillium est identique après 7 jours d'incubation et se stabilise à environ 70%.
3-Minéralisation du TNT Des essais ont été réalisés comme précédemment, avec une solution comprenant 100 mg/1 de TNT en présence de TNT radiomarquée sur tous les atomes de carbone du cycle. Cette solution comprenait en outre 150 g/l de biomasse fraîche de Penicillium tel que dans l'exemple 1 précédent, et 15 g/l de glucose. La mise en contact a été réalisée à une température de 27°C sous agitation à 150 rpm.
Le tableau III suivant regroupe les mesures effectuées pour ces essais.
Tableau III temps en jours 0 1 2 4 6 7 8 10 100 mg/1 de TNT (Cpm*xl03) 52 21 19 7 8 9 10 10 Cpm* : voir tableau II La figure 3 en annexe est un graphique réalisé à partir de ces mesures sur lequel l'abscisse représente le temps en jours et l'ordonnée la mesure de la radioactivité en coups par minute (Cpm).
Ces résultats montrent une minéralisation de 79% du TNT en 10 jours.
4-Identification des métabolites extractibles formés lors de la minéralisation du TNT par le procédé de l'invention Une chromatographie liquide haute performance nous a permis de montrer une disparition totale du TNT en 24 heures, sans apparition de métabolites connus tels que du dinitrotoluène, de l'amino-dinitrotoluène, du
diamino-nitrotoluène dérivés du TNT à partir d'une solution de 100 mg/1 de TNT. Cette observation a été confirmée par l'analyse des extraits (acétate d'éthyle) du milieu d'incubation par chromatographie sur couche mince de silice couplée à un scanner de radioactivité sur plaques. La figure 4 en annexe est un schéma illustrant cette analyse. En effet, dans le solvant CCM utilisé, la radioactivité résiduelle après 24 heures se retrouve totalement associée au dépôt. Elle ne représente plus que 25 à 30% de la radioactivité initiale, et ne correspond ni au 2,4- ni au 2,6-DNT qui ont dans ce système des Rf de 0,8 environ.
Compte tenu du pourcentage important de minéralisation du TNT, supérieur à 70% la radioactivité résiduelle dans les surnageants est faible et limite la détection de métabolites éventuels. Nous avons donc réalisé des expériences préparatives sur 1 litre de TNT à une concentration de 100 mg/1 afin d'extraire les éventuels composés résiduels en quantité suffisante pour les caractériser. A la fin de la réaction et malgré plusieurs extractions, le rendement global n'est que de 20% environ. Nous avons isolé un composé majoritaire (7%) de poids moléculaire P. M. 182. Ce produit non visible sur la plaque radioactive (Rf=0,4) précédemment décrite est présent à une concentration trop faible pour tre détecté par le scanner. Bien que ce poids moléculaire soit identique à celui des DNT, le produit isolé n'est pas du DNT car les Rf en CCM sont différents.
5-Conclusion Le champignon filamenteux de Penicillium sp. LCM permet donc une dégradation complète du TNT et de ses dérivés tels que les 2,4 et 2,6-DNT en solution à 100 mg/1 en moins de 24 heures, associée à une minéralisation de plus de 70% en 5 jours. Un tel pourcentage de minéralisation à 100 mg/1 de TNT et de ses dérivés tels que les 2,4 et 2,6-DNT n'a, à notre connaissance, jamais été rapporté précédemment dans la littérature. L'étude de l'influence de plusieurs facteurs a permis de montrer que l'absence de glucose inhibe légèrement la minéralisation du TNT, mais favorise la dénitrification de ce dernier, que la température et le pH ont un effet sur la minéralisation du TNT et de ses dérivés tels que les 2,4 et 2,6-DNT.
Exemple 3 : élimination de composés nitroaromatiques présents dans un sol selon le procédé de la présente invention Un sol contenant du TNT pourra tre inondé d'une solution aqueuse contenant un tampon phosphate 50 mM et de l'amidon comme source de carbone.
Une biomasse de Penicillium peut tre préparée comme dans l'exemple 1, puis répartie sur le sol.
Dans un autre essai, la solution destinée à inonder le sol peut contenir à la fois le tampon phosphate 50 mM, l'amidon, et la biomasse.
Next Patent: DENITRIFYING COMPOSITION FOR REMOVING NITRATE NITROGEN AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME