L'invention a trait à un procédé microbiologique de production de formiate à partir de CO2 catalysé par une bactérie méthanotrophe de classe II, et notamment par la souche bactérienne Methylosinus trichosporium OB3b. L'invention a également pour objet un procédé de valorisation du CO2 au moyen d'une bactérie méthanotrophe de classe II, et notamment la souche bactérienne Methylosinus trichosporium OB3b.

Arrière-plan technolo ique L'acide formique ou acide méthanoïque est un acide carboxylique aliphatique d'origine naturelle dont la forme basique est l'ion formiate, qui se présente sous la forme d'un liquide incolore à odeur persistante. Cette molécule a été tout d'abord découverte dans des produits de distillation de corps de fourmis. Elle se retrouve plus généralement dans les glandes de plusieurs insectes hyménoptères, ainsi que dans certaines plantes urticantes telles que les orties. De nos jours elle est synthétisée, à des fins industrielles, principalement par voie chimique. En effet, l'acide formique trouve de nombreuses applications dans l'industrie du cuir et du textile, dans la composition des teintures et produits de traitement, les insecticides, les solvants, les fumigènes, les produits de traitement anti-moisissures, etc., mais également dans la parfumerie et l'industrie agro-alimentaire en tant que molécule aromatique. Récemment, il a été montré que l'acide formique peut être utilisé comme carburant dans des piles à combustibles (Yu et al., 2008, Journal of Power Sources, 182(1), 124-132) ou pour stocker de l'hydrogène qui peut ensuite être libéré par déshydrogénation de l'acide formique (Fellay et al. 2008, Angewandte Chemie, 120(21), 4030-4032). La possibilité d'utiliser l'acide formique en tant que vecteur énergétique laisse présager que les besoins en acide formique vont s'accroître dans les prochaines années.

Jusqu'à présent, l'acide formique est quasiment exclusivement produit par synthèse chimique, en conditions extrêmes (de pression, température et pH) par l'hydrolyse du formamide (HC(0)NH2) obtenu par réaction du formiate de méthyle (HCO2CH3) avec de l'ammoniac ; le formiate de méthyle étant quant à lui synthétisé à partir de méthanol et de monoxyde de carbone (John et al., 1985 Encyclopedia of Chemical Processing and Design : Volume 23).

Des voies de synthèse biologique ont été étudiées. Néanmoins, les rendements sont encore trop faibles pour être industriellement intéressants. Ainsi, on connaît par le document W095/19425 un procédé microbiologique faisant intervenir une souche bactérienne phénotypiquement proche du genre Bacillus pour produire, en présence de facteurs de croissance, du lactate et de l'acide formique à partir de glucose. Mais, outre la consommation importante de glucose, ce procédé requiert l'utilisation d'une grande quantité de facteurs de croissance (extrait de levure/caséine trypsique). On connaît également, par le document FR2745297, un procédé de fabrication d'acide formique par une bactérie lactique homofermentaire présentant une déficience dans le transport ou le métabolisme du lactose et capable de transformer ledit lactose en acide formique. Là encore, la mise en œuvre du procédé nécessite une source de sucre fermentescible. En outre, la réaction ne peut avoir lieu qu'en présence d'une concentration élevée en substances azotées et notamment en extrait de levure. Il n'est donc pas économiquement intéressant de produire de l'acide formique à l'échelle industrielle par les procédés microbiologiques actuellement disponibles.

Une voie de synthèse biochimique du formiate (forme basique de l'acide formique) à partir de dioxyde de carbone (C0 ₂ ) a également été étudiée. Plus précisément, des enzymes de type formiate déshydrogénase (FDH) extraites de microorganismes, ont été purifiées et modifiées pour améliorer leur performances de catalyse, et utilisées pour réduire le CO2 en formiate (Alissandratos et al. 2013, Appl Environ Microbiol., 79(2), 741-4 ; Spinner et al., 2012 Catal. Sci. Technol., 2, 19-28). Néanmoins, l'addition d'un cofacteur onéreux (le NAD) est nécessaire pour réaliser la réaction de bioconversion, rendant cette alternative également incompatible avec une application industrielle. Résumé de l'invention

En travaillant sur la valorisation du CO2, les inventeurs ont découvert que des bactéries méthanotrophes de classe II, connues pour utiliser le méthane comme seule source d'énergie et de carbone, sont également aptes à convertir directement et sélectivement le CO2 en formiate dans des conditions physiologiques douces. Notamment, les inventeurs ont montré que la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b est apte à produire des quantités de formiate importantes (par comparaison aux autres voies de synthèse du formiate connues jusqu'à présent), en utilisant le CO2 comme seule source de carbone. L'utilisation de ces bactéries méthanotrophes de classe II, telle que la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b, pour produire du formiate permet donc simultanément de transformer le CO2 et de limiter l'émission de ce gaz à effet de serre dans l'atmosphère.

L'invention a donc pour objet un procédé de production de formiate à partir de CO2, caractérisé en ce qu'il comprend une étape selon laquelle on met une bactérie méthanotrophe de classe II en contact avec du CO2.

Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie méthanotrophe de classe II est Methylosinus trichosporium OB3b.

Le procédé selon l'invention peut comprendre une étape préliminaire selon laquelle la bactérie méthanotrophe de classe II est cultivée dans un milieu de culture en présence de méthane (CH ₄ ) et d'air.

L'étape de réduction du CO2 en formiate peut être réalisée sous air atmosphérique ou sous mélange gazeux contenant du CO2 ou sous CO2 pur.

Avantageusement, le procédé comprend une étape additionnelle de récupération du formiate et/ou d'acide formique.

L'invention a également pour objet un mélange réactionnel susceptible d'être obtenu par la mise en œuvre d'un tel procédé, ledit mélange comprenant au moins 150 mg de formiate/g de cellules sèches, préférentiellement au moins 250 mg de formiate/g de cellules sèches, de manière encore préférée au moins 350 mg de formiate/g de cellules sèches.

L'invention a également pour objet un procédé de criblage d'une bactérie méthanotrophe de classe II capable de produire du formiate par réduction du CO2, comprenant les étapes consistant à : (a) Mettre une bactérie méthanotrophe de classe II en suspension dans un milieu de réaction en présence de CO2 ; (b) Vérifier la présence de formiate dans le mélange réactionnel; et si du formiate est détecté à l'étape (b)

(c) Sélectionner la bactérie.

L'invention a également pour objet une bactérie méthanotrophe de classe II, isolée d'un consortium bactérien ou non, obtenue ou pouvant être obtenue selon un tel procédé de criblage.

L'invention concerne également l'utilisation d'une bactérie méthanotrophe de classe II, et notamment de la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b ou d'une bactérie obtenue ou pouvant être obtenue par le procédé de criblage, pour la production de formiate par réduction de C0 ₂ . L'invention a aussi pour objet un procédé de valorisation du C0 ₂ comprenant la réduction du C0 ₂ en formiate par une bactérie méthanotrophe de classe II, telle que la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b ou une bactérie obtenue ou pouvant être obtenue par le procédé de criblage. Un tel procédé comprend avantageusement la mise en œuvre du procédé de production de formiate ci-dessus. Brève description des figures

Figure 1 : Voie métabolique de la réduction du C0 ₂ (cas de la voie sérine) dans une bactérie méthanotrophe de classe II ;

Figure 2. Suivi cinétique de la concentration en formiate total (Figure 2. a) et suivis cinétiques du pH et de la DOôoonm (Figure 2.b) en réacteur fermé ; Figure 3. Suivis cinétiques de la concentration en formiate total, du pH et de la DOôoonm en réacteur semi-continu ;

Figure 4. Suivi cinétique de viabilité des bactéries par croissance cellulaire lors de

l'expérience en réacteur semi-continu. Description détaillée de l'invention

Les inventeurs ont découvert que des bactéries méthanotrophes de classe II, et notamment la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b, sont capables de produire du formiate en grandes quantités par réduction directe du CO2 dans des conditions opératoires douces. Cette découverte est très intéressante à plusieurs niveaux. Tout d'abord, contrairement à la bactérie Methylosinus trichosporium IMV 3011 (J.Y. Xin et al., 2007- Journal of Basic Microbiology, 47(5), 426- 435) qui produit du méthanol, la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b produit du formiate, avec des productions au moins 200 fois plus importantes que celle reportée pour le méthanol. Par ailleurs, Methylosinus trichosporium OB3b est apte à produire sélectivement du formiate en utilisant comme seule source de carbone le CO2, et cela sans apport de cofacteurs ou facteurs de croissance coûteux. De plus, les inventeurs ont pu obtenir des concentrations très élevées de formiate, jusqu'à environ 20 mM, ce qui est bien supérieur aux quantités obtenues jusqu'à présent par les procédés microbiologiques disponibles.

Forts de cette découverte, les inventeurs ont mis au point un procédé de production microbiologique de formiate à partir de CO2, comprenant une étape de mise en contact d'une bactérie méthanotrophe de classe II, telle que la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b,

Dans le contexte de l'invention, on désigne par « bactéries méthanotrophes » les bactéries capables de se développer en utilisant le méthane comme seule source de carbone et d'énergie. On désigne par « bactéries méthanotrophes de classe Π » les bactéries méthanotrophes appartenant au groupe des Protéobactéries a qui inclue les quatre genres suivant : Methylosinus, Methylocystis, Methylocapsa et Methylocella. Les bactéries méthanotrophes de classe II utilisent la voie sérine pour l'assimilation du carbone.

Avantageusement, le procédé selon l'invention est mis en œuvre en utilisant la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b.

Comme indiqué précédemment, la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b est une bactérie méthanotrophe du groupe II (NCBI : Taxonomy ID : 595536 ; GenBank ADVE00000000 ; NCJJVIB : 11131). Elle fut initialement isolée en 1970 par Roger Whittenbury. Son génome a été séquencé en 2010 (L. Stein et al., 2010 - Journal of Bacteriology, p. 6497-6498). Dans le contexte de l'invention, on utilise indifféremment les termes « M. trichosporium OB3b » et « bactérie OB3b » pour désigner la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b.

Selon l'invention, la bactérie est mise en contact avec du CO2, avantageusement dissous dans un milieu de réaction dans lequel la bactérie est maintenue. Par « milieu de réaction », on entend le milieu dans lequel la bactérie est maintenue, pour produire spécifiquement du formiate, et dans lequel le CO2 apporté va être dissous, que ce milieu permette ou non la production de biomasse. Dans le contexte de l'invention, le milieu de réaction comprend au moins de l'eau, des sels minéraux et du CO2 dissous.

Le CO2 utilisé peut être le CO2 provenant de l'air atmosphérique, ou provenir en tout ou partie d'un apport spécifique en CO2. Notamment, le CO2 peut provenir de CO2 pur ou d'un mélange gazeux, tel qu'un mélange C0 ₂ -air, CO2-O2, CO2-CH4, CO2-H2, CO2-CH4-H2, C0 ₂ -CH ₄ -air ou C02-CH ₄ -02. Dans un mode de réalisation particulier, le mélange gazeux comprend au moins 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% de C0 ₂ . Dans un mode de réalisation particulier, le mélange gazeux est un mélange équivolumique CO2-O2. Le formiate étant obtenu directement par réduction du CO2, le rendement en formiate du procédé selon l'invention dépend directement de l'apport en CO2. L'homme du métier saura adapter les concentrations en CO2 aux rendements souhaités. Dans un mode de réalisation particulier, la concentration en CO2 dissous dans le milieu de réaction est comprise entre environ 30 et environ 50 mM. Selon l'invention, l'apport en CO2 peut être réalisé par tout moyen connu et notamment par des contacteurs membranaires (Pen et al. 2014, Bioresource Technology, 174, 42-52), un fritté poreux de distribution de gaz (Kim et al. 2010, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 15(3), 476-480 ; Duan et al. Bioresource Technology, 102(15), 7349-7353) ou un simple contact gaz-liquide (milieu de réaction) dans un réacteur fermé (Pen et al. 2014, Bioresource Technology, 174, 42-52).

Dans un exemple de réalisation, il est également possible d'ajouter du molybdène à l'état de trace dans le milieu de réaction, de manière à promouvoir le fonctionnement de l'enzyme FDH de la bactérie (figure 1) et ainsi la production de CO2. Dans un exemple de réalisation, le pH dans le milieu de réaction est maintenu entre 6 et 8, préférentiellement à pH 6,5, +/- 0,5. De même la température dans le milieu réaction est préférentiellement maintenue entre 20°C et 50°C, de manière préférée entre 25°C et 35°C, et de manière encore préférée à 30°C, +/- 1. Selon l'invention, il est possible préalablement à l'étape de réaction, c'est-à-dire préalablement à la mise en contact de la bactérie avec le C0 ₂ pour produire le formiate, de placer la bactérie dans un milieu de culture dans des conditions de température et de pH favorables à sa croissance.

Par « milieu de culture », on entend le milieu dans lequel les bactéries sont mises à croître, pour produire de la biomasse bactérienne. Le milieu de culture comprend de manière classique les éléments chimiques strictement nécessaires à la croissance bactérienne sous une forme utilisable par les bactéries, à savoir une source de carbone (et notamment du méthane), des sels minéraux et de l'eau. Des milieux standards sont disponibles dans le commerce, décrits dans la littérature scientifique ou dans les catalogues des fournisseurs de souches bactériennes. L'homme du métier sait quels sont les composants minimums requis en l'absence desquels les bactéries méthanotrophes de classe II ne peuvent se développer, et peut sans difficultés cultiver une telle bactérie, et notamment Methylosinus trichosporium OB3b. De manière avantageuse, le milieu de culture comprend comme seule source de carbone du méthane. Les conditions générales de culture (température, composition du milieu, agitation, etc.) permettant la croissance ou le maintien des bactéries, sont aisément définies par l'homme du métier selon la souche bactérienne utilisée.

Sans être liés par une quelconque théorie, les inventeurs pensent que Methylosinus trichosporium OB3b est capable de réduire le CO2 en formiate en utilisant le poly-β- hydroxybutyrate (PHB), polymère intracellulaire de stockage de l'énergie qu'elle produit en grande quantité, comme donneur d'électrons pour la régénération du cofacteur NAD (figure 1). Aussi, dans un mode de réalisation particulier, le procédé comprend une étape préalable selon laquelle la bactérie est mise à croître dans des conditions lui permettant de produire de plus grandes quantités de PHB, et notamment en la maintenant préférentiellement en présence de CH ₄ et d'air, dans des conditions limitantes en azote, phosphore et/ou oxygène. Après l'étape de culture, la bactérie est avantageusement lavée de son milieu de culture et mise en suspension dans du milieu de réaction avant la mise en contact avec du C0 ₂ .

Tout ou partie du procédé selon l'invention peut être mis en œuvre à l'échelle du laboratoire ou à l'échelle industrielle, c'est-à-dire sur des fermenteurs de moyenne (d'environ 1 à 100 m ³ ) ou de grande capacité (de plus de 100 m ³ ).

Dans un mode de réalisation particulier du procédé de l'invention, l'étape de réduction du CO2 par la bactérie méthanotrophe de classe II est conduite dans un bioréacteur, ou fermenteur. Selon l'invention, il est possible d'utiliser un réacteur fermé, semi-continu ou continu, de manière à conduire une réaction en « batch », en « fed batch » ou en continu.

Ainsi, à titre d'exemple, dans un réacteur fermé, sous air atmosphérique, la concentration en formiate peut atteindre 400 mg/L ± 50 mg/L, au bout de 15 jours de réaction à 30°C ; tandis que sous mélange 50% air et 50% CO2, la concentration en formiate est supérieure à 700 mg/L ± 50 mg/L, au bout de 15 jours de réaction à 30°C. En réacteur semi-continu, sous air atmosphérique, on obtient 400 mg/L ± 50 mg/L de formiate au bout de 15 jours de réaction à 30°C.

Le procédé selon l'invention permet notamment d'obtenir au moins 150 mg de formiate/g de cellules sèches, préférentiellement au moins 250 mg de formiate/g de cellules sèches, de manière encore préférée au moins 350 mg de formiate/g de cellules sèches après un temps de réaction compris entre 10 et 15 jours.

Dans un mode de mise en œuvre particulier, le procédé de production de formiate selon l'invention comprend les étapes consistant à :

Introduire une bactérie méthanotrophe de classe II dans un bioréacteur contenant un milieu de réaction ;

Approvisionner le milieu de réaction en un gaz contenant du CO2 ; et optionnellement

Récupérer le formiate produit dans le bioréacteur par réduction du CO2, sous forme de formiate et/ou d'acide formique. Dans un mode de mise en œuvre du procédé selon l'invention, le formiate produit est récupéré sous forme d'acide formique à partir du milieu de réaction.

Dans un mode de réalisation particulier, l'étape de récupération de l'acide formique à partir du milieu de réaction est réalisée par électrodialyse ou par extraction-liquide avec un co- solvant. Ces dispositifs de récupération permettent de récupérer en continu l'acide formique et éviter ainsi l'éventuelle inhibition des bactéries par un excédent de produit, tout en obtenant un acide formique exempt d'impuretés (comme les sels du milieu de réaction). Dans le cas d'une récupération en continu du produit, un apport continu en C0 ₂ peut être réalisé dans le bioréacteur. Dans le cas d'un procédé de récupération par électrodialyse, un module d' électrodialyse bipolaire est avantageusement couplé avec un module de microfiltration pour séparer et récupérer en continu le formiate produit sous sa forme acide (acide formique). En particulier, Γ électrodialyse bipolaire peut être réalisée sur un milieu de réaction sans biocatalyseurs, obtenu en continu après avoir séparé les bactéries du milieu par un module de microfiltration tangentielle. L' électrodialyse bipolaire consiste à combiner une membrane bipolaire pour acidifier le formiate en acide formique et des membranes monopolaires pour extraire les sels du milieu de réaction.

Le formiate et/ou l'acide formique obtenu à partir d'un tel procédé microbiologique peut être avantageusement utilisé dans toute industrie susceptible d'en avoir besoin, et notamment dans l'industrie du cuir et du textile, dans la parfumerie, dans l'industrie agro-alimentaire, etc. Par exemple, le formiate et/ou l'acide formique issu du procédé selon l'invention peut être utilisé dans la composition de teintures, d'insecticides, de solvants, de fumigènes, de produits de traitement anti-moisissures ou en tant que molécule aromatique, etc. Par ailleurs, le formiate et/ou l'acide formique issu du procédé selon l'invention peut s'avérer particulièrement utile en tant que carburant dans des piles à combustibles ou pour stocker de l'hydrogène. L'invention a également pour objet le mélange réactionnel susceptible d'être obtenu par la mise en œuvre du procédé décrit ci-dessus. Avantageusement, ledit mélange comprend au moins 150 mg de formiate/g de cellules sèches, préférentiellement au moins 250 mg de formiate/g de cellules sèches, de manière encore préférée au moins 350 mg de formiate/g de cellules sèches.

Par « mélange réactionnel », on désigne un milieu de réaction comprenant au moins un microorganisme ainsi que les produits de la réaction catalysée par ledit microorganisme. Ainsi, selon l'invention, le mélange réactionnel désigne un milieu de réaction comprenant une bactérie méthanotrophe de groupe II capable de produire du formiate à partir de CO2, ainsi que du formiate. Par exemple, le mélange réactionnel comprend du milieu de réaction, la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b et du formiate.

L'invention a également pour objet un bioréacteur comprenant une suspension bactérienne de Methylosinus trichosporium OB3b dans un milieu de réaction, un système d'alimentation de gaz dans ladite suspension, et optionnellement des moyens pour alimenter la suspension en inoculum et/ou sels minéraux et/ou des moyens pour récupérer les produits de réaction.

L'invention a également pour objet l'utilisation d'une bactérie méthanotrophe de classe II capable de produire du formiate, telle que la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b pour la production de formiate par réduction de CO2.

L'utilisation d'une bactérie méthanotrophe de classe II telle que la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b pour produire du formiate permet de consommer de grandes quantités de CO2. Ainsi, l'invention fournit un procédé de valorisation du CO2 comprenant une étape de réduction du CO2 en formiate par une bactérie méthanotrophe de classe II, et notamment par la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b, mettant avantageusement en œuvre le procédé de production de formiate ci-dessus.

L'invention a également pour objet un procédé de criblage d'une bactérie méthanotrophe de classe II capable de produire du formiate par réduction du CO2, comprenant les étapes consistant à :

(a) Mettre une bactérie méthanotrophe de classe II en suspension dans un milieu de réaction en présence de CO2 ;

(b) Vérifier la présence de formiate dans le mélange réactionnel; et en cas de présence de formiate dans le milieu de réaction ;

(c) Sélectionner la bactérie.

Avantageusement, l'étape (b) de vérification de la présence de formiate se fait par comparaison avec un ou deux témoins négatifs. Un premier témoin peut consister en du milieu de réaction sous CO2 mais dépourvu de bactéries. Un second témoin peut consister en du milieu de réaction comprenant des bactéries mais dépourvu de CO2. La présence d'une bactérie méthanotrophe de classe II capable de produire du formiate par réduction du CO2 dans le milieu de réaction est confirmée si du formiate est détecté dans le mélange réactionnel et que dans le ou les témoins, il n'y a pas de formiate détecté.

Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de criblage comprend une étape préliminaire selon laquelle la bactérie est cultivée dans un milieu de culture en présence de méthane et d'air avant l'étape (a) de réaction.

L'invention a également pour objet une bactérie méthanotrophe de classe II, isolée d'un consortium bactérien ou non, obtenue ou pouvant être obtenue par un tel procédé de criblage.

D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront dans la partie expérimentale suivante, qui doit être regardée à titre illustratif, ne limitant en aucune façon l'étendue de la protection recherchée.

Exemples Matériel et méthodes

1) Souche bactérienne et culture cellulaire

La souche Méthylosinus trichosporium OB3b (NCIMB, 11131, Angleterre) est cultivée dans un milieu NMS (Nitrate Minerai Salts) modifié comme décrit dans Pen et al., 2014 (Bioresource Technology, 174, 42-52 : « An innovative membrane biorecator for méthane biohydroxylation »). La souche est maintenue par voie liquide avec des repiquages réguliers dans du milieu NMS frais (Nitrate Minerai Salts) modifié comme décrit dans Pen et al., 2014 (Bioresource Technology, 174, 42-52 : « An innovative membrane biorecator for méthane biohydroxylation »), c'est-à-dire un milieu de base constitué de 1,060 g/L KH2PO4; 4,340 g/L Na ₂ HP0 ₄ .12H ₂ 0; 1,700 g/L NaN0 ₃ ; 0,340 g/L K ₂ S0 ₄ et 0,074 g/L MgS0 ₄ .7H ₂ 0 enrichi par des minéraux usuels (0,570 mg/L ZnS0 ₄ .7H ₂ 0; 0,446 mg/L MnS0 ₄ .H ₂ 0; 0,124 mg/L H ₃ B0 ; 0,096 mg/L Na ₂ Mo0 ₄ .2H ₂ 0; 0,096 mg/L C0CI2.6H2O; 0,166 mg/L Kl; 7,00 mg/L CaCl2.2H20) mais aussi par du cuivre (1,25 mg/L CuS0 ₄ .5H20) et du fer (11,20 mg/L FeS0 ₄ .7H20). La culture cellulaire est réalisée dans un réacteur de culture cellulaire de 3 L (Biostat A plus, Sartorius, France) mis en œuvre à 30°C avec des débits gazeux fixés à 100 ± 5 mL.min ^"1 , respectivement pour le méthane et l'air. Une corrélation entre la densité optique (DO) de la suspension à 600 nm (DOôoonm) et la concentration en cellules sèches a été préalablement établie ([concentration en cellules sèches] (g/L) = 0,322 x DOôoonm (-), Pen et al., 2014). 2) Milieu de réaction et préparation de la suspension bactérienne

Les expériences sont conduites dans un milieu de réaction stérile (pH = 7,0 ± 0,1), composé de sels minéraux de 20 mM de phosphate et 5 mM de MgCl ₂ (Xin et al., 2007) dans de l'eau ultrapure. A la fin de l'étape de culture cellulaire, la culture bactérienne est centrifugée de manière stérile pendant 20 min à 4500 rpm et à 4°C. Le surnageant est ôté et les culots bactériens sont ensuite resuspendus dans le milieu de réaction, de telle sorte que la DOôoonm de la suspension bactérienne soit de l'ordre de 20 (déterminée d'après une dilution). La suspension mère ainsi obtenue est alors utilisée pour les expériences.

3) Bioréacteurs

Deux types de bioréacteurs ont été mis en œuvre : un bioréacteur fermé et un réacteur semi- continu. a. Réacteur fermé

Le réacteur fermé est un flacon étanche de 50 ml contenant 5 ml de liquide. Deux conditions ont été testées. L'espace de tête du flacon (45 ml) est rempli dans un cas, d'un mélange stérile et équivolumique d'air atmosphérique et de dioxyde de carbone (99,995 %) et dans l'autre cas, le mélange gazeux est seulement constitué d'air atmosphérique stérile ; les gaz de l'espace de tête sont tous à la pression atmosphérique. Il est à noter que l'air utilisé contient 0,039% volumique de C0 ₂ . Les gaz sont stérilisés au moyen de filtres hydrophobes en Téflon (0,2-μιη, Sartorius). Le réacteur est agité sur un plateau agitant (Unimax 1010, Heidolph) dans un incubateur. Le milieu des réacteurs est échantillonné stérilement avec une seringue. La réaction est conduite à 30 ± 1°C, sous une agitation de 160 rpm. Pour chaque cinétique, une série de flacons identiques est remplie avec la même suspension bactérienne et incubée. La réaction est arrêtée à différents temps de réaction. Deux types de témoins sont réalisés : dans un cas, le mélange bactérien dans le milieu de réaction est mis en contact d'azote stérile (99,995 %) et dans l'autre cas, le milieu de réaction seul est mis en contact d'un mélange stérile CC /air (1 : 1 v/v).

Chaque expérience est reproduite 3 fois. La concentration initiale moyenne de la suspension dans les réacteurs est 2,5 ± 0,3 g cellules sèches/L. b. Réacteur semi-continu

Le réacteur utilisé est un réacteur de culture cellulaire d'un volume total de 3L (Biostat A plus, Sartorius, France). Le volume utile est 1,6 L et la concentration initiale de la suspension bactérienne est 2,1 ± 0,2 g cellules sèches/L. Le réacteur est maintenu à 30°C avec des débits gazeux de 100 ± 5 ml. min ^"1 pour l'air et le C0 ₂ (cas d'un mélange CC /air 1 : 1 v/v). Les gaz sont stérilisés au moyen de filtres hydrophobes en Téflon (0,2-μιη, Sartorius).

Pour chaque expérience (en réacteurs fermés ou semi-continus), des échantillons sont prélevés régulièrement de manière à mesurer la DOôoonm et la concentration en formiate total. Dans le cas du réacteur fermé, l'échantillonnage effectué permet aussi de mesurer le pH au cours du temps.

4) Tests de croissance des bactéries

Afin de déterminer si tout ou partie des bactéries présentes au sein du réacteur semi-continu sont toujours vivantes, des prélèvements de la suspension du réacteur sont effectués au cours du temps et ensemencés dans du milieu de culture frais (3% v/v) puis mis en culture dans des flacons de culture étanches (de volume total 100 ml dont 35 ml de liquide). Le ciel gazeux est composé d'un mélange méthane/air (1 : 1 v/v) et le mélange gazeux est renouvelé chaque jour. La durée de la culture est fixée à 7 jours. La suspension mise en culture dans les flacons est prélevée (1 ml) initialement et au bout de 7 jours pour mesurer les DOôoonm initiale et finale.

5) Analyse du formiate total produit Immédiatement après collecte, une fraction des échantillons est transférée dans un Eppendorf de 2 mL et centrifugée pendant 3 min à 4500 rpm et 4°C pour stopper la réaction dans l'échantillon. Le surnageant est alors conservé à -20°C pour un dosage du formiate total par chromatographie ionique (Dionex ICS-1000). La colonne utilisée est une Dionex IonPac AS 19 et l'élution est réalisée avec la rampe de concentration en hydroxyde de potassium (KOH) suivante : 10 mM pendant 10 min, puis 1,75 mM.min ^"1 jusqu'à 45 mM et enfin 10 mM pendant 10 min.

Résultats

1) Résultats en réacteur fermé Les résultats obtenus en réacteur fermé sous mélange équivolumique d'air et de C0 ₂ et sous air seul sont présentés en Figure 2. Les témoins y sont également reportés.

Les témoins ne révèlent aucune présence de formiate (Fig. 2. a). En particulier, le témoin sous azote montre que les bactéries ne relarguent pas de formiate (en tant que produit microbien soluble) en cours d'expérience et le témoin sans bactéries sous mélange CC /air montre que la réduction spontanée du CO2 en formiate ne se produit pas.

L'apparition de formiate n'a lieu qu'en présence de CO2 et de bactéries (Fig. 2. a). L'évolution de la concentration en formiate au cours du temps a la même allure dans les deux cas testés (sous air et sous mélange air/CC ). En effet, la concentration croît, après une phase de latence de 10 jours, pour atteindre un maximum à 15 jours (environ 350 mg/L sous air et 750 mg/L sous mélange) puis diminue de 27 ± 1 % en moyenne dans les 2 cas à t = 20 jours.

Les concentrations en formiate atteintes sont d'autant plus grandes qu'il y a de CO2 dans l'espace de tête (Fig. 2. a). De plus, la quantité théorique de CO2 disponible dans l'espace de tête sous mélange CC /air (8,9 10 ^"1 mmol) est près de 10 fois supérieure à la quantité maximale en formiate produit (8,3 10 ^"2 mmol), ce qui signifie qu'il n'y a pas de limitation par le CO2 dans ce cas.

L'ensemble de ces éléments démontre que le CO2 est utilisé par la bactérie pour fabriquer du formiate et que, dans les conditions testées, les bactéries ont une capacité limitée d'assimilation du CO2 qui peut possiblement être liée à une inhibition des bactéries par le formiate. Dans les deux cas (mélange CC -air et air seul), les suivis de DO et de pH (Fig. 2.b) montrent une forte diminution de la DO en début d'expérience puis ce paramètre tend à se stabiliser à partir de 5 jours autour d'une valeur moyenne de 5,8 ± 0,2 sous mélange et de 4,7 ± 0,2 sous air seul (l'écart observé pouvant être attribué à l'écart de concentration initiale représentant près d'une unité DO, soit près de 0,3 g de cellules sèches /L seulement). Le pH diminue sur les 5 premiers jours (de 7,0 à 6,1 en mélange et de 7,0 à 6,7 sous air) puis reste constant tout le long de l'expérience (Fig. 2.b). Il est à noter que le pH moyen tend dans les deux cas vers le pka du couple CO2/HCO3 ^" = 6,37. A ce pH, l'espèce majoritaire est la forme basique (ion formiate) car le pKa de l'acide formique est de 3,75. La DO à 20 jours reste constante aux alentours de 5-6, ce qui montre que les bactéries sont toujours viables dans ces conditions.

2) Résultats en réacteur semi-continu

Dans cette configuration, les apports en CO2 et en air sont continus. Les résultats obtenus en réacteur semi-continu sous mélange équivolumique d'air et de CO2 sont présentés en Figure 3. Comme en réacteur fermé, il y a une production de formiate et la concentration commence à augmenter entre 5 et 10 jours. La production maximale de formiate obtenue est de 215 ± 5 mg/g cellules sèches. A partir de 30 jours, la concentration se stabilise jusqu'à 60 jours autour d'une valeur moyenne de 400 mg/L. La DOôoonm et le pH demeurent constants tout le long de l'expérience (6,5 ± 0,2 pour la DO et 6,3 ± 0,1 pour le pH dès 3 jours). La Figure 4 donne les résultats des tests de viabilité par croissance conduits tout au long de l'expérience avec le réacteur semi-continu. La DO initiale représente la DOôoonm de la suspension ensemencée dans du milieu frais (t = 0 j) ; la DO finale est la DOôoonm de la même suspension au bout de 7 jours de culture. La DO initiale est globalement constante au cours du temps (Fig. 4) et ceci s'explique par le fait que la DO dans le réacteur est quasi-constante (Fig. 3). Dans tous les cas, la DO finale reste significativement plus importante que la DO initiale. Ces résultats prouvent donc que tout ou grande partie des bactéries sont encore viables au bout de 60 jours de fonctionnement du réacteur. Les expérimentations ci-dessus permettent de confirmer qu'il est possible de produire de grandes quantités de formiate à partir du CO2 au moyen de la bactérie Méthylosinus trichosporium OB3b en présence de CO2. Le rendement en formiate est directement fonction des apports en CO2. Dans tous les cas, il est montré que la bactérie résiste à de fortes concentrations en formiate, permettant d'envisager une production du formiate à l'échelle industrielle.