DE SULFURO DE COBRE.

La presente invención se refiere a un método microbiológico de síntesis para producir nanopartículas (en adelante, NPs), semiconductoras fluorescentes de sulfuro de cobre.

El método se basa en el uso de microorganismos psicrófilos, mesófilos o termófilos, (por ejemplo Escherichia coli, Pseudomonas spp, u otro) los cuales son crecidos en un medio de cultivo, de acuerdo a las condiciones adecuadas para el tipo de microorganismos escogido, como por ejemplo su temperatura óptima de crecimiento. Tras alcanzar la fase estacionaria de crecimiento del cultivo bacteriano o bien en pleno crecimiento (fase exponencial), éste es centrifugado a 5.000 rpm por 5 minutos, el sobrenadante (medio de cultivo) es descartado mientras que las células son resuspendidas en una solución tampón de fosfato de potasio 50mM para posteriormente ser sometidas a un tratamiento con una sal de cobre (CuS0 ₄ , CuCI ₂ , CuN0 ₃ , CuBr ₂ , CuS, CuSe, CuF ₂ , Cu(CH3COO) ₂ , entre otras sales de Cu ²⁺ ) a una concentración de la misma subletal la cual dependerá del microorganismo usado para realizar la síntesis, hasta que el microorganismo adquiera características fluorescentes. La producción de las NPs se evalúa al exponer las células bacterianas a luz UV (360nm), y observar la fluorescencia característica de éstas. El método finaliza con una etapa de purificación de las NPs obtenidas.

Las NPs de sulfuro de cobre producidas mediante el método descrito, presentan ventajosas características: son semiconductoras, fluorescentes y con bajos niveles de toxicidad. Adicionalmente, el método presentado se caracteriza por su simpleza, seguridad y economía.

i Una nanopartícula es una partícula microscópica con tamaño menor a 100 nm, de las cuales existen diferentes tipos y se pueden clasificar en base a su composición:

1) Materiales de base de Carbón: Las NPs de base de carbón, son de tipo esféricas, elipsoides o tubulares. Son de bajo peso, alta dureza, elasticidad y conductividad eléctrica.

2) Materiales de base metálica: En este grupo se encuentras los denominados quantum dots (NPs semiconductores fluorescentes) o NPs de oro, plata o de materiales reactivos como el dióxido de titanio, entre otras.

3) Dendrímeros: Polímero nanomérico tridimensional de construcción arborescente. Estas macromoléculas sintéticas son de gran versatilidad y pueden diseñarse para obtener propiedades químicas y físicas específicas para una determinada aplicación.

4) Compositos: Corresponden a materiales sintéticos que están mezclados heterogéneamente y que forman un compuesto. Dichos materiales pueden combinar NPs con otras o con materiales de mayor dimensión.

Como se ha indicado, dentro de las NPs se encuentran los Quantum Dots (en adelante QDs), cristales nanométricos inorgánicos bimetálicos semiconductores capaces de emitir luz. Una de sus principales características es que a mayor tamaño de partícula cambia la longitud de onda que emiten.

Antecedentes del Estado del Arte:

Se han descrito diversos métodos tanto químicos como biológicos para la síntesis de NPs. A continuación, se describen algunas invenciones e investigaciones relacionadas con la presente. El documento CA 2723655, se refiere a un método de biosíntesis de NPs y QDs. El método descrito en este documento consiste en hacer crecer células fotosintéticas y/o células de hongos multicelulares en un cultivo que contiene uno o más compuestos con azufre, selenio y teluro, y una o más especies metálicas en forma iónica o no-iónica, siendo las células capaces de sintetizar NPs y QDs que presenten incorporado el metal. Se describe que los iones metálicos pueden ser cobre, zinc, cadmio, indio y galio. Las células fotosintéticas pueden ser procariontes o eucariontes. Sin embargo, el método descrito en este documento no se trata de una síntesis en bacterias. Además, la síntesis propuesta en el método de la invención, se ve favorecida por la presencia de fosfato, reactivo que no se adiciona en el método descrito en CA2723655.

Finalmente, las propiedades de fluorescencia de las NPs sintetizadas en este documento difieren de las descritas en la presente invención, lo cual además refleja diferencias tanto en composición como en características fisicoquímicas de estas.

El documento WO2009120737 A2, se refiere a organismos marinos resistentes a telurito o resistentes a selenito capaces de precipitar teluro o selenio cuando crecen aeróbicamente. En el documento se divulga que los organismos marinos aislados corresponden a organismos del género Virgibacillus, Bacillus y Rhodotorula. Se describe un método para usar estos organismos aislados para producir una suspensión acuosa de NPs purificadas, las que comprenden teluro o selenio. El método consisten en: a) Cultivar uno o más organismos resistentes a telurito o selenito bajo condiciones aeróbicas en un medio que contenga compuestos solubles que comprenda teluro o selenio, o la combinación de ambos elementos; b) cultivar los organismos en el medio por un periodo de tiempo suficiente para que los organismos puedan precipitar NPs de teluro o selenio, o la combinación de ambos; c) extraer las NPs de los organismos; y d) recuperar las NPs extraídas. El documento también menciona que las NPs contienen cadmio o zinc.

Adicionalmente, se divulga un método de remediación en base a los organismos descritos.

Este documento no se refiere a NPs de sulfuro de cobre o un método de preparación específico de NPs de este tipo. Es también importante considerar que en este documento no se divulgan NPs con las características indicadas en la propuesta: semiconductoras y fluorescentes.

En WO2012/030642 A2 se describe un método para producir NPs semiconductoras del tipo no-óxido, el método comprende las etapas: a) Producir una combinación para la reacción de componentes que conduzcan a la formación de NPs semiconductoras del tipo no-oxido en un proceso mediado por microbios, dicha combinación comprende: i) microbios anaerobios, ii) un medio de cultivo efectivo para el crecimiento de dichos microbios anaerobios, iii) un componente metálico que comprende al menos un tipo de ión metálico, iv) un componente no metálico que comprende al menos un no metal seleccionado desde el grupo: S, Se, Te y As, v) uno o más dadores de electrones que provean electrones al microorganismos anaerobio; b) Aislar las NPs semiconductoras del tipo no-oxido, la cual contenga al menos uno de los iones metálicos y al menos uno de los iones no metálicos. Se presenta un listado de elementos metálicos a ser parte de las NPs: Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Mo, W, Pd, Pt, Au, Ag, Cd, Hg, Ga, In, TI, Ge, Sn, Pb, Sb y Bi. Se divulga que el elemento no metálico puede ser algún compuesto que contenga sulfuro, selenio, teluro o arsénico, dicho componente no metálico puede ser un compuesto que contenga sulfato, sulfito, azufre elemental o tiosulfato. Los tipos de dadores de electrones, son compuestos que contienen carboxilato, compuestos del tipo azúcar, compuestos gaseosos o elementos que puedan ser oxidados por la bacteria. Cabe destacar que en este documento se requiere un compuesto dador de electrones el cual no se considera relevante para el caso de la presente invención. Por otra parte, en el método descrito en el documento WO2012/030642 A2 se requiere incorporar un componente no metálico a la síntesis (S, Se, Te o As), etapa innecesaria en el método de la invención donde solo se agrega el elemento metálico que constituye la NP de sulfuro de cobre más algunos elementos orgánicos del medio de cultivo. Siguiendo con esto, el nuevo método propuesto involucra el uso de grupos fosfato para favorecer la producción de NPs, ya sea facilitando la incorporación del metal a la célula así como en el proceso biosintético en sí, lo que no se describe en el documento WO2012/030642 A2 donde no se requiere este tipo de compuesto para favorecer la síntesis. Adicionalmente, cabe destacar, que la síntesis descrita por el método propuesto se puede realizar cuando las bacterias se encuentran en fase estacionaria (no solo en fase exponencial), por lo que la solución de Cu ²⁺ se puede agregar una vez que las bacterias hayan llegado a su fase estacionaria de crecimiento. Finalmente, es importante resaltar que mediante el método propuesto de biosíntesis y posterior purificación es posible obtener NPs con distintos colores de fluorescencia (QDs), fenómeno que no es reportado en el documento WO2012/030642 A2 ni en ningún artículo o patente a la fecha.

En WO 2013//025868 A2 se presenten NPs semiconductoras, nuevos métodos, sistemas y composiciones que las comprenden. El método para producir NPs semiconductoras, presenta los pasos de: proveer un organismo bacteriano que sea tolerante a una sal metálica, poner el organismo bacteriano en un ambiente acuoso que comprende al menos una sal del metal seleccionado, y dejar el organismo bacteriano en la solución acuosa por un periodo de tiempo suficiente para utilizar la sal metálica para ensamblar las NPs semiconductoras, y recuperar las NPs semiconductoras sin requerir de la lisis del organismo bacteriano. Se especifica que las NPs tienen un tamaño promedio de entre 1 y 10 nm. Cabe destacar que la invención propuesta difiere de lo presentado en el documento WO 2013//025868 A2 puesto que en el método de biosíntesis de la invención, se requiere el uso de una sal de fosfato, adición que favorece el proceso de síntesis al aumentar la tolerancia de los microorganismos a la sal, favorecer la entrada del metal a la célula y potenciar la formación de los cristales fluorescentes de sulfuro de cobre al interior de la misma, lo que se traduce en un método más rápido y eficiente. El documento WO 2013//025868 A2 solo reporta la síntesis en fase exponencial de crecimiento del microorganismo, mientras que en la invención propuesta el método puede realizarse tanto en fase exponencial como en fase estacionaria, siendo un protocolo flexible que conlleva más posibilidades en la elección de bacterias a utilizar en la biosíntesis. Más considerable aún, en el documento WO 2013/025868 A2 solo se reporta la síntesis de nano cristales de cadmio, en ningún caso hacen referencia a la producción de NPs de sulfuro de cobre, por lo que el producto es totalmente diferente en cuanto a composición, propiedades y método de síntesis.

El artículo científico "Biologically synthesized copper sulfide nanoparticles: Production and characterization" (Hosseini M. er a/, 2012), se refiere a la preparación y caracterización de NPs de sulfuro de cobre mediante el uso del hongo Fusarium oxysporum. En materiales y métodos se describe la metodología que consiste en hacer crecer el hongo en medios ricos de cultivo, generar una biomasa considerable y adicionarle una solución de CuSO ₄ , e incubar con agitación a 30°C. Tras esto, se caracterizó el tamaño de la NP y se analizó el espectro UV-visible. Este documento se diferencia de la presente invención puesto que no se refiere a un método de preparación de NPs basado en el uso de bacterias si no que de un hongo y se basa en las moléculas secretadas por el hongo al medio de cultivo. Adicionalmente, el método descrito en este artículo científico permite obtener NPs con composición y propiedades distintas, con un espectro de absorbancia y de fluorescencia diferente al que poseen las NPs generadas a través de la síntesis de la invención. La fluorescencia descrita en dicho documento no es de las NPs sintetizadas, más bien corresponde a la fluorescencia propia del medio extracelular del hongo, ya que al agregar el precursor (CuS0 ₄ ) los autores reportan que el peak de fluorescencia se reduce, por lo que correspondería a la fluorescencia de proteínas disueltas en el medio extracelular.

El artículo científico "Characterization of Copper Nanoparticles Synthesized by a Novel Microbiological Method" (Ratnika V. et al., 2010) describe la preparación de NPs de cobre mediante el uso de la bacteria Pseudomonas stutzeri, la cual fue aislada del suelo. La metodología consiste básicamente en hacer crecer la bacteria aislada del suelo en un medio de cultivo rico para este tipo bacteriano a 37°C durante 24 h. Luego, se centrifuga y el pellet obtenido se lava con agua desionizada. Se adiciona sulfato de cobre al medio: 0,1 g biomasa bacteriana más 100 mL de 1 mM de CuS0 ₄ en solución acuosa. La suspensión se cultiva en un incubador con agitación hasta obtener NPs. Para confirmar la presencia de NPs y caracterizarlas, se determinó su tamaño, distribución, espectroscopia UV-vísible, difracción de rayos X y microscopía electrónica de transmisión. Si bien en este artículo científico se describe la síntesis de NPs de cobre, éstas difieren totalmente en composición y propiedades a las obtenidas por el método de la invención, puesto que no presentan propiedades espectroscópicas de interés como fluorescencia, plasmón de superficie a 410 nm, ni distintos colores de fluorescencia. Por otra parte, en el documento de Ratnika y colaboradoresel método de síntesis es distinto al propuesto ya que se hace crecer ei cultivo hasta fase estacionaria tardía y en estas condiciones se expone a una concentración de Cobre. En el método de la invención, la síntesis de NPs fluorescentes en fase estacionaria requiere la incorporación de una sal de fosfato, de otro modo el proceso no se ve favorecido en estas condiciones. El método propuesto en este documento utiliza altas concentraciones de cobre respecto a la invención, lo que sugiere que el proceso ocurre en células altamente estresadas o incluso metabólicamente inactivas, lo que implica que el método propuesto por la invención es más eficiente y resulta ser realmente un método de biosíntesis con bacterias viables.

El artículo científico "Biosynthesis of semiconductor nanoparticles by using sulfur reducing bacteria Serratia nematodiphila" (Malarkodi C. et al., 2013) describe la biosíntesis de NPs de sulfuro de cadmio a partir de la reducción de sulfato de cadmio, utilizando la bacteria Serratia nematodiphila. La metodología propuesta corresponde a la inoculación de Serratia nematodiphila en un medio rico para su crecimiento, centrifugar, y adicionar una solución de sulfato de Cadmio (1 mM). El pH se ajustó a 7-7,5 y la suspensión resultante se centrifugo hasta observarse un cambio de color en ésta. El análisis de espectrofotometría UV-visible determinó que las NPs de CdS producidas presentan un máximo de absorbancia detectable a los 420 nm. El tamaño de la NP es de en promedio 12 nm. Adicionalmente se evaluó la actividad antibacteriana de este tipo de NPs. Este artículo científico difiere claramente de la invención propuesta puesto que no se refiere específicamente a NPs de sulfuro de cobre. En este documento se describe que la síntesis es extracelular dejando poco claro si el protocolo solo incluye los sobrenadantes de las bacterias, siendo entonces un método de producción de NPs generadas por metabolitos celulares y no por la célula bacteriana como tal.

El artículo científico "Selection of a suitable method for the synthesis of copper nanoparticles" (Umer A. et al., 2012) presenta el resumen de varios métodos químicos, físicos y biológicos para la producción de NPs de cobre. En el punto 6 denominado byological synthesis se indican los parámetros más importantes a ser considerados en la preparación de NPs utilizando organismos vivos: a) se debe elegir el medio o solvente, b) elegir un agente reductor, c) considerar un material no tóxico para la estabilización de las NPs. Se establece que entre los organismos vivos, se pueden utilizar bacterias, hongos y plantas. Este documento es considerado como parte del estado de la técnica, siendo la base teórica de la metodología utilizada en la preparación general de NPs mediante el uso de organismos vivos.

Descripción de las figuras:

Figura 1 : Efecto de ia exposición a luz UV de células bacterianas en fase estacionaria tratadas con Cu ²⁺ .

Se muestran las células bacterianas obtenidas a partir de un cultivo de fase estacionaria, y tratadas con diferentes concentraciones de CuS0 ₄ (0, 10, 25 y 50 g/mL)que fueron expuestas a luz UV en un transiluminador a 360 nm.

Figura 2: Efecto de la exposición a luz UV de células bacterianas en fase exponencial tratadas con Cu ²⁺ .

Pellet obtenido a partir de un cultivo de fase estacionaria y tratado con diferentes concentraciones de CuSO ₄ (0, 10, 25 y 50 g/ml_) expuesto a luz UV en un transiluminador a 360 nm.

Figura 3: Sobrenadante de las células homogenizadas expuestos a luz ultravioleta.

Fotografía de los sobrenadantes obtenidos luego de la síntesis y purificación de las NPs de sulfuro de cobre expuestos a luz UV (360 nm).

Figura 4: Fracciones de la cromatografía de exclusión molecular expuestas a luz UV a 360 nm. Fotografía de las fracciones recolectadas a partir de la determinación de tamaño mediante cromatografía de exclusión, luego de ser expuestas a luz UV (360 nm).

Figura 5: Espectro de absorbancia de las NPs de sulfuro de cobre sintetizadas biológicamente.

La gráfica presenta el espectro de absorción de las NPs de sulfuro de cobre biosintetizadas utilizando microorganismos, donde el eje x corresponde a la longitud de onda y el eje y a la absorbancia registrada.

Figura 6: Espectro de fluorescencia de las NPs de sulfuro de cobre sintetizadas biológicamente

La gráfica presenta la intensidad de fluorescencia expuesta como unidades arbitrarias (eje y), respecto a la longitud de onda en nm (eje x.).

Descripción de la Invención:

De forma general, el método microbiológico para la producción de NPs semiconductoras, fluorescentes de sulfuro de cobre comprende las etapas de: a) Seleccionar una sal de cobre; b) Hacer crecer un microorganismo tolerante a la sal de cobre seleccionada hasta su fase exponencial o estacionaria. c) Resuspender el sedimento del microorganismo en una solución tampón de fosfato y tratar con al menos una de las sales seleccionadas, hasta que el microorganismo adquiera características fluorescentes; d) Evaluar la producción de NPs semiconductoras, fluorescentes de sulfuro de cobre, exponiendo las células bacterianas a la luz UV (360 nm); e) Purificar las NPs semiconductoras, fluorescentes de sulfuro de cobre.

La etapa (b) se lleva a cabo a la temperatura adecuada para el crecimiento de cada tipo de microorganismo, en condiciones de aerobiosis o anaerobiosis según corresponda para el tipo de microorganismo seleccionado.

El crecimiento del microorganismo debe realizarse en un medio de cultivo adecuado para el crecimiento del microorganismo y a la temperatura óptima de crecimiento de la bacteria a usar, ya sea se utilicen microorganismos termófilos (45 - 65 °C), hipertermofilos (> 70 °C), psicrotolerantes o psicrófilos (5 - 15 °C), mesófilos (15 - 40 °C), entre otros.

El cultivo puede ser utilizado luego de llegar a fase estacionaria o a fase exponencial según corresponda, de acuerdo a las características de crecimiento del microorganismo.

En el caso de síntesis en fase estacionaria, la bacteria una vez alcanzada la fase de crecimiento deseada, se centrifuga a 5.000 rpm por 5 min, el sobrenadante es descartado y las células bacterianas son resuspendidas en una solución tampón de fosfato (en un rango de concentración entre 1 a 1000 mM y un pH en el rango 3 a 8, siendo las condiciones preferentes 50 mM y pH 7,0) suplementada con Cu ²⁺ (CuS0 ₄ , CuCI ₂ , CuN0 ₃ , CuBr ₂ , CuS, CuSe, CuF ₂ , Cu(CH ₃ COO) ₂ , entre otras sales de Cu ²⁺ ) en una concentración que va desde 10 hasta 50 g/mL de Cu ²⁺ por 12 a 48 h (tiempo en el que el microorganismo se torna fluorescente). Posteriormente, el cultivo bacteriano se centrifuga entre 5.000 hasta 10.000 rpm por un tiempo que va desde 2 a 5 min.

Para el caso de la síntesis en fase exponencial, al cultivo una vez llegado a fase exponencial se le adiciona CuS0 ₄ , CuCI ₂ , CuN0 ₃ , CuBr ₂ , CuS, CuSe, CuF ₂ , Cu(CH ₃ COO) ₂ , o cualquier otra sal de cobre(ll), en una concentración que va desde 50 hasta 400 pg/mL de Cu . Posteriormente, se deja bajo agitación constante a la misma temperatura de crecimiento que dependerá del microorganismo utilizado. Luego de un tiempo entre 12 y 48 h (tiempo en el que el microorganismo se torna fluorescente) el cultivo se centrifuga entre 5.000 hasta 10.000 rpm por un tiempo que va desde 2 hasta 5 minutos.

Las células bacterianas expuestas a los tratamientos con Cu ²⁺ , tanto en fase exponencial como en fase estacionaria, posteriormente son expuestas a luz UV a través de un transiluminador UV a una longitud de onda de 360 nm, en donde ahora se puede apreciar la fluorescencia de las células tratadas debido a la producción intracelular de NPs fluorescentes de sulfuro de cobre.

En la etapa de purificación, las células bacterianas se resuspenden en una solución tampón de fosfato de potasio a un pH entre 7 y 8, preferentemente a un pH 7,4 y luego son sonicadas a una amplitud entre 50.000 hasta 70.000 por un tiempo entre 5 y 10 minutos en series de un minuto. En otra forma de la invención, en la etapa de purificación, las células pueden ser resuspendidas en la misma solución tampón junto con perlas de vidrio y luego someterlas a un homogenizador a una velocidad de 4 m/s entre dos a tres minutos en serie de un minuto. Posterior al proceso de sonicación u homogenización, la solución es centrifugada entre 5.000 a 10.000 rpm por un tiempo que va desde 2 a 5 minutos.

Los resultados indican que tanto el sedimento bacteriano obtenido en el cultivo de fase estacionaria (figura 1) como el sedimento obtenido en el cultivo de fase exponencial (figura 2) presentan fluorescencia al ser expuestos a luz UV. Sin perjuicio de lo anterior también es posible que la síntesis sea extracelular y en estas condiciones los sobrenadantes, tanto de células tratadas en fase exponencial como estacionaria, se tornan fluorescentes al ser expuestos a la longitud de onda antes mencionada. En la presente invención, microorganismos se refiere sin limitarse a: microorganismos Gram (+), Gram (-), termófilos, hipertermófilos, psicrofilos, mesófilos, anaerobios, aerobios, halófilos, arqueas, levaduras, hongos, enterobacterias, entre otros. De forma particular los microorganismos en los que se puede realizar biosintesis son: Escherichia coli, Pseudomonas sp., Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Bacillus sp., Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Shewanella sp, Staphylococcus aureus, Leptospirillum sp, Acidithiobacillus sp, Salmonella sp., Psychrobacter sp, Yersinia sp., entre muchas otras.

En otro forma de la invención la biosintesis de NPs de sulfuro de cobre, en las condiciones descritas, puede ser desarrollada en diferentes tipos de microorganismos como: arqueas, hongos y levaduras, entre otros.

En la metodología cuando se refiere a sales de cobre, éstas corresponden a sales en las que el cobre se encuentre como Cu ⁺² , siendo ejemplos, sin limitarse: CuS0 ₄ , CuCI ₂ , CUNO3, CuBr2, CuS, CuSe, CUF2, Cu(CH ₃ COO)2, entre otras sales que cumplan con esta condición. Adicionalmente, en la invención también pueden ser utilizadas sales de cobre en el que se encuentre en su forma Cu ^{+1 ,} puesto que el cobre en este tipo de sales luego de entrar a la célula bacteriana se oxida inmediatamente a Cu ⁺² , siendo útil en la biosintesis de NPs fluorescentes de sulfuro de cobre.

Las NPs producidas están compuestas por Cu y S y presentan un tamaño menor a los 50 nm, con una baja polidispersidad. Además las propiedades espectroscópicas corresponden a NPs de CuS, con espectros de absorción con el plasmón característico de este tipo de NPs (máximo de absorbancia a 410 nm) además de espectros de emisión de fluorescencia (máximo de fluorescencia que va entre 600 y 700 nm). Las NPs, obtenidas a través del método de la invención son útiles para la fabricación de celdas fotovoltaicas, para la fabricación de aparatos optoelectrónicos, como sondas de detección en imagenología, para la detección de células tumorales y para la detección de huellas dactilares, entre otros.

Ejemplos

Ejemplo 1 : Biosíntesis de NPs semiconductoras fluorescentes de sulfuro de cobrea partir de un cultivo de E. coli.

En este ejemplo se presenta la metodología de biosíntesis de NPs de sulfuro de cobre a partir de un cultivo de Escherichia coli.

El procedimiento consiste en hacer crecer un cultivo de E. coli en 100 mL de medio de cultivo líquido (LB o cualquier otro medio apto para esta bacteria) a una temperatura de 37°C. Este cultivo se incuba hasta fase exponencial (Οϋβοο de 0,5) o hasta fase estacionaria y se continúa el protocolo dependiendo del tipo de fase alcanzada.

Cuando el cultivo llega a fase estacionaria, la bacteria se centrifuga a 5.000 rpm por 5 min, y se resuspende en una solución tampón de fosfato con una sal de cobre en una concentración desde 10 hasta 50Mg/mL de Cu ²⁺ por 12 a 48 h (tiempo en el que el sedimento se torna fluorescente). Posteriormente, el cultivo bacteriano se centrifugó a 5.000 rpm por 5 min.

Para el caso de la síntesis en fase exponencial, cuando el cultivo alcanza la densidad óptica deseada Οϋβοο de 0,5, se leadicionóCuS0 ₄ , CuC , Cu(CH3COO)2, Cu(N0 ₃ ) ₂ , o cualquier otra sal de cobre (II), en una concentración desde 50 hasta 400 g/mL de Cu ²⁺ . Posteriormente se incuba en agitación constante a su temperatura de crecimiento. Luego de 24 h el cultivo se centrifuga a 5.000 rpm por 5 minutos y se descarta el sobrenadante. En el caso de E. coli, la fluorescencia del sedimento bacteriano, es decir de las NPs sintetizadas, depende de la concentración de CuS0 ₄ , CuCb o de la sal de cobre usada. En la figura 1 se pueden apreciar las células bacterianas expuestas a luz ultravioleta a una longitud específica de 360 nm a través de un transiluminador UV, las cuales están tratadas con diferentes concentraciones de Cu (0, 10, 25 y 50 pg/mL) y la fluorescencia exhibida depende de estas concentraciones cambiando su fluorescencia de naranjo a rojo.

Ejemplo 2: Procedimiento de purificación de NPs semiconductoras fluorescentes de sulfuro de cobre.

Luego de la obtención del sedimento bacteriano, corresponde extraer las NPs de sulfuro de cobre desde el interior de las células bacterianas.

Para comenzar el procedimiento de extracción de las NPs se hizo crecer el microorganismo escogido en 100 ml_ de medio de cultivo líquido (M9 o LB, o cualquier otro medio apto para la bacteria a usar). Luego de que el tiempo de síntesis ha transcurrido (ya sea en fase exponencial o estacionaria) el cultivo se centrifuga a 5.000 rpm por 5 minutos y el sobrenadante es descartado.

Posteriormente, las células bacterianas se purifican, resuspendiéndose en una solución tampón de fosfato de potasio a pH 7,4 y luego sonicados a una amplitud de 70.000 por 2 minutos en serie de un minuto. En otra forma de la invención, las células se purifican siendo resuspendidas en la misma solución tampón junto con perlas de vidrio y luego sometidas a un homogenizador a una velocidad de 4 m/s por tres minutos en serie de 60 segundos. Posterior al proceso de sonicación u homogenización, la solución es centrifugada a 15.000 rpm por 5 minutos.

Los resultados indican que tras exponer las NPs biosintetizadas a luz UV (360 nm), la mayoría de las NPs sintetizadas quedan en el sobrenadante en donde se puede apreciar claramente la fluorescencia (figura 3). No obstante, los restos celulares mantuvieron fluorescencia, lo que se asocia a NPs que quedan atrapadas en restos de membranas y otras estructuras celulares.

Ejemplo 3: Caracterización de NPs semiconductoras fluorescentes de sulfuro de cobre sintetizadas utilizando microorganismos.

En este ejemplo se presenta la caracterización de las NPs de sulfuro de cobre biosintetizadas con microorganismos, de acuerdo a su determinación de tamaño y a la evaluación de sus propiedades espectrofotométricas y de fluorescencia.

Determinación de tamaño mediante purificación por cromatografía de exclusión molecular.

Las NPs producidas según la metodología expuesta en el ejemplo 1 se caracterizaron de acuerdo a su tamaño. Para esto, se pasaron por una columna de exclusión molecular (Sephadex 60) y se recolectaron fracciones de 1 ml_. Posterior a esto, las fracciones recolectadas se expusieron a luz UV (360 nm) con el objetivo de establecer cuál de ellas presentan la característica de fluorescencia.

A partir de los resultados, se observa que la fluorescencia no se asocia específicamente a una fracción, si no que múltiples fracciones presentan características de fluorescencia (figura 4). Así, la fluorescencia que antes se observó naranja (figura 3) luego del paso por la columna de exclusión se observa una gama de colores que van desde al rojo al verde. Las partículas más pequeñas (fluorescencia verde) quedaron embebidas en la matriz demorándose en salir, mientras que las partículas grandes que presentaron fluorescencia roja atravesaron la matriz sin problema, por lo que fueron recolectadas en las primeras fracciones. Por tanto, el método de biosíntesis de NPs mediante bacterias permite obtener QDs de sulfuro de cobre de diferentes tamaños. Caracterización mediante espectro-fotometría UV-Vis y fluorescencia.

Se realiza la caracterización espectrofotométrica de QDs biosintetizados a partir de un cultivo en fase estacionaria. Para este tipo de síntesis en fase estacionara se hizo un pre inoculo de E coli en medio LB, del que se originó un inoculo en una dilución 1 :1000 en 100 ml_ de medio de cultivo. Cuando el OD ₆ oo del cultivo indicaba haber llegado a fase estacionaria, las células fueron centrifugadas a 5.000 rpm por 2 minutos y el sobrenadante fue descartado. Las células fueron resuspendidas en buffer fosfato a pH 7,4 y suplementadas con 25 pg/mL de Cu ²⁺ .Las células se incubaron bajo agitación constante a una temperatura de 37 °C durante 24 horas. Posteriormente fueron homogenizadas con perlas de vidrio en 3 series de 60 segundos a una velocidad de 4 m/s. Luego, el homogenizado fue centrifugado a 15.000 rpm por 5 minutos, y el sobrenadante se fue utilizando en la caracterización espectrofotométrica mientras que los restos celulares fueron descartados.

Para la caracterización, se tomaron alícuotas de 200 L y fueron traspasadas a una placa multipocillo. Posteriormente se realizó una lectura de absorbancia desde 300 a 700 nm y espectros de fluorescencia excitando a 360 nm en un citoflorímetro Synergy H1 de Biotek.

Los resultados obtenidos de la caracterización espectrofotométrica de los QDs de sulfuro de cobre sintetizados biológicamente se presentan en la figura 5. Se puede apreciar un máximo de absorbancia a 410 nm característico de NPs metálicas semiconductoras correspondiente a un plasmón de resonancia de superficie localizado (LSPR). Los plasmones de superficie son un fenómeno que se produce cuando los electrones excitados (al ser irradiados por luz UV en el caso de éstos QDs) quedan en constante vibración en la banda de conducción del material, la energía absorbida se conserva en regiones espaciales de la NPs, denominada LSPR. Esto, confirma otra característica clave de las NPs, que es el plasmón de superficie.

Por otro lado, al realizar un espectro de fluorescencia (figura 6) de los QDs de sulfuro de cobre, se aprecia que las NPs, al restar la fluorescencia intrínseca de las proteínas, tienen un máximo de fluorescencia que va entre 600 y 700 nm lo que se coindice con lo observado el irradiar con luz UV.

Ejemplo 4: Uso de NPs semiconductoras fluorescentes de sulfuro de cobre en dispositivos electrónicos v biomedicina.

En este ejemplo se indican los potenciales usos o aplicaciones de las NPs semiconductoras fluorescentes de sulfuro de cobre. La información que a continuación se describe, en ningún caso puede considerarse excluyente de otras aplicaciones, si no solo como ejemplo ilustrativo de la invención.

Aplicación de NPs de sulfuro de cobre en celdas fotovoltaicas y aparatos optoelectrónicos:

Debido a las características semiconductoras y las propiedades fluorescentes que presentaron las NPs de sulfuro de cobre desarrolladas mediante la presente invención, éstas pueden ser acopladas a circuitos electrónicos siendo útiles en el desarrollo de dispositivos tecnológicos. Así, en celdas fotovoltaicas sensibilizadas por QDs, las NPs actúan como aceptor de electrones favoreciendo el intercambio electrónico entre la celda.

Para el caso de aparatos optoelectrónicos, los cuales son aparatos electrónicos cuyo funcionamiento está relacionado con la óptica, las NPs debido a sus propiedades ópticas y plasmónicas permiten potenciar la tecnología de dispositivos de tipo LEDs, QDs-Laser, sensores, entre otros. Aplicación de NPs semiconductoras fluorescentes de sulfuro de cobre ciencias de la vida:

Además de las importantes características ya descritas, las NPs de sulfuro de cobre aquí desarrolladas presentan una baja citotoxicidad, siendo posible su uso en salud, gracias a su biocompatibilidad.

De esta forma, las NPs pueden ser aplicadas en el área de la medicina, por ejemplo en la imagenología, donde éstas pueden utilizarse como sondas de detección. Otras aplicaciones en biomedicina son su uso en el mareaje de células tumorales, o en la unión de la NP a diferentes biomoléculas, péptidos, aptámeros, dendrímeros, y anticuerpos.

En otra forma de la invención, las NPs de sulfuro de cobre pueden ser utilizadas en la detección de huellas dactilares aprovechando sus propiedades de fluorescencia. No se limitan otras diversas aplicaciones biotecnológicas.