Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zelle, die gegenüber ihrem Wildtyp derart gentechnisch verändert wurde, dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp aus Saccharose und Kohlendioxid als Kohlenstoffquelle mehr C ₄ -Körper und/oder über diese C ₄ -Körper hergestellte

Folgeverbindungen zu bilden vermag. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung einer solchen gentechnisch veränderten Zelle und ein Verfahren zur Herstellung von C ₄ - Körpern und/oder von über diese C ₄ -Körper hergestellte Folgeverbindungen mit Hilfe dieser Zellen. Schließlich betrifft die Erfindung noch die Verwendung der Zellen zur Herstellung von C ₄ -Körpern Körpern und/oder von über diese C ₄ -Körper hergestellte Folgeverbindungen aus Saccharose und Kohlendioxid.

C ₄ -Körper, wie etwa Succinat, Malat, Fumarat, Oxalacetat, Aspartat, Asparagin, Threonin, Tetrahydrofuran, Pyrrolidon, Acetoin, 4,4-Bionell, Hydroxysuccinat, Epoxy-v-Butyrolacton, Butensäure, Butyrat, Butandiol, 1 ,2-Butandiol, 1 ,3-Butandiol, 1 ,4-Butandiol, 2,3-Butandiol,

Buten, n-Buten, cis-2-Buten, trans-2-Buten, Isobuten, Butadien, 1 ,2- Butadien, 1 ,3- Butadien, 3- und 4-Hydroxybutyrolacton, 1 -, 2-, und tert-Butanol, Isobutanol, 2-, 3- und 4-Hydroxybuttersäure sowie 2- und 3-Hydroxyisobuttersäure werden heutzutage im Wesentlichen aus

petrochemischen Rohstoffen hergestellt und sind als Ausgangsstoffe für Produkte der

Futterindustrie, Agrarwirtschaft und der Pharmazeutischen Industrie von Bedeutung. Zusätzlich werden diese C ₄ -Körper auch als Rohstoff der Chemieindustrie für Massenprodukte, wie zum Beispiel Polymere und Lösungsmittel, oder SpezialChemikalien eingesetzt. Aufgrund der absehbaren Verknappung petrochemischer Rohstoffe und zunehmender Nachfrage nach Produkten, die auf nachwachsenden Rohstoffen basieren, ist es wünschenswert, Alternativen zu den existierenden petrochemischen Verfahren zur Herstellung von C ₄ -Körpern

bereitzustellen, die auf nachwachsenden Rohstoffen basieren.

Die zurzeit verfolgten Ansätze basieren mehrheitlich auf Mikroorganismen, die in fermentativen Prozessen C ₄ -Körper herstellen. Dabei wird insbesondere Glucose als Kohlenstoffquelle verwendet. Die notwendige Glucose wird aus Stärke gewonnen, welche z. B. aus Mais,

Kartoffeln, Weizen oder anderen Getreidearten hergestellt wird. Nachteilig an diesen Ansätzen ist, dass Glucose vergleichsweise teuer ist und die entsprechende Herstellung und Verwendung von Glucose mit der Verwendung oder Verarbeitung der Ausgangsstoffe zu Nahrungsmitteln konkurriert. Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die sich aus dem Stand der Technik ergebenden Nachteile zu überwinden. Insbesondere liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde Glucose als Rohstoff durch eine günstigere und in ausreichenden Mengen verfügbare Alternative zu ersetzen.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, dass Saccharose als Rohstoff für die Herstellung von C ₄ -Körpern verwendet wird. Weltweit betrachtet wird Saccharose zum größten Teil aus Zuckerrohr (ca. % der Jahresproduktion) und zum geringeren Teil aus Zuckerrüben (ca. % der Jahresproduktion) gewonnen. Durch die hohe Saccharose Produktion aus Zuckerrohr in Südamerika und Asien und einer geringeren Konkurrenz zur Nahrungsmittelindustrie, ist Saccharose in großen Mengen und günstiger als Glucose erhältlich. Eine weitere Verbesserung der bestehenden Prozesse liegt darin, dass erfindungsgemäß zusätzlich zu Saccharose Kohlendioxid (C0 ₂ ) als Kohlenstoffquelle verwendet wird.

Kohlendioxid fällt beispielsweise als Abfallprodukt einer Reihe chemischer Prozesse an und ist daher vergleichsweise günstig erhältlich. Zusätzlich kann durch die Verwertung von

Kohlendioxid die Belastung der Atmosphäre mit Treibhausgasen reduziert werden.

Im Stand der Technik sind bisher keine Technologien für die Herstellung von C ₄ -Körpern aus Saccharose und Kohlendioxid verfügbar, die mit den bestehenden petrochemischen Prozessen konkurrieren könnten. Wildtyporganismen, wie etwa Basfia succiniciproducens,

Anaerobiospirillum succiniciproducens oder Actinobacillus succinogenes, die Saccharose zu C ₄ - Körpern umsetzen können, sind für die biotechnologische Herstellung nicht geeignet, da die Ausbeuten gering sind und diese Organismen komplexe Nährmedien benötigen, die durch die damit verbundenen Kosten und den Aufwand den Prozess unwirtschaftlich werden lassen.

Erfindungsgemäß wird dieser Nachteil dadurch überwunden, dass rekombinante Zellen bereitgestellt werden, die unter entsprechenden Kulturbedingungen, ausgehend von

Saccharose und C0 ₂ als Kohlenstoffquellen, große Mengen an C ₄ -Körpern herstellen können.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben überraschenderweise herausgefunden, dass die Ausbeute an C ₄ -Körpern durch gentechnische Manipulation geeigneter Zellen, insbesondere eine Verstärkung von Carboxylierungs-Reaktionen, die Kohlendioxid fixieren und zur Bildung von C ₄ -Körpern führen, eine Unterdrückung von Stoffwechselwegen, die den Kohlenstofffluss von Saccharose hin zu Gärungsprodukten verursachen, welche nicht C ₄ -Körper sind, und die Steigerung der Saccharose-Aufnahme und des Saccharose-Metabolismus stark erhöht werden kann. Dieser Ansatz erlaubt es i) Organismen, die üblicherweise nicht in der Lage sind

Saccharose zu metabolisieren, die aber im Hinblick auf die erforderlichen Kulturbedingungen günstig sind und ii) Organismen, die auch natürlicherweise in der Lage sind Saccharose zu metabolisieren, aber nur geringe Effizienz im Sinne von Raum-Zeit- und/oder

Kohlenstoffausbeute in Bezug auf die Synthese von C ₄ -Körpers besitzen, als effiziente

Ganzzellkatalysatoren zur Herstellung von C ₄ -Körpern einzusetzen.

In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung daher eine rekombinante Zelle, welche gegenüber ihrem Wildtyp derart gentechnisch verändert wurde, dass sie aus Saccharose und Kohlendioxid als Kohlenstoffquellen im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr C ₄ -Körper und/oder über diese C ₄ -Körper hergestellte Folgeverbindungen zu bilden vermag.

Der Begriff„C ₄ -Körper", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine chemische

Verbindung, die vier Kohlenstoffatome enthält, und umfasst entsprechende Carbonsäuren, Aldehyde, Alkohole, Zucker, Alkane, Alkene, Amine sowie deren Derivate. Beispielhafte C ₄ - Körper im Sinne der Erfindung umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Succinat, Malat, Fumarat, Oxalacetat, Aspartat, Asparagin, Threonin, Tetrahydrofuran, Pyrrolidon, Acetoin, 4,4- Bionell, Hydroxysuccinat, Epoxy-v-Butyrolacton, Butensäure, Butyrat, Butandiol, 1 ,2-Butandiol, 1 ,3-Butandiol, 1 ,4-Butandiol, 2,3-Butandiol, Buten, n-Buten, cis-2-Buten, trans-2-Buten, Isobuten, Butadien, 1 ,2- Butadien, 1 ,3- Butadien, 3- und 4-Hydroxybutyrolacton, 1 -, 2- und tert- Butanol, Isobutanol, 2-, 3- und 4-Hydroxybuttersäure sowie 2- und 3-Hydroxyisobuttersäure. In einer Ausführungsform der Erfindung wird der C ₄ -Körper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Malat und Oxalacetat und/oder aus durch enzymatische Synthese aus diesen C ₄ -Körpern hergestellte Folgeverbindungen, wie zum Beispiel Succinat, Aspartat, Asparagin, Threonin, Tetrahydrofuran, Butyrat, Butandiol, 1 ,2-Butandiol, 1 ,3-Butandiol, 1 ,4-Butandiol, 2,3-Butandiol, 3- und 4-Hydroxybutyrolacton, 1 -, 2-, und tert-Butanol, Isobutanol, 2-, 3- und 4- Hydroxybuttersäure sowie 2- und 3-Hydroxyisobuttersäure, Methionin und Lysin sowie über Malat, Oxalacetat und Folgeverbindungen auf chemischem Wege hergestellten Verbindungen. Wie hierin verwendet umfassen die Bezeichnungen von Carbonsäuren, sowohl die Basenform als auch die Säureform sowie Mischungen dieser Formen. Das bedeutet, dass Begriffe wie Succinat, Malat, Oxalacetat, Fumarat, Aspartat, Butyrat, 2-, 3- oder 4-Hydroxybuttersäure und 2- oder 3-Hydroxyisobuttersäure jeweils auch Bernsteinsäure, Äpfelsäure, Oxalessigsäure, Fumarsäure, Asparaginsäure, Buttersäure, 2-, 3- oder 4-Hydroxybutyrat und 2- oder 3- Hydroxyisobutyrat umfassen. Der Ausdruck„dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr C ₄ -Körper zu bilden vermag" umfasst auch den theoretischen Fall, dass der Wildtyp der gentechnisch veränderten Zelle überhaupt keine C ₄ -Körper, bzw. nicht den gewünschten C ₄ -Körper zu bilden vermag, bzw. diese Verbindung(en) nicht in nachweisbarer Menge erzeugen kann und erst nach der gentechnischen Veränderung nachweisbare Mengen dieser Verbindungen gebildet werden. Ferner ist durch diesen Ausdruck erfasst, dass die entsprechende Zelle in einem festgelegten Zeitraum, beispielsweise innerhalb von 2, 4, 8, 12, 24 oder 48 Stunden, mindestens die 2-, 5-, 10-, 100- oder 1000-fache Menge an C ₄ -Körpern bzw. einem oder mehreren gewünschten C ₄ - Körpern bildet wie der Wildtyp. Mit„Wildtyp" einer Zelle wird hierin eine Zelle bezeichnet, deren Genom in einem Zustand vorliegt, wie er natürlicherweise durch die Evolution entstanden ist. Der Begriff wird sowohl für die gesamte Zelle als auch für einzelne Gene verwendet. Unter den Begriff„Wildtyp" fallen daher insbesondere nicht solche Zellen bzw. solche Gene, deren Gensequenzen zumindest teilweise durch den Menschen mittels rekombinanter Verfahren verändert worden sind.

Die erfindungsgemäßen Zellen können Prokaryoten oder Eukaryoten sein. Dabei kann es sich um Säugetierzellen (wie etwa Zellen aus dem Menschen), andere tierische Zellen (z.B.

Insektenzellen), um pflanzliche Zellen oder um Mikroorganismen wie Hefen, Pilze oder Bakterien handeln, wobei Mikroorganismen bevorzugt und Bakterien und Hefen besonders bevorzugt sind.

Als Bakterien, Hefen oder Pilze sind insbesondere diejenigen Bakterien, Hefen oder Pilze geeignet, die bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Deutschland, als Bakterien-, Hefe- oder Pilz-Stämme hinterlegt sind. Erfindungsgemäß geeignete Bakterien gehören zu den Gattungen, die unter http://www.dsmz.de/microorganisms/bacteria_catalogue.php aufgeführt sind. Erfindungsgemäß geeignete Hefen gehören zu denjenigen Gattungen, die unter http://www.dsmz.de/microorganisms/yeast_catalogue.php aufgeführt sind. Erfindungsgemäß geeignete Pilze sind diejenigen, die unter http://www.dsmz.de/microorganisms/fungus_catalogue.php aufgeführt sind.

Erfindungsgemäß bevorzugte Zellen sind diejenigen der Gattungen Aspergillus,

Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Acinetobacter, Alcaligenes, Actinobacillus,

Anaerobiospirillum, Basfia, Wollinella, Fibrobacter, Ruminococcus, Mannheimia, Lactobacillus, Lactococcus, Paracoccus, Lactococcus, Candida, Pichia, Hansenula, Kluveromyces,

Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia,

Pseudomonas, Rhodospirillum, Rhodobacter, Burkholderia, Clostridium Cupriavidus sowie carboxydotrophe Mikroorganismen, wobei Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Alcaligenes latus, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Brevibacterium flavum, Brevibacterium

lactofermentum, Escherichia coli, Basfia succiniciproducens, Wollinella succinogenes,

Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus flavefaciens, .Anaerobiospirillum succiniciproducens, Mannheimia succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Saccharomyces cerevisiae, Kluveromyces lactis, Candida blankii, Candida rugosa, Corynebacterium glutamicum,

Corynebacterium efficiens, Zymonomas mobilis, Yarrowia lipolytica, Methylobacterium extorquens, Hansenula polymorpha, Ralstonia eutropha, Rhodobacter sphaeroides,

Paracoccus versutus, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter calcoaceticus, Pichia pastoris, Thermoanaerobacter kivui, Acetobacterium woodii, Acetoanaerobium notera, Clostridium aceticum, Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium butyricum, Moorella thermoacetica, Eubacterium limosum, Peptostreptococcus productus, Clostridium ljungdahlii, Clostridium carboxidivorans, Clostridium scatalogenes, Rhodospirillum rubrum, Burkholderia thailandensis und Pseudomonas putida besonders bevorzugt sind. Die Begriffe„Kohlendioxid" und„C0 ₂ ", wie sie hierin verwendet werden, beziehen sich sowohl auf das Gas C0 ₂ , die in wässriger Lösung mit gelöstem Kohlendioxid im Gleichgewicht stehende Kohlensäure (H ₂ C0 ₃ ) als auch die beiden Deprotonierungsprodukte der Kohlensäure, Hydrogencarbonat (HC0 ₃ ^" ) und Carbonat (C0 ₃ ^2" ) sowie deren Salze.

In einer Ausführungsform der Erfindung werden die C ₄ -Körper aus der Gruppe, die aus:

Succinat, Malat, Fumarat, Oxalacetat, Aspartat, Asparagin, Threonin, Tetrahydrofuran,

Pyrrolidon, Acetoin, 4,4-Bionell, Hydroxysuccinat, Epoxy-v-Butyrolacton, Butensäure, Butyrat, Butandiol, 1 ,2-Butandiol, 1 ,3-Butandiol, 1 ,4-Butandiol, 2,3-Butandiol, Buten, n-Buten, cis-2- Buten, trans-2-Buten, Isobuten, Butadien, 1 ,2-Butadien, 1 ,3-Butadien, 3-Hydroxybutyrolacton, 4-Hydroxybutyrolacton, 1 -Butanol, 2-Butanol, tert-Butanol, Isobutanol, 2-Hydroxybuttersäure, 3- Hydroxybuttersäure, 4-Hydroxybuttersäure, 2-Hydroxyisobuttersäure und 3- Hydroxyisobuttersäure besteht, ausgewählt. In einer Ausführungsform werden die C ₄ -Körper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Malat, Oxalacetat und aus durch enzymatische oder chemische Synthese über Malat oder Oxalacetat hergestellte Folgeverbindungen. Die durch enzymatische Synthese über Malat oder Oxalacetat hergestellte Folgeverbindungen können beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus: Succinat, Aspartat, Asparagin, Threonin, Tetrahydrofuran, Butyrat, Butandiol, 1 ,2-Butandiol, 1 ,3-Butandiol, 1 ,4-Butandiol, 2,3-Butandiol, 3- und 4-

Hydroxybutyrolacton, 1 -, 2- und tert-Butanol, Isobutanol, 2-, 3- und 4-Hydroxybuttersäure, 2- und 3-Hydroxyisobuttersäure, Methionin und Lysin.

In einer Ausführungsform sind die C ₄ -Körper C ₄ -Carbonsäuren, vorzugsweise C ₄ - Dicarbonsäuren, noch bevorzugter Succinat. In einer weiteren Ausführungsform sind die C ₄ - Körper Hydroxycarbonsäuren, noch bevorzugter 2-, 3- und/oder 4-Hydroxybuttersäure sowie 2- und/oder 3-Hydroxyisobuttersäure. In einer anderen Ausführungsform sind die C ₄ -Körper vorzugsweise Malat und/oder Oxalacetat. In weiteren Ausführungsformen handelt es sich bei der rekombinanten Zelle um eine mikrobielle Zelle, insbesondere um eine Escherichia coli, Alcaligenes latus, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Escherichia coli, Basfia succiniciproducens, Wollinella succinogenes, Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus flavefaciens, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Mannheimia succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens,

Zymonomas mobilis, Methylobacterium extorquens, Ralstonia eutropha, Saccharomyces cerevisiae, Rhodobacter sphaeroides, Paracoccus versutus, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter calcoaceticus, Clostridium acetobutylicum, Clostridium

saccharoperbutylacetonicum, Clostridium beijerinckii, Rhodospirillum rubrum, Burkholderia thailandensis oder Pseudomonas putida Zelle.

Die erfindungsgemäße rekombinante Zelle kann beispielsweise derart gentechnisch verändert sein, dass sie, im Vergleich zu ihrem Wildtyp, mehr Saccharose aufnehmen kann. Eine andere Möglichkeit, die alternativ oder auch zusätzlich Anwendung finden kann, ist eine gentechnische Veränderung der Zelle, die es der rekombinanten Zelle ermöglicht, im Vergleich zu ihrem Wildtyp, mehr Kohlendioxid zu fixieren.

In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Steigerung der Saccharoseaufnahme dadurch erreicht, dass die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines Enzyms aufweist, welches den Transport von Saccharose in die Zelle katalysiert.

Der Ausdruck„mindestens eines", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Mengen von >1 , d.h. 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30 oder mehr, insbesondere 1 , 2, 3, 4 oder 5.

In einer Ausführungsform umfasst die rekombinante Zelle der Erfindung ein Enzym E-i , das den Transport von Saccharose in die Zelle und die Umsetzung zu Saccharose-6-Phosphat katalysiert.

Unter dem Begriff„Enzym" oder„E _x ", wie hierin verwendet, wobei x eine ganze Zahl bedeutet, wird ein Protein oder Proteinkomplex verstanden, das/der eine oder mehrere biochemische Reaktionen katalysiert und/oder das/der zum Transport von bestimmten Verbindungen, beispielsweise durch eine Membran, dient.

Die Begriffe„gesteigerte Aktivität eines Enzyms" oder„verminderte Aktivität eines Enzyms", wie hierin verwendet, beziehen sich vorzugsweise auf eine gesteigerte/verminderte intrazelluläre oder membranständige Aktivität. Die nun folgenden Ausführungen zur Erhöhung oder Verminderung der Enzymaktivität in Zellen gelten sowohl für die Erhöhung/Verminderung der Aktivität des Enzyms E-ι als auch für alle nachfolgend genannten Enzyme, deren Aktivität gegebenenfalls erhöht oder vermindert werden kann.

Grundsätzlich lässt sich eine Steigerung der enzymatischen Aktivität dadurch erzielen, dass man die Kopienzahl der Gensequenz bzw. der Gensequenzen erhöht, welche für das Enzym kodieren, einen starken Promotor verwendet, die Kodonnutzung des Gens verändert, auf verschiedene Art und Weise die Halbwertszeit der mRNA oder des Enzyms erhöht, Repression eliminiert, Inhibition verhindert oder ein Gen oder Allel einschleust oder der Art manipuliert, dass es für ein entsprechendes Enzym mit einer gesteigerten Aktivität kodiert. Diese Maßnahmen werden gegebenenfalls kombiniert. Erfindungsgemäß gentechnisch veränderte Zellen werden beispielsweise durch Transformation, Transduktion, Konjugation oder einer Kombination dieser Methoden mit einem Vektor erzeugt, der das gewünschte Gen, ein Allel dieses Gens oder Teile davon und einen die Expression des Gens ermöglichenden Vektor enthält. Die heterologe Expression wird insbesondere durch Integration des Gens oder der Allele in das Chromosom der Zelle oder einem extrachromosomal replizierenden Vektor erzielt.

Einen Überblick über die Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen am Beispiel der Pyruvat-Carboxylase gibt DE-A-100 31 999, die hiermit als Referenz eingeführt wird und deren Offenbarungsgehalt hinsichtlich der Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung bildet.

Die Expression der vorstehend und aller nachfolgend genannten Enzyme bzw. Gene ist mit Hilfe von 1 - und 2- dimensionaler Proteingelauftrennung und anschließender optischer

Identifizierung der Proteinkonzentration mit entsprechender Auswert-Software im Gel nachweisbar. Wenn die Erhöhung einer Enzymaktivität ausschließlich auf einer Erhöhung der Expression des entsprechenden Gens basiert, so kann die Quantifizierung der Erhöhung der Enzymaktivität in einfacher Weise durch einen Vergleich der 1 - oder 2- dimensionalen

Proteinauftrennungen zwischen Wildtyp und gentechnisch veränderter Zelle bestimmt werden. Eine gebräuchliche Methode zur Präparation der Proteingele bei coryneformen Bakterien und zur Identifizierung der Proteine ist die von Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001 )) beschriebene Vorgehensweise. Die Proteinkonzentration kann ebenfalls durch Western-Blot- Hybridisierung mit einem für das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper (Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. USA, 1989) und anschließender optische Auswertung mit

entsprechender Software zur Konzentrationsbestimmung (Lohaus und Meyer (1989)

Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 1 1 1 : 2630-2647) analysiert werden. Die Aktivität von DNA-bindenden Proteinen kann mittels DNA-Band-Shift-Assays (auch als Gelretardation bezeichnet) gemessen werden (Wilson et al. (2001 ) Journal of Bacteriology, 183: 2151 -2155). Die Wirkung von DNA- bindenden Proteinen auf die Expression anderer Gene kann durch verschiedene gut beschriebene Methoden des Reportergen-Assays nachgewiesen werden (Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989). Die intrazellulären enzymatischen Aktivitäten können nach verschiedenen beschriebenen Methoden (Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627; Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8) : 2277-2284; Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 1 15 (3): 816- 823) bestimmt werden. Sofern in den nachfolgenden Ausführungen keine konkreten Methoden zur Bestimmung der Aktivität eines bestimmten Enzyms angegeben werden, erfolgt die Bestimmung der Steigerung der Enzymaktivität und auch die Bestimmung der Verminderung einer Enzymaktivität vorzugsweise mittels der in Hermann et al. (Electophoresis, 22: 1712-23 (2001 )), Lohaus et al. (Biospektrum 5 32- 39 (1998)), Lottspeich (Angewandte Chemie 1 1 1 : 2630- 2647 (1999)) und Wilson et al. (Journal of Bacteriology 183: 2151 -2155 (2001 )) beschriebenen Methoden. Wird die Erhöhung der Enzymaktivität durch Mutation des endogenen Gens bewerkstelligt, so können derartige Mutationen entweder nach klassischen Methoden ungerichtet erzeugt werden, wie etwa durch UV-Bestrahlung oder durch mutationsauslösende Chemikalien, oder gezielt mittels gentechnologischer Methoden wie Deletion(en) Jnsertion(en) und/oder

Nukleotidaustausch(e). Durch diese Mutationen werden gentechnisch veränderte Zellen erhalten. Besonders bevorzugte Mutanten von Enzymen sind insbesondere auch solche Enzyme, die nicht mehr oder zumindest im Vergleich zum Wildtyp- Enzym vermindert

Feedback-inhibierbar sind, wenn eine gesteigerte Enzymaktivität gewünscht ist.

Wird die Erhöhung der Enzymaktivität durch Erhöhung der Expression eines Enzyms bewerkstelligt, so erhöht man beispielsweise die Kopienzahl der entsprechenden Gene oder mutiert die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet. In gleicher weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression zu jedem beliebigen Zeitpunkt zu steigern. Des Weiteren können dem Enzym-Gen als regulatorische Sequenzen aber auch sogenannte "Enhancer" zugeordnet sein, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA ebenfalls eine erhöhte Genexpression bewirken. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte liegen dabei entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vor oder sind im Chromosom integriert und amplifiziert. Alternativ kann weiterhin eine

Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden. Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93- 98 (1991 )), in EP-A-0 472 869, in US 4,601 ,893, bei Schwarzer und Puhler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991 )), bei Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001 -1007 (1993)), in WO-A- 96/15246, bei Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), in JP-A-10-229891 , bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191 -195 (1998)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. Die vorstehend beschriebenen Maßnahmen führen ebenso wie die Mutationen zu gentechnisch veränderten Zellen. Zur Erhöhung der Expression der jeweiligen Gene werden zum Beispiel episomale Plasmide eingesetzt. Als Plasmide bzw. Vektoren kommen im Prinzip alle dem Fachmann für diesen Zweck zur Verfügung stehenden Ausführungsformen in Frage. Derartige Plasmide und

Vektoren können z. B. den Broschüren der Firmen Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech oder Gibco BRL entnommen werden. Weitere bevorzugte Plasmide und Vektoren können gefunden werden in: Glover, D. M. (1985), DNA cloning: a practical approach, Vol. I-Ill, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R.L. und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors : a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990), Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3-7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Casali, N. and Preston, A. (eds) (2003) E. coli Plasmid Vectors. Humana Press. Als Plasmide eignen sich insbesondere solche, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren, wie zum Beispiel pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology 64: 549-554 (1989)), pEKExl (Eikmanns et al., Gene 107: 69-74 (1991 )) oder pHS2-l (Sonnen et al., Gene 107: 69- 74 (1991 )) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1 . Andere Plasmidvektoren, wie zum Beispiel solche, die auf pCG4 (US 4,489,160) oder pNG2 (Serwold- Davis et al. , FEMS Microbiology Letters 66: 1 19- 124 (1990)) oder pAG1 (US 5,158,891 ) beruhen, können in gleicher weise eingesetzt werden. Weiterhin eignen sich auch solche Plasmidvektoren, mit Hilfe derer man das Verfahren der Genamplifikation durch Integration in das Chromosom anwenden kann, so wie es beispielsweise von Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60: 126-132 (1994)) zur Duplikation bzw. Amplifikation des hom- thrB-Operons beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise Escherichia coli), nicht aber in Corynebacterium glutamicum repliziert werden kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1 : 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145: 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, Wisconsin, USA), pCR2.1 -TOPO (Shuman, Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84 (1994)), pCR ^® Blunt (Invitrogen, Groningen, Niederlande), pEM1 (Schrumpf et al., Journal of Bacteriology 173: 4510-4516)) oder pBGS8 (Spratt et al., Gene 41 : 337-342 (1986)) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschließend durch Konjugation oder

Transformation in den gewünschten Stamm von Corynebacterium glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al., Applied and Environmental Microbiology 60: 756-759 (1994) beschrieben. Methoden zur Transformation sind

beispielsweise bei Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356-362 (1988), Dunican und Shivnan, Bio/Technology 7: 1067-1070 (1989) und Tauch et al., FEMS Microbiology Letters 123: 343-347 (1994) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines„cross-over"-Ereignisses enthalt der resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens.

Mit den oben genannten Methoden lässt sich analog eine Verringerung der enzymatischen Aktivität erzielen. Dies gliedert sich ebenfalls in zwei Strategien, die Reduktion der Expression und/oder die Inhibierung der Enzymaktivität. Zur Reduktion der Expression kann beispielsweise das korrespondierende Gen ganz oder teilweise deletiert werden. Zudem kann die

Transkription, beispielsweise durch die Manipulation der Promotorregion oder Verstärkung der Repression (genetisch oder chemisch) bzw. die Herabsetzung der mRNA-Halbwertszeit, inhibiert oder reduziert werden. Ebenfalls kann auf RNA-Ebene die Translation gestört oder reduziert werden. Dem Fachmann sind dazu zahlreiche Techniken bekannt, zum Beispiel die RNAi-Technologie oder die Modifikation der DNA-Sequenz dahingehend, dass es zur Ausbildung von Sekundärstrukturen auf mRNA-Ebene kommt, die die Translation inhibieren oder reduzieren. Die Enzymaktivität kann beispielsweise durch Zugabe von Inhibitoren, durch Einfügen von gerichteten oder ungerichteten Mutationen reduziert werden. Unter der vorstehend und in den nachfolgenden Ausführungen verwendeten Formulierung„eine gegenüber ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E _x " ist vorzugsweise stets eine um einen Faktor von mindestens 2, besonders bevorzugt von mindestens 10, darüber hinaus bevorzugt von mindestens 100, darüber hinaus noch mehr bevorzugt von mindestens 1 .000 und am meisten bevorzugt von mindestens 10.000 gesteigerte Aktivität des jeweiligen Enzyms E _x zu verstehen. Weiterhin umfasst die erfindungsgemäße Zelle, welche„eine gegenüber ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E _x " aufweist, insbesondere auch eine Zelle, deren Wildtyp keine oder zumindest keine nachweisbare Aktivität dieses Enzyms E _x aufweist und die erst nach Erhöhung der Enzymaktivität, beispielsweise durch Überexpression, eine

nachweisbare Aktivität dieses Enzyms E _x zeigt. In diesem Zusammenhang umfasst der Begriff „Überexpression" oder die in den nachfolgenden Ausführungen verwendete Formulierung „Erhöhung der Expression" auch den Fall, dass eine Ausgangszelle, beispielsweise eine Wildtyp-Zelle, keine oder zumindest keine nachweisbare Expression aufweist und erst durch rekombinante Verfahren eine nachweisbare Expression des Enzyms E _x induziert wird. Unter der nachfolgend verwendeten Formulierung„verminderte Aktivität eines Enzyms E _x " wird dementsprechend vorzugsweise eine um einen Faktor von mindestens 0,5, besonders bevorzugt von mindestens 0,1 , darüber hinaus bevorzugt von mindestens 0,01 , darüber hinaus noch mehr bevorzugt von mindestens 0,001 und am meisten bevorzugt von mindestens 0,0001 verminderte Aktivität verstanden. Die Verminderung der Aktivität eines bestimmten Enzyms kann beispielsweise durch gezielte Mutation, genetische Deletion des Gens, durch Zugabe von kompetitiven oder nicht kompetitiven Inhibitoren oder durch andere, weiter oben beschriebene bzw. dem Fachmann bekannte Maßnahmen zur Verminderung der Expression und/oder Funktion eines bestimmten Enzyms erfolgen. Dabei ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass die gentechnisch veränderte Zelle derart gentechnisch verändert ist, dass sie in einem definierten Zeitintervall, vorzugsweise innerhalb von 2 Stunden, noch mehr bevorzugt innerhalb von 8 Stunden und am meisten bevorzugt innerhalb von 24 Stunden, mindestens 2mal, besonders bevorzugt mindestens lOmal, darüber hinaus bevorzugt mindestens lOOmal, darüber hinaus noch mehr bevorzugt mindestens I.OOOmal und am meisten bevorzugt mindestens 10.000 mal mehr C ₄ -Körper bildet als der Wildtyp der Zelle. Die Zunahme der Produktbildung kann dabei beispielsweise dadurch bestimmt werden, dass die erfindungsgemäße Zelle und die Wildtyp-Zelle jeweils getrennt unter gleichen Bedingungen (gleiche Zelldichte, gleiches Nährmedium, gleiche Kulturbedingungen) für ein bestimmtes Zeitintervall in einem geeigneten Nährmedium kultiviert werden und anschließend die Menge an Zielprodukt (C ₄ -Körper) im Nährmedium bestimmt wird.

Das Enzym E-ι kann beispielsweise ein Phosphoenolpyruvat (PEP)-abhängiges

Phosphotransferase-System (PTS) Enzym I I (Saccharose-spezifisch) (EC 2.7.1 .69; TCDB Klassifikation 4.A.1 .2.1 , 4.A.1 .2.9 oder 4.A.1 .2.-) sein.

Das Enzym E-ι kann beispielsweise durch das scrA Gen kodiert werden. Die kodierende Nukleotidsequenz und die dazugehörige Proteinsequenz können beispielsweise der„Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes" (KEGG-Datenbank) , den Datenbanken des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA), der Proteindatenbank UniProt (Kooperation des European Bioinformatics Institute (EBI), des Swiss Institute of Bioinformatics (SI B) und des Protein Information Resource (PI R)) oder der Nukleotidsequenz-Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland bzw. Cambridge, UK) entnommen werden. In einem besonderen Fall handelt es sich bei Ei um das aus E. coli stammende scrA Gen (SEQ I D NO:41 ) und das daraus resultierende Protein. Darüber hinaus wird das Enzym Ei vorzugsweise von Genen kodiert, die aus der Gruppe derer ausgewählt werden, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren, zu mindestens 60%, vorzugsweise zu mindestens 80%, besonders bevorzugt zu mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt zu mindestens 99%, insbesondere zu 100% zu SEQ ID NO: 58 identisch ist.

In einer Ausführungsform wird das Enzym E-ι von Genen kodiert, die aus der Gruppe derer ausgewählt werden, die Genprodukte kodieren, in deren Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne„PTS-II- BC-sucr" (TIGR01996 oder PssmI D 131051 ) mit einem E-Wert (englisch„e-value") kleiner 1 x 10 ^"5 festgestellt (englisch„domain hit") wird. Zusätzlich zu dem Enzym E-i , das den Transport von Saccharose in die Zelle und die

Umsetzung zu Saccharose-6-Phosphat katalysiert, kann die rekombinante Zelle ferner eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines Enzyms E ₂ , E ₃ und E ₄ oder einer Kombination dieser Enzyme aufweisen. Dabei kann E ₂ ein Enzym sein, das die

Umsetzung von Saccharose-6-Phosphat zu -D-Glukose-6-Phosphat und -D-Fruktose katalysiert, E ₃ kann ein Enzym sein, das die Umsetzung von -D-Fruktose zu -D-Fruktose-6- Phosphat katalysiert, und E ₄ kann ein Kanal sein, der diffusions-abhängigen Saccharose- Transport in die Zelle erlaubt. In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung daher rekombinante Zellen, die im Vergleich zu ihrem Wildtyp eine gesteigerte Aktivität mindestens eines der Enzyme E ₂ , E ₃ und E ₄ aufweisen. In einer Ausführungsform ist im Vergleich zum Wildtyp die Aktivität des Enzyms E-i und mindestens eines der Enzyme E ₂ , E ₃ und E ₄ gesteigert. In einer anderen Ausführungsform ist im Vergleich zum Wildtyp die Aktivität der Enzyme i) E-i , E ₂ und E ₃ , ii) E ₂ , E ₃ und E ₄ , iii) E ₂ und E ₃ , iv) E ₃ und E ₄ , v) E ₂ und E ₄ , oder vi) E-i , E ₃ und E ₄ erhöht. In einer weiteren Ausführungsform weist die erfindungsgemäße rekombinante Zelle eine im Vergleich zum Wildtyp erhöhte Aktivität der Enzyme Ei , E ₂ , E ₃ und E ₄ auf.

In weiteren Ausführungsformen kann es sich bei dem Enzym E ₂ um eine Saccharose-6- Phosphat-Fruktohydrolase (EC 3.2.1 .26), bei dem Enzym E ₃ um eine Fruktokinase (EC 2.7.1 .4) und/oder bei dem Enzym E ₄ um ein Saccharose Porin (TCDB Klassifikation 1 .B.3.1 .2) handeln.

In einer Ausführungsform der Erfindung wird E ₂ von dem scrB (£. coli scrB: SEQ I D NO:42), bfrA, sacA, sacB, cscA, fruA oder susH Gen (Streptococcus pneumoniae susH: SEQ I D NO:52) kodiert, E ₃ wird von dem mac, yajF, mtlZ, rbsK, glcK, pfkB, frcK, frk, sacK, ydhR, kdgK, suk, ydjE, gmuE, ydjE, scrK (£. coli scrK: SEQ ID NO:43) oder cscK Gen (£. coli cscK: SEQ I D NO:46) kodiert und E ₄ wird von dem scrY Gen (£. coli scrY: SEQ ID NO:44) kodiert.

Die Nukleotidsequenzen der vorstehend genannten Gene, deren korrespondierenden

Proteinsequenzen sowie weitere Gene für die Enzyme E ₂ bis E ₄ können unter anderem auch der KEGG-, der NCBI-, der UniProt- oder EMBL-Datenbank entnommen werden. In einem besonderen Fall handelt es sich bei E ₂ , E ₃ und/oder E ₄ um aus £ coli stammende Gene bzw. die dadurch kodierten Proteine. In einer Ausführungsform wird das Enzym E ₂ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO:59 aufweisen.

In verschiedenen Ausführungsformen wird das Enzym E ₂ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, in deren Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten

Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne„scrB_fam" (TIGR01322 oder PssmID 162301 ) mit einem E-Wert (englisch„e-value") kleiner 1 x 10 ^"5 festgestellt wird (englisch„domain hit"). In einer Ausführungsform wird das Enzym E ₃ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO:60 oder SEQ ID NO:63 aufweisen.

In einer Ausführungsform wird das Enzym E ₃ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne

„bac_FRK" (cd01 167) mit einem E-Wert (englisch„e-value") kleiner 1 x 10 ^"5 festgestellt wird (englisch„domain hit").

In einer Ausführungsform wird das Enzym E ₄ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO:61 aufweisen. In einer Ausführungsform wird das Enzym E ₄ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, in deren Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne

„Maltoporin-like" (cd01346 oder PssmID 30073) mit einem E-Wert (englisch„e-value") kleiner 1 x 10 ^"5 festgestellt wird (englisch„domain hit").

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung, zeichnet sich die rekombinante Zelle dadurch aus, dass die im Vergleich zum Wildtyp gesteigerte Saccharoseaufnahme durch die erhöhte Aktivität eines Kanals E ₅ bewirkt wird, der Saccharose in die Zelle symportiert. Die vorliegende Erfindung erfasst ebenfalls Ausführungsformen, in denen dieser gesteigerte Saccharose- Symport mit den zuvor erwähnten erhöhten Aktivitäten der Enzyme E-i , E ₂ , E ₃ und/oder E ₄ kombiniert ist.

Der Kanal E ₅ kann beispielsweise eine Saccharose-Permease sein. In einer Ausführungsform wird E ₅ durch das cscB Gen (beispielsweise £ coli cscB: SEQ ID NO:45) kodiert.

In weiteren Ausführungsformen kann die rekombinante Zelle zusätzlich zu E ₅ eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines der folgenden Enzyme aufweisen: E ₆ , das die Umsetzung von Saccharose zu -D-Glucose und -D-Fruktose katalysiert; und E ₃ , das die Umsetzung von -D-Fruktose zu -D-Fruktose-6-Phosphat katalysiert. In einer

Ausführungsform ist die Aktivität beider Enzyme erhöht.. In einer Ausführungsform der Erfindung, ist das Enzym E ₅ eine Saccharose-Permease (TCDB Klassifikation 2.A.1 .5.3), das Enzym E ₃ eine Fruktokinase (EC 2.7.1 .4) und das Enzym E ₆ eine -D-Fruktofuranosid-Fruktohydrolase (EC 3.2.1 .26).

In diesem Zusammenhang kann das Enzym E ₅ durch cscB (beispielsweise £. coli cscB: SEQ ID NO:45), lamB oder scrY (beispielsweise £ coli scrY: SEQ ID NO:44), E ₃ durch mac, yajF, mtlZ, rbsK, glcK, pfkB, frcK, frk, sacK, ydhR, kdgK, suk, ydjE, gmuE, ydjE, scrK (beispielsweise £ coli scrK: SEQ ID NO:43) oder cscK (beispielsweise £ coli cscK: SEQ ID NO:46) und/oder E ₆ durch cscA (beispielsweise £ coli cscA: SEQ ID NO:47), susH (beispielsweise Streptococcus pneumoniae susH: SEQ ID NO:52), scrB (beispielsweise £ coli scrB: SEQ ID NO:42), rafD, sacA, fruA oder bfrA kodiert werden. Die Nukleotidsequenzen der vorstehend genannten Gene, deren korrespondierende Proteinsequenz sowie weiterer Gene für die Enzyme E ₃ , E ₅ und E ₆ können unter anderem auch der KEGG-, der NCBI-, der UniProt- oder EMBL-Datenbank entnommen werden. In einem besonderen Fall handelt es sich bei E ₃ , E ₅ und/oder E ₆ um aus £. coli stammende Gene und die dadurch kodierten Proteine.

In einer Ausführungsform wird das Enzym E ₅ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO:62 aufweisen.

In einer Ausführungsform wird das Enzym E ₅ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, in deren Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne „LacY_symp" (PFAM domain 01306 oder PssmID 1 10319) mit einem E-Wert (englisch„e- value") kleiner 1 x 10 ^"5 festgestellt wird (englisch„domain hit").

In einer Ausführungsform wird das Enzym E ₆ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO:64 oder SEQ ID NO:51 aufweisen.

In einer Ausführungsform wird das Enzym E ₆ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, in deren Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne„SacC" (COG1621 oder PssmID 31808) mit einem E-Wert (englisch„e-value") kleiner 1 x 10 ^"5 festgestellt wird(englisch„domain hit"). In einer weiteren Ausführungsform wird die gesteigerte Saccharoseaufnahme der erfindungsgemäßen rekombinanten Zelle dadurch bewirkt, dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mindestens eine gesteigerte Aktivität eines Enzymkomplexes aufweist, der Saccharose in die Zelle transportiert.

Dieser Saccharose transportierende Enzymkomplex kann sich beispielsweise aus den

Enzymen E ₇ , E ₈ und E ₉ zusammensetzen, und umfasst zum Beispiel einen Saccharosespezifischen ABC-Transporter (TCDB Klassifikation 3.A.1 .1.-). In diesem Zusammenhang kann das Enzym E ₇ durch ein susT1 Gen (beispielsweise

Streptococcus pneumoniae susT1 : SEQ ID NO:48), E ₈ durch ein susT2 Gen (beispielsweise Streptococcus pneumoniae susT2: SEQ ID NO:49) und/oder E ₉ durch ein susX Gen

(beispielsweise Streptococcus pneumoniae susX: SEQ ID NO:50) kodiert werden. Ferner kann die Zelle mit gesteigerter Saccharose-Transporter-Aktivität eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines Enzyms E ₁₀ , E _2, E ₃ oder E ₆ oder einer beliebige Kombination dieser Enzyme aufweisen. Dabei katalysiert das Enzym E ₁₀ die

Umsetzung von Saccharose zu Saccharose-6-Phosphat, das Enzym E ₂ die Umsetzung von Saccharose-6-Phosphat zu -D-Glukose-6-Phosphat und -D-Fruktose, das Enzym E ₃ die Umsetzung von -D-Fruktose zu -D-Fruktose-6-Phosphat und das Enzym E ₆ die Umsetzung von Saccharose zu -D-Glucose und -D-Fruktose.

In einer Ausführungsform weist die rekombinante Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität der Enzyme E ₁₀ , E ₂ , E ₃ und E ₆ auf.

Enzym E ₁₀ kann eine Saccharose-Kinase, Enzym E ₂ eine Saccharose-6-Phosphat- Fruktohydrolase (EC 3.2.1.26), Enzym E ₃ eine Fruktokinase (EC 2.7.1 .4) und/oder Enzym E ₆ eine -D-Fruktofuranosid-Fruktohydrolase (EC 3.2.1 .26) sein. In diesem Zusammenhang kann das Enzym E ₁₀ durch ein Saccharose-Kinase Gen, E ₂ durch ein scrB (beispielsweise £ coli scrB: SEQ ID NO:42), bfrA, sacA, sacB, cscA (beispielsweise £. coli cscA: SEQ ID NO:47), fruA oder susH Gen und/oder E ₃ durch ein mac, yajF, mtlZ, rbsK, glcK, pfkB, frcK, frk, sacK, ydhR, kdgK, suk, ydjE, gmuE, ydjE, scrK (beispielsweise £ coli scrK: SEQ ID NO:43) oder cscK (beispielsweise £ coli cscK: SEQ ID NO:46) Gen kodiert werden. Die Nukleotidsequenzen der vorstehend genannten Gene, deren korrespondierenden

Proteinsequenzen sowie weitere alternative Gene für die Enzyme E ₂ , E ₃ , E ₇ , E ₈ , E ₉ und E ₁₀ können unter anderem auch der KEGG-, der NCBI-, der UniProt- oder EMBL-Datenbank entnommen werden. In einem besonderen Fall handelt es sich bei E ₂ , E ₃ , und/oder E ₁₀ um aus E. coli und bei E ₇ , E ₈ und/oder E ₉ um aus Streptococcus pneumoniae stammende Gene und die dadurch kodierten Proteine.

In einer Ausführungsform wird das Enzym E ₇ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO:65 aufweisen.

In einer weiteren Ausführungsform wird das Enzym E ₇ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, ib deren Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten

Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne„LplB" (COG4209 oder PssmID 33938) mit einem E-Wert (englisch„e- value") kleiner 1 x 10 ^"5 festgestellt wird (englisch„domain hit").

In einer Ausführungsform wird das Enzym E ₈ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO:66 aufweisen. In einer Ausführungsform wird das Enzym E ₉ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO:67 aufweisen.

In einer Ausführungsform wird das Enzym E ₉ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, in deren Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne„UgpB" (COG1653 oder PssmID 31839) mit einem E-Wert (englisch„e-value") kleiner 1 x 10 ^"5 festgestellt wird (englisch„domain hit").

In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können zwei oder drei der erwähnten

Möglichkeiten der Manipulation des Saccharose-Aufnahmewegs miteinander kombiniert werden, so dass die rekombinante Zelle sich durch die gesteigerte Aktivität von zwei oder drei Saccharose-Aufnahmewegen von ihrem Wildtyp unterscheidet. Dies kann jeweils ein, mehrere oder sämtliche Enzyme aus den geschilderten Varianten betreffen. In bestimmten

Ausführungsformen ist daher in einer rekombinanten Zelle gemäß der Erfindung die Aktivität der folgenden Enzyme gegenüber dem Wildtyp gesteigert:

E E ₉ ;

E ₄ , E ₅ , E ₆ , E ₇ , E ₈ , E ₉ ;

Ei, E ₂ , E ₃ , E ₇ , E ₈ , Eg! Ε-ιο!

E ₃ , E ₄ , E ₆ , E ₇ , E ₈ , E ₉ ; oder

E ₃ , E ₆ , E ₇ , E ₈ , E ₉ .

In anderen Ausführungsformen ist die Aktivität von mindestens einem, vorzugsweise

mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Enzymen ausgewählt aus der Gruppe der Enzyme E E ₁₀ gesteigert.

In einer Ausführungsform der Erfindung ist die rekombinante Zelle gentechnisch derart verändert, dass sie im Vergleich zu Ihrem Wildtyp eine gesteigerte Aktivität mindestens eines Enzyms aufweist, das die Fixierung von C0 ₂ an einen C ₃ -Körper katalysiert. Diese gesteigerte Kohlendioxid-Fixierung kann alternativ oder zusätzlich zu einer Steigerung des Saccharose- Transports in die Zelle vorliegen. Die Steigerung des Saccharosetransports kann mittels der oben dargelegten Techniken erfolgen. Das mindestens eine Enzym, das die Fixierung von C0 ₂ an einen C ₃ -Körper katalysiert, kann in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus folgenden Enzymen besteht:

E ₁₂ , das die Umsetzung von Pyruvat, ATP und C0 ₂ zu Oxalacetat, ADP und Phosphat katalysiert;

Ei ₃ , das die Umsetzung von Phosphoenolpyruvat, H ₂ 0 und C0 ₂ zu Oxalacetat und

Phosphat katalysiert;

E ₁₄ , das die Umsetzung von Phosphoenolpyruvat, ADP/GDP/P, und C0 ₂ zu Oxalacetat und ATP/GTP/PPi katalysiert;

E ₁₅ , E ₁₆ , E ₁₇ und E ₁₈ , die die Umsetzung von Pyruvat NAD(P)H ⁺ und C0 ₂ zu Malat und NAD(P) ⁺ katalysieren.

Ebenfalls erfasst durch die vorliegende Erfindung sind beliebige Kombinationen erhöhter Aktivitäten der Enzyme E ₁₂ -E ₁₈ sowie die gesteigerte Aktivität aller Enzyme E ₁₂ -E ₁₈ . In einer Ausführungsform ist

E ₁₂ eine Pyruvat-Carboxylase (EC 6.4.1 .1 );

E ₁₃ eine Phosphoenolpyruvat-Carboxylase (Phosphat:Oxalacetat-Carboxylase) (EC 4.1 .1 .31 );

E ₁₄ eine Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (ATP/GTP/PPi:Oxalacetat-Carboxylase) (EC 4.1 .1 .32, EC 4.1 .1 .38 oder EC 4.1 .1 .49);

E ₁₅ eine Malatdehydrogenase ((S)-Malat:NAD ⁺ Oxidoreduktase) (EC 1 .1 .1 .38);

E ₁₆ eine Malatdehydrogenase ((S)-Malat:NAD ⁺ Oxidoreduktase) (EC 1 .1 .1 .39);

E ₁₇ eine Malatdehydrogenase ((S)-Malat:NADP ⁺ Oxidoreduktase) (EC 1 .1 .1 .40);

und/oder

E ₁₈ eine D-Malatdehydrogenase ((R)-Malat:NAD ⁺ Oxidoreduktase) (EC 1 .1 .1 .83).

Das Enzym E ₁₂ kann vorzugsweise aus durch ein Gen kodiert werden, das aus der Gruppe umfassend cgl516, aarl62Cp pyrl, pca, cgl0689, pc, pcx, pyc-1 , pyc-2, accC-2, pycA, pycA2, pyc, pycB, pycB1 , pycB2, accC, accA, oadA, pyr, acc und accC1 ausgewählt wird, wobei das pyc-Gen (beispielsweise E. coli pyc: SEQ ID NO:5) besonders bevorzugt ist.

Erfindungsgemäß bevorzugte Pyruvat-Carboxylasen sind insbesondere auch in US 6,455,284, US 6,171 ,833, US 6,884,606, US 6,403,351 , US 6,852,516 und US 6,861 ,246 beschrieben. Eine in diesem Zusammenhang besonders bevorzugte Pyruvat-Carboxylase pyc ist diejenige Mutante, die in„A novel methodology employing Corynebacterium glutamicum genome

Information to generate a new L-lysine- producing mutant.", Ohnishi J et al., Applied

Microbiology and Biotechnology, Vol. 58 (2), Seiten 217-223 (2002) beschrieben ist. Bei dieser Mutante wurde die Aminosäure Prolin an Position 458 durch Serin ersetzt. Der

Offenbarungsgehalt dieser Veröffentlichung hinsichtlich der Möglichkeiten zur Herstellung von Pyruvat-Carboxylase-Mutanten wird hiermit als Referenz eingeführt und bildet einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung. In bevorzugter Weise stammt pyc aus

Corynebacterium glutamicum.

Das Enzym E ₁₃ kann vorzugsweise durch ein Gen kodiert werden, das ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend ppc, capP, pepC und clpA, wobei das ppc-Gen bevorzugt ist. In einer Ausführungsform stammt ppc aus E. coli (SEQ ID NO:1 ). Das Enzym E ₁₄ kann vorzugsweise durch ein Gen kodiert werden, das ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend pck, pckG, pckA, pckl , pck2 und pck, wobei das pckA-Gen besonders bevorzugt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform stammt pckA aus E. coli (SEQ ID NO:2).

Erfindungsgemäß bevorzugte Phosphoenolpyruvat-Carboxylasen sind insbesondere auch in US 4,757,009, US 4,980,285, US 5,573,945, US 6,872,553 und US 6,599,732 beschrieben. Der Offenbarungsgehalt dieser Druckschriften im Hinblick auf Phosphoenolpyruvat-Carboxylasen wird hiermit als Referenz eingeführt und bildet einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung. Die Malatdehydrogenasen E ₁₅ , E ₁₆ und E ₁₇ können vorzugsweise durch ein Gen kodiert werden, das ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend me, me1 , me2, me3, mae, mael , mae2, sfcA, sfcA1 , maeA, maeB, maeB1 , maeB2, tme, yqkJ, ywkA, yqkJ, malS, ytsJ, mleA, mleS, mez, sce59.10c, 2sc7gll.23, malSI, malS2, dme, maeBl, maeB2, mdh, mdh1 , mdh2, dmel cgi 0120, dmel cgi 0120, dme1 -cg5889, fl9kl6.27, f6f22.7, t22p22.60, fl8al7.1 , mod1 , tme, mao, cgl3007, malS und malE, wobei für E ₁₅ maeA (beispielsweise £ coli maeA: SEQ ID NO:3), für E ₁₆ mmel (beispielsweise Chlamydomonas reinhardti mmel : SEQ ID NO:55) sowie dme und für E ₁₇ maeB (beispielsweise £ coli maeB: SEQ ID NO:4) besonders bevorzugt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform stammen maeA und maeB aus £ coli.

Die Malatdehydrogenase E ₁₈ kann vorzugsweise durch ein Gen kodiert werden, das ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend yeaU, ycsA, ttuC, ttuC1 , ttuC2, ttuC3, tdh, leuB, leuB1 und dmlA wobei yeaU und dmlA besonders bevorzugt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform stammt dmlA aus £. coli (SEQ ID NO:57).

In einer Ausführungsform wird:

E ₁₂ durch ein pyc Gen;

E ₁₃ durch ein ppc Gen;

E ₁₄ durch ein pckA Gen;

E ₁₅ durch ein maeA Gen;

E ₁₆ durch ein mmel Gen;

E ₁₇ durch ein maeB Gen; und/oder

E ₁₈ durch ein dmlA Gen kodiert.. Die vorgenannten Enzyme können einzeln, alle oder in beliebiger Kombination in ihrer Aktivität gesteigert sein. Insbesondere können mindestens eines, mindestens 2, 3, 4, 5, 6, oder 7 Enzyme der Gruppe E ₁₂ -E ₁₈ in ihrer Aktivität gesteigert sein.

Die Nukleotidsequenzen der vorstehend genannten Gene, deren korrespondierende

Proteinsequenz sowie weiterer Gene für die Enzyme E ₁₂ -E ₁₈ können unter anderem auch der KEGG-, der NCBI-, der UniProt- oder EMBL-Datenbank entnommen werden.

In einer Ausführungsform wird das Enzym E ₁₂ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO:68 aufweisen. In einer Ausführungsform wird das Enzym E ₁₂ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, in deren Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne „DRE_TIM_PC_TC_5S" (cd07937) oder der konservierten Domäne„pyruvate carboxylase" (PRK12999) mit einem E-Wert (englisch„e-value") kleiner 1 x 10 ^"5 festgestellt wird (englisch „domain hit").

In einer Ausführungsform wird das Enzym E ₁₃ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO:69 aufweisen.

In einer Ausführungsform wird das Enzym E ₁₃ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, inderen Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne „Phosphoenolpyruvate carboxylase" (PssmID 166715 oder COG3252 oder c14574 oder PRK00009) mit einem E-Wert (englisch„e-value") kleiner 1 x 10 ^"5 festgestellt wird (englisch „domain hit").

In einer Ausführungsform wird das Enzym E ₁₄ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO:70 aufweisen.

In einer Ausführungsform wird das Enzym E ₁₄ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, in deren Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne „PEPCK_ATP" (cd00484) mit einem E-Wert (englisch„e-value") kleiner 1 x 10 ^"5 festgestellt wird (englisch„domain hit").

In einer Ausführungsform wird das Enzym E ₁₅ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO:71 aufweisen.

In einer Ausführungsform wird das Enzym E ₁₅ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, in deren Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne„NAD(P) binding domain of malic enzyme (ME), subgroup 1 " (cd05312) mit einem E-Wert (englisch„e- value") kleiner 1 x 10 ^"5 festgestellt wird (englisch„domain hit").

In einer Ausführungsform wird das Enzym E ₁₆ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO:56 aufweisen. In einer Ausführungsform wird das Enzym E ₁₆ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, in deren Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne„malate dehydrogenase" (PRK13529) mit einem E-Wert (englisch„e-value") kleiner 1 x 10 ^"5 festgestellt wird (englisch„domain hit").

In einer Ausführungsform wird das Enzym E ₁₇ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO:54 aufweisen. In einer Ausführungsform wird das Enzym E ₁₇ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, in deren Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne„NAD(P) binding domain of malic enzyme (ME), subgroup 2" (cd0531 1 ) mit einem E-Wert (englisch„e- value") kleiner 1 x 10 ^"5 festgestellt wird (englisch„domain hit").

In einer Ausführungsform wird das Enzym E ₁₈ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO:53 aufweisen.

In einer Ausführungsform wird das Enzym E ₁₈ von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, in deren Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne„lso_dh Super-family" (c00445 oder PssmID 174206) mit einem E-Wert (englisch„e-value") kleiner 1 x 10 ^"5 festgestellt wird (englisch„domain hit").

Des Weiteren kann, in einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zellen, die rekombinante Zelle zusätzlich derart gentechnisch verändert sein, dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp einen verminderten Kohlenstofffluss von Saccharose hin zu Gärungsprodukten, die keine C ₄ -Körper sind, aufweist.

Diese Ausführungsform umfasst erfindungsgemäße rekombinante Zellen, die zusätzlich gegenüber ihrem Wildtyp dadurch gekennzeichnet sind, dass sie aus Saccharose weniger d-, C ₂ -, und/oder C ₃ -Nebenprodukte erzeugen. Die dazu erforderliche gentechnische Veränderung kann durch eine Manipulation der rekombinanten Zelle geschehen, wodurch der Metabolismus, der die Gärungsprodukte erzeugt, reduziert oder unterbrochen wird.

In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Aktivität von mindestens einem der folgenden

Enzyme im Vergleich zum Wildtyp verringert:

Ei9, E ₂ o, E21 und E22, die Komponenten eines glukosespezifischen Phosphoenolpyruvat- Phosphotransferasesystems darstellen und als solche den Import von Glukose und in Summe die Umsetzung von Phosphoenolpyruvat und Glukose zu Pyruvat und Glukose- B-Phosphat katalysieren;

E ₂ 3 und E ₂ 4, die die Umsetzung von Pyruvat und CoA zu Formiat und Acetyl-CoA katalysieren;

E ₂ 5, das die Umsetzung von Pyruvat, H ₂ 0 und Ferricytochrom bi zu Acetat, C0 ₂ und Ferrocytochrom bi katalysiert;

E ₂ 6, das die Umsetzung von S-Methylmalonyl-CoA zu Propanoyl-CoA und C0 ₂ katalysiert;

E ₂ 7 und E ₂ 8, die die Umsetzung von Acetyl-Phosphat und ADP/P, zu Acetat und ATP/PP, katalysieren;

E ₂ 9, das die Umsetzung von Acetyl-CoA und P, (Orthophosphat) zu Acetyl-Phosphat und CoA katalysiert;

E ₃₀ , das die Umsetzung von Pyruvat und NADH zu D-Lactat und NAD ⁺ katalysiert;

E31 , das die Umsetzung von Acetyl-CoA zu Acetaldehyd katalysiert;

E ₃₂ , das die Umsetzung von Acetaldehyd zu Ethanol katalysiert;

E ₃₃ , das die Umsetzung von Glyceronphosphat zu Methylglyoxal und Orthophosphat katalysiert;

E ₃₄ , E ₃₅ und E ₃₆ , die einen Komplex bilden, der die Umsetzung von Formiat zu C0 ₂ katalysiert;

E ₃₇ , das die Umsetzung von Formiat zu C0 ₂ katalysiert;

E ₃₈ , E ₃₉ und E ₄₀ , die einen Komplex bilden, der die Umsetzung von Formiat zu C0 ₂ katalysiert;

E41 , das die Umsetzung von Propionyl-CoA, H ₂ 0 und Oxalacetat zu 2-Methylcitrat und CoA katalysiert;

E ₄₂ , das die Umsetzung von 2-Methylcitrat zu 2-Methyl-cis-Aconitat oder 2-Methyl-trans- Aconitat und H ₂ 0 katalysiert; E ₄₃ , das die Umsetzung von 2-Methyl-trans-Aconitat zu 2-Methyl-cis-Aconitat katalysiert; E ₄₄ , das die Umsetzung von 2-Methyl-cis-Aconitat zu Succinat und Pyruvat katalysiert; E ₄₅ , das die Umsetzung von Propionyl-Phosphat und ADP zu Propionat und ATP katalysiert;

E ₄₆ , welches die Umsetzung von Propionyl-CoA und P, zu Propionyl-Phosphat und CoA katalysiert;

E ₄₇ , welches die Umsetzung von Pyruvat zu Acetaldehyd und C0 ₂ katalysiert;

E ₄₈ , welches die Umsetzung von Pyruvat und CoA 2 oxidierten Ferredoxinen zu Acetyl- CoA, C0 ₂ , und 2 reduzierten Ferredoxinen und 2 H ⁺ katalysiert;

E ₄₉ , welches die Umsetzung von D-Xylulose-5-Phosphat und Phosphat zu

Acetylphosphat und D-Glyceraldehyd-3-Phosphate und H ₂ 0 katalysiert;

E ₅₀ , welches die Umsetzung von (S)-Methylmalonyl-CoA und Pyruvat zu Propionyl-CoA und Oxalacetat katalysiert;

E51 , welches die Umsetzung von (S)-Methylmalonyl-CoA zu Succinyl-CoA katalysiert; E ₅₂ , welches die Umsetzung von 2 Pyruvat zu 2-Acetolactat und C0 ₂ katalysiert;

E ₅₃ , welches die Umsetzung von 2-Acetolactat zu Acetoin und C0 ₂ katalysiert;

E ₅₄ , welches die Umsetzung von Acetoin und NAD(P)H ⁺ zu Butan-2,3-diol und NAD(P) ⁺ katalysiert;

E ₅₅ , welches die Umsetzung 2 Acetyl-CoA zu Acetoacetyl-CoA katalysiert;

E ₅₆ , welches die Umsetzung von Acetoacetyl-CoA und NAD(P)H ⁺ zu 3-Hydroxybutyryl-

CoA und NAD(P) ⁺ katalysiert;

E ₅₇ , welches die Umsetzung von Crotonyl-CoA und H ₂ 0 zu 3-Hydroxybutyryl-CoA katalysiert;

E ₅₈ , welches die Umsetzung von Butyraldehyd und NAD(P)H ⁺ zu Butanol und NAD(P) ⁺ katalysiert;

E ₅₉ , welches die Umsetzung von Butyryl-CoA und NAD(P)H ⁺ zu Buryraldehyd und NAD(P) ⁺ katalysiert;

E ₆ o, welches die Umsetzung von Acetoacetat und H ⁺ zu Aceton und C0 ₂ katalysiert; E ₆ i , welches die Umsetzung von Aceton und NAD(P)H ⁺ zu Propanol und NAD(P) ⁺ katalysiert;

E ₆₂ , welches die Umsetzung von Acyl-CoA und Carbonsäure zu Acylat und

Carbonsäure-CoA katalysiert und

E ₆ 3, das die Umsetzung von Pyruvat und NADH zu L-Lactat und NAD ⁺ katalysiert. In bestimmten Ausführungsformen können auch mehrere, d.h. mindestens 2, oder alle der vorgenannten Enzyme in ihrer Aktivität verringert sein.

In bestimmten Ausführungsformen ist/sind:

E ₁₉ und E ₂ o ein PEP-abhängiges Phosphotransferase-System Enzym I I (EC 2.7.1 .69);

E ₂ i ein PEP-abhängiges Phosphotransferase-System Enzym I (EC 2.7.3.9);

E ₂ 2 eine Phosphohistidin-Protein (HPr)-Hexose-Phosphotransferase-Komponenente des

PEP-abhängigen Phosphotransferase-Systems;

E ₂ 3 und E ₂ 4 eine Formiat-C-Acetyltransferase (EC 2.3.1 .54);

E ₂₅ eine Pyruvat:Ferricytochrom b-i-Oxidoreduktase (EC 1 .2.2.2);

E ₂₆ eine Methylmalonyl-CoA-Decarboxylase (EC 4.1 .1 .41 );

E ₂₇ eine ATP/PPi:Acetat-Phosphotransferase (EC 2.7.2.1 oder EC 2.7.2.1 );

E ₂₈ eine Propionat-/Acetat-Kinase (EC 2.7.2.15);

E ₂₉ eine Acetyl-CoA:Phosphat-Acetyltransferase (EC 2.3.1 .8);

E ₃₀ eine D-Lactatdehydrogenase (EC 1 .1 .1 .28);

E ₃₁ eine Acetaldehyd-Dehydrogenase (CoA-acetylierend) (EC 1 .2.1 .10);

E ₃₂ eine NAD-abhängige Alkohol-Dehydrogenase (EC 1 .1 .1 .1 );

E ₃₃ eine Glyceronphosphat-Phospholyase (EC 4.2.3.3);

E ₃₄ , E ₃₅ , E ₃₆ , E ₃₇ , E ₃₈ , E ₃₉ und E ₄₀ Formatdehydrogenasen (EC 1 .2.1 .2);

E ₄₁ eine 2-Methylcitrat Synthase (EC 2.3.3.5);

E ₄₂ eine 2-Methylcitrat Dehydratase (EC 4.2.1 .79 oder EC 4.2.1 .1 17);

E ₄₃ eine 2-Methylaconitat Isomerase;

E ₄₄ eine Methylisocitrat Lyase (EC 4.1 .3.30);

E ₄₅ eine Propionatkinase (EC 2.7.2.15);

E ₄₆ eine Phosphat-Propionyltransferase (EC 2.3.1 .8);

E ₄₇ eine Pyruvatdecarboxylase (EC 4.1 .1 .1 );

E ₄₈ eine Pyruvat:Ferredoxin Oxidoreduktase (EC 1 .2.7.1 );

E ₄₉ eine Phosphoketolase (EC 4.1 .2.9);

E ₅₀ eine Methylmalonyl-CoA-Carboxytransferase (EC 2.1 .3.1 );

E51 eine Methylmalonyl-CoA-Mutase (EC 5.4.99.2);

E ₅₂ eine Acetolactat-Synthase (EC 2.2.1 .6);

E ₅₃ eine Acetolactat-Decarboxylase (EC 4.1 .1 .5);

E ₅₄ eine Butandiol-Dehydrogenase (EC 1 .1 .1 .4 oder EC 1 .1 .1 .76);

E ₅₅ eine Thiolase (EC 2.3.1 .9); E ₅₆ eine 3-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydrogenase (EC 1 .1 .1.157, EC 1 .1.1.35, EC 1.1 .1 .36 oder EC 1.1 .1.21 1 );

E ₅₇ eine Crotonase (EC 4.2.1 .17);

E ₅₈ eine Butanol-Dehydrogenase (EC 1.1 .1.1 oder EC 1.1.1.2);

E ₅₉ eine Butyraldehyd-Dehydrogenase (EC 1.2.1.3, EC 1 .2.1.4 oder EC 1.2.1.5);

E ₆ o eine Acetoacetat-Decarboxylase (EC 4.1 .1.4);

E ₆ i eine Propanol-Dehydrogenase (EC 1 .1 .1.1 oder EC 1 .1 .1.2);

E ₆ 2 eine Acyl-CoA:CoA-Transferase (EC 2.8.3.-); und/oder

E ₆ 3 eine L-Lactatdehydrogenase (EC 1.1 .1 .27).

Die erfindungsgemäßen Zellen weisen in einer Ausführungsform eine im Vergleich zum Wildtyp verringerte Aktivität von mindestens einem, vorzugsweise mindestens 2, noch bevorzugter mindestens 3, am bevorzugtesten mindestens 5 der genannten Enzyme auf. In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Aktivität von mindestens einem der Enzyme E19-E22 reduziert. Eine solche Verringerung der Enzymaktivität kann vorteilhaft sein, da damit der energieaufwendige Import und die Aktivierung von Glukose unterbunden werden, wodurch der Zelle mehr Energie für den Import und die Aktivierung von Saccharose und für die Fixierung von Kohlendioxid zur Verfügung steht.

Das Enzym E ₂ 6 wird vorzugsweise von einem Gen kodiert, das ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend ygfG, mmdA, oadB, oadB2, oadB3, SC1 C2.16, SC1 G7.10, pccBI, mmdB, mmdC und ppcB, wobei das ygfG-Gen besonders bevorzugt ist. In einer Ausführungsform stammt ygfG aus £. coli.

Gemäß verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung weist die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp verminderte Aktivität von mindestens einem Enzym E ₁₉ -E ₄₅ auf, wobei:

E ₁₉ durch ein ptsG Gen kodiert wird;

E ₂ o durch ein ptsl Gen kodiert wird;

E21 durch ein ptsH Gen kodiert wird;

E22 durch ein crr Gen kodiert wird;

E ₂ 3 durch ein tdcE Gen kodiert wird;

E ₂₄ durch ein pflA oder pflB Gen kodiert wird;

E ₂ 5 durch ein poxB Gen kodiert wird; E ₂₆ durch ein ygfG Gen kodiert wird;

E ₂₇ durch ein ackA Gen kodiert wird;

E ₂₈ durch ein ackA oder tdcD Gen kodiert wird;

E ₂ 9 durch ein pta Gen kodiert wird;

E ₃₀ durch ein IdhA Gen kodiert wird;

E ₃₁ durch ein adhE Gen kodiert wird;

E ₃₂ durch ein adhE Gen kodiert wird;

E ₃₃ durch ein mgsA Gen kodiert wird;

E ₃₄ durch ein fdnG Gen kodiert wird;

E ₃₅ durch ein fdnH Gen kodiert wird;

E ₃₆ durch ein fdnl Gen kodiert wird;

E ₃₇ durch ein fdhF Gen kodiert wird;

E ₃₈ durch ein fdoG Gen kodiert wird;

E ₃₉ durch ein fdoH Gen kodiert wird;

E ₄₀ durch ein fdol Gen kodiert wird;

E ₄₁ durch ein prpC Gen kodiert wird;

E ₄₂ durch ein prpD oder acnD Gen kodiert wird;

E ₄₃ durch ein prpF Gen kodiert wird;

E ₄₄ durch ein prpB Gen kodiert wird;

E ₄₅ durch ein tdcD Gen kodiert wird

E ₄₆ durch ein pta Gen kodiert wird;

E ₄₇ durch ein pdc Gen kodiert wird;

E ₄₈ durch ein porA, porB, porC oder porD Gen kodiert wird;

E ₄₉ durch ein xpkl oder xpk2 Gen kodiert wird

E ₅₀ durch ein Methylmalonyl-CoA-Carboxytransferase Gen kodiert wird;

E ₅₁ durch ein sbm oder ein mcmA und ein mcmB Gen kodiert wird;

E ₅₂ durch ein alsS, ilvB, ilvM, ilvN, ilvG, ilvl oder ilvH Gen kodiert wird;

E ₅₃ durch ein alsD Gen kodiert wird;

E ₅₄ durch ein butBGen kodiert wird;

E ₅₅ durch ein thl, thIA, thIB oder phaA Gen kodiert wird;

E ₅₆ durch ein phaB Gen kodiert wird;

E ₅₇ durch ein crt Gen kodiert wird;

E ₅₈ durch ein adhE Gen kodiert wird;

E ₅₉ durch ein adhE, bdhA oder bdhB Gen kodiert wird; E ₆ o durch ein ade Gen kodiert wird;

E ₆ i durch ein adh Gen kodiert wird;

E ₆ 2 durch ein ctfA und ein ctfB oder ein atoA und ein atoD Gen kodiert wird und/oder E ₆ 3 durch ein IdhL Gen kodiert wird.

Die Nukleotidsequenzen der vorstehend genannten Gene, deren korrespondierende

Proteinsequenz sowie weiterer Gene für die Enzyme E ₁₉ -E ₆ 3 können unter anderem auch der KEGG-, der NCBI-, der UniProt- oder EMBL-Datenbank entnommen werden. In einer Ausführungsform der Erfindung, weist die rekombinante Zelle, die ausgehend von Saccharose und C0 ₂ als Kohlenstoffquellen mehr C ₄ -Körper als der Wildtyp herstellen kann, eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp verminderte Aktivität von mindestens einem, mindestens zwei, mindestens 3, oder mindestens 4 der Enzyme E ₁₉ , E ₂ 6, E ₂ 7, E ₂₉ , E ₃₀ , E ₃₁ , E ₃₂ und E ₄₆ auf. In einer solchen Ausführungsform sind die Enzyme E ₁₉ , E ₂₆ , E ₂₇ , E ₂₉ /E ₄₆ , E ₃₀ und E ₃₁ /E ₃₂ IdhA, adhE, ack, pta, ygfG und ptsG. Die erfindungsgemäße Zelle kann auch eine verringerte Aktivität aller 8 Enzyme E ₁₉ , E ₂₆ , E ₂₇ , E ₂₉ , E ₃₀ , E ₃₁ , E ₃₂ und E ₄₆ bzw. aller 6 Enzyme, die durch die Gene IdhA, adhE, ack, pta, ygfG und ptsG kodiert werden, aufweisen.

In weiteren Ausführungsformen weist die rekombinante Zelle, die aus Saccharose und C0 ₂ als Kohlenstoffquellen mehr C ₄ -Körper als der Wildtyp herstellen kann, eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität von mindestens einem der Enzyme E E ₁₈ und, optional, eine verringerte Aktivität von mindestens einem der Enzyme E ₁₉ -E ₆₃ auf.

Bestimmte Ausführungsformen der Erfindung betreffen Zellen, in denen im Vergleich zum Wildtyp die Aktivität:

(i) der Enzyme E- _\ bis E ₄ und E ₁₂ gesteigert und der Enzyme E ₁₉ , E ₂₆ , E ₂₇ , E ₂₉ bis E ₃₂ und E ₄₆ verringert ist;

(ii) der Enzyme E ₃ , E ₅ , E ₆ und E ₁₂ gesteigert und der Enzyme E ₁₉ , E ₂₆ , E ₂₇ , E ₂₉ bis E ₃₂ und E ₄₅ verringert ist; oder

(iii) der Enzyme E ₂ , E ₃ , E ₇ , E ₈ , E ₉ , E ₁₀ und E ₁₂ gesteigert und der Enzyme E ₁₉ , E ₂₆ , E ₂₇ , E ₂₉ bis E ₃₂ und E ₄₆ verringert ist.

In solchen Ausführungsformen können die Enzyme E-ι bis E ₁₀ und E ₁₂ bis E ₁₈ durch die Gene scrA, scrB, scrK, scrY, cscB, cscA, cscK, susT1 , susT2, susX bzw. pyc, ppc, pckA, maeA, mmel , maeB und dmlA und die Enzyme E ₁₉ , E ₂₀ , E ₂ i , E ₂₂ , E ₂₃ , E ₂₄ , E ₂₅ , E ₂₇ , E ₂₈ , E ₂₉ , E ₃₀ , E ₃ i , E ₃₂ , E ₃₃ , E ₄₅ , E ₄ 6, E47, E ₄ 8, E49, E ₅ o, E ₅₅ , E ₅ 6, E57, E ₅ 8, E59, EQO, E _ß i und Εβ ₃ ptsG, ptsl, ptsH, crr, tdcE, pflA, pflB, poxB, ack, pta, tdcD, IdhA, adhE, mgsA, ygfG, pdc, porA, porB, porC, porD, xpkl , xpk2, thl, thIA, thIB, phaA, phaB, crt, bdhA, bdhB, ade, adh und IdhL kodiert werden.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Zelle gemäß der Erfindung.

In einem solchen Verfahren kann die Erhöhung der Aktivität von mindestens einem der vorstehend beschriebenen Enzyme E E ₁₈ und, optional, die Verringerung der Aktivität von mindestens einem der vorstehend beschriebenen Enzyme E ₁₉ -E ₆₃ , durch eines der eingangs beschriebenen Verfahren erfolgen. Bevorzugte Kombinationen von Enzymen mit gesteigerter bzw. verringerter Aktivität sind die oben erwähnten Kombinationen. In noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung mindestens eines C ₄ -Körpers und/oder mindestens einer über diesen C ₄ -Körper hergestellten

Folgeverbindung, wobei das Verfahren die Inkubation einer Zelle gemäß der Erfindung mit einem Nährmedium, das Saccharose enthält, unter Bedingungen, die die Herstellung mindestens eines C ₄ -Körpers und/oder mindestens einer über diesen C ₄ -Körper hergestellten Folgeverbindung aus Saccharose und C0 ₂ erlauben, umfasst.

In einer besonderen Ausführungsform dieses Verfahrens enthält das Medium Kohlendioxid.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des mindestens einen C ₄ -Körpers und/oder mindestens einer über diesen C ₄ -Körper hergestellten Folgeverbindung kann zusätzlich auch das Isolieren des mindestens einen C ₄ -Körpers und/oder mindestens einer über diesen C ₄ - Körper hergestellten Folgeverbindung aus dem Nährmedium einschließen.

Schließlich richtet sich die Erfindung in noch einem weiteren Aspekt auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Zellen zur Herstellung von mindestens einem C ₄ -Körper und/oder mindestens einer über diesen C ₄ -Körper hergestellten Folgeverbindung aus Saccharose und Kohlendioxid als Kohlenstoffquellen. In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. der erfindungsgemäßen Verwendung werden die C ₄ -Körper aus folgender Gruppe ausgewählt: Succinat, Malat, Fumarat, Oxalacetat, Aspartat, Asparagin, Threonin, Tetrahydrofuran, Pyrrolidon, Acetoin, 4,4-Bionell, Hydroxysuccinat, Epoxy-v-Butyrolacton, Butensäure, Butyrat, Butandiol, 1 ,2-Butandiol, 1 ,3-Butandiol, 1 ,4-Butandiol, 2,3-Butandiol, Buten, n-Buten, cis-2- Buten, trans-2-Buten, Isobuten, Butadien, 1 ,2-Butadien, 1 ,3-Butadien, 3-Hydroxybutyrolacton, 4-Hydroxybutyrolacton, 1 -Butanol, 2-Butanol, tert-Butanol, Isobutanol, 2-Hydroxybuttersäure, 3- Hydroxybuttersäure, 4-Hydroxybuttersäure, 2-Hydroxyisobuttersäure und 3- Hydroxyisobuttersäure.

In einer Ausführungsform werden die C ₄ -Körper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Malat, Oxalacetat und die über diese C ₄ -Körper hergestellten Folgeverbindungen ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus durch enzymatische oder chemische Synthese über Malat oder Oxalacetat hergestellte Folgeverbindungen. Die durch enzymatische Synthese über Malat oder Oxalacetat hergestellte Folgeverbindungen können beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus: Succinat, Aspartat, Asparagin, Threonin,

Tetrahydrofuran, Butyrat, Butandiol, 1 ,2-Butandiol, 1 ,3-Butandiol, 1 ,4-Butandiol, 2,3-Butandiol, 3- und 4-Hydroxybutyrolacton, 1 -, 2- und tert-Butanol, Isobutanol, 2-, 3- und 4- Hydroxybuttersäure, 2- und 3-Hydroxyisobuttersäure, Methionin und Lysin.

Die erfindungsgemäßen, gentechnisch veränderten Zellen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed-batch-Verfahren

(Zulaufverfahren) oder repeated-fed-batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von C ₄ -Körpern, beispielsweise C ₄ -Carbonsäuren wie Succinat, mit dem

Nährmedium in Kontakt gebracht und kultiviert werden. Ebenfalls praktikabel ist ein

semikontinuierliches Verfahren, wie es in der GB-A-1009370 beschrieben wird. Eine

Zusammenfassung der bekannten Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel

(„Bioprozesstechnik 1 . Einführung in die Bioverfahrenstechnik" (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991 )) oder im Lehrbuch von Storhas („Bioreaktoren und periphere Einrichtungen", Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) zu finden. Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen des jeweiligen Wirtszellstammes genügen.

Beschreibungen von Kulturmedien für verschiedene Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology

(Washington D. C, USA, 1981 ) enthalten. In den verwendeten Nährmedien dienen insbesondere Saccharose und/oder Kohlendioxid als Kohlenstoffquellen. Als Stickstoffquellen können organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone,

Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder

Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet werden.

Das Kulturmedium kann weiterhin Metallsalze enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum der Zellen notwendig sind.

Schließlich können dem Medium noch weitere Stoffe, wie z.B. Aminosäuren und/oder Vitamine zugesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes

hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid,

Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie

Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der

Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika hinzugefügt werden.

Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C.

Die Aufreinigung des/der C ₄ -Körper(s) oder Folgeprodukten aus der Nährlösung erfolgt vorzugsweise kontinuierlich, wobei es in diesem Zusammenhang weiterhin bevorzugt ist, auch die Herstellung des C ₄ -Körpers durch Fermentation kontinuierlich durchzuführen, so dass der gesamte Prozess von der Herstellung des C ₄ -Körpers bis zur dessen Aufreinigung aus der Fermentationsbrühe kontinuierlich durchgeführt werden kann. Zur kontinuierlichen Aufreinigung des C ₄ -Körpers aus der Fermentationsbrühe wird diese kontinuierlich über eine Vorrichtung zur Abtrennung der bei der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen, vorzugsweise über einen Filter mit einer Ausschlussgröße in einem Bereich von 20 bis 200 kDa geführt, in dem eine Fest/Flüssig-T rennung stattfindet. Denkbar ist auch der Einsatz einer Zentrifuge, einer geeigneten Sedimentationsvorrichtung oder eine Kombination dieser Vorrichtungen, wobei es besonders bevorzugt ist, zumindest einen Teil der Mikroorganismen zunächst durch

Sedimentation abzutrennen und anschließend die von den Mikroorganismen teilweise befreite Fermentationsbrühe einer Ultrafiltration oder Zentrifugationsvorrichtung zuzuführen.

Das hinsichtlich seines C ₄ -Körper-Anteils angereicherte Fermentationserzeugnis wird nach der Abtrennung der Mikroorganismen einer vorzugsweise mehrstufigen Trennanlage zugeführt. In dieser Trennanlage sind mehrere hintereinander geschaltete Trennstufen vorgesehen, aus denen jeweils Rückführleitungen ausmünden, die zum Fermentationstank zurückgeführt sind. Weiterhin führen aus den jeweiligen Trennstufen Ableitungen heraus. Die einzelnen

Trennstufen können nach dem Prinzip der Elektrodialyse, der Umkehrosmose, der Ultrafiltration oder der Nanofiltration arbeiten. In der Regel handelt es sich um Membran-Trenneinrichtungen in den einzelnen Trennstufen. Die Auswahl der einzelnen Trennstufen ergibt sich aus Art und Umfang der Gärungsnebenprodukte und Substratreste.

Neben der Abtrennung des C ₄ -Körpers mittels Elektrodialyse, Umkehrosmose, Ultrafiltration oder Nanofiltration, in deren Verlauf als Endprodukt eine wässrige C ₄ -Körper-Lösung erhalten wird, kann der C ₄ -Körper auch durch Extraktionsverfahren aus der von Mikroorganismen befreiten Fermentationslösung abgetrennt werden, wobei in diesem Fall letztendlich der reine C ₄ -Körper erhalten werden kann. Zur Abtrennung einer C ₄ -Carbonsäure durch Extraktion können der Fermentationslösung beispielsweise Ammoniumverbindungen oder Amine zugesetzt werden, um ein Ammoniumsalz der C ₄ -Carbonsäure zu bilden. Dieses

Ammoniumsalz kann dann aus der Fermentationslösung abgetrennt werden, in dem ein organisches Extraktionsmittel zugesetzt und die so erhaltene Mischung anschließend erhitzt wird, wodurch das Ammoniumsalz sich in der organischen Phase anreichert. Aus dieser Phase kann die C ₄ -Carbonsäure dann unter Erhalt der reinen C ₄ -Carbonsäure beispielsweise durch weitere Extraktionsschritte isoliert werden. Genauere Einzelheiten bezüglich dieses

Trennverfahrens sind der WO- A-02/090312 zu entnehmen, deren Offenbarungsgehalt hiermit als Referenz eingeführt wird und einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Anmeldung bildet.

Je nach Art und Weise der Abtrennung des C ₄ -Körpers aus der Fermentationslösung wird entweder eine wässrige C ₄ -Körper-Lösung, beinhaltend 2 bis 90 Gew.-%, vorzugsweise 7,5 bis 50 Gew.-% und besonders bevorzugt 10 bis 25 Gew.-% an C ₄ -Körper, oder aber reiner C ₄ - Körper erhalten.

Des Weiteren können die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte C ₄ - Carbonsäuren vor, während oder nach der Aufreinigung noch neutralisiert werden, wobei hierzu Basen wie etwa Kalziumhydroxid oder Natriumhydroxid eingesetzt werden können.

Weitere Ausführungsformen der Erfindung sind in den Ansprüchen und den Beispielen enthalten. Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der Erfindung, wobei die Erfindung nicht auf diese speziellen Ausführungsformen beschränkt ist.

Beispiel 1

Herstellung von E. co// ^' -Expressionsvektoren für die Gene ppc, pck, maeA und maeB aus E. coli sowie pyc aus C. glutamicum

Zur Herstellung von £ co//-Expressionsvektoren für die Gene ppc (SEQ ID NO: 1 ), pck (SEQ ID NO: 2), maeA (SEQ ID NO: 3) und maeB (SEQ ID NO: 4) aus £ coli sowie pyc aus C.

glutamicum (SEQ ID NO: 5) werden diese Gene aus chromosomaler DNA von £. coli MG1655 bzw. C. glutamicum ATCC 13032 per PCR amplifiziert und gleichzeitig über die verwendeten Oligonukleotide eine Schnittstelle stromaufwärts der jeweiligen Ribosomenbindungstelle und eine Schnittstelle stromabwärts des Stopcodons eingeführt. Die Präparation der

chromosomalen DNA von £ coli MG 1655 bzw. C. glutamicum ATCC 13032 erfolgt mittels DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden) gemäß den Angaben des Herstellers. Bei der Amplifikation der Gene ppc, pck, maeA und maeB aus £ coli sowie pyc aus C. glutamicum mit chromosomaler DNA von £ coli MG 1655 bzw. C. glutamicum ATCC 13032 als Matrize kommen folgende Oligonukleotide zum Einsatz: 5'-ATA GAG CTC AGG GCT ATC AAA CGA TAA GAT GGG GTG-3' (SEQ ID NO: 6)

5'-ATA CCT GCA GGT TAG CCG GTA TTA CGC ATA CCT GCC G-3' (SEQ ID NO: 7)

E. coli pck: pck-fw: 5'-ATA GGA TCC TTA CTA TTC AGG CAA TAC ATA TTG GCT AAG

GA-3' (SEQ ID NO: 8) pck-rv: 5'-ATA CCT GCA GGT CAT TAC AGT TTC GGA CCA GCC GCT AC-3'

(SEQ ID NO: 9)

5'-ATA GAG CTC GTG GAT ATT CAA AAA AGA GTG AGT GAC ATG GAA C-3' (SEQ ID NO: 10)

5'-ATA CCT GCA GGT TAG ATG GAG GTA CGG CGG TAG TCG-3' (SEQ ID NO: 1 1 )

5'-ATA GAG CTC TAC GTG AAA GGA ACA ACC AAA TGG ATG ACC-3' (SEQ ID NO: 12)

5'-ATA CCT GCA GGT TAC AGC GGT TGG GTT TGC GCT TC-3' (SEQ ID NO: 13) C. glutamicum pyc: pyc-fw: 5'-ATA GAG CTC TGA AAG GAA TAA TTA CTC TAG TGT CGA CTC-3'

(SEQ ID NO: 14) pyc-rv: 5'-ATA CCT GCA GGG GTT TAG GAA ACG ACG ACG ATC AAG-3'

(SEQ ID NO: 15)

Folgende Parameter werden für die PCR eingesetzt: 1 x: initiale Denaturierung, 98 °C, 0:30 min; 30 x: Denaturierung, 98 °C, 0:10 min, Annealing, 60 °C, 0:30 min; Elongation, 72 °C, 3 min; 1 x: terminale Elongation, 72 °C, 10 min. Für die Amplifikation wird der Phusion™ High-Fidelity Master Mix von New England Biolabs (Frankfurt) entsprechend den Empfehlungen des

Herstellers verwendet. Jeweils 10 μΙ der PCR-Reaktionen werden anschließend auf einem 0,8 %igen Agarosegel aufgetrennt. Die Durchführung der PCR, der Agarosegel-Elektrophorese, Ethidiumbromidfärbung der DNA und Bestimmung der PCR-Fragmentgrößen erfolgt in dem Fachmann bekannter Art und Weise. In allen Fällen können PCR-Fragmente der erwarteten Größe amplifiziert werden. Diese beträgt für ppc 2710 bp, für pck 1686 bp, für maeA 1745 bp, für maeB 3220 bp und für pyc 3466 bp. Die PCR-Produkte werden mit Sac\ und Sbfi {ppc, maeA, maeB und pyc) bzw. ßamHI und Sbfi {pck) entsprechend den Empfehlungen des Herstellers der Restriktiosendonukleasen (New England Biolabs; Bad Schwalbach) verdaut und in den mit Sac\ und Sbfi {ppc, maeA, maeB und pyc) bzw. ßamHI und Sbfi {pck) geschnittenen Vektor pEC-XC99E (SEQ ID NO: 16) ligiert. pEC-XC99E ist ein £ coli-C. g/yfam/ci/m-Shuttle-Vektor, der in beiden Organismen

Chloramphenicol-Resistenz vermittelt sowie einen ColE1 -Replikationsursprung (hohe

Kopiezahl: > 500 Kopien pro £ co//-Zelle) und einen synthetischen irc-Promotor ohne

Ribosomenbindungstelle trägt. Ligation sowie Transformation chemisch kompetenter £. coli DH5 -Zellen (Gibco-BRL, Karlsruhe) erfolgen in dem Fachmann bekannter Art und Weise.

Die korrekte Insertion der ppc-, pck-, maeA-, maeB- bzw. pyc-Fragmente wird durch eine Restriktion mit Sac\ und Sbfi {ppc, maeA, maeB und pyc) bzw. ßamHI und Sbfi {pck) überprüft. Die Authentizität der inserierten Fragmente wird durch DNA-Sequenzierung überprüft. Die fertiggestellten £ co//-Expressionsvektoren werden als pEC-XC99E-ppc (SEQ ID NO:17), pEC- XC99E-pck (SEQ ID NO:18), pEC-XC99E-maeA (SEQ ID NO:19), pEC-XC99E-maeB (SEQ ID NO:20) und pEC-XC99E-pyc (SEQ ID NO:21 ) bezeichnet. Beispiel 2

Herstellung von E. co// ^' -Expressionsvektoren für die Loci cscA-cscKB aus E. coli sowie scrK-scrYAB aus pUR400

Zur Herstellung von £ co//-Expressionsvektoren für die Loci cscA-cscKB aus £. coli DSM 1 1 16 (SEQ ID NO: 22) sowie scrK-scrYAB aus pUR400 (SEQ ID NO: 23) werden diese aus chromosomaler DNA von £ coli DSM 1 1 16 bzw. Gesamt-DNA von £ co// ^' -K12 (pUR400) per PCR amplifiziert und gleichzeitig über die verwendeten Oligonukleotide je eine

Restriktionsschnittstelle am 5'- bzw. 3'-Ende eingeführt. Die Präparation der chromosomalen DNA aus £ coli DSM 1 1 16 bzw. Gesamt-DNA aus £ co// ^' -K12 (pUR400) erfolgt mittels DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden) gemäß den Angaben des Herstellers Bei der Amplifikation der Loci cscA-cscKB aus chromosomaler DNA von £ coli DSM 1 1 16 bzw. von scrK-scrYAB aus Gesamt-DNA von £ co//-K12 (pUR400) als Matrize kommen folgende Oligonukleotide zum Einsatz:

£ coli cscA-cscKB: csc-fw: 5'-ATA CAT ATG TTA TTA ACC CAG TAG CCA GAG TGC TCC AT GT-

3' (SEQ ID NO: 24) csc-rv: 5'-ATA CTC GAG CTA CTA TAT TGC TGA AGG TAC AGG CGT TTC C-

3' (SEQ ID NO: 25)

£ coli scrK-scrYAB scr-fw: 5'-ATA CCA TGG TCC GCC AGT TCA TCC GGG AAC GG-3' (SEQ ID

NO: 26) scr-rv: 5'-ATA GCG GCC GCT TAT TCT ACC ATG CAA GTT CGC AGC-3'

(SEQ ID NO: 27) Folgende Parameter werden für die PCR eingesetzt: 1 x: initiale Denaturierung, 98 °C, 0:30 min; 30 x: Denaturierung, 98 °C, 0:10 min, Annealing, 60 °C, 0:30 min; Elongation, 72 °C, 5 min; 1 x: terminale Elongation, 72 °C, 10 min. Für die Amplifikation wird der Phusion™ High-Fidelity Master Mix von New England Biolabs (Frankfurt) entsprechend den Empfehlungen des

Herstellers verwendet. Jeweils 10 μΙ der PCR-Reaktionen werden anschließend auf einem 0,8 %igen Agarosegel aufgtrennt. Die Durchführung der PCR, der Agarosegel-Elektrophorese, Ethidiumbromidfärbung der DNA und Bestimmung der PCR-Fragmentgrößen erfolgen in dem Fachmann bekannter Art und Weise. In beiden Fällen können PCR-Fragmente der erwarteten Größe amplifiziert werden. Diese beträgt für cscA-cscKB 3907 bp und für scrK-scrYAB 5800 bp. Die PCR-Produkte werden mit Λ/col- und Not\ (scrK-scrYAB) bzw. Nde\ und Xho\ (cscA-cscKB) entsprechend den

Empfehlungen des Herstellers der Restriktiosendonukleasen (New England Biolabs; Bad Schwalbach) verdaut und in den Λ/col- und Not\ (scrK-scrYAB) bzw. Nde\ und Xho\ (cscA- cscKB) geschnittenen Vektor pCOLADuet-1 (SEQ ID NO: 28; Merck Biosciences; Nottigham, UK) ligiert. pCOLADuet-1 ist ein £. co//-Vektor mit niedriger Kopiezahl (20 - 40 Kopien pro Zelle), der Kanamycin-Resistenz vermittelt sowie einen ColA-Replikationsursprung trägt.

Ligation sowie Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5 -Zellen (Gibco-BRL,

Karlsruhe) erfolgen in dem Fachmann bekannter Art und Weise. Die korrekte Insertion der cscA-cscKB- und scr -scrY^ß-Fragmente wird durch eine Restriktion mit Λ/col- und Not\ (scrK-scrYAB) bzw. Nde\ und Xho\ (cscA-cscKB) überprüft. Die Authentizität der inserierten Fragmente wird durch DNA-Sequenzierung überprüft. Die fertiggestellten E. coli- Expressionsvektoren werden als pCOLA-csc (SEQ ID NO:29) bzw. pCOLA-scr (SEQ ID NO:30) bezeichnet.

Beispiel 3

Chromatographische Quantifizierung von Edukten und Produkten

Die chromatographische Quantifizierung von Saccharose erfolgt auf folgende Art und Weise: Die Quantifizierung von Saccharose wird mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatografie durchgeführt. Für die Trennung von Zuckern wird eine Anionenaustauscher-Säule mit

Aminophase, 5 μηι Partikelgröße und den Maßen 250 x 4,6 mm (Waters Spherisorb NH2; Waters, Eschborn) verwendet. Die mobile Phase besteht aus einem Gemisch aus Acetonitril (56% v/v), Aceton (26% v/v) und Wasser (16% v/v). Die Proben werden sterilfiltriert und unverdünnt vermessen. Das Injektionsvolumen beträgt 10 μΙ_, der Durchfluss der mobilen Phase 2 mL/min und die Säulentemperatur 30°C. Saccharose wird mittels Brechungsindex- Detektor (Agilent 1200 Series RID; Agilent Technologies, Böblingen) quantifiziert. Die

Referenzsubstanz (Sigma-Aldrich, Steinheim) wird in Wasser gelöst vermessen. Dabei liegt bis zu einer Konzentration von 100 g/L eine lineare Abhängigkeit zwischen der Peakfläche und der Substanzkonzentration vor. Die Bestimmungsgrenze liegt für Saccharose bei 1 g/L.

Die chromatographische Quantifizierung von Succinat, Acetat, Lactat, Formiat und Ethanol erfolgte auf folgende Art und Weise: Die Trennung der organischen Säuren und Ethanol wird mit Hilfe der Hochleistungsflüssigkeitschromatografie durchgeführt. Dabei findet die

lonenausschluss-Säule Aminex® HPX 87H mit den Maßen 300 mm x 7,8 mm (Bio Rad Laboratories, München) als stationäre Phase Verwendung. Als mobile Phase wird 10 mM

Schwefelsäure eingesetzt. Die Säulentemperatur beträgt 40°C, der Durchfluss 0,6 ml/min. Die Probe wird mit 0,5 M Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4 bis 5 angesäuert und mit einem Volumen von 20 μί in die Säule injiziert. Die Detektion erfolgt mittels Diodenarraydetektor (Agilent 1200 Series DAD, Agilent Technologies, Böblingen) bei einer Wellenlänge von 190 bis 400 nm sowie Brechungsindex-Detektor (Agilent 1200 Series RID, Agilent Technologies, Böblingen). Die Referenzsubstanzen werden in Konzentrationen von 0,1 g/L bis 20 g/L in Wasser gelöst vermessen. Die Bestimmungsgrenzen liegen für Lactat, Acetat, Succinat und Formiat bei 0,8 g/L, Ethanol kann bis zu einer Konzentration von 1 g/L bestimmt werden. Im Bereich von 0,8 g/L bis 20 g/L liegt eine lineare Abhängigkeit der Peakflächen von der

Substanzkonzentration vor.

Beispiel 4

Produktion von Succinat durch E. co// ^' -Stämme mit Expressionsvektoren für die Gene ppc, pck, maeA und maeB aus E. coli sowie pyc aus C. glutamicum in Kombination mit Expressionsvektoren für die Loci cscA-cscKB aus E. coli sowie scrK-scrYAB aus pUR400 Zur Erzeugung von £ co//-Stämmen mit Expressionsvektoren für die Gene ppc, pck, maeA und maeB aus £ coli sowie pyc aus C. glutamicum in Kombination mit Expressionsvektoren für die Loci cscA-cscKB aus £. co// sowie scrK-scrYAB aus pUR400 werden kompetente Zellen von £ co// MG1655 hergestellt. Dazu wird der Stamm in Luria-Bertani Bouillon nach Miller (Merck, Darmstadt) als 10 mL-Vorkultur angezogen. Eine 100 mL LB-Bouillon wird mit 2 mL der Vorkultur inokuliert und bei 37°C und 200 U/min im Inkubationsschüttler bis zu einer optischen Dichte (600 nm) von 0,5 kultiviert. Die elektrokompetenten Zellen werden durch Waschen mit einer sterilen 10% (w/v) Glycerinlösung wie folgt hergestellt: Die 100 mL Kultur wird durch 10minütige Zentrifugation bei 4°C und 5500 x g geerntet und durch Resuspendieren in 10% Glycerinlösung gewaschen. Nach einem weiteren Zentrifugations- und Waschschritt werden die pellettierten E.coli MG1655 Zellen in 0,5 mL 10% Glycerinlösung aufgenommen und in Aliquots von 50 L bei -80°C bis zur Elektroporation gelagert.

Diese werden dann sequentiell oder in Kombination mit den Plasmiden pEC-XC99E, pEC- XC99E-ppc, pEC-XC99E-pck, pEC-XC99E-maeA, pEC-XC99E-maeB, pEC-XC99E-pyc, pCOLADuet-1 , pCOLA-csc und pCOLA-scr transformiert und auf LB-Platten mit

Chloramphenicol (50 Mg/ml) und/oder Kanamycin (50 Mg/ml) ausplattiert. Transformanten werden durch Plasmidpräparation und analytische Restriktionsanalyse bezüglich Präsenz der authentischen Plasmide überprüft.

So wurden folgende £

• £ coli MG 1655 (pCOLADuet-1 , pEC-XC99E)

• £ coli MG 1655 (pCOLA-csc, pEC-XC99E)

• £ coli MG 1655 (pCOLA-csc, pEC-XC99E-ppc)

• £ coli MG 1655 (pCOLA-csc, pEC-XC99E-pck)

• £ coli MG 1655 (pCOLA-csc, pEC-XC99E-maeA)

• £ coli MG 1655 (pCOLA-csc, pEC-XC99E-maeB)

• £ coli MG 1655 (pCOLA-csc, pEC-XC99E-pyc)

• £ coli MG 1655 (pCOLA-scr, pEC-XC99E)

• £ coli MG 1655 (pCOLA-scr, pEC-XC99E-ppc)

• £ coli MG 1655 (pCOLA-scr, pEC-XC99E-pck)

• £ coli MG 1655 (pCOLA-scr, pEC-XC99E-maeA)

• £ coli MG 1655 (pCOLA-scr, pEC-XC99E-maeB) • E. coli MG1655 (pCOLA-scr, pEC-XC99E-pyc)

Diese Stämme werden im Anschluss verwendet, um ihre Fähigkeit zur Produktion von Succinat unter anaeroben Bedingungen zu analysieren. Dabei wird wie folgt vorgegangen: Die Stämme werden einem mehrstufigen Kultivierungsprozess unterzogen. Die Vorkultur zur Produktion von Biomasse wird aerob durchgeführt in einem modifizierten M9-Medium, das zusätzlich Hefeextrakt als Komplexbestandteil enthält. Das Medium, bestehend aus 38 mM Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Merck, Darmstadt), 22 mM Kaliumdihydrogenphosphat (Merck, Darmstadt), 8,6 mM Natriumchlorid (Merck, Darmstadt), 18,7 mM Ammoniumchlorid (Merck, Darmstadt), 1 % (w/v) Hefeextrakt (Merck, Darmstadt), 2% (w/v) Saccharose (Sigma- Aldrich, Steinheim), 0,1 mM Calciumchlorid-Dihydrat (Sigma-Aldrich, Steinheim), 1 mM

Magnesiumsulfat-Heptahydrat (Merck, Darmstadt), 200 mM MOPS (3-(N-Morpholino)- Propansulfonsäure, Sigma-Aldrich, Steinheim) und 1 % (v/v) MEM Vitaminlösung (Sigma- Aldrich, Steinheim), wird mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und zu 10 ml_ mit Chloramphenicol (50 g/mL) und/oder Kanamycin (50 g/mL) in einen 100 mL

Erlenmeyerkolben mit Schikane vorgelegt und mit einer Einzelkolonie des zu untersuchenden Stammes inokuliert. Die Kultivierung erfolgt bei 37°C und 250 U/min in einem

Inkubationsschüttler. Nach einer Kultivierungsdauer von 8 Stunden werden 200 mL

modifiziertes M9-Medium mit 0,2 mg/L Biotin und 0,5 mM IPTG in einem 1000 ml_- Erlenmeyerkolben mit Schikane mit der Vorkultur inokultiert, so dass eine optische Dichte (600 nm) von 0,2 erreicht wird. Nach einer Kultivierungsdauer von mindestens 12 Stunden bei 37°C und 250 U/min wird die Kulturbrühe durch 10minütige Zentrifugation bei 3300 g und 4°C geerntet. Die sedimentierten Bakterienzellen werden mit steriler 0,9% Natriumchloridlösung gewaschen und anschließend in Medium für die anaerobe Kultivierung aufgenommen. Die anaerobe Hauptkultur erfolgt in modifiziertem M9 Medium ohne Komplexbestandteile (38 mM Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat, 22 mM Kaliumdihydrogen-phosphat, 8,6 mM

Natriumchlorid, 18,7 mM Ammoniumchlorid, 2% (w/v) Saccharose, 0,1 mM Calciumchlorid- Dihydrat, 1 mM Magnesiumsulfat-Heptahydrat, 200 mM MOPS, 1 % (v/v) MEM Vitaminlösung, 0,1 % (w/v) Natriumhydrogencarbonat, pH 7,0 mit Natriumhydroxid) unter Zusatz von 0,2 mg/L Biotin, 50 g/L Magnesiumcarbonat und 0,5 mM IPTG, sowie 1 mg/L Resazurin als

Sauerstoffindikator. 50 mL Medium werden in 100 mL Laborglasflaschen (Schott, Mainz) vorgelegt und mit der Zellsuspension inokuliert, so dass eine optische Dichte (600 nm) von 20 erreicht wird. Die Flaschen werden mit einer Verschlusskappe mit Stopfen gasdicht verschlossen, die Kultivierung erfolgt bei 37°C und 250 U/min im Inkubationsschüttler für eine Dauer von 24 Stunden. Die Anaerobiose stellt sich innerhalb der ersten Stunde der Kultivierung ein und wird anhand der Entfärbung des Resazurin festgestellt. Während der Kultivierung werden Proben von 1 ml_ steril mit einer Kanüle durch den Stopfen entnommen, die nach Sterilfiltration mittels in Beispiel 3 beschriebener chromatografischer Methoden hinsichtlich ihres Saccharosegehaltes und des Gehaltes organischer Säuren analysiert werden.

Beispiel 5 Produktion von Succinat durch E. co// ^' -Stämme mit Deletionen in den Genen ack-pta, adhE, IdhA und ygfG, in welchen das Gen ptsG durch den scrK-scrYAB-Locus aus dem Plasmid pUR400 ersetzt wurde und welcher das Gen pyc, kodierend für eine

Pyruvatcarboxylase aus Corynebacterium glutamicum, überexprimiert.

Zunächst wurde ein £. co//-Stamm mit Deletionen in den Genen ack-pta (SEQ ID NO:31 ), adhE (SEQ ID NO:32), IdhA (SEQ ID NO:33) und ygfG (SEQ ID NO:34) und einem Austausch des pisG-Gens (SEQ ID NO:35) durch den scrK-scrYAB-Locus konstruiert. Es wurde der E. coli- Stamm MG1655 ack-pta adhE IdhA ygfG ptsG:: scrK-scrYAB mittels Methoden generiert, die dem Fachmann bekannt sind (z.B. siehe Datsenko KA, Wanner BL. Proc Natl Acad Sei U S A. 2000. 97(12):6640-5.). Die DNA-Sequenz der einzelnen Loci nach Deletion bzw. Insertion ist in SEQ ID NO:36 ( ack-pta), SEQ ID NO:37 ( adhE), SEQ ID NO:38 ( IdhA), SEQ ID NO:39 ( ygfG) und SEQ ID NO:40 {ptsGwscrK-scrYAB) wiedergegeben.

£. co// MG1655 ack-pta adhE IdhA ygfG ptsG:: scrK-scrYAB wurde im Anschluss analog zu Beispiel 4 mit den Plasmiden pEC-XC99E und pEC-XC99E-pyc transformiert. Die £. co// ^' -Stämme MG1655 ack-pta adhE IdhA ygfG ptsG:: scrK-scrYAB (pEC-XC99E) und ack-pta adhE IdhA ygfG ptsG:: scrK-scrYAB (pEC-XC99E-pyc) wurden daraufhin analog zu Beispiel 4 kultiviert und die Konzentration von Saccharose, Succinat und

Nebenprodukten analog zu Beispiel 3 quantifiziert. Die Ergebnisse sind in Tab. 1 und 2 dargestellt. Tab. 1 . Produktion von Succinat mit E. coli MG1655 ack-pta adhE IdhA ygfG ptsGv. scrK-scrYAB (pEC-XC99E). Angegeben sind die Konzentration von Succinat und

Nebenprodukten sowie die Produktausbeute (Yp _/ s) und die durchschnittliche Raum-Zeit- Ausbeute (RZA) in den ersten 24 Stunden. Ethanol, Lactat, Pyruvat und Formiat konnten nicht nachgewiesen werden.

Tab. 2. Produktion von Succinat mit £. coli MG1655 ack-pta adhE IdhA ygfG ptsGv. scrK-scrYAB (pEC-XC99E-pyc). Angegeben sind die Konzentration von Succinat und den Nebenprodukten Acetat, Ethanol, Lactat und Formiat sowie die Produktausbeute (Yp _/ s) und die durchschnittliche Raum-Zeit-Ausbeute (RZA) in den ersten 24 Stunden. Ethanol, Lactat, Pyruvat und Formiat konnten nicht nachgewiesen werden.

Der Offenbarungsgehalt aller hierin zitierter Dokumente ist in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen und bildet einen Teil der Offenbarung der vorliegenden

Anmeldung.

Die Erfindung wird hierin durch Bezugnahme auf bestimmte Ausführungsformen beschrieben, ist aber nicht auf diese beschränkt. Insbesondere ist für den Fachmann ohne Weiteres ersichtlich, dass verschiedene Änderungen an der beschriebenen Erfindung vorgenommen werden können, ohne vom Sinn und Umfang der Erfindung, wie er durch die angefügten Patentansprüche bestimmt wird, abzuweichen. Der Umfang der Erfindung wird somit durch die Patentansprüche bestimmt und es ist beabsichtigt, dass die Erfindung alle Modifikationen und Änderungen, die in den Deutungs- und Äquivalenzbereich der Ansprüche fallen, umfasst.