La présente invention concerne une microcapsule comprenant au moins une cellule primaire de type II étant formée d'un cœur liquide et d'une enveloppe gélifiée encapsulant le cœur liquide. Ladite microcapsule peut être utilisée comme outil de culture tridimensionnelle des cellules primaires de type II.

ÉTAT DE LA TECHNIQUE Parmi les différentes phases de criblage des médicaments en industrie pharmaceutique, les médicaments candidats doivent être testés sur des modèles in vitro de cellules dans des conditions se rapprochant au mieux des conditions physiologies humaines in vivo. Pour ce faire l'utilisation de cellules primaires remplirait ces critères.

En revanche, il existe des limitations concernant la manipulation de ces cellules primaires comme par exemple :

(1) la source limitée de ces cellules (biopsie, extrait cadavériques etc ..) ainsi que leur coût,

(2) l'absence de ou la très faible multiplication de ces cellules dans une culture in vitro,

(3) une activité métabolique de certaines de ces cellules très dépendante de l'établissement des interactions intercellulaires, impliquant leur mise en culture à confluence pour maintenir ces fonctions métaboliques.

Parmi les cellules primaires, 2 types peuvent être distingués : les cellules primaires de type I pouvant se multiplier et les cellules primaires de type II incapable de se multiplier dans des conditions in vitro.

Une demande de brevet WO2015/086832 sur une méthode in vitro de culture 3D de cellules primaires de type I telles que les cellules hématopoïétiques a déjà été décrite. La réalisation de culture 3D de cellules primaires de type II est plus compliquée du fait de leur incapacité à se multiplier.

Une demande de brevet FR 2 939 012 décrit un procédé de fabrication de capsules ne comprenant pas de cellules. La fabrication de capsules comprenant des cellules primaires de type II est plus compliquée du fait de leur fragilité lors de l'incorporation dans le cœur d'une capsule.

Une demande de brevet WO2015/158777 décrit une méthode in vitro de culture 3D de cellules primaires de type II telles que les hépatocytes. Cette méthode, appelée "hanging drop" (goutte pendante), consiste à suspendre des cellules dans des gouttes de ~40μί à un faible débit par puit d'une plaque 96 puits et laisser la plaque intacte pendant une semaine le temps pour que les hépatocytes forment un sphéroïde. Le premier inconvénient de ce système est sa manipulation ; non seulement pendant la première semaine de mise en culture mais aussi une fois que le sphéroïde est formé. Les gouttes peuvent tomber avec un léger tapotement et le changement de milieu est très délicat. De plus, le taux élevé d'évaporation et la perte d'humidité avec ce système nécessite l'ajout d'une réserve de liquide pour compenser la perte d'humidité. Cela ajoute encore une étape supplémentaire à la manipulation de la plaque et augmente donc les risques de stress et contamination des cellules. Un second inconvénient de cette méthode est la contrainte de cisaillement et le choc thermique appliqué aux hépatocytes pendant la manipulation des sphéroïdes. En conséquence, les sphéroïdes d'hépatocytes ont une durée de vie de 28 jours et nécessite l'utilisation d'un grand nombre de cellules (1000 hépatocytes/sphéroïde).

Pour répondre à ces différents inconvénients, les inventeurs ont donc mis au point une nouvelle méthode de culture des cellules primaires de type II en 3D par micro- encapsulation. Cette méthode de culture cellulaire est adaptée pour encapsuler des quantités minimales de cellules à un débit élevé de 1250 capsules par seconde. Ainsi, les cellules primaires de type II, telles que les hépatocytes, encapsulées démontrent (i) une durée de vie prolongée sur 45 jours, (ii) une bonne reproductibilité des résultats ainsi que (iii) une miniaturisation de l'échelle test (150 cellules/sphéroïde). Ces cellules primaires de type II encapsulées peuvent donc être utilisées pour des études précliniques pharmaceutiques pour déterminer par exemple la clairance d'un composé, le risque d'interactions inter médicamenteuses et la toxicité d'un composé.

RÉSUMÉ Un objet de l'invention est une microcapsule comprenant un cœur liquide et une enveloppe externe encapsulant le cœur liquide, ledit cœur liquide comprenant au moins une cellule primaire de type II et ladite enveloppe externe comprenant au moins un polyélectrolyte gélifié et au moins un agent tensioactif.

Dans un mode de réalisation, la cellule primaire de type II est une cellule hépatique, un cardiomyocyte, une cellule du pancréas, un neurone.

Dans un autre mode de réalisation, la microcapsule comprend un nombre inférieur à environ 900 cellules/microcapsule.

Dans un autre mode de réalisation, la microcapsule comprend environ 20 à 500 cellules/microcapsule. Dans un autre mode de réalisation, la masse moléculaire de l'agent tensioactif est d'environ 150 g/mol à 10000 g/mol.

Dans un autre mode de réalisation, le diamètre moyen de la microcapsule est d'environ 100 à 1000 μπι.

Un objet de l'invention est une utilisation de la microcapsule selon l'invention, comme outil de culture tridimensionnelle de cellules primaires de type II.

Dans un mode de réalisation, la microcapsule est utilisée pour tester l'effet d'un composé test.

Dans un autre mode de réalisation, la microcapsule est utilisée pour des tests de pharmacologiques. Dans un autre mode de réalisation, la microcapsule est utilisée pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Dans un autre mode de réalisation, la microcapsule est utilisée pour le remodelage d'un tissu. Dans un autre mode de réalisation, la microcapsule est utilisée pour la réparation de tissu malade ou défectueux.

Dans un autre mode de réalisation, la microcapsule est utilisée comme outil de diagnostic.

Dans un autre mode de réalisation, la microcapsule est utilisée pour détecter des particules sécrétées par les cellules primaires de type II. Un autre objet de l'invention est un dispositif d'obtention d'une microcapsule telle que décrite précédemment, comprenant un injecteur auquel sont connectés au moins deux tubes d'alimentation : un tube d'alimentation permettant d'alimenter l'injecteur en solution de cœur comprenant des cellules primaires de type II, ledit tube se divisant en un premier tube permettant d'alimenter l'injecteur en solution de cœur et au moins un second tube permettant d'alimenter l'injecteur en cellules primaires de type II suspendues dans une solution de cœur ; et un tube d'alimentation permettant d'alimenter l'injecteur en solution de l'enveloppe externe.

Dans un mode de réalisation, chaque tube d'alimentation comprend un moyen de contrôle de l'injection de liquide dans l'injecteur. Dans un mode de réalisation, le dispositif comprend en outre des moyens d'alimentation connectés aux tubes d'alimentation.

Dans un mode de réalisation, chaque moyen d'alimentation est connecté à un tube d'alimentation.

Dans un autre mode de réalisation, chaque moyen d'alimentation est connecté à deux tubes d'alimentation. Un autre objet de l'invention est un dispositif d'obtention d'une microcapsule telle que décrite précédemment, comprenant un injecteur auquel sont connectés au moins deux tubes d'alimentation de l'injecteur, le premier tube d'alimentation comprenant une solution de cœur et le au moins un second tube d'alimentation comprenant les cellules primaires de type II suspendues dans une solution de cœur, ledit second tube étant une dérivation du premier tube.

Dans un mode de réalisation, chaque tube d'alimentation comprend un moyen de contrôle de l'injection de liquide dans l'injecteur.

Dans un mode de réalisation, le dispositif comprend en outre des moyens d'alimentation connectés aux tubes d'alimentation.

Dans un mode de réalisation, chaque moyen d'alimentation est connecté à un tube d'alimentation.

Dans un autre mode de réalisation, chaque moyen d'alimentation est connecté à deux tubes d'alimentation.

DÉFINITIONS

Dans la présente invention, les termes ci-dessous sont définis de la manière suivante :

« environ », placé devant un nombre, signifie plus ou moins 10% de la valeur nominale de ce nombre.

DESCRIPTION DÉTAILLÉE

Un objet de l'invention est une microcapsule comprenant un cœur liquide et une enveloppe gélifiée encapsulant le cœur liquide, ledit cœur liquide comprenant au moins une cellule primaire de type II et ladite enveloppe gélifiée comprenant au moins un polyélectrolyte gélifié et au moins un agent tensioactif. On entend par « cellule primaire », des cellules obtenues directement à partir de fluides corporels ou de tissus corporels provenant d'un organisme multicellulaire tel que l'humain. Des cultures de cellules primaires sont des cellules primaires qui ont été cultivées jusqu'au premier passage. Les cellules primaires ont des caractéristiques naturelles de différenciation et sont mortelles et par conséquent soumises au processus de sénescence.

Les cellules primaires peuvent être classées en deux groupes : les cellules primaires de type I et les cellules primaires de type II. Les cellules primaires de type I correspondent aux cellules primaires qui peuvent se multiplier en culture, mais qui cessent de croître et meurent après un petit nombre de doublements de population. La mortalité de ces cellules limite sévèrement leur utilisation commerciale. Des exemples de cellules de type I comprennent les cellules endothéliales vasculaires, les kératinocytes, et les fïbroblastes.

Les cellules primaires de type II sont des cellules non-proliférantes, c'est-à-dire des cellules dont la capacité proliférative dans la culture cesse dès l'ensemencement : elles ne peuvent donc pas être amenées à se multiplier plus de 2 cycles après leur ensemencement. Les cellules primaires de type II avant ensemencement sont majoritairement en phase GO du cycle cellulaire. Des exemples de cellules de type II comprennent mais à titre non limitatif, les cellules hépatiques, les cardiomyocytes, les cellules pancréatiques, telles que par exemple, les cellules des îlots de Langerhans, les neurones. De préférence, la cellule primaire de type II est une cellule hépatique.

Les cellules primaires de type II utilisées dans l'invention sont des cellules de mammifères provenant de l'humain, rat, souris, singe, hamster, chien, cochon, cochon d'inde de préférence les primaires de type II sont humaines.

Dans un aspect de l'invention, la cellule primaire de type II est saine. Dans un autre aspect de l'invention, la cellule primaire de type II est malade.

Des exemples de cellules malades incluent sans limitation, des cellules vieillissantes, des cellules dégénérescentes, des cellules porteuses de déficiences génétiques (mutation, délétion, insertion), ou des cellules porteuses d'un chromosome supplémentaire. D'autres exemples de cellules malades incluent sans limitation, des cellules du foie malades provenant de sujets atteints de stéatose, hypercholestérolémie familiale, porphyrie hépatique, déficit en alpha 1-antitrypsine, syndrome de crigler-najjar, hypertension portale, porphyrie aiguë intermittente, déficience en acide delta- aminolévulinique déshydratase, hydroxyméthylbilane synthase, déficience en coproporphyrinogène oxydase, déficience en protoporphyrinogène oxydase, déficience en uroporphyrinogène décarboxylase, une coproporphyrie héréditaire, hépatite, nécrose hépatique, insuffisance hépatique aiguë et subaiguë, insuffisance hépatique chronique, fïbrose hépatique, sclérose hépatique, dégénérescence graisseuse du foie, congestion passive chronique du foie, nécrose hémorragique centrale du foie, infarctus hépatique, péliose hépatique, maladie veino-occlusive du foie, syndrome hépato-rénal.

D'autres exemples de cellules malades incluent sans limitation, des cardiomyocytes malades provenant de sujets atteints de cardiomyopathie dilatée, cardiomyopathie hypertrophique, cardiomyopathie ventriculaire droite arythmogène, cardiomyopathie restrictive, syndrome du QT long, arythmie, syndrome de Brugada, tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique, syndrome de repolarisation précose, dysplasie ventriculaire droite arythmogène.

D'autres exemples de cellules malades incluent sans limitation, des cellules pancréatiques malades provenant de sujets atteints de diabète, cancer du pancréas, pancréatite aigue, pancréatite chronique, hyperglycémie.

La présente invention concerne une microcapsule comprenant :

- un cœur liquide,

- une enveloppe externe encapsulant totalement le cœur liquide à sa périphérie, l'enveloppe externe étant propre à retenir le cœur liquide lorsque la microcapsule est plongée dans un gaz, et comprenant au moins un polyélectrolyte gélifié et au moins un agent tensioactif,

ladite capsule comprenant dans son cœur liquide au moins une cellule primaire de type II.

Dans un mode de réalisation, la microcapsule de l'invention est gélifiée. On entend par « microcapsule gélifiée » une microcapsule comprenant un cœur liquide et une enveloppe gélifiée. Avantageusement, une microcapsule gélifiée ne comprend pas d'enveloppe rigidifiée, mais peut comprendre une enveloppe intermédiaire liquide. Dans un mode de réalisation, une microcapsule gélifiée selon l'invention peut comprendre au moins une cellule primaire de type II dans le cœur liquide.

Dans un mode de réalisation, les microcapsules gélifiées comprennent des cellules uniquement dans le cœur liquide. Ces capsules sont typiquement obtenues par la production de gouttes multi-composantes par co-extrusion par convoyage séparé dans une double enveloppe par co-extrusion de deux compositions tels que décrits ci-dessous. Dans ce cas, la double enveloppe convoie deux flux dans deux tubes : un premier flux constitué de la composition interne dans un premier tube interne, un deuxième flux constitué de la composition externe dans un deuxième tube externe puis selon le procédé de l'invention, les gouttes obtenues subissent une étape de gélifîcation décrite ci-dessous.

Dans un mode de réalisation, la microcapsule de l'invention est gélifiée et rigidifiée. On entend par « microcapsule gélifiée et rigidifiée » une microcapsule comprenant un cœur liquide, une enveloppe gélifiée et une enveloppe rigidifiée. Avantageusement, l'enveloppe gélifiée encapsule totalement à sa périphérie l'enveloppe rigidifiée, qui encapsule elle-même totalement à sa périphérie le cœur liquide. Une microcapsule gélifiée et rigidifiée selon l'invention peut comprendre au moins une cellule eucaryote de mammifère dans le cœur liquide.

Selon un mode de réalisation, le cœur liquide est constitué d'une composition interne, généralement liquide ou légèrement visqueuse, qui peut être aqueuse. La composition interne peut également être une dispersion de gouttes d'eau dans une phase huileuse, ou bien une dispersion de gouttes d'huile dans une phase liquide, ou tout type d'émulsion multiple de type eau/huile/eau ou huile/eau/huile.

Le terme « huile » se réfère ici à un composé ayant la propriété de solubiliser des composés apolaires, tels que des corps gras, des huiles ou des lipides et hydrophobe (insoluble dans l'eau). Selon un mode de réalisation, l'huile est un corps gras, une huile ou un mélange d'huiles d'origine végétale, animale ou minérale.

Les huiles végétales comprennent sans s'y limiter, l'huile d'amande douce, l'huile de jojoba, l'huile de palme ou le phytosqualane. Les corps gras comprennent sans s'y limiter, les esters d'alcools gras et/ou d'acides gras, typiquement en C1-C20, tels que le myristate d'isopropyle, le myristate de glycérol, l'isononanoate d'isononyle, les triglycérides d'acide caprylique ou d'acide caprique, le palmitate d'isopropyle et le palmitate d'éthyle, les huiles de silicone ou polysiloxanes, tels que les polydiméthylsiloxanes (PDMS). Les huiles animales comprennent sans s'y limiter, le squalène. Les huiles minérales comprennent sans s'y limiter, le polyisobutylène hydrogéné, l'isododécane ou les huiles de paraffine.

Le cœur liquide peut éventuellement comprendre des particules solides en suspension, telles que des nanoparticules métalliques, des particules minérales ou des particules composites par exemple. Avantageusement, lorsqu'elles sont présentes, la taille desdites particules est comprise de 10 nm à 10 μιη. Le cœur liquide comprend généralement un ou plusieurs agents actifs, choisis parmi les agents cosmétiques, pharmaceutiques, comestibles, ou lubrifiants, qui peuvent être hydrophiles ou hydrophobes.

Dans un mode de réalisation, le cœur liquide comprend un principe actif choisi avantageusement parmi les anticoagulants, les anti-thrombogéniques, les agents antimitotiques, les agents anti-prolifération, anti-adhésion, anti-migration, les promoteurs d'adhésion cellulaire, les facteurs de croissance, les molécules antiparasitaires, les antiinflammatoires, les angiogéniques, les inhibiteurs de l'angiogenèse, les vitamines, les hormones, les protéines, les antifongiques, les molécules antimicrobiennes, les antiseptiques ou les antibiotiques. Dans un mode de réalisation, le cœur liquide peut comprendre également des excipients, tels que des épaississants, ou des modificateurs de rhéologie. Ces épaississants sont par exemple, des polymères, des cross-polymères, des microgels, des gommes ou des protéines, dont des polysaccharides, des celluloses, des polyosides, des polymères et co-polymères à base de silicone, des particules colloïdales (silice, argiles, latex...). Dans un autre mode de réalisation, le cœur liquide contient des agents réactifs tels que des protéines, des polysaccharides, des acides gras ou leur mélange synthétisés par les cellules eucaryotes ou destinés à former un bioréacteur ou à former des tissus en croissance ou matures notamment pour des implants. Dans un mode de réalisation, le cœur liquide est à un pH entre 7,2 et 7,4.

Dans un mode de réalisation, l'enveloppe externe est formée d'une composition aqueuse ou huileuse externe et comprend au moins un polyélectrolyte et au moins un tensio-actif.

L'enveloppe externe comprend de préférence une quantité réduite d'agent tensio-actif. Le pourcentage massique de tensio-actifs compris dans l'enveloppe externe est généralement inférieur ou égal à 0,5%, de préférence inférieur ou égal à 0,2%, 0,1 % ou 0,05%> et préférentiellement inférieur ou égal à 0,025%), 0,03%> ou 0,01%, par rapport à la masse de l'enveloppe externe.

Selon un mode de réalisation, le polyélectrolyte est de préférence un polymère biocompatible inoffensif pour le corps humain choisi parmi la liste comportant, mais sans y être limité, les polysaccharides, polyélectrolytes de synthèse à base d'acrylates (polyacrylate de sodium, de lithium, de potassium ou d'ammonium, ou polyacrylamide), de polyélectrolytes de synthèse à base de sulfonates (poly(styrène sulfonate) de sodium, par exemple). Plus particulièrement, le polyélectrolyte est choisi parmi un alginate d'alcalino-terreux, tel qu'un alginate de sodium ou un alginate de potassium, une gellane ou une pectine.

Dans le cas où le polyélectrolyte est un alginate de sodium (NaAlg), et où le réactif est le chlorure de calcium, la réaction qui se produit lors de la gélifïcation est la suivante : 2NaAlg + CaCk Ca(Alg) ₂ + 2NaCl. Les alginates sont produits à partir d'algues brunes appelées « laminaires », désignées par le terme anglais « sea weed ». De préférence, le polyélectrolyte est un alginate d'alcalin ayant avantageusement une teneur en bloc a-L- guluronate supérieure à 50%>, notamment supérieure à 55%, voire supérieure à 60%>.

Selon un mode de réalisation, le polyélectrolyte est un alginate de sodium. Selon un mode de réalisation, la teneur massique en polyélectrolyte dans la deuxième solution peut être inférieure à 5% en masse et est avantageusement comprise entre 0,5 et 3% en masse.

A l'état liquide, les chaînes individuelles de polyélectrolyte sont sensiblement libres de s'écouler les unes par rapport aux autres.

Selon un mode de réalisation, une solution aqueuse de 2% en masse de polyélectrolyte présente un comportement purement visqueux à un des taux de cisaillement caractéristiques du procédé de mise en forme.

Selon un mode de réalisation, à l'état liquide, une solution aqueuse de 2% en masse de polyélectrolyte présente un comportement purement visqueux aux taux de cisaillement faibles.

Selon un mode de réalisation, la viscosité de cette solution à cisaillement nul est entre 50 mPa.s et 10000 mPa.s, avantageusement entre 500 mPa.s et 5000 mPa.s.

Selon un autre mode de réalisation, les chaînes individuelles de polyélectrolyte dans l'état liquide présentent une masse molaire supérieure à environ 65000 g/mol.

Selon un mode de réalisation, l'agent tensioactif est un tensioactif anionique, un tensioactif non ionique, un tensioactif cationique ou un mélange de ceux-ci. La masse moléculaire de l'agent tensioactif est d'environ 150 g/mol à 10000 g/mol, avantageusement d'environ 250 g/mol à 1500 g/mol. Selon un mode de réalisation, le tensioactif est un tensioactif anionique, choisi parmi la liste comportant, mais sans y être limité, un alkylsulfate, un alkyle sulfonate, un alkylarylsulfonate, un alkylphosphate alcalin, un dialkylsulfosuccinate, un sel d'alcalino- terreux d'acides gras saturés ou non. Ces tensioactifs présentent avantageusement au moins une chaîne hydrocarbonée hydrophobe présentant un nombre de carbones supérieur à environ 5, voire environ 10 et au moins un groupement anionique hydrophile, tel qu'un sulfate, un sulfonate ou un carboxylate lié à une extrémité de la chaîne hydrophobe. Selon un mode de réalisation, le tensioactif est un tensioactif cationique, choisi parmi la liste comportant, mais sans y être limité, un sel d'halogénure d'alkylpyridium ou d'alkylammonium comme le chlorure ou le bromure de n-éthyldodecylammonium, le chlorure ou le bromure de cétylammonium (CTAB). Ces tensioactifs présentent avantageusement au moins une chaîne hydrocarbonée hydrophobe présentant un nombre de carbones supérieur à environ 5, voire environ 10 et au moins un groupement cationique hydrophile, tel qu'un cation d'ammonium quaternaire.

Selon un mode de réalisation, le tensioactif est un tensioactif non ionique, choisi parmi la liste comportant, mais sans y être limité, des dérivés polyoxyéthylénés et/ou polyoxypropylénés des alcools gras, des acides gras, ou des alkylphénols, des arylphénols, ou parmi des alkyls glucosides, des polysorbates, des cocamides. En particulier, l'agent tensioactif sera choisi dans la liste suivante: un alkylsulfate, un alkyle sulfonate, un alkylarylsulfonate, un alkylphosphate alcalin, un dialkylsulfosuccinate, un sel d'alcalino-terreux d'acides gras saturés ou non, un sel d'halogénure d'alkylpyridium ou d'alkylammonium comme le chlorure ou le bromure de n-éthyldodecylammonium, le chlorure ou le bromure de cétylamonium, des dérivés polyoxyéthylénés et/ou polyoxypropylénés des alcools gras, des acides gras ou des alkylphénols, ou parmi des arylphénols, des alkyls glucosides, des polysorbates, des cocamides ou leurs mélanges.

Selon un mode de réalisation, le pourcentage massique total en agent tensioactif dans la deuxième solution sera supérieur à environ 0,01% et est avantageusement d'environ 0,01 ) à 0,5%o en masse.

Dans un mode de réalisation, la microcapsule de l'invention comprend en outre une enveloppe intermédiaire.

Dans un mode de réalisation, l'enveloppe intermédiaire comprend un polyélectrolyte différent de celui de l'enveloppe externe.

Dans un mode de réalisation, l'enveloppe intermédiaire liquide peut être rigidifïée selon tout mode de rigidification envisageable, comme par exemple, par polymérisation, par précipitation, par agrégation colloïdale ou bien par transition vitreuse généralement provoquée par une variation de température. Dans un mode de réalisation, l'enveloppe intermédiaire est particulièrement avantageuse en ce qu'elle permet de compartimenter les capsules et d'offrir une surface propice à l'adhésion cellulaire ainsi qu'un compartiment supplémentaire propice à la survie cellulaire, indépendant du cœur de la capsule. Dans un autre mode de réalisation, le cœur liquide et/ou l'enveloppe intermédiaire et/ou l'enveloppe externe comprend en outre au moins un agent nutritif.

L'agent nutritif peut être un acide aminé essentiel (arginine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, méthionine, phénylalanine, thréonine, tryptophane, valine, glutamine, cystéine, tyrosine) ou un mélange d'acides aminés essentiels, des sels minéraux (notamment NaCl, KO, CaCk, MgCk, NaH ₂ P04 ou leur mélange), des sucres tels que le pyruvate de sodium et/ou des vitamines. L'agent nutritif peut être du sérum (tel que le sérum de veau fœtal), des facteurs de croissance cellulaire (EGF, FGF, PDGF), des facteurs de différentiation (exemple fibronectine), des inhibiteurs enzymatiques (inhibiteurs de la trypsine par exemple, tel que l'alpha- 1 antitrypsine) et/ou des antibiotiques (Pénicilline G, Streptomycine, Amphotéricine B).

Avantageusement, l'agent nutritif est introduit dans un tampon tel qu'un tampon phosphate (PBS phosphate -buffered saline) ou un milieu de culture cellulaire par exemple, du RPMI (Roswell Park Mémorial Institute médium), du MEM (Minimum Essential Médium Eagle), ou du DMEM (Dulbecco/Vogt modifïed Eagle's minimal essential médium).

Dans un mode de réalisation, le pH du cœur liquide et/ou de l'enveloppe intermédiaire et/ou de l'enveloppe externe est entre 7,2 et 7,4.

Dans un mode de réalisation, le cœur liquide et/ou l'enveloppe intermédiaire comprend ou ne comprend pas de chélatants ou de phosphates. Selon un mode de réalisation, les microcapsules ont un diamètre moyen d'environ 100 à 1000 μιη, préférentiellement d'environ 200 à 900 μιη, d'environ 300 à 850 μιη, d'environ 400 à 800 μαι, 450 à 700 μπι. Selon un mode de réalisation, l'enveloppe rigidifïée des microcapsules possède une épaisseur d'environ 1 μιη à 500 μιη, de préférence d'environ 10 μιη à 300 μιη, et avantageusement d'environ 20 μιη à 200 μιη.

Selon un mode de réalisation, l'enveloppe externe gélifiée des microcapsules possède une épaisseur d'environ 20 μιη à 200 μιη, et avantageusement d'environ 45 μιη à 150 μιη, plus préférentiellement, d'environ 50 μιη à 100 μιη.

Le rapport de l'épaisseur h de l'enveloppe de la microcapsule et du diamètre D de la microcapsule est calculé à partir de la conservation du volume et s'exprime en fonction du rapport qiJqout entre les débits interne et externe de la façon suivante :

Selon un mode de réalisation, le rapport qin/qout est compris entre environ 0.1 à 10, de préférence entre environ 0.5 à 5, plus préférentiellement entre environ 1 à 3.

Ainsi, par exemple, pour un diamètre de 1000 μιη, h est d'environ 150 à environ 230 μιη et pour un diamètre de 200 μιη, h est d'environ 6 à environ 30 μιη ou voir Tableau 1.

Tableau 1 Selon un mode de réalisation, la microcapsule comprend un nombre inférieur à environ 900 cellules/microcapsule, de préférence environ 20 à 500 cellules/microcapsule, plus préférentiellement environ 100 à 200 cellules/microcapsule.

Un autre objet de l'invention est un procédé de préparation de la microcapsule telle que décrite ci-dessus.

En particulier, la microcapsule selon l'invention est obtenue à partir d'un procédé comprenant les étapes suivantes de :

a) convoyage séparé dans une double enveloppe d'une première solution liquide contenant au moins une cellule primaire de type II et d'une deuxième solution liquide contenant un polyélectrolyte liquide propre à gélifier; ladite première solution liquide contenant au moins une cellule primaire de type II étant placée dans un système de dérivation annexe, de façon à calibrer préliminairement le système en absence de cellules, et à utiliser un très faible nombre de cellules primaires de type II,

b) formation, à la sortie de la double enveloppe, d'une série de gouttes, chaque goutte comprenant un noyau central formé de ladite première solution et une pellicule périphérique formée de ladite deuxième solution et recouvrant totalement le noyau central,

c) immersion de chaque goutte dans une solution gélifiante contenant un réactif propre à réagir avec le polyélectrolyte de la pellicule pour le faire passer d'un état liquide à un état gélifié et former l'enveloppe gélifiée, le noyau central formant le cœur liquide,

d) récupération des capsules formées,

la deuxième solution contenant au moins un agent tensioactif avant son contact avec la première solution.

Selon un mode de réalisation, le rapport du débit de la première solution au débit de la deuxième solution à la sortie de la double enveloppe est d'environ 0.1 à 10, préférentiellement est d'environ 0.5 à 5, plus préférentiellement d'environ 1 à 3. L'enveloppe gélifiée présentant une épaisseur comprise est d'environ 3% à 55%, avantageusement est d'environ 6% à 30% du diamètre de la capsule, après récupération des capsules formées.

Selon un mode de réalisation, la première solution liquide physiologiquement acceptable comprend une solution saline, une solution tampon, un viscosifïant physiologiquement acceptable, un excipient physiologiquement acceptable, avantageusement un épaississant ou un modificateur de rhéologie, et/ou du milieu de culture.

Selon un mode de réalisation, la production des gouttes selon le procédé selon l'invention mentionné précédemment est effectuée par convoyage séparé dans une double enveloppe d'une première solution liquide contenant la ou les cellules et d'une deuxième solution liquide contenant un polyélectrolyte liquide propre à gélifier et au moins un agent tensioactif.

On entend par « goutte » une goutte liquide constituée d'au moins un cœur central liquide et d'une enveloppe externe liquide encapsulant totalement à sa périphérie le cœur central liquide. Préférentiellement, la « goutte » est une goutte liquide constituée d'un cœur central liquide, d'une enveloppe intermédiaire liquide, encapsulant totalement à sa périphérie le cœur liquide, et d'une enveloppe externe liquide encapsulant totalement à sa périphérie l'enveloppe intermédiaire liquide. Dans cette seconde variante, l'enveloppe intermédiaire est au contact du cœur et de l'enveloppe externe et maintient le cœur hors de contact de l'enveloppe externe. Selon une autre variante, la « goutte » peut comprendre plus de deux enveloppes.

Préférentiellement, la composition intermédiaire, à l'interface entre la composition externe et la composition interne, a une viscosité inférieure à celle de la composition externe et supérieure à celle de la composition interne. L'homme du métier sait aisément en fonction de la composition de chacune des couches équilibrer leur viscosité afin d'obtenir de telles variations. La viscosité peut être mesurée selon l'invention, à l'aide d'un viscosimètre de Brookfïeld RVT à 20°C en suivant les indications du constructeur. Etape de formation d'une goutte liquide.

Selon un mode de réalisation, les gouttes formées par co-extrusion dans la double enveloppe tombent par inertie à travers un volume d'air dans la solution gélifiante. La production de ce type de goutte est généralement effectuée par co-extrusion de différentes compositions, à savoir la composition interne, le cas échéant, la composition de l'enveloppe intermédiaire, et la composition de l'enveloppe externe.

Préférentiellement, la composition du cœur et/ou la composition de l'enveloppe intermédiaire sont aqueuses ou le cas échant huileuses.

La production de gouttes par co-extrusion peut se faire par exemple, par convoyage séparé dans une double ou une triple enveloppe. Le procédé sera expliqué ci-après pour une goutte par co-extrusion de trois compositions, néanmoins, le principe reste applicable pour deux compositions ou plus. Dans le cas d'une triple enveloppe de trois flux : un premier flux constitué de la composition du cœur, un deuxième flux constitué de la composition de l'enveloppe intermédiaire et un troisième flux constitué de la composition de l'enveloppe externe, tel que décrit dans la demande FR 2 986 165.

Au cours du procédé selon l'invention, lorsque la capsule comprend une enveloppe intermédiaire, le procédé comprend en outre, une étape de dépolymérisation de l'enveloppe externe gélifiée.

L'étape de dépolymérisation a pour but de supprimer l'enveloppe externe gélifiée, sans altérer la structure de l'enveloppe intermédiaire rigidifiée.

Cette étape peut être effectuée par toute méthode de dépolymérisation de l'hydrogel formé lors de l'étape de gélifîcation. Dans le cas d'une enveloppe externe gélifiée d'alginate, la dépolymérisation peut être effectuée par immersion dans une solution de dépolymérisation, comme par exemple, une solution de citrate de sodium concentrée à une teneur massique de 5% minimum, typiquement de 10%, ou bien une solution tampon phosphate salin (encore appelé tampon PBS). On peut encore citer des solutions d'ions tartrates, d'acide phytique ou d'EDTA, toute solution d'espèces dites chélatantes pour les cations divalents, ou encore des solutions de polymères d'acide acrylique type carbomer, carbopol, polyacrylamide ou polyacrylate. De manière générale, l'enveloppe intermédiaire rigidifîée n'est pas altérée par l'étape de dépolymérisation de l'enveloppe externe gélifiée.

Un autre objet de l'invention est un dispositif pour mettre en œuvre le procédé d'encapsulation de l'invention. Selon un mode de réalisation illustré en Figure 4, le dispositif selon l'invention comprend un injecteur (1) auquel sont connectés au moins deux tubes d'alimentation (2, 3) :

- un tube d'alimentation (2) permettant d'alimenter l'injecteur (1) en solution de cœur comprenant des cellules primaires de type II, ledit tube se divisant en un premier tube (22) permettant d'alimenter l'injecteur (1) en solution de cœur et au moins un second tube (23) permettant d'alimenter l'injecteur (1) en cellules primaires de type II suspendues dans une solution de cœur, et

- un tube d'alimentation (3) permettant d'alimenter l'injecteur (1) en solution de l'enveloppe externe.

Un tel dispositif permet une calibration préliminaire du système en l'absence de cellules et une utilisation d'un très faible nombre de cellules primaires de type II. En effet, la dérivation annexe permet d'injecter une concentration importante de cellules dans un volume restreint en utilisant un système de valve ON/OFF réglable. Cela nous permet de d'abord réaliser les ajustements et la calibration du système avec la solution de cœur (la dérivation annexe est OFF). Une fois le système prêt pour l'injection, la voie principale sera OFF et les cellules présentes dans le tube annexe seront injectées.

Selon un mode de réalisation, chaque tube d'alimentation (2, 3) comprend un moyen de contrôle de l'injection de liquide dans l'injecteur (21).

Selon un mode de réalisation, le moyen de contrôle de l'injection de liquide dans l'injecteur (21) est une vanne. Selon un mode de réalisation, le dispositif selon l'invention comprend des moyens d'alimentation (4) connectés aux tubes d'alimentation (2, 3).

Selon un mode de réalisation, chaque moyen d'alimentation (4) est connecté à un tube d'alimentation (2, 3). Selon un mode de réalisation, chaque moyen d'alimentation (4) est connecté à deux tubes d'alimentation (2, 3).

Selon un mode de réalisation, les moyens d'alimentation (4) connectés aux tubes d'alimentation (2, 3) sont des pousse-seringues connectées chacune à une seringue ou des pompes connectées chacune à une seringue.

Selon un mode de réalisation, comme illustré en Figure 5, le dispositif selon l'invention comprend un injecteur (1) auquel sont connectés au moins deux tubes d'alimentation (24, 25) : un premier tube d'alimentation (24) permettant d'alimenter l'injecteur (1) avec une solution de cœur et au moins un second tube (25) permettant d'alimenter l'injecteur (1) en cellules primaires de type II suspendues à une forte concentration (entre environ 2 à 20 millions de cellules/ml) dans un volume minimal de solution de cœur (entre environ 100 μΙ_, à 1 ml), ledit au moins un second tube d'alimentation (25) étant une dérivation du premier tube (24).

Selon un mode de réalisation, chaque tube d'alimentation (2, 3) comprend un moyen de contrôle de l'injection de liquide dans l'injecteur (21).

Selon un mode de réalisation, le moyen de contrôle de l'injection de liquide dans l'injecteur (21) est une vanne.

Selon un mode de réalisation, le dispositif selon l'invention comprend des moyens d'alimentation (4) connectés aux tubes d'alimentation (2, 3).

Selon un mode de réalisation, chaque moyen d'alimentation (4) est connecté à un tube d'alimentation (2, 3).

Selon un mode de réalisation, comme illustré en figure 6, chaque moyen d'alimentation (4) est connecté à deux tubes d'alimentation (24, 25, 3).

Selon un mode de réalisation, les moyens d'alimentation (4) connectés aux tubes d'alimentation (2, 3) sont des pousse-seringues connectées chacune à une seringue ou des pompes connectées chacune à une seringue. Un autre objet de l'invention est un procédé de préparation de microcapsules basé sur la co-extrusion concentrique de compositions via un dispositif à triple enveloppe pour former des gouttes multi-composante.

Dans un mode de réalisation, ledit dispositif est mis en œuvre comme dans l'exemple 3. Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'au moins une microcapsule de l'invention comme outil de culture tridimensionnelle de cellules primaires de type II.

Afin de mettre en place un modèle de culture tridimensionnelle, les microcapsules utilisées peuvent être des capsules gélifiées, des capsules gélifiées rigidifîées ou des capsules rigidifîées. Préférentiellement, ces capsules peuvent contenir des cellules primaires de type II dans le cœur liquide.

Préférablement, l'enveloppe externe comprend un alginate, l'enveloppe rigide comprend du collagène ou un mélange de collagène, de gélatine, de laminine, d'entractine et d'héparane sulfate. Un polyol tel que le sorbitol peut être ajouté dans la composition de l'enveloppe intermédiaire. A titre illustratif, afin d'obtenir des modèles de foie, plusieurs variantes peuvent être mises en œuvre notamment, à partir d'une microcapsule comprenant une enveloppe intermédiaire, une enveloppe externe et un cœur liquide.

Les microcapsules rigides dans lesquelles l'enveloppe gélifiée a été dépolymérisée sont d'intérêt pour l'établissement de modèles de lame basale afin d'étudier par exemple les interactions entre un type cellulaire avec la lame basale. Dans ce cas, l'enveloppe rigide peut comprendre du collagène ou un mélange de collagène, de gélatine, de laminine, d'entractine et d'héparane sulfate. Préférablement, un polyol tel que le sorbitol est ajouté dans la composition de l'enveloppe. Selon cette variante, les cellules étudiées sont comprises dans le cœur liquide. Ce modèle permet notamment l'étude de la migration cellulaire notamment le cas de métastases.

Selon un mode de réalisation, la microcapsule favorise Γ auto-assemblage des cellules primaires de type II pour qu'elle forme un agrégat ou un sphéroïde. Selon un mode de réalisation, 1 microcapsule est utilisée par puit de plaque 96 puits ou 384 puits.

Selon un mode de réalisation, la sécrétion de molécules, l'expression protéique ou nucléique d'une molécule peut être directement déterminée à l'intérieur de la microcapsule sur les cellules primaires de type II par immuno-marquage ou par des colorants visualisés en confocal.

Selon un autre mode de réalisation, la microcapsule est dissoute et la cellule primaire de type II extraite pour déterminer la sécrétion de molécules, l'expression protéique ou nucléique selon des méthodes connues de l'état de l'art.

Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'au moins une microcapsule de l'invention en tant que modèle de maladies in vitro, les cellules primaires de type II encapsulées étant des cellules malades.

Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'au moins une microcapsule de l'invention pour tester l'effet d'un ou plusieurs composés tests.

Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'au moins une microcapsule de l'invention pour tester la toxicité d'un ou plusieurs composés tests.

Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'au moins une microcapsule de l'invention pour des tests pharmaco logiques.

Dans un mode de réalisation, les tests pharmacologiques comprennent des tests de pharmacocinétiques, pharmacodynamiques, efficacité, biocompatibilité, clairance, et/ou toxicité.

Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'au moins une microcapsule de l'invention pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'au moins une microcapsule de l'invention pour la fabrication d'un organe bio-artificiel. Dans un mode de réalisation, l'organe bio-artificiel est un foie bio-artificiel, un cœur bio- artificiel, ou un pancréas bio-artificiel.

Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'au moins une microcapsule de l'invention pour le remodelage d'un tissu.

Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'au moins une microcapsule de l'invention pour la réparation de tissu malade ou défectueux.

Le terme de « tissu » se réfère ici à un extrait de foie, cœur, pancréas, cerveau.

Les termes de « tissu malade ou défectueux » se réfèrent à des tissus atteints de maladies métaboliques, dégénérescentes, infectieuses, inflammatoires, angiogéniques, thrombogéniques, vasculaires, musculaires, myocardiques.

Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'au moins une microcapsule de l'invention pour une transplantation ou dans le cadre d'une thérapie cellulaire.

Dans un mode de réalisation, la transplantation est une transplantation des cellules du foie, une transplantation des cellules cardiaques, ou une transplantation des cellules pancréatiques.

Dans un mode de réalisation, la thérapie cellulaire utilise des cellules du foie encapsulées ou des cellules du cœur encapsulées ou encore des cellules pancréatiques encapsulées.

Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'au moins une microcapsule de l'invention comme un outil de diagnostic de maladie du foie, du cœur, du pancréas ou du cerveau.

Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'au moins une microcapsule de l'invention comme un outil de détection de particules sécrétées par les cellules primaires de type II.

Dans un mode de réalisation de l'invention, l'utilisation est pour détecter les particules sécrétées par les cellules primaires de type II, lesdites particules sécrétées restant confinées dans les microcapsules. On entend par exemple par « particules sécrétées » dans la présente invention, un anticorps, un microsome, un exosome ou des vésicules. En effet, les particules dont la taille est inférieure aux pores d'alginate sortent de la microcapsule mais celles dont la taille est supérieure vont rester à l'intérieur des microcapsules. Par exemple, les particules sécrétées par des cellules issues de tissu malade pourront être détectées à l'intérieur des microcapsules.

Un autre objet de l'invention est un procédé de production de culture 3D de cellules primaires de type II comprenant :

a. mise en culture d'au moins une microcapsule selon l'invention pour obtenir des agrégats ou sphéroïdes à l'intérieur des microcapsules, et

b. récolte d'au moins une microcapsule.

Les microcapsules selon l'invention, permettent une mise en culture in vitro ou in capsula de cellules primaires de type II.

Les microcapsules selon l'invention, peuvent être mises en culture dans des « conditions suffisantes pour Γ auto-assemblage cellulaire » qui sont connues de l'homme du métier tel que notamment en présence d'un tampon ou d'un milieu de base de culture additionné d'au moins un agent nutritif. Les « conditions suffisantes pour Γ auto-assemblage cellulaire » notamment les conditions et temps d'incubation pourront être adaptés selon le type cellulaire par l'homme du métier, les microcapsules pourront être cultivées notamment à 37°C dans 5% de CO2.

La récolte des microcapsules peut se faire par simple élimination du milieu de culture par filtration, par une simple sédimentation ou par toute autre technique de récupération des capsules.

Dans un mode de réalisation, la microcapsule selon l'invention peut comprendre en outre un agent de stockage.

Dans l'industrie pharmaceutique, les capsules telles que décrites ci-dessus peuvent notamment contenir des produits biologiquement actifs. Elles sont utilisées notamment pour protéger leur contenu et contrôler le relargage du ou des produit(s) qu'elles contiennent. Les microcapsules selon l'invention sont particulièrement adaptées pour le stockage ou la conservation d'échantillons biologiques notamment de cellules primaires de type II sous la forme de cellules isolées ou de tissus, pour l'obtention de modèles de culture tridimensionnelle, pour la production ou le criblage à haut débit de composés.

La présente invention concerne donc un procédé de stockage ou de conservation de cellules primaires de type II sous la forme de cellules isolées ou de tissus comprenant une étape de préparation d'une capsule par le procédé selon l'invention et une étape de stockage desdites microcapsules obtenues.

Le procédé de préparation de microcapsules selon l'invention permet d'obtenir au moins une enveloppe extérieure d'un seul tenant garantissant l'herméticité de cette dernière et ainsi la bonne conservation du cœur liquide. Le cœur liquide peut éventuellement comprendre un agent de stockage, tel qu'un tampon (tampon HEPES) ou un agent de cryoprotection à savoir, l'acétamide de méthyle, le méthanol, l'éthylène glycol, la polyvinylpyrrolidone, le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou le glycérol. Les conditions de stockages sont connues de l'homme du métier. Ainsi, des microcapsules contenant des cellules primaires de type II ainsi qu'un agent de stockage pourront être conservées dans de l'azote liquide pendant des durées assez longues.

Un autre objet de l'invention est un procédé de criblage de composés bio logiquement actifs comprenant :

a. mise en culture d'au moins une microcapsule de l'invention,

b. mise en contact de la culture avec au moins un composé test,

c. détermination et quantification d'au moins un paramètre biologique des cellules primaires de type II induit ou modifié par le composé test.

On entend par « composé biologiquement actif » une molécule qui possède un effet thérapeutique, il s'agit donc d'un actif thérapeutique. Le composé biologiquement actif peut être libre ou véhiculé (dans un solvant ou en mélange avec un excipant), encapsulé (par exemple, dans des liposomes), ou vectorisé (par exemple, dans des nanoparticules avec des ligands de ciblage en surface). Par exemple, il peut s'agir de toute molécule ayant des propriétés thérapeutiques entrant dans la composition d'un médicament. On pourra citer par exemple, les agents anti-apoptotiques, les agents anti-oxydants, les agents antimitotiques, les agents anti-prolifération, les agents anti-adhésion, les agents anti- inflammatoires, les analgésiques ou les antibiotiques. Cette liste n'est pas exhaustive et s'étend à tout composé biologiquement actif thérapeutique connu de l'homme du métier.

Le « composé test » selon l'invention, est une molécule d'origine naturelle ou synthétique dont on veut tester les effets thérapeutiques. Cette molécule peut être une molécule chimique de petite taille ou de grande taille tels qu'un polymère, une molécule biologique tels qu'un peptide, une protéine, un saccharide ou un polysaccharide, un acide nucléique ou un acide gras.

Ledit composé test peut être ajouté au tampon ou au milieu de culture dans lequel les microcapsules sont incubées. On entend par « paramètre biologique » toute modification d'un caractère biologique de la cellule, une telle modification pouvant se traduire par exemple, par une augmentation ou une diminution de la prolifération cellulaire, de la mort cellulaire, de l'expression de marqueurs cellulaires, de la sécrétion de cytokines, hormones, radicaux libres ou autres facteurs de croissance, de l'adhésion intercellulaire ou du décollement des cellules des parois de la microcapsule.

Le paramètre biologique peut être détecté par observation directe notamment par un marquage fluorescent spécifique, immunofluorescence, tests ELISA, cytométrie en flux, immunomarquage, tests d'activité, techniques d'imagerie, ou par toute autre technique génomique ou protéomique connue de l'homme du métier. La méthode de criblage selon l'invention est avantageuse en ce qu'elle permet un criblage à haut débit dans des environnements 3D physiologiquement pertinents, elle permet également une détection, une sélection et une récupération des cellules analysées pouvant se faire par des moyens automatisés. Inversement, par l'encapsulation d'une cellule individuelle puis une mise en culture, la méthode selon l'invention permet une exposition simultanée d'un très grand nombre de colonies cellulaires à des conditions expérimentales strictement identiques.

Dans un mode de réalisation, l'effet d'un composé test sur les cellules primaires de type II consiste à déterminer la toxicité et/ou l'efficacité sur une cible dudit composé. La détermination de la toxicité d'un composé test comprend des techniques bien connues de l'homme du métier et incluent par exemple, la détermination de l'état apoptotique des cellules, la réalisation du test de Tunel, la détermination de la sécrétion de radicaux libres, la détermination de l'expression de marqueurs de toxicité bien connus de l'homme du métier.

La détermination de l'efficacité d'un composé test comprend des techniques bien connues de l'homme du métier et incluent les mêmes tests que pour la détection d'un paramètre biologique.

BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES

Figure 1 représente deux histogrammes et des photos de culture tridimensionnelle montrant le nombre d'hépatocytes/capsule et la taille d'agrégat.

Figure 2 représente des images de la formation de sphéroïdes d'hépatocytes au cours du temps. Figure 3 représente deux histogrammes comparant le taux de sécrétion d'urée des hépatocytes dans un modèle d'encapsulation selon l'invention et un modèle in vitro 2D à partir de 2 lots différents.

Figure 4 représente un dispositif pour la mise en œuvre du procédé d'encapsulation selon l'invention. Figure 5 représente un dispositif pour la mise en œuvre du procédé d'encapsulation selon l'invention.

Figure 6 représente un dispositif pour la mise en œuvre du procédé d'encapsulation selon l'invention.

Figure 7 représente deux graphes comparant le taux de sécrétion d'albumine des hépatocytes dans un modèle d'encapsulation selon l'invention et un modèle in vitro 2D à partir de 2 lots différents. Figure 8 illustre la mise en évidence de la présence des canalicules biliaires dans des hépatocytes dans un modèle d'encapsulation selon l'invention.

EXEMPLES

La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants qui illustrent non-limitativement l'invention.

Exemple 1 : Encapsulation des hépatocytes primaires humaines dans des microcapsules d'alginate

Pour Γ encapsulation des cellules, une solution de 1.9% d'alginate a été préparée. 100 à 150 cellules primaires de type II par capsule sont préparées selon le procédé dans la présente invention. Le taux de production de capsule est d'environ 1250 par seconde.

La mise au point du nombre de cellules à ajouter par microcapsule est montrée Figure 1.

Par conséquent, un cryotube d'hépatocytes à 8 x 10 ⁶ cellules donne 30,000 microcapsules dénommées "HepatoPearls".

La Figure 2 montre l'évolution des hépatocytes encapsulés provenant de 2 lots différents sur 30 jours. La détermination de la viabilité est effectuée avec de la calcéine AM pour les cellules vivantes, du propidium iodide (PI) pour les cellules mortes et du NucBlue pour les noyaux.

Les résultats montrent que les hépatocytes encapsulés forment un sphéroïde par autoassemblage de plus de 7 jours. Au bout de 30 jours, les cellules sont encore en vie. L'encapsulation de cellules est reproductible d'un lot à l'autre.

Exemple 2 : Mesure de production et sécrétion d'urée des hépatocytes

Les hépatocytes sont cultivés dans des plaques 96 puits soit sur une couche de collagène I en 2D (40,000 cellules par puit) soit en forme d'HepatoPearl (encapsulées selon l'invention) à raison de 100 à 200 capsules par puits. Une comparaison de la sécrétion d'urée des hépatocytes a été effectuée dans les 2 modèles et avec 2 lots différents (Figure 3). Premièrement la sécrétion d'urée est plus importante dans les cultures d'HepatoPearl par rapport aux cultures 2D. Deuxièmement, la sécrétion d'urée est encore élevée au bout de 28-32 jours dans les cultures d'HepatoPearl tandis qu'elle est quasiment nulle dans les cultures 2D. Matériel et Méthodes

Milieux et solutions :

- Milieu CHRM (Life technologies) un tube de 50 ml,

- Milieu d'ensemencement : DMEM, S VF décomplémenté, Gentamycin, Insuline, Dexamethasone,

- Solution alginate LF200FTS,

- Solution cœur : Cellulose 0.5%,

- Plaques 96 puits pré-coatés avec collagène I.

Matériel :

- Kit QuantiChrom Urea assay (DIUR-500). Exemple 3 : Mesure de production et sécrétion d'albumine des hépatocytes

Les hépatocytes sont cultivés dans des plaques 96 puits soit sur une couche de collagène I en 2D (40,000 cellules par puit) soit en forme d'HepatoPearl (encapsulées selon l'invention) à raison de 100 à 200 capsules par puits. Une comparaison de la sécrétion d'albumine des hépatocytes a été effectuée dans les 2 modèles et avec 2 lots différents (Figure 7). Premièrement la sécrétion d'albumine est plus importante dans les cultures d'HepatoPearl par rapport aux cultures 2D. Deuxièmement, la sécrétion d'albumine est encore élevée au bout de 28-32 jours dans les cultures d'HepatoPearl tandis qu'elle est quasiment nulle dans les cultures 2D.

Matériel et Méthodes Milieux et solutions :

- Milieu CHRM (Life technologies) un tube de 50ml,

- Milieu d'ensemencement : DMEM, S VF décomplémenté, Gentamycin, Insuline, Dexamethasone, - Solution alginate LF200FTS,

- Solution cœur : Cellulose 0.5%,

- Plaques 96 puits pré-coatés avec collagène I.

Matériel :

- Euromedex E88-129, Human Albumin ELI SA Kit.

Exemple 4 : Mise en évidence de canalicules biliaires

Les hépatocytes sont cultivés dans des plaques 96 puits soit sur une couche de collagène I en 2D (40,000 cellules par puit) soit en forme d'HepatoPearl (encapsulées selon l'invention) à raison de 100 à 200 capsules par puits. La présence des canalicules biliaires a été mise en évidence par une incubation dans CFDA (Carboxyfluorescein diacetate) (figure 8). LA CFDA est une molécule non fluorescente qui diffuse dans les cellules et s'hydrolyse par les estérases cellulaires, produisant une fluorescence. Le CFDA hydrolysé est ensuite éjecté vers les canalicules biliaires par des transporteurs tels que BCRP et MDR-1 sur la membrane apicale des hépatocytes. Matériel et Méthodes

Milieux et solutions :

- Milieu CHRM (Life technologies) un tube de 50ml,

- Milieu d'ensemencement : DMEM, S VF décomplémenté, Gentamycin, Insuline, Dexamethasone,

- Solution alginate LF200FTS,

- Solution cœur : Cellulose 0.5%,

- Plaques 96 puits pré-coatés avec collagène I,

- CFDA (Carboxyfluorescein diacetate).

Exemple 5 : Dispositif selon l'invention Le dispositif utilisé pour la mise en œuvre du procédé d'encapsulation de l'invention est décrit Figure 4. Le dispositif comprend une pousse seringue (4) contenant la solution de cœur (à gauche) branché aux tubes (22, 23) connectés à l'injecteur (1). Deux vannes (21) contrôlent l'injection du liquide dans l'injecteur (1). Dans la deuxième branche de tube (23), les cellules sont suspendues dans la solution de cœur à une forte concentration (entre 2 à 20 millions de cellules/ml) dans un volume minimal (entre ΙΟΟμί à 1ml) et le tube (23) est branché sur l'installation. Dans un premier temps, la vanne (21) du tube (23) est fermée et la pousse seringue (4) injecte la solution de cœur. Cette phase nous permet d'obtenir un jet stable. Une fois cette étape validée, la vanne (21) du tube (22) est fermée et la vanne (21) du tube (23) est ouverte et cela permet l'injection des cellules à une forte concentration dans des microcapsules.

RÉFÉRENCES 1 - injecteur,

2 - tube d'alimentation,

21 - moyen de contrôle de l'injection de liquide dans l'injecteur,

22 - tube d'alimentation,

23 - tube d'alimentation,

24 - tube d'alimentation,

25 - tube d'alimentation,

3 - tube d'alimentation,

4 - moyen d'alimentation.