La presente invención se relaciona con la rama de la Microbiología y en particular con la obtención de una formulación que contiene como principio activo 1- (5-Bromofur- 2-ιl) -2-bromo-2-nιtroeteno, el cual es empleado como agente esterilizante de medios de cultivo para el control de contaminantes bacterianos y fungosos.

Técnica Anterior

Las contaminaciones de medios de cultivos por ejemplo, en la producción de plantas cultivadas "ín vitro", provocan cuantiosas perdidas durante todo el proceso, ya que su esterilización mediante autoclave elimina solamente los contaminantes existentes en el momento en que esta se lleva a cabo. Para evitar posteriores contaminaciones son empleados antibióticos muy costosos como la Cefotaxima, Novobiocina y Dihidroestreptomicma, entre otros, cuyos efectos aun no llegan a ser los deseados.

El compuesto 1- (5-Bromofur-2-ιl) -2-bromo-2-nιtroeteno, ha sido previamente descrito (Z. N. Nazarova, 1972. "Synthesis of some furylmtroolefms with potential biological activity, Khim. Farm. Zh. 6(10,) pág. 5-8 and Z. N. Nazarova et al, 1972. "Physicochemical properties and reactivity of furylnitroolefms, Zh. Org. Khim. 8 (2), pag. 404-11) y es conocido como un antimicrobiano potente para uso farmacéutico y veterinario (Solicitud de patente europea No. EP-A 0 678 516) .

Divulgación de la Invención

La presente invención proporciona una composición microcida que puede ser empleada ventajosamente para el

control de contaminantes, tanto de origen bacteriano como fúngico, en medios de cultivos.

Esta solución técnica, aunque puede ser empleada tanto para la esterilización de medios de cultivos sólidos como líquidos, resulta particularmente muy útil para su empleo en la producción de plantas "ín vitro", donde sorprendentemente se encontró que su utilización podía sustituir totalmente el proceso previo de esterilización que dichos medios requieren, y que además con su empleo resultaba factible la eliminación de la adición de hormonas de crecimiento necesarias en condiciones normales para lograr un adecuado enraizamiento de la planta a los mismos durante su crecimiento.

El principal inconveniente de este principio activo para su utilización como agente descontaminante en medios de cultivos sólidos, radicaba precisamente en su poca solubilidad (casi nula) en agua, asi como su reducida velocidad de disolución en un medio acuoso. Para resolver este problema se empleo la técnica de las dispersiones sólidas que permite la disminución del tamaño de las partículas hasta el nivel molecular.

El método propuesto en la presente invención que permite obtener una composición microcida conteniendo 1- (5-Bromofur- 2-ιl) -2-bromo-2-nιtroeteno para ser empleado como agente esterilizante químico, consistió en emplear una dispersión por fusión o coprecipitación de dicho principio activo en una matriz fisiológicamente inerte y fácilmente soluble en agua, la cual está formada por un polietilenglicol de alto peso molecular u otros polímeros similares.

Para llevar a cabo la dispersión por fusión, tanto el método de elaboración, como los parámetros de temperatura y los tiempos de agitación, fueron seleccionados basados en los

criterios de temperatura de fusión y estabilidad térmica tanto del principio activo como del polímero escogido.

El 1- (5-Bromofur-2-il) -2-bromo-2-nitroeteno es un compuesto que se caracteriza por que se funde sin descomposición a temperaturas de 89-90 C, y es térmicamente estable hasta la temperatura de 110 C.

Sin embargo, la elaboración de sistemas sólidos dispersos de dicho principio activo con polímeros cuyas temperaturas de fusión son superiores a los 110 C afectan la estabilidad térmica del 1- (5-Bromofur-2-il) -2-bromo-2- nitroeteno, por lo que en estos casos se empleó el método de co-precipitación en un solvente.

Para llevar a cabo la dispersión por fusión del l-{5- Bromofur-2-il) -2-bromo-2-nitroeteno, éste compuesto fue mezclado físicamente con Polietilenglicol 6000 (PGE 6000) en proporciones desde 1:20 hasta 1:1. La mezcla se calienta hasta fusión a la temperatura de 60-80 C y se mantiene durante 15 minutos bajo agitación constante hasta lograr la completa homogeneidad del fundido. La mezcla fundida se vierte y se extiende en forma de capa fina sobre plantas de acero inoxidable refrigeradas, garantizándose la rapidez del proceso de solidificación. El sólido asi obtenido es posteriormente triturado en molinos y tamizado a un tamaño de partícula menor de 0,2 mm.

El rango de temperatura de fusión de las dispersiones sólidas del principio activo y el PEG 6000, varia con la composición de la mezcla, siendo de 53-54 C para la dispersión sólida al 30%, cuya composición coincide con la composición auténtica del sistema binario principio activo- PEG 6000.

Para lograr una dispersión del compuesto empleando la técnica de co-precipitación, la mezcla 1- (5-Bromofur-2-il) -2-

bromo-2-mtroeteno y polímero en proporciones desde 1:20 hasta 1:1, se disuelve en un solvente polar tal como el etanol, cloroformo, metanol y alcohol isopropilico, entre otros, y la mezcla es calentada durante 10 a 60 minutos a una temperatura entre 40-60 C y posteriormente se rotoevapora al vacio con regulación de la temperatura entre 40 y 80°C.

El sólido obtenido a partir del paso anterior se tritura en un molino y se tamiza a un tamaño de partícula menor de 0, 2 mm.

Para la elaboración de medios de cultivos líquidos que contienen 1- (5-Bromofur-2-ιl) -2-bromo-2-nιtroeteno, este principio activo puede incluirse igualmente en una formulación acuosa, empleando para ello preferiblemente compuestos tensioactivos tales como el Solutol IIS-15 y el Cremophor, entre otros, tratando de lograr la solubilidad y estabilidad del compuesto en el medio, sin que se produzcan efectos adversos sobre los organismos que son cultivados en dichos medios .

Una vez obtenidas composiciones estables que contienen este principio activo por los métodos anteriores, fueron llevados a cabo diferentes ensayos para determinar la dosis óptima del mismo a emplear en el caso de su utilización como agente esterilizante de medios de cultivos solidos utilizados para la propagación de plantas "ín vitro" . Esta dosis fue determinada considerando un efecto inhibidor potente del principio activo sobre los contaminantes del medio, asi como la no aparición de efectos colaterales indeseables sobre las plantas crecidas en dichos medios de cultivo.

Para la evaluación de la fítotoxicidad del l-(5- Bromofur-2-ιl) -2-bromo-2-nιtroeteno sobre las plantas propagadas "m vitro" en medios de cultivo que lo contienen como agente esterilizante, se analizaron determinados

parámetros como son la necrosis, la clorosis, el coeficiente de multiplicación, asi como la distancia entrenudos (en el caso del cultivo de la papa) .

Para los tres cultivos estudiados (plátano, papa y caña de azúcar) se obtuvo una dosis óptima del principio activo en un rango entre 30 y 45 Mq/ml, en la cual el agente manifiesta un elevado efecto inhibidor del crecimiento microbiano, sin que se observen efectos fitotóxicos sobre los cultivos estudiados .

Los siguientes ejemplos de realización de la presente invención van encaminados a ilustrarla, y en ninguna manera a limitar su alcance.

EJEMPLO 1 : INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA Y EL TIEMPO CON RESPECTO A LA PUREZA DE LA DISPERSIÓN OBTENIDA POR EL MÉTODO DE FUSIÓN.

Se llevó a cabo un estudio de la influencia de los parámetros tiempo y temperatura sobre la pureza de la composición conteniendo 1- (5-Bromofur-2-ιl) -2-bromo-2- nitroeteno obtenida mediante el método de dispersión por fusión.

Se encontró que la pureza del principio activo en la dispersión solida obtenida por éste método depende de la temperatura empleada y del tiempo de agitación a esa temperatura. En la TABLA 1 se muestran los porcientos de pureza del 1- (5-Bromofur-2-il) -2-bromo-2-nιtroeteno a partir de la dispersión solida de este principio activo en PEG 6000 (30:70), empleando temperaturas de fusión entre 80 C y 120 C, y tiempos de agitación entre 15 y 60 minutos.

El estudio de todos los casos se realizó como se describe a continuación. Para el caso de una temperatura de 80°C y tiempo de agitación de 15 minutos por ejemplo, la

mezcla fisica del principio activo y el PEG 6000 se calienta hasta fusión a la mencionada temperatura y se mantiene durante 15 minutos bajo agitación constante hasta lograr una completa homogeneidad del fundido. La mezcla fundida se vierte y se extiende en forma de capa fina sobre planchas de acero inoxidable refrigeradas. El sólido obtenido se tritura en molinos y se tamiza a un tamaño de partículas menor de 0,2 mm.

La pureza del 1- (5-Bromofur-2-il) -2-bromo-2-nitroeteno determinada por cromatografía de gases, en la dispersión obtenida para las condiciones anteriormente descritas, se corresponde con un 99,89%.

TABLA 1: Influencia de la temperatura y el tiempo en la pureza de la dispersión obtenida mediante fusión.

EJEMPLO 2: DETERMINACIÓN DE PROPIEDADES DE DISOLUCIÓN DEL 1- (5-Bromofur-2-il) -2-bromo-2-nitroeteno DESPUÉS DE LOS PROCESOS DE DISPERSIÓN POR FUSIÓN O POR COPRECIPITACIÓN.

En la obtención de soluciones/suspensiones acuosas homogéneas del principio activo 1- (5-Bromofur-2-il) -2-bromo-

2-mtroeteno, es importante el estudio de sus propiedades de disolución.

En la TABLA 2 se compara la velocidad de disolución de dicho principio activo con un tamaño de partícula convencional, micronizado, humectado y utilizando en una dispersión sólida con PEG 6000 al 30%, donde se pueden apreciar que mejoran considerablemente las propiedades de disolución del principio activo, lo cual garantiza la rapidez y homogeneidad de la distribución del mismo en el medio de cultivo.

TABLA 2: Evaluación de la velocidad de disolución l-(5- Bromofur-2-ιl) -2-bromo-2-nιtroeteno presentado en el medio de cultivo de diferentes formas.

EJEMPLO 3: DETERMINACIÓN DE LA ESTABILIDAD QUÍMICA DEL PRINCIPIO ACTIVO DISUELTO/DISPERSO EN PEG.

Para la determinación de la estabilidad química del principio activo 1- (5-Bromofur-2-ιl) -2-bromo-2-nιtroeteno disuelto o disperso en PEG, se empleó la Cromatografía

Gaseosa como técnica, para la cuantificación del contenido de dicho compuesto.

Un ^' estudio realizado incluyó la determinación de estabilidad de la sustancia activa hasta pasados 385 dias de su preparación. Los resultados de este estudio se muestran en la TABLA 3, donde se puede apreciar que el contenido del 1- (5-Bromofur-2-il) -2-bromo-2-nitroeteno se mantiene estable en los niveles originales, aún después de transcurrido este periodo de tiempo.

TABLA 3: Evaluación de la estabilidad química de estante de la dispersión sólida en PEG 6000 al 30%, empleando Cromtaografia de gases .

EJEMPLO 4: DETERMINACIÓN DE LA ACCIÓN DE UNA COMPOSICIÓN QUE CONTIENNE 1- (5-Bromofur-2-il) -2-bromo-2-nitroeteno SOBRE MICROORGANISMOS SELECCIONADOS.

Para llevar a cabo el estudio de la acción de la sustancia activa obtenida mediante los ejemplos anteriormente referidos sobre patógenos agrícolas y microorganismos contaminantes presentes en el proceso de obtención de plantas "in vitro", se empleó para el caso de las bacterias, el método de las diluciones seriadas en tubos (Bailey, W. R. and Scott, E. S. Diagnostic Microbiology 4 ^th Edition, pp. 313- 329, The C. V. Mosbhy Co. St . Louis, 1974) modificado por Silveria y col. (Silveira E. et al, Determinación de la minima concentración inhibitoria (M.C.I.) de sustancias bioactivas, Boletín Científico ISCM IV (2), 1986), y para el

caso de los hongos, la evaluación se realizó siguiendo el método del crecimiento diametral de la colonia, de acuerdo a lo descrito por Casadens y cois. (Casadens II: Método de investigaciones fitopatológicas . Instituto Iberoamericano de Cooperación para la Agricultura. San José de Costa Rica, 1985) .

Las concentraciones empleadas para la evaluación de la acción del principio activo estuvieron comprendidas en el rango entre 1 y 100 El medio de cultivo empleado, la temperatura y el periodo de incubación se ajustaron a las condiciones y características del microorganismo objeto de ensayo. La DL-50 fue calculada en Hg/ml mediante el método de Probit (Finney D. J. Probit analysis. 3 ^rd Ed. Cambridge University Press. 1971)

Los resultados obtenidos en estos estudios se muestran en la TABLA 4.

TABLA 4: Pruebas "in vitro" realizadas con el valor de la DL 50 correspondiente, frente a microorganismos de importancia agrícola.

EJEMPLO 5: DETERMINACIÓN DE LA ACCIÓN DEL 1- (5-Bromofur- 2-il)-2-bromo-2-nιtroeteno SOBRE MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS EN LA PRODUCCIÓN DE PLANTAS "IN VITRO" .

Se realizó un estudio de la efectividad del l-(5- Bromofur-2-ιl) -2-bromo-2-nιtroeteno sobre contammates fungosos y bacterianos presentes en el proceso del cultivo ^w ιn vitro" de plantas de como la papa, el plátano y la caña de azúcar.

Para ello, se fregaron apropiadamente los frascos y tapas a utilizar en la producción de vitroplantas, los cuales fueron finalmente si nergidos en una solución de hipocloπto de sodio (0,5%) por un periodo nunca inferior a los 3

minutos. Los frascos asi lavados son posteriormente secados y empleados antes de las 24 de este procesamiento.

Una vez preparado el medio de cultivo y que éste alcance una temperatura aproximada entre 60 y 80 C, se incorpora al mismo el peso necesario del formulado para lograr una concentración deseada del principio activo. A continuación se vierte el volumen necesario de este medio en cada frasco, procediéndose a la siembra de la planta a las 24 horas.

El rango de concentración ensayado estuvo comprendido entre 1 y 50 M^g/ml . Para determinar la efectividad del compuesto, se evaluaron los cultivos a partir de las 72 horas de sembrados y durante el periodo necesario que le corresponde a cada cultivo para la realización del subcultivo siguiente en el medio de multiplicación. Similar estudio se llevó a cabo en el medio de cultivo de enraizamiento.

Los resultados obtenidos en este ensayo se muestran la TABLA 5.

TABLA 5: Acción de la dispersión sólida conteniendo 1- (5-Bromofur-2-il) -2-bromo-2-nιtroeteno sobre microorganismos contaminantes de medios de cultivos empleados en la producción de vitroplantas de Musa sp.

*: El % de mortalidad durante los ensayos fue de 0,81% para los escalados realizados con la adición del principio activo y de 1% para el método tradicional.

De estos ensayos se puede inferir que las contaminaciones se comportaron de forma similar en los

cultivos que contenían la composición conteniendo l-(5- Bromofur-2-ιl) -2-bromo-2-nιtroeteno que en el cultivo empleado como control, el cual habla sido previamente esterilizado mediante autoclave, comenzando a incrementarse dichas contaminaciones a partir del ll ^πo dia en ambos casos. Por otra parte pudo observarse un incremento del coeficiente de multiplicación en los cultivos que contenían el esterilizante químico (TABLA 6) .

TABLA 6: Acción de la dispersión sólida conteniendo 1- (5-Bromofur-2-ιl) -2-bromo-2-nιtroeteno sobre el desarrollo de vitroplantas.

En el caso en que el agente químico fue empleado en el medio de enraizamiento, se observó un efecto superior en los cultivos que lo contenían que en el control esterilizado, es decir, se observaron raices mas vigorosas y más abundantes en un menor periodo de tiempo. El porciento de contaminación detectado no fue significativo con relación al control.

En los ensayos en Musa sp. con los clones Gran Enano y FHIA-03 en el propio medio de enraizamiento donde no se adicionaron hormonas mductoras de raices (A.I.A), se observó un mejor comportamiento de ambos clones frente al agente químico esterilizante que frente al control autoclaveado, ya que a los 5 dias de la siembra en los medios que contenían 1- (5-Bromofur-2-ιl) -2-bromo-2-nιtroeteno se observó en ellos mayor cantidad de raíces y mayor vigor en las mismas,

mientras que en el control esterilizado de forma tradicional, sólo se apreciaron esbozos radicales en similar periodo.