La présente invention concerne les dispositifs microfluidiques de type « laboratoire sur puce », qui peuvent intégrer la séquence complète d'analyse d'un échantillon jusqu'à la lecture du résultat. Plus précisément, le dispositif selon la présente invention est une cartouche permettant de réaliser des étapes d'analyse d'un échantillon biologique, classiquement réalisées en laboratoire. Elle comporte des moyens permettant d'identifier des marqueurs moléculaires cibles, isolés à partir d'un échantillon biologique. Cette cartouche est adaptée pour être insérée dans au moins un dispositif permettant le contrôle de l'injection et de la circulation microfluidique, le contrôle thermique ainsi que la transduction d'un signal spécifique traduisant la présence d'une substance recherchée.

Est entendu comme diagnostic moléculaire dans la présente demande, la mise en évidence de la présence dans un échantillon biologique, d'un acide nucléique ou marqueur moléculaire, dont la séquence est spécifique d'un gène d'intérêt voir d'un germe.

Un diagnostic moléculaire peut être réalisé dans un dispositif microfluidique de type « laboratoire sur puce », qui intègre dans un même substrat, ou cartouche, dont la taille est généralement de quelques centimètres carrés, des zones fonctionnelles permettant la réalisation d'analyses complexes classiquement réalisées en laboratoire tout en consommant de faibles volumes réactionnels.

Des dispositifs microfluidiques intégrant des moyens de traitement de l'échantillon (extraction des acides nucléiques dudit échantillon et/ou amplification des acides nucléiques cibles) et des moyens de détection des acides nucléiques cibles sont par exemples décrit dans les documents « Current state of intellectual property in microfluidic nucleic acid analysis », Malic et al., Récent Patents on Engineering 2007, 1 , 71 -88 et « Microfluidic Systems for pathogen sensing », Mairhofer et al., Sensors 2009, 9, 4807-4823.

La détection des acides nucléiques peut être réalisée par différentes techniques. En général la détection de molécules cibles est effectuée par la mise en jeu de mécanismes de reconnaissance moléculaire, qui traduisent la présence d'une substance recherchée par un signal détectable. Les biocapteurs par affinité interagissent avec la substance d'intérêt par hybridation. Ce type de capteur utilise des molécules spécifiques comme des anticorps, des oligonucléotides, des peptides ou encore des lectines. Ce type de biocapteur est idéal dans le cadre du développement de dispositifs portables d'identification universelle.

En particulier, les technologies des biopuces qui reposent sur ce principe, ont rendu possible le suivi des niveaux d'expression d'un grand nombre de marqueurs moléculaires de façon simultanée (voir par exemple Schena et al. 1995, Science 270 :467-470 ; Lockart et al. 1996, Nat. Biotechnology 14 :1675-1680). La technique des biopuces à ADN repose sur le principe de l'hybridation moléculaire. Ces biopuces comportent essentiellement un substrat ou support solide, en général plat, à la surface duquel sont immobilisées des molécules sondes, dont la séquence est spécifique des acides nucléiques cibles.

L'hybridation localisée est détectée par l'émission d'un signal chromogénique. On entend ici par signal chromogénique, tout signal lumineux émis directement, ou indirectement après excitation par une source lumineuse appropriée ou après transformation chimique ou enzymatique. Entrent ainsi dans la catégorie des signaux chromogéniques, les signaux colorimétriques, photoluminescents, fluorescents, chimioluminescents, bioluminescents et analogues. Ces signaux sont soit émis directement par les molécules d'intérêts, soit émis par des éléments détectables (tags), qui leurs sont rajoutés et/ou greffés. La technologie la plus fréquente consiste à greffer un tag chimique ou électrostatique à la molécule cible à détecter. La greffe d'un tag (élément détectable), comme un fluorophore par exemple (molécule fluorescente organique, ou nanoparticule inorganique comme les nanocristaux et boîtes quantiques de type quantum dots) peut être réalisée par des techniques connues sur les molécules cibles avant ou après leur immobilisation à la surface de la biopuce. Il peut également arriver que la détection de la molécule d'intérêt ou du tag soit indirecte, requérant une étape supplémentaire de révélation. L'élément détectable peut également être porté par la molécule sonde.

Sous éclairement, la surface de la biopuce émet alors de la lumière à une longueur d'onde caractéristique aux endroits où sont accrochées des molécules sondes marquées ou liées aux molécules cibles marquées.

Généralement, la séquence de mesure d'une biopuce à ADN avec détection par fluorescence est la suivante : la biopuce portant un ensemble choisi de gouttes (spots) de molécules sondes est mise en contact avec l'échantillon à étudier, susceptible de comporter des molécules d'acides nucléiques cibles en phase liquide. Dans des conditions contrôlées de température, les molécules cibles vont s'hybrider de manière préférentielle avec les molécules sondes qui leur sont spécifiques. Après hybridation des molécules cibles, la biopuce est lavée. Un lecteur de fluorescence permet alors d'obtenir une image en fluorescence de la surface de la biopuce. Pour cela, la biopuce est éclairée avec une source lumineuse à la longueur d'onde d'excitation du fluorophore marquant les molécules cibles, puis une optique adaptée forme une image de la fluorescence de la biopuce à la longueur d'onde d'émission des fluorophores. L'intensité lumineuse de chaque point de cette image est reliée à la quantité de fluorophores présents au point correspondant de la biopuce, elle-même proportionnelle au nombre de molécules cibles qui se sont accrochées sélectivement en cet endroit lors de la phase d'hybridation, ce qui permet de collecter des informations (souvent quantitatives) sur le contenu en acides nucléiques de l'échantillon.

Une des limitations de cette technique de détection est la sensibilité du signal produit, notamment lorsqu'il y a peu de molécules cibles dans l'échantillon à analyser. Pour repousser ces limites, les dispositifs microfluidiques de type laboratoire sur puce reposant sur des systèmes de détection des acides nucléiques de type biopuce intègrent donc généralement des moyens d'amplification géniques.

L'amplification génique permet d'obtenir un nombre considérable de copies de séquences nucléiques identiques. Elle permet ainsi d'obtenir une bonne sensibilité de détection à partir d'une quantité initiale infime d'acide nucléique cible (voir par exemple, Future Microbiol. 2010 Feb 5(2):191 -203). La technique d'amplification la plus généralement utilisée est la réaction en chaîne par polymérase, dont l'acronyme anglais est PCR. La PCR est réalisée par répétition de réactions d'élongation en présence d'amorces nucléotidiques spécifiques de la séquence à amplifier, et d'une ADN polymérase.

Dans le cadre d'une détection des acides nucléiques cibles par biopuce, dans laquelle plusieurs marqueurs sont en général détectés de façon simultanée, l'amplification est souvent réalisée par une PCR multiplexée, dans laquelle plusieurs acides nucléiques sont amplifiés simultanément dans une même chambre.

Les dispositifs microfluidiques de type laboratoire sur puce présentent de nombreux avantages par rapport aux techniques conventionnelles de diagnostic moléculaire en laboratoire. La miniaturisation et la réduction des volumes réactionnels associée à la réduction du nombre d'interventions extérieures ont ainsi permis un gain de temps considérable, et une réduction importante des risques de contamination de l'échantillon. Par ailleurs l'intégration des étapes d'analyse au sein d'un même dispositif fournissant un résultat final minimise les interventions sur l'échantillon par un manipulateur humain et rend ainsi cette technologie accessible à des techniciens non experts en biologie moléculaire.

Ces avantages ont contribué à généraliser leur l'utilisation, et des automates permettant la lecture de cartouches microfluidiques ont ainsi été mis au point. Néanmoins, l'utilisation à grande échelle de ces dispositifs, notamment dans le cadre du diagnostique moléculaire chez l'homme, pour lequel la cartouche doit être jetée après chaque utilisation, est limitée par la complexité et les coûts importants inhérents à cette technologie. Par ailleurs ces dispositifs consistant souvent en un assemblage de nombreux éléments pour la réalisation des différentes étapes d'analyse, ils restent extrêmement fragiles et délicats à manipuler.

Ainsi, malgré les nombreux développements de dispositifs microfluidiques intégrés, il existe toujours un besoin pour des dispositifs améliorés permettant leur réalisation simplifiée et à moindre coût. On connaît des dispositifs microfluidiques complexes intégrant les étapes d'analyse classiquement réalisées en laboratoire. Ils comportent en général un ensemble de cavités reliées par des microcanaux, formant un réseau contrôlé par des vannes microfluidiques intégrées. Ces vannes sont très souvent des vannes à membrane. Les vannes à membrane comprennent un corps (siège) de vanne avec au moins deux ports (un port d'entrée et un port de sortie, formant respectivement un orifice d'entrée et un orifice de sortie) ainsi qu'une membrane flexible placée en regard du siège de vanne, dont la déflection permet d'obstruer la vanne.

Un dispositif microfluidique comportant des vannes à membrane est notamment divulgué dans le document EP 1 327 474 A1 . Ce document décrit un dispositif microfluidique intégrant un système simplifié de vanne microfluidique. Dans ce dispositif un élément (B) est lié à la surface d'un élément (A). Ladite surface de l'élément (A) comporte des rainures. L'élément (B) coopère ainsi avec l'élément (A) de manière à définir, à l'interface entre les éléments (A) et (B), un canal d'écoulement capillaire. Des « espaces » peuvent être formées dans ces canaux. Par ailleurs, l'élément (B) peut être réalisé dans un matériau mou, au moins dans la portion opposée à « l'espace », réalisé dans le canal d'écoulement capillaire. Le dispositif intègre une fonction soupape de sorte que la compression sélective de « l'espace », à partir de l'élément (B) permet au volume dudit espace de décroître de manière réversible.

Par ailleurs, le document WO2009/049268 A1 , décrit un dispositif microfluidique comportant plusieurs aires fonctionnelles d'analyse. Ce dispositif intègre : une aire de préparation de l'échantillon permettant l'extraction des acides nucléiques, une aire d'amplification des acides nucléique et une aire d'analyse et de détection des acides nucléiques amplifiés. Ladite aire de détection étant susceptible d'être une biopuce.

Le dispositif selon cet art antérieur est formé par un substrat plastique rigide, sur lequel est fixée une membrane plastique, elle-même substantiellement rigide. La membrane et le substrat sont formés dans des matériaux de type polymères thermoplastiques (polyméthyl méthacrylate, polystyrène, polycarbonate). L'épaisseur de la membrane est choisie de façon à permettre sa déformation par une force mécanique appropriée. Le substrat peut comporter des micro-éléments en regard de parties non scellées à la membrane, coopérant avec la membrane pour former une structure de vanne à membrane.

Ce dispositif est une structure lamellaire à trois couches, intégrant le système d'actuation des vannes à membrane. La troisième couche, située sur la face supérieure de la membrane souple, permet le contrôle pneumatique des vannes.

Bien qu'elle ait été progressivement simplifiée, la conception des dispositifs microfluidiques reste donc complexe. Le but de la présente invention est une cartouche permettant la réalisation de l'ensemble des étapes de l'analyse et de la détection de marqueurs moléculaires présent dans un échantillon, qui soit robuste et simple.

Son utilisation est ainsi possible en tant qu'élément à usage unique permettant la réalisation de tests fiables dans de bonnes conditions économiques.

La cartouche selon la présente invention est un dispositif permettant la réalisation d'un procédé d'analyse d'acides nucléiques compris dans un échantillon, comprenant un corps principal réalisé en un substrat, dans lequel sont formés

- au moins une chambre réactionnelle et une chambre de détection d'au moins un acide nucléique susceptible d'être contenu dans l'échantillon.

- un circuit microfluidique comportant un moyen d'injection de l'échantillon, des moyens d'injection et d'évacuation de fluides dans et hors de la cartouche, des cavités, des canaux fluidiques et des vannes aptes à les obturer.

Cette cartouche est caractérisée en ce qu'elle comprend (a) une face dite face d'actuation à partir de laquelle est possible l'actuation des vannes de la cartouche et (b) une deuxième face, opposée à ladite face d'actuation des vannes comportant la chambre de détection d'au moins un acide nucléique susceptible d'être contenu dans l'échantillon, et dite face de détection.

Le substrat de cette cartouche est avantageusement rigide.

Le terme microfluidique s'applique dans le cadre de la présente demande à des systèmes permettant la manipulation de fluides comportant des canaux dont au moins l'une des dimensions est inférieure au millimètre.

Cette cartouche est apte à être insérée dans des stations d'accueil, au sein d'appareils permettant de réaliser les fonctions suivantes : le contrôle thermique, l'alimentation fluidique et le contrôle de la circulation de fluide ainsi que la détection optique.

Selon un mode de réalisation particulier, les vannes sont formées par une membrane déformable placée en regard d'un siège de vanne. Ledit siège de vanne comprenant au moins un orifice d'entrée et un orifice de sortie dudit siège de vanne.

Les orifices d'entrée et de sorties des sièges de vannes correspondent à des extrémités des canaux fluidiques de la cartouche.

Plus particulièrement, les sièges de vannes sont formés par des renfoncements formés à la surface de la face d'actuation. Par surface de la face d'actuation, il est entendu qu'il s'agit de la surface du substrat formant le corps principal de la cartouche, du côté de la face dite d'actuation.

Plus précisément encore, la surface de la membrane déformable, placée en regard des sièges de vanne est, au repos, approximativement plane et parallèle à la face d'actuation de la cartouche et apte à être déformée par un actionneur extérieur. Selon différents modes de réalisation, la déformation de la membrane est susceptible d'ouvrir ou d'obstruer la vanne.

Les sièges des vannes peuvent être formés de façon à définir un espace entre la membrane au repos et le fond (ou plancher) du siège de vanne. Selon ce mode de réalisation, les vannes sont donc en position ouverte au repos.

Avantageusement les actionneurs des vannes sont susceptibles d'être des pistons déformant la vanne et l'obstruant. Un dispositif pneumatique permettant d'appliquer une pression déformant la membrane en regard de chaque siège de vanne peut également être envisagé.

Il est également envisageable que les sièges de vannes soient formés de façon à ce que la membrane au repos obstrue les dits sièges de vannes. Un dispositif pneumatique permettant d'appliquer une dépression déformant la membrane en regard de chaque siège de vanne permettrait alors l'ouverture des vannes.

Selon un mode de réalisation particulier, la cartouche comporte des canaux fluidiques réalisés dans le substrat formant le corps principal de la cartouche, au voisinage de chacune des faces d'actuation et de détection de la cartouche. La cartouche comporte également des trous traversant ledit substrat et reliant ses deux faces de la cartouche, ou les canaux au voisinage de celles-ci. Il est avantageux que les canaux formés au voisinage des deux faces soient parallèles à la face d'actuation de la cartouche.

Plus précisément, ces canaux fluidiques situés au voisinage des faces d'actuation et de détection de la cartouche peuvent être formés par des rainures, réalisées dans le substrat formant le corps principal de la cartouche, affleurant l'une des surfaces du dit substrat, du côté de la face d'actuation ou du côté de la face de détection. Ces rainures sont fermées par des éléments de fermeture, pour former des canaux fluidiques.

Selon un mode de réalisation particulier, la cartouche permet l'injection de l'échantillon ainsi que l'injection de fluides dans la cartouche, ou l'évacuation de fluides hors de la cartouche à partir de la face de détection de ladite cartouche. Ces injections ou évacuations sont réalisée à partir d'orifices d'injection ou d'évacuation, situés à la surface du substrat formant le corps principal de la cartouche, du côté de la face de détection de la cartouche. Ces orifices peuvent être reliés aux canaux fluidiques formés au voisinage de la face d'actuation par des trous traversants.

Avantageusement, l'injection de fluide (y compris éventuellement l'échantillon), dans la cartouche ainsi que l'évacuation de fluides hors de la cartouche sont contrôlées par des vannes de la cartouche. Ces vannes qui comme toutes les vannes de la cartouche sont situées à la surface du substrat rigide (formant le corps principal de la cartouche) du côté de la face d'actuation, comportent au moins : - Un orifice d'entrée ou de sortie du siège de vanne, débouchant au centre dudit siège de vanne. Cet orifice est formé par une extrémité d'un trou traversant le substrat, perpendiculairement à la face de détection. L'autre extrémité du trou traversant, débouchant avantageusement à la surface du substrat du côté de la face de détection de la cartouche, est susceptible d'être un orifice d'injection ou d'évacuation précédemment décrits.

- Un orifice de sortie ou d'entrée du siège de vanne, formé par une extrémité d'un canal fluidique formé au voisinage de la face d'actuation de la cartouche. Avantageusement, ce canal est formé par une rainure affleurant la surface du substrat de la cartouche, du côté de la face de détection.

Dans des vannes de ce type, la déformation de la membrane par l'application d'une pression (pneumatique ou par un piston) est susceptible d'obstruer le siège de vanne et plus particulièrement l'orifice d'entrée ou de sortie débouchant en son centre. Ce type de vanne est classiquement ouvert au repos.

Il est avantageux selon une variante de réalisation, de prévoir des vannes dites en U, permettant d'interrompre la circulation de fluide, au sein d'un canal formé au voisinage de la face d'actuation de la cartouche. Pour former une telle vanne en U, le canal parallèle à la face d'actuation de la cartouche est déporté, au moyen d'un trou traversant sur la face de détection puis réinjecté dans la face d'actuation au moyen d'un second trou traversant, dont l'extrémité du côté de la face d'actuation de la cartouche forme un orifice débouchant au centre d'un siège de vanne.

Selon le mode de réalisation, un canal déporté est formé au voisinage de la face de détection de la cartouche. Préférentiellement selon cette variante de réalisation, les dits canaux formés au voisinage de la face d'actuation ou de la face de détection sont formés par des rainures affleurant l'une ou l'autre surface du substrat du côté de la face d'actuation ou de la face de détection.

Avantageusement, les éléments fermant les rainures formées sur la face de détection (opposée à la face d'actuation), et formant ainsi des canaux fluidiques, sont des pastilles (patchs) adhésives, par exemple des éléments lamellaires susceptible d'être fixés par collage sur le substrat après formation des rainures.

Dans des vannes de ce type, la déformation de la membrane par l'application d'une pression (pneumatique ou par un piston) est susceptible d'obstruer le siège de vanne et plus particulièrement l'orifice d'entrée ou de sortie débouchant en son centre. Ce type de vanne est classiquement ouvert au repos.

La circulation de fluide, au sein d'un canal parallèle à la face d'actuation de la cartouche, peut être également être contrôlée selon un autre dispositif, de type vanne en ligne. Le canal parallèle selon ce dispositif est interrompu par un siège de vanne en regard duquel une membrane déformable est susceptible d'être déformée. Dans ce type de vanne, la déformation de la membrane, par pression ou par dépression est susceptible d'obstruer le siège de vanne et de fermer la vanne, ou d'ouvrir ladite vanne.

Selon ce dernier mode de réalisation, dans lequel les vannes en lignes sont employées, tous les canaux fluidiques parallèles à la face d'actuation peuvent être avantageusement situés à la surface du substrat rigide du côté de ladite face d'actuation.

Selon une variante de réalisation, la ou les chambre(s) réactionnelle(s) est/sont susceptibles d'être formée(s) par un/des renfoncement(s), affleurant les surfaces du substrat rigide du côté d'une ou des deux faces de détection et d'actuation de la cartouche. Ce(s) renfoncement(s) peut/peuvent être fermé(s) par un élément de fermeture.

Préférentiellement, la cartouche comporte au moins une chambre réactionnelle pour l'amplification d'acides nucléiques.

La technique d'amplification la plus courante est la PCR (acronyme anglais de Polymerase Chain Reaction). Cette technique requiert de cycler thermiquement (généralement entre 50 et 95 °C) un mélange réactionnel. Ce cyclage thermique est favorisé dans le cadre d'un microsystème comme la cartouche de la présente invention, part les faibles volumes réactionnels. Il est possible de déplacer le mélange réactionnel entre différentes zones de températures, de manière circulaire ou en flux continu ou de réaliser le cyclage thermique au sein d'une chambre unique qui peut être isolée. La PCR ayant été citée à titre d'exemple, d'autres techniques d'amplification peuvent également être utilisées, incluant la PCR par transcriptase inverse (RT-PCR, reverse transcriptase PCR), l'amplification rapide des extrémités d'ADNc (RACE, Rapid Amplification of cDNA Ends), l'amplification en cercle roulant (RCA, Rolling Circle Amplification), l'amplification basée sur des séquences d'acides nucléiques (NASBA, Nucleic Acid Séquence Based Amplification), l'amplification médiée par transcription (TMA, Transcript Mediated Amplification), la réaction de ligature en chaîne (Ligase Chain Reaction). Les techniques d'amplifications isothermes peuvent être avantageuses car elles sont fondées sur diverses enzymes qui rendent l'étape de dénaturation des acides nucléiques à 95 °C inutile. Ces techniques emploient par exemple: des polymérases comme la Phi29 qui ont une activité de déplacement de brin, des hélicases, qui dénaturent les brins en amont d'une polymérase classique, d'autres enzymes, produisant de l'ARN, comme produit intermédiaire, lui-même amplifié par transcription.

La cartouche selon la présente invention est préférentiellement destinée à la détection en parallèle, de la présence de plusieurs marqueurs moléculaires au sein d'un échantillon biologique. Le choix d'une amplification multiplexée permet alors de réaliser dans une seule chambre réactionnelle, l'amplification de plusieurs molécules cibles d'acides nucléiques.

L'étape d'amplification peut par ailleurs permettre de marquer les amplicons, par exemple par incorporation de nucléotides tagués (c'est à dire : portant un élément détectable). Le choix du tag (élément détectable) dépend de la stratégie de détection utilisée. Dans le cadre, par exemple, d'une lecture optique de la reconnaissance moléculaire par détection de lumière (transduction optique), le tag peut être un fluorophore organique ou des nanoparticules inorganiques, comme les quantum dots, les nanocristaux d'oxydes de terre rare dopés, les nanoparticules de silice ou encore les nanoparticules métalliques.

Selon un mode de réalisation particulier, la ou les chambre(s) réactionnelle(s) est/sont susceptible(s) d'être formée(s) à la surface du substrat formant le corps principal de la cartouche du côté de la face d'actuation de la cartouche. Dans ce mode de réalisation la ou les chambre(s) sont formées par des renfoncements réalisés dans le substrat de la cartouche et affleurant la surface dudit substrat du côté de la face d'actuation.

Selon un mode de réalisation, la cartouche comporte une membrane monolithique, qui recouvre tout ou partie de la face d'actuation de la cartouche (c'est-à- dire la surface du substrat rigide, sur laquelle elle peut par exemple être collée ou thermosoudée). Selon ce mode de réalisation, ladite membrane coopère avec la surface du substrat rigide du côté de la face d'actuation de la cartouche, pour former des canaux parallèles à ladite face, au niveau des rainures formées sur ladite surface, et au moins une chambre réactionnelle, au niveau de la/ou des cavité(s) (renfoncement) formée(s) sur ladite surface.

Il est alors avantageux que ladite membrane monolithique recouvrant la face d'actuation soit apte à résister à la chaleur et à transmettre ladite chaleur.

Cet aspect peut se révéler important dans le cadre d'un contrôle thermique de la ou des chambre(s) réactionnelles.

Plusieurs dispositifs de cyclage thermique de la chambre d'amplification peuvent être envisagés. Il est possible de chauffer localement la chambre réactionnelle en utilisant, par exemple, une irradiation Infrarouge (par exemple à l'aide d'un laser ou d'une lampe). Des dispositifs chauffants peuvent aussi être amené en contact de la chambre de PCR, comme des éléments peltiers ou des électrodes de platine.

A cet effet, des ouvertures peuvent être opérées à travers le corps principal de la cartouche et la membrane, qui permettent notamment de réduire la dispersion thermique.

Avantageusement encore, cette membrane monolithique est une membrane déformable, coopérant avec la surface du substrat rigide du côté de la face d'actuation de la cartouche pour former des vannes à membrane, en regard des sièges de vannes formés sur ladite surface. Ladite membrane est susceptible d'être déformée en regard de chaque siège de vanne par l'intermédiaire d'une pression pneumatique ou appliquée par exemple par un piston, ou par une dépression pneumatique.

Dans les modes de réalisation comprenant une membrane monolithique, telle que décrite précédemment, ladite membrane est donc susceptible de remplir un certain nombre de fonctions. En effet, la membrane monolithique coopère avec (i) le substrat rigide, pour former les canaux parallèles et fermer la face d'actuation, et (ii) les systèmes d'actuation placés en regard des sièges de vannes formés dans le substrat rigide, pour la formation des vannes et leur actionnement. Elle peut encore assurer la transmission de la chaleur.

Le positionnement et le collage d'une telle membrane sur un substrat rigide formant un dispositif microfluidique d'analyse sont des étapes délicates de fabrication.

Selon la présente invention, les problèmes de fabrication de la cartouche, liés notamment au positionnement de la membrane sur le substrat rigide sont simplifiés. En effet dans la cartouche selon l'invention, les deux faces principales opposées sont distinctement fonctionnalisées. En particulier, l'une de ces faces est dédiée à l'actuation de toutes les vannes. De cette façon, il n'est pas nécessaire de réaliser des découpes de la membrane préalablement, ou postérieurement, au dépôt de ladite membrane sur le substrat rigide formant le corps principal de la cartouche. En outre dans certains modes de réalisation particulièrement préférés, le dépôt de ladite membrane peut recouvrir la totalité de la face d'actuation du substrat rigide.

La chambre de détection est un biocapteur d'affinité permettant de détecter la présence de molécules cibles spécifiques dans l'échantillon. Les biocapteurs par affinité interagissent avec la molécule cible par ligation. La cartouche selon la présente invention est destinée à permettre la détection en parallèle de la présence de plusieurs marqueurs moléculaires au sein d'un échantillon biologique. La capture des produits d'amplification, ou amplicons, sur une surface est une technique bien connue de l'homme du métier, pour réaliser une détection multiplexée. Le mode de détection de prédilection est la biopuce.

Les systèmes de biopuce sont actuellement largement utilisés pour la détection et la mesure de substances spécifiques dans des échantillons complexes. Avec une telle biopuce, l'identité et la quantité d'une molécule cible dans un échantillon sont mesurées par la mesure du niveau d'association de la séquence cible avec des sondes spécifiquement prévues pour ladite séquence. Dans les technologies de biopuce à ADN, un ensemble d'acides nucléiques sondes, ayant chacun une séquence définie, est immobilisé sur un support ou substrat solide de façon à ce que chaque sonde occupe une position prédéterminée. Une fois le jeu de sonde immobilisée, la biopuce est mise en contact avec un échantillon de façon à ce que les séquences complémentaires puissent s'associer à une sonde immobilisée, par exemple en s'hybridant, s'associant ou se liant à la sonde. Après élimination du matériel non associé les séquences associées sont détectées et mesurées.

Les sondes sont en général non marquées (autrement dit la sonde ne possède pas de marqueur détectable).

Selon ce mode de réalisation dans lequel la détection par biopuce est utilisée, la détection et la quantification de l'interaction entre les molécules cibles et les sondes est réalisée un dispositif de détection optique : un rayonnement lumineux d'une première longueur d'onde donnée excite des chromophores liés aux molécules cibles. La lumière émise par les chromophores à une deuxième longueur d'onde, en réponse à leur excitation lumineuse est ensuite collectée par un dispositif de collecte.

Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la chambre de détection des acides nucléiques est formée par un renfoncement réalisé à la surface du substrat formant le corps principal de la cartouche, du côté de la face de détection. Cette chambre de détection est apte à accueillir une biopuce. Cette chambre de détection peut alors être appelée chambre d'hybridation. Il est ainsi avantageux que la biopuce ferme la chambre de détection du côté externe du substrat formant le corps principal de la cartouche. La chambre de détection/hybridation comporte au moins un orifice d'entrée et un orifice de sortie (lesdits orifices constituant les extrémités de trous traversant le substrat formant le corps principal de la cartouche, et rejoignant les canaux fluidiques réalisés à la surface dudit substrat du côté de la face d'actuation). L'orifice d'entrée dans la chambre de détection/hybridation permet l'entrée par exemple du mélange réactionnel contenant les amplicons. Ces amplicons sont alors susceptibles de s'hybrider sur les molécules sondes qui leurs sont complémentaires.

Il est également particulièrement avantageux que la présente cartouche, et donc la lecture de la biopuce, soit adaptée à un système de collecte de la lumière émise par les chromophores en réponse à une excitation lumineuse de type imagerie de contact.

Il peut être envisagé que la cartouche soit destinée à être placée dans un appareil permettant la lecture optique par imagerie de contact.

Il sera alors avantageux que la biopuce soit placée sur la face inférieure de la cartouche. La face d'actuation des vannes étant alors formée sur la face supérieure de la cartouche.

Avantageusement, le substrat formant le corps principal de la cartouche est transparent. Il est alors possible d'envisager que l'illumination des chromophores susceptibles d'être immobilisés à la surface du support de la biopuce, soit réalisée à partir de la face supérieure, d'actuation, de la cartouche.

Dans le cas d'une détection des acides nucléiques cibles par l'intermédiaire d'une biopuce à fluorescence, il peut être avantageux que le substrat de la biopuce, susceptible de comprendre des substances fluorescentes immobilisées à sa surface qui absorbent la lumière à une première longueur d'onde d'excitation et qui émettent de la lumière à une deuxième longueur d'onde d'émission, comprenne des moyens permettant d'accroître le rendement de la quantité de lumière d'émission rapportée à la quantité de lumière d'excitation.

Selon un mode de réalisation, les moyens augmentant la quantité de lumière émise comprennent un miroir réfléchissant placé dans le substrat à une distance (d) de la face supérieure, cette distance (d) satisfaisant à la relation d;^/2NA2 ou <ηλ /2NA2.

Ces aspects ont notamment été décrits dans les documents WO 02/16912 A1 , WO 2007/045755 A1 et WO 2010/007233.

Enfin selon un mode particulièrement préféré de réalisation, la cartouche est jetable. En effet, l'invention permet de simplifier la conception de ladite cartouche. Ladite cartouche comprend un substrat rigide comportant deux faces opposées (susceptible d'être approximativement parallèles) à la surface desquelles sont formées des rainures et des cavités. La fonctionnalité des deux faces est strictement définie : toutes les vannes sont situées sur la même face dite face d'actuation des vannes. Selon un mode de réalisation, cette face comporte aussi tous les canaux fluidiques parallèles à cette dite face d'actuation.

La face d'actuation des vannes est fermée par une membrane déformable, qui remplit également un rôle de membrane déformable au niveau de sièges de vannes formés à la surface de la face d'actuation.

Le substrat est également percé par des trous traversant, perpendiculaires à la face d'actuation de la cartouche.

Ces canaux traversants remplissent les rôles de ports d'injection des fluides (et de l'échantillon) dans la cartouche et de ports d'évacuation des fluides hors de la cartouche, et de canaux d'accès à la biopuce.

La face biopuce comprend les orifices d'injections, et d'évacuations, éventuellement les canaux parallèles déportés des vannes en U et la chambre de détection, qui est susceptible d'accueillir une biopuce, du côté externe du substrat formant le corps principal de la cartouche. La biopuce remplit donc également le rôle de fermeture étanche de la chambre de détection.

Les canaux parallèles déportés peuvent être fermés par un élément de fermeture.

Cette cartouche est destinée à être insérée dans un au moins un automate pour assurer les fonctions de contrôle de la circulation fluidique, de cyclage thermique et de détection optique. Ces dispositifs, qui peuvent sans inconvénient être utilisés à de multiples reprises, peuvent être très complexes. La présente invention vise à fournir une cartouche, permettant de remplir l'ensemble des étapes d'analyse d'un échantillon biologique mais dont la conception est ultra-simplifiée de façon à obtenir un objet consommable robuste et dont les coûts de fabrication sont réduits. La description détaillée de modes de réalisation particuliers de l'invention sera faite en référence aux dessins dans lesquels :

La figure 1 a est une vue schématique de la face d'actuation de la cartouche selon un mode de réalisation comprenant des vannes en U.

Ce schéma illustre, le substrat formant le corps principal de la cartouche 1 , les canaux microfluidiques parallèles à la face d'actuation 2, des sièges de vannes en U 3, des orifices formés par les extrémités de trous traversant 4, des sièges de vannes d'injection ou d'évacuation fluidique 5, une chambre réactionnelle 6.

La figure 1 b est une vue schématique de la face de détection de la cartouche selon un mode de réalisation. Elle illustre notamment l'orifice d'injection de l'échantillon 7, des canaux fluidiques déporté des vannes en U 8, des éléments de fermetures des dits canaux 9, la chambre de détection 10, la biopuce 1 1 .

La figure 1 c est une vue schématique en coupe selon l'axe AA' de la cartouche selon un mode de réalisation. Elle illustre notamment, la membrane déformable recouvrant la face d'actuation de la cartouche 12, et les trous traversant 13.

La figure 1 d est une vue schématique en coupe selon l'axe BB' de la cartouche selon un mode de réalisation.

La figure 2a est une vue schématique de la face d'actuation de la cartouche selon un mode de réalisation différent du mode de réalisation de la figure 1 . Elle illustre notamment les sièges de vannes en ligne 14.

La figure 2b est une vue schématique de la face de détection de la cartouche.

La figure 2c est une vue schématique en coupe selon l'axe AA' de la cartouche selon un mode de réalisation.

La figure 2d est une vue schématique en coupe selon l'axe BB' de la cartouche.

Les figure 3a et 3b sont des vues schématiques en coupe selon l'axe BB' de la cartouche selon les modes de réalisation respectivement des figures 1 et 2, illustrant la déformation de la membrane en regard des sièges de vannes.

La figure 4a est une vue schématique en coupe longitudinale d'un dispositif d'accueil 17 de la cartouche (substrat formant le corps principal de la cartouche, 1 ) et permettant le contrôle de l'actuation, 18 des vannes à partir de la face d'actuation 16 de ladite cartouche et l'injection fluidique 19 à partir de la face de détection 15 de ladite cartouche.

La figure 4b est une coupe transversale de la biopuce réalisée selon l'axe CC, illustré dans l'encart sur la gauche. Elle représente la cartouche (et la biopuce) reposant sur un dispositif d'imagerie de contact 20 et formant un biocapteur intégré 21 .

La cartouche, selon la présente invention, est adaptée à la réalisation de diagnostics moléculaires par voie génétique, permettant la détection de marqueurs moléculaires cibles à partir d'un échantillon biologique. Elle est ainsi susceptible de mettre en œuvre après chargement de l'échantillon, l'ensemble des étapes de la chaîne d'analyse.

Ces étapes comportent des étapes de préparation de l'échantillon et de reconnaissance biomoléculaire.

- La préparation de l'échantillon peut notamment inclure, suivant les méthodes, des étapes de lyse cellulaire, d'extraction d'acides nucléique d'amplification de certains des acides nucléiques, de digestion enzymatique.

- La reconnaissance biomoléculaire comprend la liaison entre les molécules sondes et les molécules cibles et l'identification de ladite liaison.

La cartouche selon la présente invention comporte :

- Un substrat formant le corps principal 1 de la cartouche comportant une face d'actuation 16 exemplifiée dans la figure 1 a, et une face de détection 15 exemplifiée dans la figure 1 b, qui est lui est opposée.

- Un circuit fluidique comportant un ensemble de canaux 2 et de cavités, réalisés dans le substrat formant le corps principal 1 de la cartouche. Lesdites cavités étant susceptibles de former la ou les chambre(s) réactionnelle(s) 6 ainsi que la chambre de détection 10. Par chambre de détection 1 0 il est ici entendu, qu'il s'agit d'une chambre ou d'une zone permettant la mise en œuvre de processus de reconnaissance biomoléculaire.

- Un ensemble de vannes microfluidiques qui contrôlent : l'écoulement de fluide au sein d'un même canal 2 formé au voisinage de la face d'actuation 16 de la cartouche fluidique, ainsi que les entrées (injection) et sorties (évacuation) de fluides dans et hors de la cartouche. A cet effet des vannes en « U » ou « en ligne » sont susceptibles d'être employées suivant le mode de réalisation.

La cartouche comporte deux faces opposées, dont les fonctionnalités sont clairement séparées :

- La face dite d'actuation 16 comporte les sièges des vannes intégrées 3, 5 et 14, la ou les chambre(s) réactionnelle(s) 6 ainsi que les canaux microfluidiques 2 les reliant.

- La face opposée, dite face de détection 15, comporte la chambre de détection 10. L'accès à la chambre de détection 10 est réalisé par des trous traversant 13 le corps principal 1 de la cartouche.

L'injection fluidique est réalisée à partir de la face de détection 15. L'accès au circuit fluidique de la face d'actuation 16 est réalisé par des trous traversant 13 le substrat rigide formant le corps principal 1 de la cartouche, perpendiculairement à la face d'actuation 16 et de détection 15. L'extrémité de ces trous traversant 13, forme des orifices 4 débouchant sur les faces de détection 15 ou d'actuation 16 de la cartouche. L'invention sera mieux comprise et d'autres caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement à la lecture de la description des modes de réalisation proposés à titre illustratif.

Selon un mode de réalisation préféré, la cartouche comporte quatre parties assemblées :

Ce mode de réalisation particulier est décrit en référence aux figures 1 et 3a.

a. Un corps principal, formé dans un substrat 1 rigide et comportant deux faces opposées. : la face d'actuation 16 (Fig.l a) et la face de détection 15(Fig.1 b), ces deux faces étant approximativement parallèles.

Le corps principal 1 de la cartouche est formé dans un substrat rigide. Ce corps principal 1 peut avantageusement être réalisé par moulage par injection d'un matériau polymère thermoplastique comme les copolymères d'oléfines cyclique (COC) ou les polymères d'oléfines cycliques (COP). Les COC et COP sont des matériaux amorphes et transparents basés sur des oléfines cycliques, dont la biocompatibilité est excellente.

De manière générale, ces matériaux doivent être biocompatibles, transparents et doivent permettre la réalisation d'une liaison étanche avec une membrane et/ou des patchs adhésifs. Ils peuvent notamment être choisis dans le groupe comprenant le polydiméthyl-siloxane (PDMS), le polyméthyl-méthacrylate (PMMA), le polycarbonate, le polyacrylamide, le polyéthylène, le polychlorure de vinyle (PVC).

De façon préférée, les dimensions de la cartouche sont approximativement en longueur et en largeur, celles d'une lame de microscope, soit des dimensions comprises entre 65 et 85 mm de long et 20 et 35 mm de large. L'épaisseur de la cartouche est préférentiellement comprise entre approximativement 1 et 2 mm.

La face d'actuation 16 de la cartouche comporte un certain nombre de renfoncements formés à la surface du substrat rigide. Ces renfoncements définissent les sièges des vannes 3, 5 et 14, la chambre réactionnelle d'amplification 6 et les canaux fluidiques 2 les reliant.

Les canaux fluidiques 2 reliant les différents éléments sont parallèles à la face d'actuation des vannes de la cartouche et avantageusement, sont tous situés sur cette même face. Ces canaux fluidiques 2 parallèles à la face d'actuation 16 sont formés par des rainures, dont la taille est approximativement de 0.5 mm de largeur et de 0.3 mm de profondeur, formées à la surface de la face d'actuation 16 de la cartouche. Ces rainures sont fermées par la membrane monolithique 12.

Avantageusement également, les sièges de vannes 3, 5 et 14 sont formés par un renfoncement cylindrique, dont le diamètre est approximativement de 4 mm et la profondeur de 0.1 mm, réalisé à la surface de la face d'actuation 16 du corps principal 1 de la cartouche formé dans un substrat rigide. Ce renfoncement comporte un orifice d'entrée et un orifice de sortie. Ces orifices correspondent à une extrémité de canal fluidique 2 parallèle à la face d'actuation et à l'extrémité ou orifice 4 d'un trou traversant 13 perpendiculairement la cartouche.

La face d'actuation 16 de la cartouche comporte également une chambre d'amplification 6 des acides nucléiques. Cette chambre réactionnelle d'amplification 6 est définie par un renfoncement affleurant la surface de la face d'actuation 16 de la cartouche, de forme quasi rectangulaire, réalisé à la surface de la face d'actuation 16 de la cartouche. La taille de cette chambre d'amplification 6 est de l'ordre de 6 mm ^χ 4 mm x 0.5 mm. Sa contenance est approximativement de 10 μί. La chambre réactionnelle est en général reliée par deux canaux microfluidiques 2, parallèles à la face d'actuation 16 et affleurant ladite face 16.

L'amplification des acides nucléiques permet de multiplier la quantité d'acides nucléique d'un facteur 10 ⁶ à 10 ⁸ . Il est ainsi possible de détecter dans des acides nucléiques cibles présents en quantité infime (inférieure à 10 molécules cibles d'acides nucléiques, en théorie 1 seule copie suffit) dans l'échantillon de départ. Ce cyclage thermique est favorisé dans le cadre d'un microsystème comme la cartouche de la présente invention, par les faibles volumes réactionnels mis en jeu. Il est possible de déplacer le mélange réactionnel entre différentes zones de températures, de manière circulaire ou en flux continu. Dans le mode de réalisation présentement décrit l'amplification est réalisée au moyen d'une réaction de PCR (acronyme anglais de Polymerase Chain Reaction) au sein de la chambre réactionnelle 6, qui peut être isolée physiquement et cyclée en température. Cette technique requiert de cycler thermiquement (généralement entre 50 et 95 °C) un mélange réactionnel. La cartouche selon la présente invention est préférentiellement destinée à la détection en parallèle, de la présence de plusieurs marqueurs moléculaires (au moins 2 cibles) au sein d'un échantillon biologique. Le choix d'une amplification multiplexe permet alors de réaliser dans une seule chambre réactionnelle, l'amplification de plusieurs molécules cibles d'acides nucléiques. b. Une membrane monolithique 12 recouvrant la face d'actuation 16 de la cartouche.

La membrane 12 recouvre la face d'actuation 16 de la cartouche. Cette membrane monolithique 12 est préférentiellement réalisée dans un matériau similaire au substrat rigide formant le corps principal 1 de la cartouche. Préférentiellement la membrane 12 est un film thermoplastique d'environ 0.1 mm d'épaisseur, collé ou soudé à la surface de la face d'actuation 16 du substrat rigide formant le corps principal 1 de la cartouche, par des procédés de thermo-soudage, de collage, d'adhésion ou de liaison chimique. Cette membrane 12 ferme ladite face d'actuation 16 et permet l'étanchéité du circuit microfluidique. Elle coopère avec les rainures et la cavité formée par un renfoncement, pour former les canaux et fermer la chambre réactionnelle 6. Avantageusement, la membrane 12 est susceptible non seulement de résister à la chaleur mais aussi de la transmettre. Il est donc possible d'envisager qu'un système de chauffage soit placé directement en regard de la zone ou la chambre d'amplification 6 des acides nucléiques, lorsque la cartouche est placée dans un automate 17 de contrôle des fonctions fluidique, 18 et 19 et thermique.

Plus avantageusement encore, la membrane 12 est déformable. Elle coopère ainsi avec les sièges de vannes 3,5 et 14, réalisés à la surface de la face d'actuation 16 de la cartouche, pour former des vannes à membrane au niveau de ces dits sièges de vannes 3,5 et 14. Au repos, la membrane 12 est approximativement plane et parallèle à la face d'actuation 16 sur laquelle elle est collée ou thermo-soudée. Les vannes sont donc ouvertes au repos. L'actuation de ces vannes à membrane est avantageusement réalisée par des dispositifs d'actuation, externes à la cartouche, qui permettent de déformer la membrane 12 en regard de chaque siège de vanne 3,5 et 14 et d'obturer les vannes.

Le renfoncement formant le siège de vanne 3, et 5 est interposé entre un trou traversant 13 la cartouche perpendiculairement à la face d'actuation 16, qui débouche en son centre et forme un orifice 4 et un canal parallèle 2 à la face d'actuation 16 et affleurant la surface du substrat rigide du côté de ladite face 16. Ce dessin de vanne est utilisé de façon similaire pour les vannes contrôlant l'entrée et la sortie de fluide dans et hors de la cartouche et les vannes contrôlant de façon binaire l'écoulement au sein d'un même canal parallèle à la face d'actuation 16. Ces dernières vannes sont appelées « vannes en U ».

La déflection de la membrane 12 en regard du siège de vanne permet l'obturation de l'orifice 4 formé par le trou traversant 13, dont le diamètre est bien inférieur au renfoncement formé par le siège de vanne 3 et 5. Ce dispositif permet de réaliser une obturation maximale de la cartouche tout en employant une membrane monolithique 12 présentant une certaine rigidité.

Les accès au circuit fluidique, formé sur la face d'actuation 16 de la cartouche, sont réalisés à partir de la face de détection 15, par des trous traversants 13. La déflection de la membrane 12 en regard des sièges de vanne 3 ou 5 permet l'obturation des orifices 4, formés par les extrémités des trous traversant 13 débouchant au centre des sièges de vanne 3 et 5, et stoppe ainsi l'entrée et la sortie de fluide dans et hors de la cartouche.

Dans le cas des vannes en U, le canal parallèle 2 à la face d'actuation 16 des vannes est déporté sur la face de détection 15 au moyen d'un trou traversant, forme un canal parallèle déporté 8 sur la face de détection 15 de la biopuce puis est réinjecté dans la face d'actuation 16 au moyen d'un trou traversant 13 débouchant par un orifice 4 au centre d'un siège de vanne 3 ou 5. c. Des éléments de fermetures 9 coopérant avec des rainures, réalisées sur la surface de la face de détection, pour former les canaux parallèles déportés 8 dans le cadre des « vannes en U ».

Les canaux parallèles déportés 8 sont formés par des rainures réalisées à la surface du substrat rigide, formant le corps principal 1 de la cartouche, du côté de la face de détection 16. La cartouche comporte donc des éléments de fermeture 9, préférentiellement des pastilles (patchs) adhésives, pour fermer ces canaux 8 et réaliser leur étanchéité. d. Une biopuce 1 1 fermant la chambre de détection 10 permettant la mise en œuvre de processus d'hybridation moléculaire.

La chambre de détection 10 consiste en un renfoncement formé à la surface du substrat rigide, du côté de la face opposée 15 à la face d'actuation 16. Les dimensions de ce renfoncement sont de l'ordre de 24 mm ^χ 24 mm ^χ 0.5 mm.

La chambre de détection 10 intègre une biopuce 1 1 . Cette biopuce 1 1 est avantageusement collée sur la chambre de détection 10, du côté externe du substrat formant le corps principal 1 de la cartouche, par l'intermédiaire d'un siège de biopuce (rebord ou décroché formé dans le renfoncement, du côté externe du substrat). Elle ferme ainsi le renfoncement formant la chambre de détection 10 et permet l'étanchéité de ladite chambre.

La biopuce 1 1 comporte essentiellement un substrat solide, approximativement plat, par exemple une lame en verre, en silicium, ou en plastique dont la taille est approximativement de 24 mm ^χ 24 mm ^χ 0.1 mm.

La surface de ce substrat est fonctionnalisée chimiquement par des techniques bien connues de l'homme du métier de type silanisation ou par un dépôt de nitrocellulose, polylysine, streptavidine, biotine, polypyrol. La dite surface porte après réaction, des sondes oligonucléotidiques immobilisées. La fixation des sondes peut être effectuée de différentes manières bien connues de l'homme du métier. On citera par exemple, l'adressage par voie chimique, électrochimique ou l'adressage basé sur la technologie des jets d'encre, mise en œuvre dans les imprimantes. Les sondes sont déposées suivant une grille régulière, par des gouttes (spots) dont le diamètre est compris entre 10 et 1000 μιτι, préférentiellement 300μιτι. Chaque goutte correspond ainsi à une zone affine spécifique à étudier. L'accrochage des molécules cibles est alors spatialement sélectif et réalise une reconnaissance moléculaire des molécules cibles, par la connaissance a priori de la composition des molécules sondes sur lesquelles elles se sont accrochées.

L'accès à la face de détection 15 est réalisé à partir de la face d'actuation 16, par un trou traversant 13 perpendiculairement le substrat rigide à partir de la face d'actuation 16 et formant un orifice 4 au niveau de la chambre 10. La chambre de détection 10 selon ce mode de réalisation comporte aussi une évacuation permettant de réaliser les étapes de lavage. Ladite évacuation est formée par un orifice 4 débouchant dans ladite chambre et formant l'extrémité d'un canal traversant 13 et rejoignant un canal parallèle 2 sur la face d'actuation 16. Ce canal parallèle 2 est ensuite réinjecté dans la face de détection 15 par un trou traversant 13 pour évacuation.

Dans un deuxième mode de réalisation, la cartouche comporte trois parties assemblées :

a. un corps principal formé dans un substrat 1 rigide et comportant deux faces approximativement parallèles (par « parallèle » est entendu, dans le cadre de la présente invention, « approximativement parallèle »), la face d'actuation 16 et la face de détection 15.

b. une membrane 12 recouvrant la face d'actuation 16 de la cartouche.

c. Une biopuce 1 1 fermant la chambre de détection 10 et permettant la mise en œuvre de processus d'hybridation moléculaire.

Selon ce mode de réalisation, le corps principal 1 de la cartouche, formé en un substrat rigide, comporte deux types de vannes:

• les vannes contrôlant l'entrée ou la sortie de fluide dans ou hors de la cartouche,

• les vannes en ligne pour le contrôle binaire de l'écoulement au sein d'un canal.

Le premier type de vanne est formé selon le principe tel que précédemment décrit. Ces vannes sont notamment formées par un siège 5 de vanne, au centre duquel débouche un orifice 4 formé par un trou traversant 13. Le siège de vanne 5 consiste en un renfoncement cylindrique effectué à la surface du substrat rigide du côté de la face d'actuation 16.

Les vannes en ligne permettent le contrôle binaire de l'écoulement au sein d'un canal fluidique 2, Les canaux fluidiques 2 sont similaires à ceux évoqués précédemment. Ils sont formés par des rainures réalisées parallèlement à la surface du substrat 1 rigide du côté de la face d'actuation 16 de la cartouche et sont fermés par la membrane monolithique 12.

Le canal fluidique 2 est interrompu par un siège de vanne 14 en regard duquel la membrane 12 peut être déformée pour interrompre la circulation de fluide. Ledit siège de vanne 14 est un renfoncement cylindrique effectué à la surface du substrat rigide du côté de la face d'actuation 16 de la cartouche et dont les dimensions sont approximativement 4 mm de diamètre et 0.1 mm d'épaisseur.

Selon ce deuxième mode de réalisation la conception de la cartouche est extrêmement simplifiée puisqu'elle ne comprend que 3 éléments assemblés. L'ensemble des canaux microfluidiques 2 est localisé sur la face d'actuation 16, à partir de laquelle le contrôle de l'écoulement des fluides peut être réalisé par un ou des dispositifs d'actionnement externe. La membrane monolithique 12 qui recouvre ladite face d'actuation 16 est à l'interface entre le microcircuit fluidique et le ou les dispositif(s) de contrôle des fonctions de la cartouche et d'accueil 17 de ladite cartouche. Ces fonctions incluent notamment le contrôle de l'écoulement fluidique (contrôle de l'actuation 18 des vannes intégrées de la cartouche et l'injection fluidique 19) et le contrôle de la température des chambres ou zones réactionnelles.

Cette simplicité contribue également à la robustesse de l'objet qui peut être soit jeté après chaque utilisation, comme nécessairement dans le cadre de tests diagnostic chez l'homme, soit être réutilisé après lavage.

La détection de la reconnaissance biomoléculaire est réalisée par lecture optique de la lumière émise lors de la fixation de la molécule cible sur la sonde directement ou indirectement après excitation par une lumière appropriée. La présente cartouche présente deux faces fonctionnellement différenciées : une face d'actuation 16 et une face de détection 15.

Préférentiellement, la face de détection est située sur la face inférieure de la cartouche, de sorte que ladite cartouche est apte à être lue par un dispositif de lecture de la fluorescence de type imagerie de contact 20, l'ensemble formant un biocapteur intégré 21 . Ces aspects sont illustrés par la figure 4b.

Suivant ce mode de réalisation, la cartouche peut alors être mise au contact, par l'intermédiaire de sa face de détection 15, d'un détecteur de fluorescence 20, par exemple un imageur de type matrice de photodétecteur CCD ou CMOS.

L'ensemble cartouche et dispositif de lecture de la fluorescence forme alors un biocapteur intégré extrêmement compact.

En outre, ce dispositif permet de maximiser la collecte de l'émission lumineuse des fluorophores, la lumière émise étant directement captée vers le milieu d'indice le plus élevé, soit vers l'intérieur du substrat de la biopuce.

Avantageusement le substrat de la biopuce 1 1 est alors au moins partiellement transparent à la longueur d'onde d'émission de fluorophores employés. Il peut s'avérer utile de s'affranchir de la lumière d'excitation des chromophores par l'utilisation de filtres interférentiels ou d'autres types comme les filtres colorés, ou une combinaison de filtres de différents types fortement réjecteurs de la lumière d'excitation (d'une valeur typiquement inférieure à 10 ^"4 et si possible inférieure à 10 ^"5 ), tout en assurant une fenêtre de transmission pour le rayonnement des fluorophores.

D'une façon générale, il est souhaitable, pour augmenter l'efficacité de collecte de la lumière émise par les chromophores, d'utiliser des substrats ayant des indices de réfraction le plus élevé possible (comme c'est le cas d'un empilement de couches diélectriques du type miroir de Bragg), cela d'autant plus que les mesures sont effectuées en phase liquide car l'indice de réfraction du milieu est alors de l'ordre de 1 .3.

Selon les lois de l'optique ondulatoire, il est également possible de créer une double résonance de manière à obtenir un renforcement de la lumière collectée et de l'excitation. La première résonance concerne la longueur d'onde d'émission et la seconde la longueur d'onde d'excitation. Cette double résonance s'obtient par une détermination de la coïncidence des ventres du champ électrique pour les deux longueurs d'ondes d'émission et d'excitation.

Un filtre interférentiel (de type miroir de Bragg) ou un filtre de réjection de la longueur d'onde d'excitation des fluorophores, transparent à la longueur d'onde d'émission des fluorophores peut être interposé entre le substrat et le capteur ou directement constituer le substrat. Avantageusement ce filtre comprend un filtre absorbant ou un filtre réfléchissant ou une combinaison de filtres absorbant et réfléchissant, notamment comme décrit dans la demande antérieure WO 2007/04575, incorporée ici par référence. Ces filtres permettent de bénéficier d'une amplification de la lumière d'excitation des marqueurs par un effet d'interférence constructive et également d'une amplification de la lumière émise par les marqueurs. Ces filtres sont également fortement réjecteurs de la lumière d'excitation (d'une valeur typiquement inférieure à 10 ^"4 et si possible inférieure à 1 0 ^"5 ), tout en assurant une fenêtre de transmission pour le rayonnement des chromophores. En pratique, le rapport des transmittances des longueurs d'onde d'émission et d'excitation des marqueurs est d'au moins 10 ⁵ . Un moyen réfléchissant ou miroir dit « proche » placé à une distance (d) des chromophores telle que ledit réflecteur assure un effet d'interférence permettant une amplification de la collecte de la lumière émise dans le support (d vérifiant la relation : d < ηλ/2ΝΑ2, où NA est l'ouverte numérique de l'objectif de collecte de la lumière émise par les chromophores selon la longueur d'onde (λ) et « n » est l'indice du milieu entre le miroir et les chromophores), et couplé à des ondes excitatrices parvenant sur les chromophores sous une incidence quelconque par rapport à la normale au support. Une incidence non nulle assure en complément un renforcement de l'excitation lorsqu'il existe une double résonance, c'est à dire une coïncidence des ventres du champ pour les deux longueurs d'onde d'excitation ( exc) et d'émission ( émis). La détection demeure centrée sur la normale au support.

De telles variantes de la composition du substrat de la biopuce 1 1 sont également décrites dans la demande WO 201 0/000757, incorporée ici par référence.

La biopuce 1 1 peut également intégrer des structures produisant des ondes guidées possédant une partie évanescente, pour exciter des fluorophores susceptibles d'être immobilisés sur un substrat de biopuce. Les biopuces à excitation par onde évanescente sont particulièrement intéressantes dans d'un système de collecte de l'image de fluorescence par contact, où l'on cherche à éviter l'illumination directe du capteur 20 (que l'on doit alors protéger par un filtre sélectif en longueur d'onde éliminant la lumière d'excitation). Les ondes évanescentes permettent ainsi d'éviter d'exciter tout élément, sur le chemin optique, qui peut augmenter le fond de fluorescence.

On peut utiliser, comme source des ondes guidées, l'émission de fluorescence ou l'injection par la tranche ou tout autre moyen de coupler la lumière d'excitation dans la biopuce 1 1 . De tels moyens d'excitation des fluorophores sont notamment décrits dans la demande WO 02/16912 A1 , incorporée par référence. Pour cela, le substrat de la biopuce peut comporter une couche guidante ayant un indice plus élevé que celui de la couche environnante et dont la face supérieure est très proche des chromophores à l'échelle de la longueur d'onde d'évanescence de l'onde guidée.

La cartouche selon la présente invention permet notamment de mettre en œuvre le procédé suivant dans lequel, la réalisation de l'analyse peut être constituée d'une succession d'opérations d'extraction, de purification, d'amplification d'hybridation et de détection.

a. Après collection de l'échantillon, celui-ci est susceptible d'être soumis à une étape de lyse à l'extérieur du système, par exemple grâce à une solution de lyse à laquelle sont ajoutée des billes magnétiques qui fixent les acides nucléiques. Pour mettre en œuvre les étapes suivantes de l'analyse, qui se réalisent au sein de la cartouche, ladite cartouche doit être insérée dans un ou des dispositif(s) d'accueil 17 et20 de la cartouche, permettant notamment le contrôle de l'injection et de la circulation fluidique 17 et le contrôle thermique des chambres d'amplification et d'hybridation ainsi que la lecture optique 20.

Il est possible de se référer à titre d'illustration pour les étapes suivantes, à la figure 1 a ou 2a, dans laquelle les vannes A et D et E et H sont des vannes permettant le contrôle binaire de l'écoulement de fluide au sein d'un canal parallèle.

La vanne B/F est une vanne permettant l'injection fluidique dans la cartouche.

La vanne C/G est une vanne permettant l'écoulement de fluides hors de la cartouche.

b. L'échantillon lysé est alors injecté dans la cartouche au travers d'un orifice d'injection 7 de l'échantillon. Les vannes A/E et C/G étant ouvertes et les vannes B/F et D/H étant fermées.

c. Dans le cas d'une extraction des acides nucléiques par billes magnétiques, un aimant placé dans le dispositif d'accueil de la cartouche, en regard de la zone d'extraction de l'ADN, permet de retenir les billes magnétiques.

d. Différents lavages sont alors appliqués, pendant lesquels seules les vannes B/F et C/G permettant l'injection fluidique et l'écoulement de fluide hors de la cartouche sont ouvertes. e. Le mélange réactionnel est injecté. Une amplification multiplexée est réalisée dans la chambre d'amplification 6, laquelle est soumise à un cyclage thermique. Au cours de cette opération, l'ensemble des vannes est fermé, afin d'isoler la chambre 6 de l'extérieur.

f. Une fois cette PCR réalisée, le contenu de la chambre 6 est transféré dans la chambre d'hybridation 10 par l'ouverture des vannes concernées. Pour ce faire un fluide est injecté au travers de la vanne B/F, afin de pousser le mélange amplifié, et la vanne D/H est ouverte afin de permettre le transfert vers la chambre de détection 10.

g. Au cours de la procédure d'hybridation, les molécules cibles s'hybrident aux sondes déposées sur la biopuce 1 1 . Cette réaction peut être accélérée par une agitation d'avant en arrière contrôlée par le dispositif d'accueil de la cartouche. Toutes les vannes sont fermées. A noter que l'orifice 4 d'évacuation des fluides hors de la cartouche microfluidique n'est pas contrôlé par une vanne. Selon les principes d'écoulement des fluides dans des circuits microfluidiques, la fermeture de la vanne D en amont de la chambre de détection permet de bloquer l'écoulement hors de ladite chambre de détection 10. A la fin de cette étape (ou au cours de celle-ci), la détection par excitation/collection a lieu, afin de révéler quelles cibles ont été hybridées.

h. La biopuce 1 1 est susceptible d'être lavée et de subir des étapes de révélation, avant détection, les vannes B/F et D/G sont alors ouvertes.

Ainsi la cartouche permet la mise en œuvre simplifiée d'un procédé complet de diagnostic moléculaire dans des conditions économiques optimisées.