Mikrofluidische Chips mit hydrophilen Kanaloberflächen werden in der Mikroflui- dik und insbesondere in der Mikrochip-Elektrophorese benötigt, um effiziente Analysen adsorptiver Verbindungen wie Proteine, ohne störende Analyt/Wand- Wechselwirkungen zu ermöglichen. Hierzu werden mikrofluidische Strukturen in strukturierbare Polymere erzeugt, weiche sich nach Oberflächenbehandlung zu stark hydrophilen Materialien umsetzen lassen.

Die Miniaturisierung chemischer Analysensysteme ist seit langem bekannt. Sie hat zum Ziel ein integriertes miniaturisiertes Analysensystem zu entwickeln, bei dem unterschiedliche Arbeitsvorgänge wie Probenvorbereitung, chemische Re- aktion/Derivatisierung, Auftrennung und Detektion auf einem Mikrochip integriert sind. In diesem Zusammenhang wird auch oft das Schlagwort"lab-on-a-chip "benutzt. Als besonders Erfolg versprechend hat sich die Miniaturisierung der Elektrophorese auf einem Mikrochip erwiesen. Mikrofluidische Chips werden als besonders aussichtsreiche Systeme zur elektrophoretischen Auftrennung kom- plexer Proteingemische für die Proteomforschung angesehen, bisher wird dies jedoch durch die adsorptiver Eigenschaften der Chipmaterialen erschwert.

Das zunächst bevorzugte Material zur Herstellung mikrofluidischer Systeme war Silizium wegen der vielfältigen Anwendbarkeit etablierter Strukturierungsmetho- den aus der Mikroelektronik. Für die Mikrochip-Elektrophorese (MCE) ist Silizi- um, wegen seiner mangelhaften optischen Transparenz und der Halbleiter- Eigenschaften, jedoch weniger gut geeignet. Einige etabliert Fabrikationstech- niken für Silizium lassen sich auch auf Glas oder Quarz übertragen, welches derzeit das bevorzugte Material für die MCE ist. Dies ist in den günstigen physi- kalisch-chemischen Eigenschaften, wie optische Transparenz, mechanische Stabilität, chemische Resistenz, elektrische Durchschlagfestigkeit und hohe opti- sche Transparenz, von Glas und insbesondere hochreinem synthetischem Quarz (fused silica) begründet. Ein Nachteil der Glaschips ist jedoch ihr relativ aufwen- diger Fertigungsprozess unter Reinraumbedingungen, bei dem zunächst photoli- thographisch eine Struktur übertragen wird, welche dann durch nasschemisches Ätzen mit Flusssäure entwickelt wird.

Eine insbesondere für die Proteinanalytik störende Eigenschaft von Glas und Quarz ist die Adsorptivität der Oberflächen. Zur Unterdrückung störender Ana- lyt/Wandwechselwirkungen sind in der klassischen Kapillarelektrophorese (CE) Methoden zur Oberflächenbeschichtung entwickelt worden. Als besonders ge- eignete Beschichtungsmaterialien haben sich hier hydrophile Polymere und ins- besondere Polyvinylalkohol erwiesen. Es sind auch Oberflächenbeschichtungen für mikrofluidische Chips bekannt, um deren Oberflächeneigenschaften zu verbessern.

Eine Alternative zu Glass als Material zur Herstellung mikrofluidischer Chips werden auch zunehmend Kunststoffe untersucht und eingesetzt. Gegenüber Glaschips können Kunststoffchips durch Anwendung von unterschiedlichen Replikationstechniken, wie z. B. Heißprägen, Mikro-Spritzguß oder Soft- lithographie deutlich günstiger, auch in großer Stückzahl hergestellt werden.

Wie bei Glas werden jedoch auch an vielen Kunststoffoberflächen störende Ad- sorptions-Effekte beobachtet. Zum Einsatz in der MCE werden daher auch Po- lymerchips aus Materialien wie Polydimethylsiloxan (PDMS), Polymethylmetacry- lat (PMMA), Polycarbonat oder Zeonex oft einer aufwendigen Nachbehand- lung/Beschichtung unterzogen werden.

Da die Adsorption von Proteinen an hydrophilen Polymeroberflächen minimiert ist, sollten hydrophile Polymere besonders geeignete Materialien zur Herstellung mikrofluidischer Systeme sein. Bisher werden jedoch fast ausschließlich relativ hydrophobe Materialien eingesetzt.

Der vorliegenden Erfindung lag demgemäß die Aufgabe zugrunde ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit welchem es möglich ist, Trägermaterialien mit einer Oberflächenstruktur zur Verfügung zu stellen, die eine geringe Adsorption ge- genüber Proteinen zeigt und z. B. in der Mikrochip-Elektrophorese eingesetzt werden kann.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demgemäß ein Verfahren zur Her- stellung mikrofluidischer Chips aus Polymermaterial als Träger, worin ein Poly- mermaterial zu einem Chip verarbeitet wird oder ein Trägermaterial damit be- schichtet wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymermaterial ausgewählt ist einem ein hydrophilen Polymer oder einem Derivat davon oder ein hydrophiles Polymer oder einem Derivat enthält.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können polymere mikrofluidische Chips mit hydrophilen Oberflächen erhalten werden, die eine bessere Auflösung z. B. in der Elektrophorese ermöglichen. In vielen Fällen können die mikrofluiden Chips unmittelbar aus dem Polymermaterial hergestellt werden. Aber auch Beschich- tungen sind möglich, wobei die hydrophile Oberfläche auf einfache Weise erhal- ten werden kann.

Die Herstellung der mikrofluidischen Chips kann auf verschiedene Weise erfol- gen. Werden die Polymermaterialien selbst als Träger eingesetzt, so können diese aus deren Lösungen erhalten werden, indem die Lösung des Polymers in Form gegossen und das Lösungsmittel anschließend entfernt wird. Es ist auch möglich, die Form aus der Polymerschmelze zu gießen oder ein Polymergranulat in einer geeigneten Form auf zu schmelzen. Eine Mikrostrukturierung kann direkt während der Herstellung, z. B. während des Spritzgussverfahrens, erfolgen, oder durch Heißprägen oder Softlithographie.

In Fällen, in denen Trägermaterialien mit höherer Festigkeit benötigt werden, wie z. B. Glas, ist es auch möglich, diese mit dem hydrophilen Polymer oder einem Derivat davon zu beschichten.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden als Polymermaterialien Derivate eines hydrophilen Polymers eingesetzt. Diese werden durch eine nachfolgende Reaktion an der Oberfläche in ein hydrophiles Polymer überführt.

Als hydrophile Polymere eignen sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung solche, die über wasserunlösliche Derivate verfügen und aus diesen Derivaten auf möglichst einfache Weise in ihre hydrophile, d. h. wasserlösliche Form, über- führt werden können. Ein besonders geeignetes hydrophiles Polymer ist Polyvi- nylalkohol, dessen Derivate, wie Polyvinylester, Polyvinylacetale, wie Polyvinylbutyral, und Polyvinylacetate besonders bevorzugt eingesetzt werden.

Als besonders geeignet erscheint hier Polyvinylalkohol, welches ein ausgezeich- netes Material zur Beschichtung von Quarzkapillaren für die Proteinanalytik in der klassischen Kapillarelektrophorese darstellt. Wegen seiner Wasserlöslichkeit ist Polyvinylalkohol selbst jedoch als Ausgangsmaterial ungeeignet.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird durch Umsetzung, vorzugsweise durch Hydrolyse, des Derivats des hydrophilen Poly- mers an der Oberfläche des Chips in ein hydrophiles Polymer überführt. In dieser Ausführungsform wird ein mikrostrukturierter Chip mit hydrophiler Oberfläche erhalten. Der Grad der Umwandlung und somit die Hydrophilie an der Oberfläche kann z B. durch Menge und Einwirkungszeit des Hydrolysereagenz eingestellt werden. Zur Umwandlung des Derivats in das hydrophile Polymer kann die Ober- fläche des Derivats zum Beispiel mit einer geeigneten Reagenzlösung gespült oder besprüht werden. Als Reagenziösung für die Hydrolyse hat sich eine wäs- serige Lösung eines Alkalimetallhydroxyids, NaOH, KOH oder LiOH, oder Alka- limetallalkoholats, wie Na-, K-oder Li-Methanolat,-Ethanolat,-Propanolat oder- Butanolat, als geeignet erwiesen.

Gemäß einer besonders bevorzugten Form des Verfahrens werden Polyvinyles- ter und insbesondere Polyvinylacetat (PVAc) als Material zur Mikrostrukturierung ausgewählt, welches sich durch einfache Hydrolyse entsprechend Reaktionsglei- chung 1 in hydrophiles Polyvinylalkohol (PVAI) überführen lässt.

Gleichung 1 Polyvinylacetat ist ein wichtiger Grundstoff für die Farben und Klebstoffindustrie.

Zur Verwendung von Polyvinylacetat als Werkstoff und insbesondere zur Mikro- strukturierung ist jedoch wenig bekannt. So ist im Saechtling Kunststoff Ta- schenbuch zu lesen"PVAc (... ) sind glasklare, weiche bis harte Harze, die man- gels ausreichender Temperaturbeständigkeit für Formmassen nicht geeignet sind, aber in den meisten Lösungsmitteln (... ) gut löslich sind [Karl Oberbach : "Saechtling Kunststoff Taschenbuch", 28. Ausgabe, Carl Hanser Verlag, Mün- chen, Wien, 2001, S. 460].

In einer möglichen Ausführungsform wird die Mikrostrukturierung des Derivats, beispielsweise von Polyvinylazetat aus der Lösung durchgeführt.

Zur Verarbeitung beispielsweise von Polyvinylacetat (PVAc) als Ausgangsmate- rials aus der Lösung werden Lösungen von PVAc in Ethylacetat auf einen 4"Si- Formeinsatz gegossen. Nach Trocknen wird ein lederartig, zäher Film abgezo- gen, welcher die gewünschten Strukturen aufweist. Zur Herstellung einer funkti- onsfähigen geschlossenen mikrofluidischen Struktur wird ein Deckel mit Zu- gangslöchern entsprechend Abb. 1 benötigt. Das Deckeln der Struktur mit analog aus Lösung prozessierten Substraten gelingt leicht da sich die Schichten spon- tan miteinander durch Kontakt verbinden. Allerdings ist die fluidische Kontaktie- rung schwierig, da die flexible und weiche Konsistenz des Materials ein mechani- sches Bohren erschwert.

In einer bevorzugten Variante dieser Ausführungsform der Erfindung werden zur Lösung dieses Problems Deckel hergestellt, indem nicht von einer Lösung aus- gegangen wird, sondern das PVAC Material auf einer Heißpresse gepresst wur- de. Diese Deckel weisen eine ausreichende Festigkeit auf, um die Zugangslö- cher durch Bohren herzustellen. Nach diesem Verfahren gelingt es leicht mikrofluidische Chips aus Polyvinylazetat herzustellen. Diese Chips bestehen aus einer flexiblen mikrostrukturierten PVAC Schicht mit einem starren aus PVAC gepressten Deckel. Ein Photo eines solchen 2-Komponenten PVAc-Chips ist in Abb. 2 gezeigt. Eine mikroskopische Aufnahme des Kreuzungsbereiches mit den 50 um breiten Kanälen ist in Abb. 3 dargestellt Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind mikrofluidische Chips mit hydrophiler Oberfläche, insbesondere solche, die durch das erfindungsge- mäße Verfahren erhalten werden können.

Noch ein weiterer Gegenstand sind Systeme mit mikrofluidischen Strukturen, in denen die oben beschriebenen Chips eingesetzt werden.

Diese erfindungsgemäßen Chips eignen sich z. B. in elektromigrativen Trennver- fahren und anderen Techniken unter Verwendung mikrofluidischer Systeme so- wie zur Dosierung flüssiger Proben z. B. für die chemische Analyse oder für mik- rosynthetische Verfahren in der Chemie.

Als Beispiel wurde eine sog."Pinched Injection"eines Fluoreszenzfarbstoffes durchgeführt und videomikroskopisch verfolgt. Drei Einzelbilder einer erfolgrei- chen Injektion sind in Abb. 4 gezeigt.

In einer weiteren möglichen Ausführungsform der Erfindung wird das Aus- gangsmaterial statt aus Lösung durch Heißprägen strukturiert. Hierzu wird ein Polymergranulat, z. B. Polyvinylacetat-Granulat, in einer Heißpresse mit einem Si-Formeinsatz geprägt. Der entstehende strukturierte Chip konnte nach Abküh- len aus dem Formeinsatz entfernt werden. Es wird ein ausgezeichnet strukturier- tes Material mit überraschend guten optischen und mechanischen Eigenschaften erhalten. Das Photo eines so mikrostrukturierten PVAC-Wafers ist in Abb. 5. gezeigt. Das Material zeigt eine hohe Transmission ab 400 nm auf mit sehr ge- ringer Eigenfluoreszenz.

Die Hydrophilisierung der Oberflächen der PVAC Chips gelingt durch zwei unter- schiedliche Verfahren.

1. Die Kanäle gedeckelter PVAc-Chips, die nach einem der oben genanten Verfahren hergestellt wurden, werden mit einer Reagenziösung gespült welche die Polyvinylacetat-Oberfläche in Polyvinylalkohol umsetzt, dies ist schematisch in Abbildung 6 gezeigt. In einer bevorzugten Ausführungs- form wird hierfür die wässerige oder alkoholische Lösung einer starken Base wie NAOH oder Natriummethanolat eingesetzt. Nach diesem Spül- schritt werden die Kanäle gereinigt und die Base entfernt. Dies gelingt bevorzugt durch Spülen mit Wasser oder Alkohol. Danach weisen die mikrofluidischen Chips hydrophile Oberflächen bestehend aus PVAI auf und sind gebrauchsfertig.

2. Nach einer zweiten Ausführungsform der Erfindung werden die Oberflä- chen der Polyvinylazetat-Chips noch vor dem Deckeln und Verschließen der Struktur hydrophilisiert. Dies gelingt in dem die strukturierten Chips, sowie die Deckel einer Lösung ausgesetzt werden weiche PVAc in PVAI umwandelt, bevorzugt wird hierzu die Lösung einer starken Base einge- setzt. Dies gelingt z. B. durch ein Tauchbad oder durch Besprühen.

Durch diesen Hydrophilisierungs-Schritt wird wegen der guten Haftung der hydrophilisierten Oberflächen aufeinander das Verbinden der Struktur mit dem Deckel erleichtert.

Beispiele Beispiel 1 : Herstellung eines mikrostrukturierten PVAc-Chips Zur Herstellung des mikrostrukturierten Teils eines mikrofuidischen PVAc-Chips wurde 50 g PVAc (Mw= 50. 000) in 250 ml Ethylazetat gelöst. Ca. 35 g der Lö- sung wurde in ein Gefäß mit einem 4"Si-Formeinsatz gegossen. Nach Trocknen über 19 h wurde das Substrat weitere 2,5 Stunden bei 80 °C auf einer Heizplatte getrocknet. Jetzt lässt sich ein lederartig zäher Film abziehen indem die Struktur enthalten ist. Ein Überstrecken des Filmes muss vermieden werden, leichte Dehnungen der Struktur bilden sich jedoch vollständig.

Zur Herstellung des Deckels wurde PVAc-Pulver auf einer Heißpresse gepresst.

Hierfür wurde eine Temperatur von 80°C und eine Kraft von 10 kN verwendet.

Zur Herstellung einer funktionsfähigen geschlossenen mikrofluidischen Chips wurde der Deckel mit dem strukturierten Substrat verbunden. Das Photo eines so hergestellten mikrofluidischen PVAc-Chips ist in Abb. 2 gezeigt. Die Mikro- skopische Vergrößerung des Kreuzungsbereiches der 50 um breiten Kanäle ist in Abb. 3 dargestellt.

Beispiel 2 : Injektion eines Fluoreszenzfarbstoffes unter Verwendung eines mikrostrukturierten PVAc-Chips Ein nach Beispiel 1 hergestellter PVAc-Chip wurde in der Mikrochip Elektropho- rese eingesetzt. Es wurde eine so genannte"pinched injection", bei der kleinste Probevolumina über ein Spannungsprogramm injiziert werden, durchgeführt und videomikroskopisch verfolgt.

Zunächst wurde die fluidische Struktur des Chips mit einem Elektrolyten beste- hend aus einem 40 mM Phosphat-Puffer pH : 6 gefüllt. Die Bohrungen des Chips dienen als Proben und Puffergefäße entsprechend Abb. 6. Das Probeneinlaß- Gefäß (SI) wurde mit Lösung (0, 1 mg/ml) des Fluoreszenzfarbstoffes Alexafluor 647 gefüllt. Zur Durchführung der Injektion wurden folgende Spannungen an die <BR> <BR> Gefäße angelegt : A : -0, 81/-1,76/-1, 16/0 (BI/BO/SI/SO), B :-2/0/-0, 32/-0, 33. Ein- zelbilder einer videomikroskopischen Verfolgung des erfolgreichen Injektionspro- zesses sind in Abb. 4. gezeigt.

Beispiel 3 Herstellung eines mikrostrukturierten PVAc-Chips mittels Heißprä- gen.

Durch Verwendung eines Polyvinylacetat Materials wie das Vinapas UW10 von Wacker gelingt auch die Mikrostrukturierung allein durch Heißprägen. Damit ist sowohl die Fertigung von Deckel und mikrostrukturiertem Teil sehr ökonomisch in einem automatisierten Prozess in einer Heißpresse möglich. Neben Polyvinyl- acetat ist auch Polyvinylbutyral als Ausgangstoff geeignet.

Zur Herstellung eines Polyvinylacetatchips wurde Vinapas UW10 Granulat in einer Heißpresse mit einen 4"Si-Formeinsatz mit Kreuzstruktur geprägt, wo- durch ein durchsichtiges Werkstück mit geprägten Kanälen von 50pm breite und 30um Tiefe entsteht. Zur Herstellung des Deckels wurde das Vinapas Granulat analog auf einer Heißpresse gepresst. Hierfür wurde eine Temperatur von 80°C und eine Kraft von 10 kN verwendet.

Zur Herstellung eines funktionsfähigen geschlossenen mikrofluidischen Chips wurde der Deckel mit dem strukturierten Substrat verbunden. Das Photo eines so hergestellten mikrofluidischen PVAc-Chips ist in Abb. 7 gezeigt.

Beispiel 4.

Ein nach Beispiel 3 hergestellter PVAc-Chip wurde in der Mikrochip Elektropho- rese eingesetzt. Es wurde eine so genannte"pinched injection", eines Testgemi- sches bestehend aus Fluoresceinisothiocyanat markierten Aminen durchgeführt.

Die Detektion erfolgte mittels Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 450-488, und einer Emissionswellenlänge >515.

Wie in Abbildung 8 gezeigt, gelingt in einem nativen Polyvinylacetatchip eine Antrennung der Verbindungen. Durch Hydrophilisieren der Oberflächen kann die Auflösung deutlich gesteigert werden.