Mikrofluidische Vorrichtung und Verfahren zum Analysieren einer Probe biologischen Materials

Stand der Technik

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine mikrofluidische Vorrichtung zum Analysieren einer Probe biologischen Materials, ferner auf ein Verfahren zum Analysieren einer Probe biologischen Materials, zudem auf eine Vorrichtung zum Ausführen der Schritte des Verfahrens sowie auf ein entsprechendes

Computerprogramm.

Bei einem mikrofluidischen Diagnosesystem, wie einem sogenannten Chiplabor bzw. Lab-on-Chip (LoC) ist eine miniaturisierte und integrierte Durchführung komplexer fluidischer Arbeitsabläufe insbesondere für den spezifischen

Nachweis verschiedenster Moleküle ermöglicht. Die US 2011/0070578 AI offenbart eine DNA-Analyseeinrichtung, bei der eine Polymerase- Kettenreaktion und eine Verdünnung für eine nachfolgende elektrophoretische Separation durchgeführt werden.

Offenbarung der Erfindung

Vor diesem Hintergrund werden mit dem hier vorgestellten Ansatz eine mikrofluidische Vorrichtung zum Analysieren einer Probe biologischen Materials, ein Verfahren zum Analysieren einer Probe biologischen Materials, weiterhin eine Vorrichtung, die dieses Verfahren verwendet, sowie schließlich ein

entsprechendes Computerprogramm gemäß den Hauptansprüchen vorgestellt. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den jeweiligen Unteransprüchen und der nachfolgenden Beschreibung. Gemäß Ausführungsformen der Erfindung kann insbesondere eine

verschachtelte (engl, nested) Polymerase- Kettenreaktion bzw. PCR (engl.

Polymerase Chain Reaction) geschaffen werden, bei der eine Probe zwischen einer ersten und einer zweiten Polymerase- Kettenreaktion verdünnt wird (engl, diluted), was als eine„Diluted Nested PCR" bezeichnet werden kann. Somit können gemäß Ausführungsformen der Erfindung mikrofluidische Strukturen und Prozessabläufe für eine Durchführung einer verschachtelten Polymerase- Kettenreaktion mit Verdünnung und unter Verwendung gleicher

Primersequenzen bei der ersten und der zweiten Polymerase- Kettenreaktion bereitgestellt werden.

Vorteilhafterweise kann gemäß Ausführungsformen der Erfindung insbesondere eine Implementierung von PCR-Assays ohne Primer- Modifikation, wie

beispielsweise herkömmlicherweise üblich durch Verwendung dUTP-haltiger

(dUTP = Deoxyuridine Triphosphate) Primer, Primer mit unterschiedlichen Schmelztemperaturen, „Abfangprimern", die in der zweiten PCR eingesetzt werden, zu den Primern der ersten PCR komplementär sind und somit die Primer deaktivieren, oder dergleichen, ermöglicht werden. Somit braucht insbesondere nicht auf die Verwendung von dUTP-haltigen Primern bei der ersten PCR zurückgegriffen werden, wobei nach Überführung des PCR-Produkts in die singleplex- Reaktionskammern ein UNG-Verdau (U NG = Uracil-N-Glycosylase) durchgeführt würde, um die Primer der ersten Reaktion zu deaktivieren. Daher kann auf spezielle Nukleotide bei einer Primer-Synthese sowie auf ein zusätzliches Enzymsystem für den UNG-Verdau verzichtet werden. Ebenso braucht nicht auf die Verwendung von Primern mit unterschiedlichen

Schmelztemperaturen zurückgegriffen werden, wobei in der ersten multiplex- PCR beispielsweise Primer mit einer Schmelztemperatur zwischen 55 und 65°C, bei den zweiten singleplex-PCRs Primer mit einer Schmelztemperatur um 72 °C eingesetzt würden. Somit brauchen PCR-Primer für die erste und zweite PCR nicht in unterschiedlichen Längen für unterschiedliche Schmelztemperaturen ausgelegt werden.

Daher können gemäß Ausführungsformen der Erfindung Kosten und Aufwand bei der verschachtelten Polymerase- Kettenreaktion eingespart werden. Auch kann dadurch eine Flexibilität eines LoC-Systems gesteigert werden, da viele verschiedene PCR-Assays bzw. Biocontents ohne Anpassung in einem LoC implementiert werden können. So gibt es beispielsweise deutlich mehr Assays, bei denen DNA-Moleküle direkt über eine singleplex- bis quadplex-PCR-Reaktion nachgewiesen werden als in einer Kombination aus multiplex-PCR plus anschließender Mikroarrayanalyse.

Vorteile einer Verschachtelung der Polymerase- Kettenreaktionen bestehen darin, dass durch eine Voramplifikation von in der Probe enthaltenen

Nukleinsäuremolekülen in der ersten Polymerase- Kettenreaktion genügend Material für Einzelnachweisreaktionen in der zweiten Polymerase- Kettenreaktion erzeugt werden kann. Daher kann verhindert werden, dass beispielsweise ein zu untersuchendes Probenmaterial, das sehr wenige DNA-Moleküle enthält, direkt auf mehrere Reaktionskammern verteilt wird und somit die einzelnen Kammern zu wenig genetisches Ausgangsmaterial für eine PCR enthalten. Vielmehr kann durch eine Anhebung einer Menge an zu untersuchenden

Nukleinsäuremolekülen in der ersten PCR in jeder Reaktionskammer der zweiten PCR beispielsweise jedes gewünschte der vorhandenen Nukleinsäuremoleküle nachgewiesen werden kann. Durch die Verschachtelung zweier Polymerase- Kettenreaktionen können in singleplex- Reaktionen sehr viele genetische

Merkmale aus einer kleinen Probenmenge nachgewiesen werden.

Ferner braucht kein DNA-Mikroarray für einen Nachweis unterschiedlicher DNA- Moleküle eingesetzt zu werden. Dadurch können auch Anforderungen an eine optische Detektionseinheit in puncto Auflösung gesenkt werden und eine

Prozesszeit verkürzt werden. Zudem kann gemäß Ausführungsformen der Erfindung eine Echtzeitfähigkeit bzw. Real-time- Fähigkeit vorgesehen sein.

Reaktionen können beispielsweise in Triplikaten durchgeführt werden, wodurch eine Aussagekraft der Reaktionen erhöht werden kann.

Es wird eine mikrofluidische Vorrichtung zum Analysieren einer Probe

biologischen Materials vorgestellt, wobei die mikrofluidische Vorrichtung folgende Merkmale aufweist: eine erste Reaktionskammer, die ausgebildet ist, um eine erste Polymerase- Kettenreaktion an der Probe auszuführen, um ein erstes Reaktionsprodukt zu erzeugen; eine fluidisch mit der ersten Reaktionskammer verbundene oder verbindbare Mischkammer, die ausgebildet ist, um das erste Reaktionsprodukt mit einem Verdünnungsmedium zu mischen, um ein verdünntes Gemisch zu erzeugen; und zumindest eine fluidisch mit der Mischkammer verbundene oder verbindbare, zweite Reaktionskammer, die ausgebildet ist, um zum Analysieren der Probe eine zweite Polymerase- Kettenreaktion an dem verdünnten Gemisch

durchzuführen.

Die mikrofluidische Vorrichtung kann beispielsweise in Verbindung mit analytischen Systemen, insbesondere für mikrofluidische Lab-on-Chip-Systeme zur Umweltanalytik oder medizinischen Diagnostik verwendet werden. Bei der mikrofluidischen Vorrichtung kann es sich um ein mikrofluidisches System bzw. eine analytische Vorrichtung handeln, insbesondere ein mikrofluidisches Lab-on- Chip bzw. Chiplabor zur medizinischen Diagnostik, mikrobiologischen Diagnostik oder Umweltanalytik. Als Probe kann eine zu analysierende Flüssigkeit, typischerweise eine flüssige oder verflüssigte Patientenprobe, z. B. Blut, Urin, Stuhl, Sputum, Liquor, Lavage, ein ausgespülter Abstrich oder eine verflüssigte Gewebeprobe, oder eine Probe eines nichtmenschlichen Materials bezeichnet werden. In der Probe enthaltene Zellen können beispielsweise menschliche Zellen, z. B. Blutzellen oder dergleichen, tierische Zellen oder pathogene Zellen bzw. Pathogene, z. B. Viren oder Mikroorganismen, wie z. B. Bakterien oder Pilze, umfassen, die DNA und/oder RNA, d. h. Nukleinsäuremoleküle, aufweisen. Die Reaktionskammern können beispielsweise unter Verwendung von Ventilen mit der Mischkammer fluidisch verbunden sein.

Gemäß einer Ausführungsform kann in der ersten Reaktionskammer zumindest eine Substanz zum Ausführen der ersten Polymerase- Kettenreaktion vorgelagert sein. Hierbei kann in der Mischkammer das Verdünnungsmedium vorgelagert sein. Dabei kann in der zumindest einen zweiten Reaktionskammer und zusätzlich oder alternativ in der Mischkammer zumindest eine Substanz zum Durchführen der zweiten Polymerase- Kettenreaktion vorgelagert sein. Gemäß einer Ausführungsform kann die Vorrichtung zumindest zwei oder zumindest drei zweite Reaktionskammern aufweisen. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass eine besonders platzsparende Anordnung von Kammern in der mikrofluidischen Vorrichtung sowie eine Vereinfachung einer Anordnung von

Kammern ermöglicht werden. Gemäß einer Ausführungsform kann der

Reaktionsmix auch schon„ready-to-use" in die Reaktionskammer eingeleitet werden. Auch kann eine fluidisch mit der Mischkammer verbundene oder verbindbare

Speicherkammer zum Speichern von Verdünnungsmedium vorgesehen sein. Hierbei kann in der ersten Reaktionskammer zumindest eine Substanz zum Ausführen der ersten Polymerase- Kettenreaktion vorgelagert sein, wobei in der Speicherkammer das Verdünnungsmedium vorgelagert sein kann. Dabei kann in der zumindest einen zweiten Reaktionskammer, in der Speicherkammer und zusätzlich oder alternativ in der Mischkammer zumindest eine Substanz zum Durchführen der zweiten Polymerase- Kettenreaktion vorgelagert sein. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass ein variables

Mischungsverhältnis bzw. eine variable Verdünnung in der Mischkammer erzeugt werden kann. Gemäß einer Ausführungsform kann der Reaktionsmix auch schon

„ready-to-use" in die Reaktionskammer eingeleitet werden.

Insbesondere können ein Volumen der ersten Reaktionskammer und ein

Volumen der Mischkammer ausgebildet sein, um in dem verdünnten Gemisch ein Mischungsverhältnis zu bewirken, das geeignet ist, um Primer aus der ersten

Polymerase- Kettenreaktion von der zweiten Polymerase- Kettenreaktion zumindest teilweise auszuschließen. Durch die Verdünnung und der damit einhergehenden Verringerung der Konzentration von Primern aus der ersten Polymerase- Kettenreaktion wird eine Beteiligung dieser Primer an der zweiten Polymerase- Kettenreaktion unterdrückt. Auch kann ein Volumen der

Speicherkammer ausgebildet sein, um in dem verdünnten Gemisch ein

Mischungsverhältnis zu bewirken, das geeignet ist, um Primer aus der ersten Polymerase- Kettenreaktion für die zweite Polymerase- Kettenreaktion zumindest teilweise zu inaktivieren. Bei einer verschachtelten PCR können somit insbesondere PCR-Primer der ersten bzw. multiplex-Polymerase-Kettenreaktion von der nachfolgenden singleplex- Polymerase- Kettenreaktionen im Wesentlichen ausgeschlossen werden. Daher ist es möglich, ein spezifisches Zielmolekül nachzuweisen. Anders ausgedrückt kann das PC R-Produkt der ersten PCR soweit verdünnt werden, dass die ja ebenfalls verdünnten Primer der ersten PCR in der zweiten PCR im Wesentlichen dadurch zumindest teilweise effektiv inaktiviert sind. Der biochemische Hintergrund des beschriebenen Ansatzes besteht darin, dass die Konzentration der Primer der ersten PCR durch eine Verdünnung des Reaktionsvolumens (nach Vollendung der ersten PCR) soweit herabgesetzt oder verringert wird, dass diese Primer in der anschließenden zweiten PCR nicht mehr aktiv an der zweiten Reaktion teilnehmen können, weil die Konzentration dieser Primer dafür nicht ausreicht. Das Reaktionsvolumen der ersten PCR wird dann auf mehrere Kammern verteilt, in denen Primer für die zweite PCR vorgelagert sind, die sich beim Befüllen der Kammern mit dem verdünnten Mix der ersten PCR vermischen, sodass sich funktionsfähige Reaktionsmixe einstellen.

Ferner kann eine Lüftungsöffnung vorgesehen sein, die in der Mischkammer als Ausgleichsöffnung relativ zu einem Umgebungsdruck ausgeformt ist. Hierbei kann die Lüftungsöffnung ausgebildet sein, um einen Druckausgleich zwischen der Mischkammer und einer Umgebung der mikrofluidischen Vorrichtung zu ermöglichen. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass

überschüssige Luft in der Mischkammer somit durch die Lüftungsöffnung entweichen kann und somit ein Mischvorgang in der Mischkammer erleichtert werden kann.

Gemäß einer Ausführungsform können eine fluidisch zwischen die erste

Reaktionskammer und die Mischkammer geschaltete Pumpkammer und eine Mehrzahl von Ventilen vorgesehen sein. Auch kann eine Mehrzahl von zweiten Reaktionskammern vorgesehen sein. Dabei kann die erste Reaktionskammer zwischen einem ersten Paar von Ventilen angeordnet sein, kann die

Pumpkammer zwischen einem zweiten Paar von Ventilen angeordnet sein und kann die Mehrzahl von zweiten Reaktionskammern zwischen einer Mehrzahl von dritten Paaren von Ventilen angeordnet sein. Die Kammern der mikrofluidischen Vorrichtung können mittels Kanälen fluidisch verbunden sein, wobei die Ventile ausgebildet sein können, um einen Fluidfluss durch die Kanäle zu beeinflussen. Die Speicherkammer kann über einen Kanal und ein Ventil fluidisch mit der Mischkammer verbunden sein. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass eine besonders effiziente, platzsparende und konstruktionsunaufwendige mikrofluidische Vorrichtung bereitgestellt werden kann.

Es wird auch ein Verfahren zum Analysieren einer Probe biologischen Materials vorgestellt, wobei das Verfahren unter Verwendung einer mikrofluidischen Vorrichtung ausführbar ist, die eine erste Reaktionskammer, eine fluidisch mit der ersten Reaktionskammer verbundene Mischkammer und zumindest eine fluidisch mit der Mischkammer verbundene, zweite Reaktionskammer aufweist, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:

Ausführen einer ersten Polymerase- Kettenreaktion an der Probe in der ersten Reaktionskammer, um ein erstes Reaktionsprodukt zu erzeugen;

Mischen des ersten Reaktionsprodukts mit einem Verdünnungsmedium in der Mischkammer, um ein verdünntes Gemisch zu erzeugen; und

Durchführen einer zweiten Polymerase- Kettenreaktion an dem verdünnten Gemisch in der zumindest einen zweiten Reaktionskammer, um die Probe zu analysieren.

Das Verfahren kann in Verbindung mit einer Ausführungsform der vorstehend genannten mikrofluidischen Vorrichtung vorteilhaft ausgeführt werden, um eine Probe biologischen Materials zu analysieren. Ferner kann das Verfahren zwischen dem Schritt des Ausführens und dem Schritt des Mischens einen ersten Schritt des Förderns des ersten Reaktionsprodukts von der ersten

Reaktionskammer in die Mischkammer sowie zwischen dem Schritt des

Mischens und dem Schritt des Durchführens einen zweiten Schritt des Förderns des verdünnten Gemischs von der Mischkammer in die zumindest eine zweite Reaktionskammer aufweisen. Die Schritte des Förderns können durch Ansteuern von zumindest eines Ventils und zusätzlich oder alternativ zumindest einer Fördereinrichtung ausgeführt werden. Dabei können das zumindest eine Ventil und/oder die zumindest eine Fördereinrichtung Schnittstellen aufweisen, die ausgebildet sind, um Ansteuersignale zu empfangen. Gemäß einer Ausführungsform können im Schritt des Mischens Ansteuersignale zum Ansteuern zumindest eines Ventils und zusätzlich oder alternativ zumindest einer Fördereinrichtung der mikrofluidischen Vorrichtung erzeugt werden, um in dem verdünnten Gemisch ein Mischungsverhältnis zu bewirken, das geeignet ist, um Primer aus der ersten Polymerase- Kettenreaktion von der zweiten

Polymerase- Kettenreaktion auszuschließen. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass exakte Nachweise von Nukleinsäuresequenzen unter

Vermeidung des Einsatzes spezieller oder unterschiedlicher Primer ermöglicht werden.

Bei einer verschachtelten PCR können zwei Polymerase- Kettenreaktionen nacheinander durchgeführt werden. Bei der ersten Polymerase- Kettenreaktion können mehrere Primerpärchen eingesetzt werden, wodurch im Sinne einer multiplex-PCR spezifisch mehrere Nukleinsäuresequenzen bzw. insbesondere

DNA-Sequenzen in einer Reaktionskammer gleichzeitig amplifiziert werden können. Ein PCR-Produkt der ersten Reaktion kann dann auf mehrere räumlich getrennte Reaktionskammern verteilt werden, die jeweils ein Primerpaar enthalten können. Somit können amplifizierte Nukleinsäuremoleküle bzw.

insbesondere DNA-Moleküle der ersten PCR als sogenannte„Template DNA" in der zweiten PCR fungieren. Dadurch ist bei der zweiten PCR im Sinne einer singleplex-PCR in jeder Kammer ein Nukleinsäuremolekül nachweisbar.

Zunächst kann eine zu untersuchende Probenlösung beispielsweise in eine erste Reaktionskammer eingebracht und mittels multiplex-PCR voramplifiziert werden. Bei dieser Reaktion können mehrere, beispielsweise zwischen 5 und 100, verschiedene Abschnitte einer Nukleinsäure vervielfältigt werden. Nach dem Mischen bzw. Verdünnen kann dieses PCR-Produkt beispielsweise auf viele zweite Reaktionskammern verteilt werden, in denen Substanzen wie Polymerase und ein Primerpaar vorgelagert sein können. Dadurch können in den

Einzelkammern verschiedene Nukleinsäuremoleküle in Einzelreaktionen der singleplex-PCR insbesondere im Ablauf parallel bzw. hochparallel nachgewiesen werden.

Der hier vorgestellte Ansatz schafft ferner eine Vorrichtung, die ausgebildet ist, um die Schritte einer Variante eines hier vorgestellten Verfahrens in entsprechenden Einrichtungen durchzuführen, anzusteuern bzw. umzusetzen. Auch durch diese Ausführungsvariante der Erfindung in Form einer Vorrichtung kann die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe schnell und effizient gelöst werden.

Unter einer Vorrichtung kann vorliegend ein elektrisches Gerät verstanden werden, das Sensorsignale verarbeitet und in Abhängigkeit davon Steuer- und/oder Datensignale ausgibt. Die Vorrichtung kann eine Schnittstelle aufweisen, die hard- und/oder softwaremäßig ausgebildet sein kann. Bei einer hardwaremäßigen Ausbildung können die Schnittstellen beispielsweise Teil eines sogenannten System-ASICs sein, der verschiedenste Funktionen der Vorrichtung beinhaltet. Es ist jedoch auch möglich, dass die Schnittstellen eigene, integrierte Schaltkreise sind oder zumindest teilweise aus diskreten Bauelementen bestehen. Bei einer softwaremäßigen Ausbildung können die Schnittstellen Softwaremodule sein, die beispielsweise auf einem Mikrocontroller neben anderen Softwaremodulen vorhanden sind.

Von Vorteil ist auch ein Computerprogrammprodukt mit Programmcode, der auf einem maschinenlesbaren Träger wie einem Halbleiterspeicher, einem

Festplattenspeicher oder einem optischen Speicher gespeichert sein kann und zur Durchführung und/oder Ansteuerung der Schritte des Verfahrens nach einer der vorstehend beschriebenen Ausführungsformen verwendet wird,

insbesondere wenn das Programmprodukt auf einem Computer oder einer Vorrichtung ausgeführt wird.

Der hier vorgestellte Ansatz wird nachstehend anhand der beigefügten

Zeichnungen beispielhaft näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung einer mikrofluidischen Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung;

Fig. 2 eine schematische Darstellung einer mikrofluidischen Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung; Figuren 3 und 4 Vergleichsdarstellungen von Analyseergebnissen gemäß Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung; und

Fig. 5 ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens gemäß einem

Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung.

In der nachfolgenden Beschreibung günstiger Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden für die in den verschiedenen Figuren

dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente gleiche oder ähnliche

Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung dieser Elemente verzichtet wird.

Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung einer mikrofluidischen Vorrichtung 100 zum Analysieren einer Probe biologischen Materials gemäß einem

Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Dabei ist die Mikrofluidische Vorrichtung 100 beispielsweise als ein mikrofluidischer Chip bzw. ein

Westentaschenlabor bzw. LoC (engl. Lab on Chip) ausgeführt, insbesondere zur medizinischen Diagnostik, mikrobiologischen Diagnostik oder Umweltanalytik. Gezeigt sind von der mikrofluidischen Vorrichtung 100 in Fig. 1 hierbei eine erste Reaktionskammer 110, eine Pumpkammer 120, eine Mischkammer 130, eine Lüftungsöffnung 140, eine Mehrzahl von zweiten Reaktionskammern 150, wobei in Fig. 1 lediglich beispielhaft vier zweite Reaktionskammern 150 gezeigt sind, sowie eine Mehrzahl von Ventilen 161, 162, 163, 164, 165 und 166.

Die erste Reaktionskammer 110 ist zwischen einem ersten Ventil 161 und einem zweiten Ventil 162 angeordnet. Dabei ist das erste Ventil 161 in einem

mikrofluidischen Zufuhrkanal angeordnet. Über den mikrofluidischen Zufuhrkanal ist die Probe in die erste Reaktionskammer 110 zuführbar. Die erste

Reaktionskammer 110 ist ausgebildet, um eine erste Polymerase- Kettenreaktion an der Probe auszuführen, um ein erstes Reaktionsprodukt zu erzeugen. Das zweite Ventil 162 ist in einem ersten mikrofluidischen Verbindungskanal angeordnet. Die erste Reaktionskammer 110 ist mittels des ersten

mikrofluidischen Verbindungskanals fluidisch mit der Pumpkammer 120 verbunden. Die Pumpkammer 120 ist zwischen einem dritten Ventil 163 und einem vierten Ventil 164 angeordnet. Dabei ist das dritte Ventil 163 dem ersten

mikrofluidischen Verbindungskanal angeordnet. Somit sind zwischen der ersten Reaktionskammer 110 und der Pumpkammer 120 in dem ersten mikrofluidischen Verbindungskanal das zweite Ventil 162 und das dritte Ventil 163 angeordnet.

Die Pumpkammer 120 ist mittels eines zweiten mikrofluidischen

Verbindungskanals fluidisch mit der Mischkammer 130 verbunden. Das vierte Ventil 164 ist in dem zweiten mikrofluidischen Verbindungskanal angeordnet. Die Pumpkammer 120 ist fluidisch zwischen der ersten Reaktionskammer 110 und der Mischkammer 130 angeordnet.

Die Mischkammer 130 ist über den zweiten mikrofluidischen Verbindungskanal fluidisch mit der Pumpkammer 120 verbunden. Das vierte Ventil 164 ist hierbei zwischen der Pumpkammer 120 und der Mischkammer 130 in dem zweiten mikrofluidischen Verbindungskanal angeordnet. Somit ist die Mischkammer 130 über den zweiten mikrofluidischen Verbindungskanal, die Pumpkammer 120 und den ersten mikrofluidischen Verbindungskanal fluidisch mit der ersten

Reaktionskammer 110 verbunden. Das erste Reaktionsprodukt ist von der ersten Reaktionskammer 110 über die Pumpkammer 120 in die Mischkammer 130 zuführbar. In der Mischkammer 130 ist ein Verdünnungsmedium vorlagerbar bzw. vorgelagert. Die Mischkammer 130 ist ausgebildet, um das erste

Reaktionsprodukt aus der ersten Reaktionskammer 110 mit dem

Verdünnungsmedium zu mischen, um ein verdünntes Gemisch zu erzeugen. Die Lüftungsöffnung 140 ist in der Mischkammer 130 ausgeformt. Auch wenn es in Fig. 1 darstellungsbedingt nicht explizit erkennbar ist, so ist die

Lüftungsöffnung 140 als eine Durchgangsöffnung zwischen der Mischkammer 130 und einer Außenoberfläche der mikrofluidischen Vorrichtung 100

angeordnet. Dabei ist die Lüftungsöffnung 140 als eine Ausgleichsöffnung relativ zu einem Umgebungsdruck ausgeformt.

Zwischen dem zweiten Ventil 162 und dem dritten Ventil 163 ist gemäß dem in Fig. 1 dargestellten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung eine Verzweigungsstelle in dem ersten mikrofluidischen Verbindungskanal zwischen der ersten Reaktionskammer 110 und der Pumpkammer 120 angeordnet. An der Verzweigungsstelle zweigt von dem ersten mikrofluidischen Verbindungskanal ein dritter mikrofluidischer Verbindungskanal ab. Der dritte mikrofluidische Verbindungskanal erstreckt sich zwischen der Verzweigungsstelle und den beispielhaft vier zweiten Reaktionskammern 150. Dabei verzweigt sich der dritte mikrofluidische Verbindungskanal in vier Teilkanäle.

Jede der beispielhaft vier zweiten Reaktionskammern 150 ist zwischen einem fünften Ventil 165 und einem sechsten Ventil 166 angeordnet. Somit sind gemäß dem in Fig. 1 dargestellten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung vier fünfte Ventile 165 und vier sechste Ventile 166 vorgesehen. Dabei ist jedes der fünften Ventile 165 in einem der Teilkanäle des dritten mikrofluidischen

Verbindungskanals angeordnet. Die zweiten Reaktionskammern 150 sind über die mikrofluidischen Verbindungskanäle fluidisch mit der Mischkammer 130 verbunden. Über den dritten mikrofluidischen Verbindungskanal ist das verdünnte Gemisch aus der Mischkammer 130 in die zweiten Reaktionskammern 150 zuführbar. Die zweiten Reaktionskammern 150 sind ausgebildet, um zum Analysieren der Probe eine zweite Polymerase- Kettenreaktion an dem

verdünnten Gemisch durchzuführen. Die beispielhaft vier sechsten Ventile 166 sind in vier Teilkanälen angeordnet, die sich in einem mikrofluidischen

Abfuhrkanal vereinigen.

Auch wenn es in Fig. 1 nicht explizit erkennbar ist, so ist gemäß dem in Fig. 1 dargestellten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung in der ersten Reaktionskammer 110 zumindest eine Substanz zum Ausführen der ersten Polymerase- Kettenreaktion vorgelagert. Ferner ist in der Mischkammer 130 zumindest eine erste Substanz zum Durchführen der zweiten Polymerase- Kettenreaktion vorgelagert. Schließlich ist in den zweiten Reaktionskammern 150 zumindest eine zweite Substanz zum Durchführen der zweiten Polymerase- Kettenreaktion vorgelagert. Die mikrofluidische Vorrichtung 100 ist insbesondere ausgebildet, um ein verdünntes Gemisch mit einem Mischungsverhältnis zu erzeugen, das geeignet ist, um Primer aus der ersten Polymerase- Kettenreaktion von der zweiten Polymerase- Kettenreaktion zumindest teilweise auszuschließen. Die Ventile 161, 162, 163, 164, 165 und 166 können Schnittstellen aufweisen, die ausgebildet sind, um Ansteuersignale zu empfangen. Gemäß einem Ausführungsbeispiel sind ein Volumen der ersten

Reaktionskammer 110 und ein Volumen der Mischkammer 130 ausgebildet, um in dem verdünnten Gemisch ein Mischungsverhältnis zu bewirken, das geeignet ist, um Primer aus der ersten Polymerase- Kettenreaktion von der zweiten Polymerase- Kettenreaktion in den zweiten Reaktionskammern 150 zumindest teilweise auszuschließen.

Anders ausgedrückt zeigt Fig. 1 eine schematische Aufsicht der mikrofluidischen Vorrichtung 100 gemäß einem Ausführungsbeispiel. Die mikrofluidische

Vorrichtung 100 ist beispielsweise als ein mikrofluidischer Chip ausgeführt und umfasst unter anderem die erste Reaktionskammer 110 für die Durchführung einer ersten Polymerase- Kettenreaktion bzw. PCR (engl. Polymerase Chain Reaction) als eine multiplex-PCR, die Pumpkammer 120, die Mischkammer 130 und die zweiten Reaktionskammern 150 für die Durchführung der zweiten PCR als singleplex- Polymerase- Kettenreaktionen. Dabei sind Substanzen bzw.

Reaktionskomponenten für die erste PCR, wie beispielsweise Polymerase, unterschiedliche Primerpärchen für eine gemultiplexte PCR,

Nukleosidtriphosphate, insbesondere Desoxyribonukleosidtriphosphate bzw. dNTP, PCR-Puffer, Additive und dergleichen, in der ersten Reaktionskammer 110 vorgelagert. Substanzen bzw. Reaktionskomponenten für die zweite PCR, wie beispielsweise dNTP, PCR-Puffer und Additive, sind in dem

Verdünnungsmedium in der Mischkammer 130 vorgelagert. Polymerase, Primerpärchen und beispielsweise real-time-Sonden bzw. Sonden für die Durchführung einer real-time-PCR, sind in den zweiten Reaktionskammern 150 vorgelagert.

Im Betrieb der mikrofluidischen Vorrichtung 100 wird die Probe bzw. DNA-Probe in die erste Reaktionskammer 110 eingefüllt und mit den dort vorgelagerten Reaktionskomponenten vermischt. Wenn das erste Ventil 161 und das zweite Ventil 162 geschlossen sind, werden Reaktionsbedingungen für die erste PCR geschaffen. Anschließend wird mittels einer Fördereinrichtung, welche die Pumpkammer 120 und das dritte Ventil 163 sowie das vierte Ventil 164 als Pumpventile aufweist, das erste Reaktionsprodukt aus der ersten PCR bzw. das Flüssigkeitsvolumen der ersten Reaktionskammer 110 in die Mischkammer 130 überführt und mit dem darin befindlichen Verdünnungsmedium vermischt. Eine Verdrängung überschüssiger Luft der Mischkammer 130 erfolgt hierbei über die Lüftungsöffnung 140. Das verdünnte Gemisch wird mittels der Pumpkammer 120 bei geschlossenem zweiten Ventil 162 auf die zweiten Reaktionskammern 150 verteilt. Anschließend werden die fünften Ventile 165 und sechsten Ventile 166 geschlossen und Reaktionsbedingungen für die zweite PCR geschaffen. Ein Reaktionsverlauf kann entweder in Echtzeit (engl, real time) verfolgt werden, wobei quantitative Informationen über eine initiale Menge jeweiliger DNA- Moleküle gewonnen werden können, oder am Ende der zweiten Reaktion gemessen werden, wobei ja/nein-Aussagen möglich sind. Gemäß dem in Fig. 1 gezeigten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist ist das

Mischungsverhältnis bzw. eine Verdünnungsstufe durch eine Menge an vorgelagertem Verdünnungsmedium in der Mischkammer 130 bestimmt.

Gemäß einem im Bezug zu dem in Fig. 1 gezeigten Ausführungsbeispiel vereinfachten Ausführungsbeispiel einer mikrofluidischen Vorrichtung 100 neben der ersten Reaktionskammer 110 und der Mischkammer 130 noch zumindest eine zweite Reaktionskammer 150. Ein in die zweite Reaktionskammer 150 führender Kanal kann, wie in Fig. 1 gezeigt, von einem Verbindungskanal zwischen der ersten Reaktionskammer 110 und der Mischkammer 130 abzweigen, oder alternativ von der Mischkammer 130 in die zweite

Reaktionskammer 150 führen. Eine optionale Pumpkammer 120 kann an einer geeigneten Position eines die Kammern 110, 130, 150 verbindenden

Verbindungskanalnetzes angeordnet sein.

Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung einer mikrofluidischen Vorrichtung 100 zum Analysieren einer Probe biologischen Materials gemäß einem

Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Hierbei entspricht die mikrofluidische Vorrichtung 100 der mikrofluidischen Vorrichtung aus Fig. 1 mit der Ausnahme, dass die mikrofluidische Vorrichtung 100 in Fig. 2 zusätzlich ein siebtes Ventil 267 und eine Speicherkammer 270 aufweist. Somit sind von der mikrofluidischen Vorrichtung 100 in Fig. 2 die erste Reaktionskammer 110, die Pumpkammer 120, die Mischkammer 130, die Lüftungsöffnung 140, die lediglich beispielhaft vier zweiten Reaktionskammern 150, die Ventile 161, 162, 163, 164, 165, 166 sowie 267 und die Speicherkammer 270 gezeigt. Die Speicherkammer 270 ist über einen vierten mikrofluidischen

Verbindungskanal fluidisch mit der Verzweigungsstelle in dem ersten

mikrofluidischen Verbindungskanal zwischen der ersten Reaktionskammer 110 und der Pumpkammer 120 verbunden. Das siebte Ventil 267 ist in dem vierten mikrofluidischen Verbindungskanal angeordnet. Die Speicherkammer 270 ist ausgebildet, um das Verdünnungsmedium zu speichern. Mit der Mischkammer 130 ist die Speicherkammer 270 fluidisch über den vierten mikrofluidischen Verbindungskanal fluidisch verbunden. Somit ist das erste Reaktionsprodukt in der Mischkammer 130 mit dem Verdünnungsmedium aus der Speicherkammer 270 in einem einstellbaren Mischungsverhältnis verdünnbar.

Anders ausgedrückt zeigt Fig. 2 eine Struktur der mikrofluidischen Vorrichtung 100, bei der unterschiedliche Verdünnungsstufen des ersten Reaktionsprodukts für die zweite PCR einstellbar sind. Gemäß dem in Fig. 2 dargestellten

Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist das Verdünnungsmedium für die zweite PCR in der Speicherkammer 270 vorgelagert. Ein Reaktionsvolumen der ersten PCR bzw. das erste Reaktionsprodukt wird mittels der Pumpkammer 120 in die Mischkammer 130 transferiert. Mittels der Pumpkammer 120 wird eine definierte Menge des Verdünnungsmediums aus der Speicherkammer 270 ebenfalls der Mischkammer 130 zugeführt und dort mit dem ersten

Reaktionsprodukt vermischt. Dieses verdünnte Gemisch wird nun, wie es in Fig. 1 beschrieben ist, auf die zweiten Reaktionskammern 150 verteilt, und dort bei der zweiten PCR temperaturzykliert. Somit sind hierbei ohne Designänderung verschiedene Verdünnungsstufen des ersten Reaktionsprodukts in dem verdünnten Gemisch einstellbar.

Fig. 3 zeigt eine Vergleichsdarstellung von Analyseergebnissen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Die Analyseergebnisse sind dabei durch händisches Pipettieren unter Verwendung von Eppendorf-Tubes (= Reaktionsgefäße) entstanden: Die Ergebnisse zeigen, dass die Grundidee

(Inaktivierung von Primern einer ersten PCR-Reaktion mittels Verdünnen) funktioniert.

Anders ausgedrückt zeigt Fig. 3 eine Vergleichsdarstellung einer

Gelelektrophorese von Analyseergebnissen einer„Diluted Nested PCR" gemäß Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung, durchgeführt in einem Labor- PCR-Gerät. Das erste Reaktionsprodukt bzw. ein PCR-Produkt einer ersten PCR, einer multiplex-PCR, wurde um unterschiedliche Verdünnungsfaktoren verdünnt und als sogenannte Template-DNA für die zweite PCR, in Gestalt mehrerer singleplex-PCRs, verwendet. Dabei wurde ein Primerpaar für das PVL-

Gen eingesetzt. Einige der Spalten A, B, C, D, E, F, G und H in Fig. 3

repräsentieren hierbei die Analyseergebnisse, die aufgrund unterschiedlicher Verdünnungsfaktoren erhalten wurden.

In Spalte A ist ein PCR-Produkt der ersten PCR bzw. ein erstes

Reaktionsprodukt gezeigt. Spalte B zeigt ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR-Produkt der zweiten PCR, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 50 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. In Spalte C ist ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR-Produkt der zweiten PCR gezeigt, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 500 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. Spalte D zeigt ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR- Produkt der zweiten PCR, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 5000 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. In Spalte E ist ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR-Produkt der zweiten PCR gezeigt, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 50000 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. Spalte F zeigt ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR- Produkt der zweiten PCR, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 500000 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. In Spalte G ist eine Negativkontrolle dargestellt und Spalte H zeigt eine DNA-Leiter, lediglich beispielhaft vom Typ 50 bp plus.

Fig. 4 zeigt eine Vergleichsdarstellung von Analyseergebnissen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Die Analyseergebnisse sind dabei durch händisches Pipettieren unter Verwendung von Eppendorf-Tubes (= Reaktionsgefäße) entstanden: Die Ergebnisse zeigen, dass die Grundidee

(Inaktivierung von Primern einer ersten PCR-Reaktion mittels Verdünnen) funktioniert.

Anders ausgedrückt zeigt Fig. 4 eine Vergleichsdarstellung einer

Gelelektrophorese von Analyseergebnissen einer„Diluted Nested PCR" gemäß Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung, durchgeführt in einem Labor- PCR-Gerät. Das erste Reaktionsprodukt bzw. ein PCR-Produkt einer ersten PCR, einer multiplex-PCR, wurde um unterschiedliche Verdünnungsfaktoren verdünnt und als sogenannte Template-DNA für die zweite PCR, in Gestalt mehrerer singleplex-PCRs, verwendet. Dabei wurde ein Primerpaar für das

SSCl-Gen eingesetzt. Einige der Spalten A, B, C, D, E, F, G und H in Fig. 4 repräsentieren hierbei die Analyseergebnisse, die aufgrund unterschiedlicher Verdünnungsfaktoren erhalten wurden.

In Spalte A ist ein PCR-Produkt der ersten PCR bzw. ein erstes

Reaktionsprodukt gezeigt und Spalte B zeigt eine DNA-Leiter, lediglich beispielhaft vom Typ 50 bp plus. Spalte C zeigt ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR-Produkt der zweiten PCR, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 50 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. In Spalte D ist ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR-Produkt der zweiten PCR gezeigt, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 500 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. Spalte E zeigt ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR- Produkt der zweiten PCR, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 5000 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. In Spalte F ist ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR-Produkt der zweiten PCR gezeigt, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 50000 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. Spalte G zeigt ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR- Produkt der zweiten PCR, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 500000 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. In Spalte H ist eine Negativkontrolle dargestellt.

Fig. 5 zeigt ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens 500 zum Analysieren einer Probe biologischen Materials gemäß einem Ausführungsbeispiel der

vorliegenden Erfindung. Das Verfahren 500 ist unter Verwendung einer mikrofluidischen Vorrichtung ausführbar, die eine erste Reaktionskammer, eine fluidisch mit der ersten Reaktionskammer verbundene Mischkammer und zumindest eine fluidisch mit der Mischkammer verbundene, zweite

Reaktionskammer aufweist. Insbesondere ist das Verfahren 500 unter

Verwendung einer mikrofluidischen Vorrichtung ausführbar, wie sie

beispielsweise anhand der Fig. 1 bzw. Fig. 2 beschrieben ist. Das Verfahren 500 weist einen Schritt 510 des Ausführens einer ersten

Polymerase- Kettenreaktion an der Probe in der ersten Reaktionskammer auf, um ein erstes Reaktionsprodukt zu erzeugen. Auch weist das Verfahren 500 einen Schritt 520 des Mischens Des ersten Reaktionsprodukts mit einem

Verdünnungsmedium in der Mischkammer auf, um ein verdünntes Gemisch zu erzeugen. Ferner weist das Verfahren 500 einen Schritt 530 des Durchführens einer zweiten Polymerase- Kettenreaktion an dem verdünnten Gemisch in der zumindest einen zweiten Reaktionskammer auf, um die Probe zu analysieren.

Gemäß einem Ausführungsbeispiel werden im Schritt 520 des Mischens

Ansteuersignale zum Ansteuern zumindest eines Ventils und zusätzlich oder alternativ zumindest einer Fördereinrichtung der mikrofluidischen Vorrichtung erzeugt, um in dem verdünnten Gemisch ein Mischungsverhältnis zu bewirken, das geeignet ist, um Primer aus der ersten Polymerase- Kettenreaktion von der zweiten Polymerase- Kettenreaktion zumindest teilweise auszuschließen.

Im Folgenden werden Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die Figuren 1 bis 5 zusammenfassend und in anderen Worten erläutert.

Die Vergleichsdarstellungen aus den Figuren 3 und 4 zeigen, dass bei

Verdünnen des ersten Reaktionsprodukts bzw. des PCR-Produkts der ersten PCR, der multiplex-PCR, um den Faktor 500 mit Verdünnungsmedium in der Mischkammer 130 dann in der zumindest einen nachgeschalteten singleplex-

PCR, der zweiten PCR, ein einziges, spezifisches PCR-Produkt generiert wird. Eine Verdünnung des ersten Reaktionsprodukts kann verhindern, dass die Primer der ersten PCR auch in der zweiten PCR noch aktiv sind. Somit kann in der zweiten PCR nur das gewünschte singleplex-PCR-Produkt generiert werden, und nicht auch alle anderen, von den multiplex-Primerpärchen adressierten,

PCR- Produkte. So kann eine erhöhte Reaktionseffizienz bei sparsamerem Verbrauch von Reaktionskomponenten und Erhöhung einer Enzymaktivität erreicht werden, weshalb beispielsweise auch DNA-Sequenzen in kleinen Menge nachgewiesen werden können. Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird um einen Faktor 50 verdünnt. Hierbei kann eine teilweise Inaktivierung der Primerpärchen der ersten PCR erreicht werden, wie es in Fig. 3, Spalte B bzw. Fig. 4, Spalte C dargestellt ist. Die nötige Spezifität kann durch einen Einsatz von realtime-Sonden, die Signale nur bei Vorhandensein einer bestimmten DNA-Sequenz liefern, in der zweiten PCR erhalten werden. Wird dies beispielsweise unter Verwendung der

mikrofluidischen Vorrichtung 100 aus Fig. 2 realisiert, so weist beispielsweise die erste Reaktionskammer 110 ein Volumen von 10 Mikroliter auf und weist die Speicherkammer 270, die das Verdünnungsmedium mit Reaktionskomponenten enthält, ein Volumen von 490 Mikroliter auf.

Gemäß Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung kann eine Dicke der mikrofluidischen Vorrichtung 100 beispielsweise 0,5 bis 5 Millimeter betragen, wobei Kanaldurchmesser von mikrofluidischen Kanälen 10 Mikrometer bis 3 Millimeter und Volumen von Kammern zwischen 1 Kubikmillimeter bis 1000 Kubikmillimeter betragen können.

Ein beispielhafter Prozessablauf umfasst für eine erste PCR einen

Parameterraum mit einer Anzahl von 1 bis 20 Thermozyklen, wobei

Temperaturzyklen mit 93 Grad Celsius bis 96 Grad Celsius zur Denaturierung, 72 Grad Celsius zur Verlängerung, 54 Grad Celsius bis 65 Grad Celsius zur Primeranbindung vorgesehen sind, wobei es auch möglich ist, den Schritt auf der Verlängerungstemperatur wegzulassen und somit eine zweischrittige PCR durchzuführen. Für eine zweite PCR umfasst ein Parameterraum eine Anzahl von 20 bis 60 Thermozyklen, wobei Temperaturzyklen mit 93 Grad Celsius bis 96 Grad Celsius zur Denaturierung, 72 Grad Celsius zur Verlängerung, 54 Grad Celsius bis 65 Grad Celsius zur Primeranbindung vorgesehen sind, wobei es auch möglich ist, den Schritt auf der Verlängerungstemperatur wegzulassen und somit eine zweischrittige PCR durchzuführen. Eine Anzahl an Polymerase- Kettenreaktionen liegt beispielsweise für die erste PCR zwischen 1 und 20 Reaktionen und für die zweite PCR zwischen 1 und 50 Reaktionen.

Eine Messung eines PCR- Reaktionserfolgs umfasst beispielsweise einen Einsatz von Hydrolysesonden, beispielsweise TaqMan-Sonden, LightCycler-Sonden, LoopTag-Sonden, Scorpion-Primer oder Molecular Beacons. Hierbei kann an einem ansteigenden Fluoreszenzsignal der Reaktionserfolg bestimmt werden. Auch denkbar sind eine elektrische Auslese mittels ISFETs, eine

Impedanzmessung, eine Messung eines oberflächengebundenen PCR-Produkts mittels Interdigitalelektrodenstrukturen oder dergleichen.

Die beschriebenen und in den Figuren gezeigten Ausführungsbeispiele sind nur beispielhaft gewählt. Unterschiedliche Ausführungsbeispiele können vollständig oder in Bezug auf einzelne Merkmale miteinander kombiniert werden. Auch kann ein Ausführungsbeispiel durch Merkmale eines weiteren Ausführungsbeispiels ergänzt werden.

Ferner können die hier vorgestellten Verfahrensschritte wiederholt sowie in einer anderen als in der beschriebenen Reihenfolge ausgeführt werden.

Umfasst ein Ausführungsbeispiel eine„und/oder"- Verknüpfung zwischen einem ersten Merkmal und einem zweiten Merkmal, so ist dies so zu lesen, dass das Ausführungsbeispiel gemäß einer Ausführungsform sowohl das erste Merkmal als auch das zweite Merkmal und gemäß einer weiteren Ausführungsform entweder nur das erste Merkmal oder nur das zweite Merkmal aufweist.