VENTURINI ULIANA CAROLINA (BR)
SANTIAGO AFONSO ANDRÉ (BR)
BR0105260A | 2003-08-12 | |||
US6939451B2 | 2005-09-06 |
LOWINSOHN, D. ET AL.: "Sensores eletroquimicos: Considerações sobre mecanismos de funcionamento e aplicações no monitoramento de especies químicas em ambientes microscópicos", QUIMICA NOVA, vol. 29, no. 6, August 2006 (2006-08-01), pages 1318 - 1325
ANDRIEUX, G. ET AL.: "Technologies and market trends for polymer MEMS in microfluidics and lab-on- Microfluidics, BioMEMS, and Medicai Microsystems III", PROCEEDINGS OF SPIE, vol. 5718, February 2005 (2005-02-01), pages 60 - 64, XP055442019
Reivindicações 1. DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO, caracterizado por compreender um arranjo de 1 a 12 eletrodos de trabalho, um eletrodo de referência, um eletrodo auxiliar e um canal microfluídico contendo um orifício para entrada de solução, conectado a uma bomba de seringa e injetor manual, e um orifício para saída de solução. 2. DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por compreender um arranjo de preferencialmente 8 eletrodos de trabalho. 3. DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os eletrodos são fabricados em materiais poliméricos. 4. DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de que a sua fabricação utiliza uma impressora de corte doméstica, software compatível para desenho dos eletrodos, filme de vinil adesivo, folha de poliéster, tinta de carbono e plástico adesivo dupla face. 5. DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os eletrodos de trabalho possuem diâmetro de 1 ,0 a 5,0 mm. 6. DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO, de acordo com a reivindicação 5. caracterizado pelo fato de que os eletrodos de trabalho possuem preferencialmente diâmetro de 3,0 mm. 7. DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do dispositivo microfluídico ser provido de um canal dotado de dois furos nas extremidades para entrada e saída de solução. 8. DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato do referido canal ser produzido em um plástico adesivo dupla face de 0,4 mm de espessura, e apresentar dimensões de 200mm x 3,0mm, podendo ser alterados dependendo do diâmetro utilizado na construção dos eletrodos de trabalho. 9. DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato dos eletrodos serem utilizados como sensores químicos individuais. 10. DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO, de acordo com a reivindicação 1. caracterizado pelo fato dos eletrodos serem utilizados como biossensores para detecção de um ou mais composto simultaneamente. 11. DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado peio fato de ser utilizado para detecção de diferentes tipos de compostos, tais como: proteínas, anticorpos e DNA, para análises químicas e diagnósticos clínicos. 12. DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO, de acordo com a reivindicação 9. caracterizado pelo fato de ser utilizado para detectar biomarcadores proteicos para o diagnóstico de câncer. 13. DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de ser aplicável no desenvolvimento de imunossensores que utilizam métodos eletroqutmicos e eletroquimioluminescência para detecção. 14. DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO, de acordo com quaisquer reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o dispositivo é descartável, portátil, flexível, robusto, de baixo custo e fácil utilização para aplicações em locais com falta de recursos. 15. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO, caracterizado por compreender as etapas de: - projetar os desenhos dos eletrodos por meio de software apropriado; - cortar um filme de vinil adesivo nos formatos dos eletrodos, utilizando qualquer impressora de corte doméstica; - retirar as porções indesejadas, com uma pinça, deixando o molde dos eletrodos como uma máscara negativa; - transferir o vinil com o molde para uma folha de poliéster (película de transparência para impressoras a laser) com as dimensões 21 ,0 cm x 29,7 cm; - aplicar a tinta de carbono utilizando um pequeno rodo, conforme a seguir: - verter a tinta de carbono sobre o topo da superfície da máscara de vinil e arrastar através do molde, tanto para os eletrodos de trabalho como para os eletrodos de pseudo-referência, provendo em uma camada de -80 pm de espessura da tinta depositada sobre a folha de poliéster; - curar a tinta de carbono a uma temperatura de 90°C por 30 minutos; - depositar a tinta de Ag/AgCI como o eletrodo de referência; - curar a tinta de Ag/AgCI a uma temperatura de 60°C por 30 minutos; - cortar um canal com 200 mm x 3,0 mm em um plástico adesivo dupla face com 0,4 mm de espessura, utilizando impressora de corte; - colar a folha contendo o eletrodo de referência sobre uma face do plástico adesivo dupla face; e - colar a outra folha contendo os eletrodos de trabalho e o contra eletrodo na outra face do plástico adesivo dupla face. |
Campo da Invenção
[001] A presente invenção trata de um dispositivo microfluídico para ser utilizado em diagnósticos clínicos e análises químicas. Mais especificamente, a presente invenção trata de um dispositivo microfluídico produzido preferencialmente com materiais poliméricos e composto de 8 eletrodos de trabalho, um eletrodo de referência e um eietrodo auxiliar, no qual estes podem ser sensores químicos individuais ou biossensores utilizados para a detecção de diferentes compostos como proteínas, anticorpos, DNA ou compostos orgânicos e inorgânicos, aplicado na detecção de biomarcadores proteicos visando o diagnóstico do câncer.
Histórico da Invenção
[002] Como bem conhecido dos técnicos versados no assunto, o campo da microfluídica pode ser definido como a ciência e a engenharia de sistemas com dimensões micrométricas, em que o comportamento dos fluidos nesta ordem de grandeza pode diferir daquele observado em escala macro.
[003] Existem diversas aplicações para dispositivos microfiuidicos, dentre as quais podemos citar: determinação de pH, monitoramento de cinética de reações, interações biomoleculares, separações eletroforéticas, imunoensaios, citometria de fluxo, manipulação de células, além de análises proteômicas, metabolômicas, de DNA e várias outras aplicações.
[004] Notadamente, tais dispositivos trazem uma série de vantagens, pois possibilitam o diagnóstico "point-of-care" em países em desenvolvimento, onde a disponibilidade de recursos é limitada. Outras vantagens estão voltadas ao baixo custo, facilidade de uso, baixo consumo de reagentes (característica significativamente importante quando é preciso do uso de reagentes caros, ou em situações em que a quantidade de amostra é reduzida), portabilidade e desça fiabilidade.
[005] O documento WO2015038767-A1 descreve um método de construção de um dispositivo microfluídico com substratos de polidimetilsiloxano (PDMS), polidimetilmetacrilato (PMMA), policarbonato, poliepóxido, polímeros de olefina cíclica, copolímero de olefina cíclica e politereftalato de etileno. Nestes sistemas, um tratamento sobre a superfície de um dos substratos é feito para aumentar a adesão entre os dois substratos que foram fixados com um material polimérico curável adicionado entre eles.
[0061 O documento WO2010088219-A2 descreve a construção de um dispositivo microfluídico com base na moldagem de microcanais em polidimetilsiloxano, o qual é fixado por duas placas de vidro.
[007] Em outro documento BR102012012293-6A2 é descrito um sistema microfluídico, a base de poliéster-toner com o transporte da amostra por capilaridade para detecção de diversas amostras biológicas como glicose, proteínas, colesterol, triglicérides. lactato e ácido úrico.
[008] Em relação ao primeiro documento podemos ressaltar que este utiliza materiais curáveis e processo para aumentar a adesão entre os substratos, o que resulta em uma construção de alta complexidade. Já em relação ao segundo documento, podemos citar que embora utilize materiais de baixo custo, sua fabricação é baseada no uso de materiais rígidos e moldagem de microcanais, o que atribui ao dispositivo fragilidade e, portanto, facilmente quebrável. O terceiro documento aqui citado, ainda que utilize materiais de baixo custo para a detecção de amostras, esta é apenas semi-quantitativa. [009] Podemos citar ainda artigos como: "Design and rapid prototypíng of thin- film laminate-based microfiuidic devices" (Weigl et al. 2001). "Microfluidic Electrochemical Immunoarray for Ultrasensitive Detection of two Câncer Biomarker Proteins in Serum" (Chikkaveeraiah et ai. 2011). Tais artigos descrevem sistemas microfluídicos, porém ainda possuem as desvantagens citadas no parágrafo anterior.
[0010] Portanto, é objetivo da presente invenção prover um dispositivo microfiuídico para detecção de compostos, que trazem o emprego de materiais e equipamentos de baixo custo, flexíveis, robustos, descartáveis, contendo um arranjo de sensores para a fácil aplicação na determinação eletroquímica de um ou mais biomarcadores simultaneamente em amostras de interesse clínico voltado para países em desenvolvimento, como o Brasil.
Descrição Resumida da invenção
[0011] De acordo com a presente invenção, é provido um dispositivo microfiuídico aplicado na determinação eletroquimica de um ou mais biomarcadores simultaneamente em amostras de interesse clínico, dito dispositivo sendo produzido com materiais de baixo custo, tais como: uma impressora de recorte doméstica; folhas de poliéster como substrato e uma folha de poliestireno contendo adesivo dupla face para a construção do microcanal. O dispositivo ainda possui um arranjo de preferencialmente 8 eletrodos, um eletrodo de referência e um eletrodo auxiliar fabricados em materiais poliméricos que são utilizados para a construção de sensores químicos individuais ou biossensores, podendo ser utilizados para a detecção de diferentes tipos de compostos como proteínas, anticorpos, DNA, ou compostos orgânicos e inorgânicos. Nesta invenção, os eletrodos foram aplicados na determinação de biomarcadores proteicos para o diagnóstico de câncer. A configuração dos eletrodos pode ser facilmente modificadas permitindo a construção de eletrodos com diferentes diâmetros ou arranjos contendo diferentes números de eletrodos, não estando limitados a arranjos de apenas 8 eletrodos, podendo ser de 1 a 12 eletrodos.
[0012] Como será apreciado, este arranjo torna o custo de produção do dispositivo extremamente baixo conferindo ao mesmo flexibilidade, descartabilidade, robustez, facilidade de uso, portabilidade, simplicidade de construção e, portanto, adequado para produção em larga escala com aplicação voltada para países em desenvolvimento.
Breve Descrição das Figuras
[0013JO dispositivo microfluídico segundo a presente invenção poderá ser bem compreendido a partir das figuras ilustrativas em anexo, as quais de uma forma esquemática e não limitativa de seu escopo representam:
- Figura 1 - Esquema das etapas de construção dos eletrodos;
- Figura 2 - Esquema de montagem do dispositivo microfluídico;
- Figura 3 - Gráfico referente às respostas de correntes obtidas usando um conjunto de 8 eletrodos não modificados após a injeção de 100 μΙ_ de ácido ferrocenomonocarboxílico 1 ,0 x 10 -3 mol L -1 em KCI 0,1 mol L -1 e aplicação de 0,3 V vs. Ag|AgCI.
- Figura 4 - Gráfico pertinente aos voltamogramas cíclicos obtidos em solução de ácido ferrocenomonocarboxílico 1 ,0 x 10 -3 mol L 1 em meio de KCI 0,1 mol L * \ com velocidade de varredura de 50 mV s _1 .
- Figura 5 - Gráfico referente aos voltamogramas cíclicos em solução tampão PBS pH 7,0 contendo cada composto individualmente a concentração de 1 ,0 x 10 s mol L -1 . sendo a primeira varredura (curva 1), e a segunda varredura (curva 2), com velocidade de varredura de 50 mV s _1 .
- Figura 6 - Gráfico pertecente aos voltamogramas cíclicos obtidos com eletrodos modificados com PDDA / AuNP-GSH / HRP em solução somente de PBS 0,1 mol L- 1 pH 6,5 (1), PBS 0,1 mol L' 1 pH 6,5 contendo 1 ,0 x 10 -4 mol L 1 de H2O2 (2), PBS 0,1 mol L 1 pH 6.5 contendo 1 ,0 x 10 3 mol L' 1 de HQ (3) e PBS 0,1 mol L -1 pH 6,5 contendo 1 ,0 x 10 3 mol L -1 de HQ e 1 ,0 x 10 -4 mol L -1 de H2O2 (4). Parâmetros: Εί= 0,1 V; EF -0,45 V, com velocidade de varredura de 20 mV s 1
- Figura 7 - Gráfico correspondente ás respostas amperométricas individuais para soluções de ERa em soro de bezerro não diluído em concentrações de a) 0, b) 5,6 fg ml/ 1 , c) 28 fg ml/ 1 , d) 0,11 pg ml/ 1 , e) 1 ,1 pg mL- 1 , f) 2,8 pg ml/ 1 a -0,2 V vs. Ag|AgCI e Curva analítica para detecção de ERa.
- Figura 8 - Gráfico correspondente às respostas amperométricas individuais para soluções de CA 15-3 em soro de bezerro não diluído em concentrações de 1 ,0 x 10 6 a 1 ,0 x 10 -3 U mL' 1 a -0,2 V vs. Ag|AgCI e Curva analítica para detecção de CA 15-3.
Descrição Detalhada da Invenção
[0014] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um dispositivo mícrofluídico que compreende oito eletrodos podendo ser utilizados como biossensores ou sensores químicos individuais, tendo a possibilidade de ser aplicado na detecção de diferentes tipos de compostos como proteínas, anticorpos, DNA ou outros compostos orgânicos e inorgânicos. Precisamente, a presente invenção utiliza os eletrodos na determinação de biomarcadores proteicos para o diagnóstico de câncer. A configuração dos eletrodos pode ser facilmente modificada permitindo a construção de eletrodos com diferentes diâmetros ou arranjos contendo diferentes números de eletrodos, não estando limitados a arranjos de apenas 8 eletrodos, podendo ser de 1 a 12 eletrodos.
[0015] O conjunto de eletrodos de carbono impresso, composto por oito eletrodos de trabalho, um eletrodo de referência e um eletrodo auxiliar, foi construído de acordo com o seguinte procedimento: Um filme de vinil adesivo é cortado nos formatos dos eletrodos, sendo utilizado para o corte qualquer impressora de corte doméstica e software para desenho compatível. O diâmetro dos eletrodos de trabalhos é preferencialmente de 3 mm, podendo ser entre 1,0 e 5,0 mm. Após o corte do filme de vinil adesivo, as porções indesejadas foram retiradas usando uma pinça, deixando o molde dos eletrodos, como uma máscara negativa. A seguir, o vinil com o molde é transferido para uma folha de poliéster (pelicula de transparência para impressoras a laser) com as dimensões 21,0 cm x 29,7 cm e então a tinta de carbono é aplicada utilizando-se um pequeno rodo, em três etapas: Primeiro, a tinta de carbono foi vertida sobre o topo da superfície da máscara de vinil e arrastada através do molde, tanto para os eletrodos de trabalho como para os eletrodos de referência e auxiliar, resultando em uma camada de ~80 pm de espessura da tinta depositada sobre a folha de poliéster. Após a cura da tinta por 30 minutos a 90 °C, a tinta de Ag/AgCI foi depositada como o eletrodo de referência, seguido de cura por 30 minutos a 60 °C.
[0016] Todo o processo é ilustrado na Figura 1 , na qual o fluxograma superior ilustra a construção dos eletrodos de trabalho, e o fluxograma inferior ilustra os eletrodos de referência, sendo 1) folha de transparência, 2) vinil adesivo contendo os padrões dos eletrodos são colocados sobre a folha de transparência; 3) deposição da tinta de carbono, seguido por deposição da tinta de AgjAgCI nos eletrodos referência; 4) a remoção do vinil adesivo.
[0017] Para a obtenção do dispositivo microfluídico, um canal de 200 mm x 3,0 mm por onde a solução é transportada, é cortado um plástico adesivo dupla face de 0,4 mm de espessura usando uma impressora de corte compativel. As dimensões do canal microfluídico podem ser facilmente alteradas, uma vez que as medidas referentes a espessura e largura do canal são escolhidas no momento da concepção e configuração do canal usando o software apropriado. O sistema é montado colando-se a folha contendo o eletrodo de referência sobre um lado do plástico adesivo e outra folha contendo os eletrodos de trabalho e eletrodo auxiliar na outra face do plástico, conforme mostrado na Figura 2. Para entrada e saída de solução foram feitos dois furos nas extremidades do canal.
[0018] A Figura 2 demonstra o processo do esquema de montagem do dispositivo microfluídico, sendo 1) arranjo contendo oito eletrodos de trabalho e o eletrodo auxiliar; 2) colagem de adesivo dupla face de plástico contendo o canal sobre a transparência contendo eletrodos; 3) dispositivo selado com a transparência contendo o eletrodo de referência; 4) o dispositivo microfluídico pronto para uso.
Procedimentos experimentais
[0019] Com o objetivo de avaliar a performance do arranjo de eletrodos no sistema microfluídico, inicialmente foram feitas medidas por amperometria usando uma solução de ácido ferrocenomonocarboxílico na concentração 1 ,0 x 10 3 mol L/ 1 em meio de KCI 0,1 mol L \ O arranjo contendo oito eletrodos sem modificação foi montado, 100 μΙ_ da solução de ácido ferrocenomonocarboxílico foi injetada no sistema e aplicou-se 0,3 V vs. Ag|AgCI.
[0020] A Figura 3 ilustra em um gráfico as respostas de correntes obtidas usando o conjunto de 8 eletrodos não modificados após a injeção de 100 pL de ácido ferrocenomonocarboxílico 1 ,0 x 10- 3 mol L' 1 em KCI 0,1 mol L.- 1 e aplicação de 0,3 V vs. Ag|AgCI.
[0021] As intensidades de correntes obtidas após a injeção de solução de ácido ferrocenomonocarboxílico foram muito semelhantes para os oito eletrodos do dispositivo, com uma média de 2,04 ± 0,01 μΑ e um desvio padrão relativo de 0,69%, demonstrando uma boa reprodutibilidade das áreas dos eletrodos. [0022] Os eletrodos de carbono construídos pelo método descrito podem ser aplicados na detecção de diversas espécies químicas, seja como eletrodo sem modificação ou com a modificação da superfície de forma a se obter resposta seietivas a um determinado analito (espécie que se quer detectar).
[0023] Com o intuito de se avaliar as potencialidades dos eletrodos de carbono descartáveis, foram realizadas medidas eletroquí micas de diferentes compostos. As técnicas eletroanalíticas de voltametria cíclica e voítametria de onda quadrada foram empregadas.
Experimento A
[0024] Foram feitas medidas em solução de ácido ferrocenomonocarboxilico de 1,0 x 10' 3 mol L -1 em meio de KCI 0,1 mol ΙΛ A Figura 4 evidencia o perfil voltamétrico do ácido ferrocenomonocarboxilico, avaliado por voltametria cíclica usando 8 eietrodos.
[0026] Neste estudo observa-se que as intensidades de corrente de oxidação e de redução foram muito similares para os oito eletrodos, apresentando um desvio padrão relativo de 4,0%.
Experimento B
[0026] Medidas eletroquímicas foram feitas utilizando compostos altamente adsortivos, como o corante disperso Red 1 (DR1), o 10-gingerol, o resveratrol e a hesperitina. Todas as soluções foram preparadas na concentração de 1 ,0 x 10- 5 mol L -1 e avaliadas individualmente por voltametria cíclica na região de oxidação. [0027] A Figura 5 apresenta os voltamogramas cíclicos obtidos para cada composto.
[0028]Por meio da voltametria ciclica, observa-se na Figura referente ao DR1 a presença de um pico de oxidação em +0.73 V. A intensidade de corrente de pico sofre uma diminuição de aproximadamente 52% durante a segunda varredura, indicando um forte processo de adsorção do corante sobre a superfície eletródica. A Figura referente ao 10-gingerol mostra a presença de um pico de oxidação em +0,31 V, que sofre um decaimento de 80% da intensidade de corrente de pico na segunda varredura. O composto resveratrol apresentou um pico de oxidação no potenciai de +0,35 V que pode corresponder à oxidação do grupo 4'-hídroxila do resveratrol. Conforme mostrado na Figura, a intensidade de corrente de pico sofre uma diminuição de 54% após a segunda varredura. A segunda varredura realizada na solução de hesperitina mostra que a intensidade de corrente de pico em +0,45 V sofre uma diminuição de 50% de seu valor inicial, indicando que produtos da oxidação do composto podem causar uma passivação do eletrodo.
[0029] Os resultados apresentados mostram que o eletrodo de carbono descartável apresenta-se como uma adequada superfície eletródica para estudos eletroquímicos de diferentes compostos. O fato de algumas espécies sofrerem processos de adsorção durante a oxidação não se mostra um problema, visto que não são necessários procedimentos de limpeza ou reativação da superfície do eletrodo, reduzindo o tempo de análise. O eletrodo desenvolvido pode, então, ser aplicado no desenvolvimento de metodologias analíticas para determinação dos compostos de interesse clínico, ambiental, farmacêutico e biológico.
Experimento C [0030] A imobilização da enzima HRP sobre os etetrodos realizada pela técnica de layer-by-layer. Para a formação do layer-by-layer, primeiramente foi realizada a adsorção uma camada do policátion polidimetildialilamõnio (PDDA) a partir de uma solução aquosa de concentração 2,0 mg mL' 1 contendo 0,05 mol L 1 de NaCI por 20 minutos. Após enxágue com água, realizou-se a adsorção de uma camada carregada negativamente de partículas de ouro de ~250 nm modificadas com glutationa (AuNP-GSH), por 20 minutos, seguido de enxágue com água. Na sequência, realizou-se a ativação dos grupos carboxilas da glutationa presente nas nanopartículas de ouro com 0,4 mol L *1 de EDC e 0,1 mol L -1 de NHS por 10 minutos, e após enxágue, adícionou-se uma solução de HRP 3,0 mg mL 1 por 3 horas. Posteriormente ao enxágue para retirada das moléculas não imobilizadas, realizou-se a medida eletroquímica em uma solução contendo os substratos enzimáticos H2O2 1,0 x IO- 3 mol L -1 e hidroquinona (HQ) 1 ,0 x 10 4 mol L *1 em PBS pH 6,5 por voltametria cíclica no intervalo de potencial de +0,1 V a -0,45 V, com velocidade de varredura de 20 mV s 1 .
[0031] A Figura 6 mostra os voltamogramas obtidos com os eletrodos modificados quando em solução somente de PBS, em PBS contendo H2O2, em PBS contendo HQ e em PBS contendo H2O2 e HQ.
[0032]Nota-se a presença de um pico de redução em -0,25 V apenas quando os eletrodos modificados estão na presença dos substratos enzimáticos H2O2 e HQ, indicando que houve a catálise enzimática, confirmando a imobilização da enzima HRP. Desta maneira, a metodologia de imobilização de biomoléculas por layer-by-layer se mostrou adequada para a modificação dos eletrodos na construção dos biossensores.
Experimento D [0033] Construção de um biossensor eletroquímico acoplado a um sistema microfluídico para a detecção de ERa, o Receptor de Estrógeno Alfa, um biomarcador usados no diagnóstico de câncer de mama, que regula a expressão de genes e afeta a proliferação celular e diferenciação no tecido alvo. Para a modificação das superfícies eletródicas, as etapas consistiram em:
1- formação de layer-by-layer com PDDA e AuNP modificadas com glutationa;
2- imobilização de NH2-DNA contendo a sequência específica para a interação com ERa. Para a etapa de captura e interação do analito na amostra, utilízou- se partículas magnéticas previamente modificadas com anticorpo monoclonal anti-ERa e com a enzima HRP. Tais partículas magnéticas modificadas após a captura do analito foram injetadas no sistema em fluxo e, ao atingirem o canal contendo os eletrodos modificados, o fluxo foi pausado por 30 min. Após a interação com o analito. medidas amperométricas foram conduzidas a -0,20 V vs. AgjAgCI, enquanto 100 μΐ_ de H2O2 1,0 x 10 -4 mol e hidroquinona 1 ,0 x 10 -3 mol L' 1 foram injetados no dispositivo microfluídico.
[0034] A Figura 7 mostra as respostas amperométricas utilizando o biossensor com as concentrações crescentes de ERa e a relação linear entre a intensidade de corrente obtida e a concentração do analito.
[0035] Cada concentração na curva analítica foi detectada utilizando um novo arranjo de oito eletrodos, resultando em oito respostas para cada ponto e as pequenas barras de erro indicam uma excelente reprodutibilidade dos eletrodos. A faixa linear é de 5.6 fg mL 1 a 2,8 pg mL' 1 com um limite de detecção de 0,27 fg mLr\ mostrando que o biossensor desenvolvido apresentou excelente resposta, com um limite de detecção ultrabaixo e ausência de interferências. O biossensor desenvolvido mostrou-se adequado para a detecção de ERa e pode ser aplicado em amostras de células sem a necessidade de etapas de pré-tratamento da amostra. Experimento E
[0036] Construção de um biossensor eletroquímico acoplado a um sistema microfluidico para a detecção de CA 15-3, um marcador sérico amplamente utilizado em pacientes com câncer de mama. Para a modificação das superfícies eletródicas, as etapas consistiram em: 1- formação de layer-by- layer com PDDA e AuNP modificadas com glutationa; 2- imobilização de anticorpo policlonal anti-CA 15-3. Para a etapa de captura e interação do analito na amostra, utilizou-se partículas magnéticas previamente modificadas com anticorpo monoclonal anti-CA 15-3 e com a enzima HRP. Tais partículas magnéticas modificadas após a captura do analito foram injetadas no sistema em fluxo e, ao atingirem o canal contendo os eletrodos modificados, o fluxo foi pausado por 30 min. Após a interação com o analito. medidas amperométricas foram conduzidas a -0,20 V vs. Ag|AgCI, enquanto 100 pL de H2O2 1 ,0 x 10 -4 mol L -1 e hidroquinona 1 ,0 x 10 3 mol L -1 foram injetados no dispositivo microfluidico.
[0037] A Figura 8 apresenta os sinais amperométricos obtidos para concentrações de CA 15-3 e a relação linear entre a intensidade de corrente obtida e a concentração do analito.
[0038]A Figura 8 apresenta os sinais amperométricos obtidos para concentrações de CA 15-3 variando de 1 ,0 x 10 -6 U ml_- 1 a 1 ,0 x 10 3 U mL -1 e a relação linear entre o aumento da intensidade de corrente e o aumento da concentração de CA 15-3, com equação de reta de y= -0,04576 -0,00338 log (x), r= 0,9599, observando-se a possibilidade de boa performance do biossensor na detecção do biomarcador CA 15-3.