La presente invención hace referencia a un dispositivo microfluídico que separa partículas del líquido en el que están contenidas maximizando la cantidad de líquido extraído de una mezcla inicial. En concreto, puede separar plasma de una gota de sangre para formar parte de un dispositivo portable de análisis de sangre.

ESTADO DEL ARTE

Hoy en día, se ha hecho un progreso considerable dentro del campo de la microfluídica, especialmente en aplicaciones relacionadas con la química, la biología y la biomedicina. De hecho, los productos de diagnóstico portátiles no podrían desarrollarse si no fuese por esta tecnología. La mayoría de intentos hechos por investigadores en estos años se han focalizado en desarrollar un chip microfluídico para la separación de plasma de la sangre, pero aunque hay muchos intentos existen aún muchos handicaps como mejorar la eficiencia (cantidad de plasma extraído) sin hemolisis (ruptura de los glóbulos rojos).

El uso de la microfluídica no solo es conveniente debido a su pequeño tamaño, sino que además hace que se puedan obtener resultados más rápidamente.

En los test tradicionales, las muestras de sangre esperan durante mucho tiempo a que todos los procesos se hayan completado. Eso aumente las posibilidades de erras y hace que la sangre no se encuentre en sus óptimas condiciones.

Los nuevos test diagnósticos pueden ser más precisos ya que el uso de la microfluídica permite utilizar una gota de sangre justo extraída, con lo que la sangre es más fresca y como no hay manipulación se minimizan los errores y los resultados se obtienen más rápido.

La sangre se utiliza en muchos análisis para detectar un amplio rango de enfermedades. Pero previamente, los elementos de la sangre se separan: plasma (serum más fibrinógeno), glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas. La sangre normal está constituida por un 45% glóbulos rojos, 1 % glóbulos blancos, 0.5% plaquetas y el resto plasma. Los glóbulos rojos son células deformables con forma de disco de 8 mieras de diámetro y una altura de 2 mieras. Los glóbulos blancos tienen un diámetro entre 8 y 12 mieras y previenen de las infecciones. El otro componente principal de la sangre son las plaquetas que se agregan para formar coágulos. Todas estas partículas se hallan suspendidas en el plasma, que está formado en un 90% de plasma y tiene color amarillento. A parte de agua, el plasma contiene pequeñas partículas (entre 1 y 3 mieras de diámetro) que son básicamente serum, albúmina, factores de coagulación, hormonas, dióxido de carbono, proteínas, electrolitos y inmunoglobulina.

Actualmente, la separación del plasma de la sangre se realiza mediante centrifugación en un laboratorio y se requieren cantidades de sangre relativamente elevadas (mililitros) o mediante sedimentación pero este proceso es muy lento. Así pues, la minimizar errores, reducir el tiempo entre la extracción y la obtención de los resultados del test, los dispositivos tipo "lab-on-a chip" (laboratorio en un chip) son atractivos para la separación del plasma de la sangre y la posterior integración del test. Los investigadores han desarrollados sistemas de separación de plasma que utilizan distintas técnicas en microfluídico, como filtración con flujo perpendicular, desplazamiento determinístico lateral, flujo estrangulado, técnicas dieletroforéticas o separación biomimética. Pero la mayoría de estas técnicas necesitan una fuente de presión o bomba que puede que los usuarios de un test portátil no tengan disponible.

Hay otro grupo de científicos que se han centrado en el desarrollo de filtros microfluídico sin fuentes externas, pero el volumen de plasma extraído antes que se produzca la colmatación de la entrada del canal de separación es mínimo y no suficiente para implementar análisis de sangre.

Así pues, sería deseable contar con un dispositivo que pudiera separar la máxima cantidad de líquido de un líquido que contiene partículas deformables.

Ralf-Peter Peters et al. U.S. Patent Application Publication No. US 2004/0232074, patentan una microestructura que separa plasma de la sangre. La microestructura incluye un canal de transporte recto, por donde la sangre circula, un canal de separación en una bifurcación del canal de transporte que se une perpendicularmente a este y con una altura diferente del inicial. En esta bifurcación es por donde el plasma circular. Este canal de separación tiene una microestructura que retiene las partículas grandes y ralentiza las pequeñas (efecto cromatográfico, el líquido que transporta las partículas tiende a moverse más rápido que estas). Si el canal de separación tiene una altura superior a las partículas que se quieren filtrar o las partículas son deformables y pueden entrar, la cualidad del líquido filtrado no será 100% libre de partículas. Pero si la área de filtración tiene una altura menor que las partículas a ser filtradas no hay un mecanismo que evite el colamatamiento de la entrada, de manera que las partículas grandes taparan la entrada limitando la cantidad de fluido que se puede extraer. La alta concentración de partículas en la sangre (45% de glóbulos rojos) causa que la separación por efecto cromatográfico de lugar a una extracción de plasma muy limitada, y con muchas probabilidades no suficiente para implementar test sanguíneos. Además el diseño presentado en ésta patente se basa en fabricar canales de distintas alturas en una única pieza y cubrir el canal con una tapa. Proceso de fabricación que puede ser complejo.

Jee-Hoon Seo et al. International Patent NO. WO 2005/095954, presentaron otro diseño de filtro que no utiliza membranas u otros dispositivos para separar plasma de la sangre. El filtro está formado por un sustrato que incluye un canal. Este canal tiene una entrada y al menos dos salidas separadas un cierto ángulo, una de otra; y un conjunto de estructuras rectangulares (pilares) colocadas en el canal principal con un cierto ángulo las unas respecto a las otras. Las estructuras rectangulares en el canal permiten separar el plasma de la sangre según su disposición. Aunque esta invención proporciona un diseño para separar plasma de la sangre, la eficiencia de separación es no es muy buena (bastante cantidad de partículas se encuentran en el canal de salida), debido a que la distancia entre pilares sea de alrededor de 10 mieras y que los glóbulos rojos pueden deformarse, éstos consiguen pasar a través de los pilares hacia la salida.

El objetivo de la presente invención es crear un chip microfluídico que pueda ser parte de un dispositivo de diagnóstico portátil (Point-of-care, POC) el cual a partir de una gota de sangre pueda separar sin fuerzas externas una cantidad de plasma suficiente para hacer análisis de alta calidad (>90% sin células) y en un tiempo razonable (minutos).

Otro punto importante comparado con las patentes previas, consiste en maximizar la cantidad de volumen extraído del volumen inicial. Esto se consigue gracias al hecho que la presente invención considera el comportamiento reológico de los glóbulos rojos dentro del canal de transporte, y retrasa la colmatación de la entrada hasta que al menos el canal/cámara de recogida está lleno. Este retraso se consigue actuando en dos puntos: primero, el canal de recogida se llena más rápidamente que en diseños previos, ya que la área de separación se ha diseñado como una bomba capilar de grane eficiencia, además de tener el comportamiento hidrofílico apropiado. Segundo, se minimiza la concentración de glóbulos rojos a la entrada en la zona de separación, que en lugar de estar situada solo a un lado del canal de transporte como en la patente N. US 2004/0232074, se ha situado de forma simétrica a ambos lados del canal de transporte. Este hecho hace que las fuerzas capilares que actúan sobre los glóbulos rojos que circulan dentro del canal de transporte se vean compensadas, de manera que la trayectoria de éstos no se ve muy afectada y se reduce el problema de colmatación de la entrada de la zona de separación y tercero, si fuera necesario sería posible colocar unos electrodos a la entrada y a la salida del canal para aplicar fuerzas electroforéticas sobre los glóbulos rojos forzándolos a alejarse de la entrada de la zona de separación.

Otro objetivo de la presente invención es presentar un dispositivo que pueda ser producido en serie utilizando distintos procesos de fabricación. Con este fin el dispositivo se ha dividido en dos partes: el canal de transporte y de separación se hallan en un parte y la zona de separación en otra. Esta característica que no se menciona en las demás patentes podría facilitar en gran medida la fabricación.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Esta invención consiste en un dispositivo microfluídico 100 para la separación de partículas deformables de un líquido que las contiene sin fuerzas externas mediante filtración fuera del plano del canal. El dispositivo microfluídico está compuesto por dos partes: (101) parte superior que comprende al menos un canal de transporte (1) que utiliza varios principios hidrodinámicos para maximizar el volumen de líquido separado por el dispositivo (100) y una parte inferior (102) que contiene al menos una área de separación (2) que filtra las partículas y actúa como bomba capilar para impulsar el fluido al canal de recogida (3), éste pude ser uno o varios y puede tener una altura adaptable en función de las necesidades de sensibilidad del test que se vaya a implementar.

La área de separación puede incluir una matriz de pilares (su forma puede ser diferente y su colocación también en función de la cantidad de fluido que se desee extraer). Si la cantidad de líquido extraído no es suficiente para realizar el test el dispositivo permite colocar a la entrada y a la salida dos electrodos (4 y 5) para alejar los glóbulos rojos de la entrada del área de separación y así permitir más extracción de fluido.

La invención consta de un canal principal (para el transporte del líquido que incluye las partículas), que incluye al menos un estrangulamiento (1b), pasado este o en este punto el canal principal se divide y se conecta a un canal/zona de filtración (2) situada fuera del plano del canal de transporte. Por el canal (2) circula el fluido sin partículas. El estrangulamiento (1 b) incrementa la velocidad local de la partícula y retrasa la colmatación de la entrada del canal/área de separación (2) incrementando en consecuencia la cantidad de fluido que se puede separar.

En otro diseño de la invención, el canal principal (1 ) se extiende después de la separación con una microbomba capilar que consiste en un conjunto de canales paralelos (41) en la Figura 5 o una matriz de pilares (51) en la Figura 6. En estos diseños, las fuerzas capilares promueven más flujo en el canal de manera que se disminuye la posibilidad de colmatación de la entrada de la zona de separación. El diseño de la invención tienes varias ventajas sobre diseños previos para separar partículas de un líquido de las contiene, maximizando la cantidad de líquido extraído. Por un lado, el diseño no necesita actuación externa, es decir, que la fuerzas capilares son suficientes para transportar el líquido a través de los canales. La fuerza capilar se consigue a través de la hidrofilicidad del material ya sea a través de la modificaciones de materiales hidrofóbicos como el PDMS (con recubrimientos hidrofílicos o tratamientos de plasma de 0 ₂ ) o bien utilizando directamente materiales hidrofílicos. Si se utiliza un material hidrofóbico como el Polydimethylsiloxane (PDMS), surfactantes noiónicos se pueden aplicar para compensar su hidrofobicidad.

En esta invención se minimiza la concentración de glóbulos rojos a la entrada del área de separación, por este motivo la altura del área de separación (H2, figura 1 b) es menor que la altura del canal principal (H1 , figura 1 b) y claramente menor que el diámetro de la partículas que se pretende filtrar. De manera, que la calidad del líquido filtrado es mejor que en diseños previos, muchos de los cuales tenían alturas superiores al tamaño de partícula a filtrar. Además, si nos centramos en la obtención de plasma de la sangre, la deformabilidad de los glóbulos rojos hace que se tenga que restringir la altura H2 entre 0.5 y 2 mieras.

El diseño del dispositivo puede contar también con varias áreas de separación, que se sitúan una detrás de otra, ver figuras 7, 8 y 9 donde estas áreas son la 21 y 22.

Para recoger el plasma filtrado, el dispositivo dispone de un canal de recogida (3) que recoge las salidas de las diferentes áreas de separación. En un dispositivo de diagnóstico portátil, en este canal (3) se podrían localizar los reactivos para realizar el test o si no quiere integrarse se podría recoger el líquido filtrado con una jeringa.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La descripción de la invención se realiza a través de los siguientes dibujos.

FIG 1A muestra una vista general del diseño microfluídico que se reivindica en la invención.

FIG 1 B muestra una sección del diseño a través de la zona de filtración.

FIG 2 es una ilustración esquemática del incremento de velocidad al que se ven sometidas las partículas en el estrangulamiento del canal principal para evitar la acumulación de partículas en el área de filtración. Además se muestra el estrangulamiento progresivo para evitar el daño en partículas biológicas y las fuerzas capilares aplicadas sobre las partículas al pasar a través de la zona de separación.

FIG 3 muestra una vista en planta de otra versión de la invención en la cual el canal principal es curvado.

FIG 4 muestra una vista den planta de otra versión de la invención en la cual el canal principal es curvado y el canal de recogida se halla en el lado opuesto a la dirección del flujo de plasma.

FIG 5 muestra una vista en planta de la invención a la cual se le ha añadido al canal principal una bomba capilar (de canales paralelos) para promover el flujo en el canal principal.

FIG 6 muestra una vista en planta de la invención a la cual se le ha añadido al canal principal una bomba capilar (matriz de pilares) para promover el flujo en el canal principal.

FIG 7 muestra una vista en planta de la invención con tres áreas de separación. FIG 8 muestra una vista en planta de la invención con tres áreas de separación con una reducción de la longitud del canal principal después de cada área de separación.

FIG 9 muestra una vista en planta de la invención con seis áreas de separación para incrementar la cantidad de líquido extraído.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La figura 1A ilustra una primera versión del dispositivo microfluídico que tiene un canal de transporte recto ( 1 ) con un orificio de entrada ( 11 ) y un orificio de salida ( 12 ) , un canal de flujo principal primario ( 1a ) está unido a través de un estrangulamiento ( 1b ) a un canal de menor anchura ( 1c ) y luego se vuelve a su anchura normal (1e) a través de otra transición o estrangulamiento ( 1d ) . Estas dos transiciones (1b) y (1d) pueden ser rectas o curvadas como se muestra en la figura 2 para reducir el riesgo de daños en partículas biológicas (células). Estas dos transiciones proporcionan una reducción suave del flujo de 1a a 1c o 1c a 1e. Específicamente en las células de la sangre, la hemolisis (la ruptura de los glóbulos rojos) aumenta debido a la tensión inducida en el estrangulamiento. Durante la mayor parte de su longitud, el canal de transporte de menor anchura ( 1c ) está cubierto por una zona de separación ( 2 ), que se mecaniza en otra parte ( 101 ) . En el caso de la sangre, el plasma sanguíneo que ha de ser separado fluye a través de esta zona de separación ( 2 ) que también está conectado a un canal de recogida ( 3 ) para donde se implementará el análisis de sangre . El líquido filtrado se recoge desde la zona de separación a un canal de recogida ( 3 ) que está conectado con el medio ambiente a través de un puerto de extracción ( 31 ) o un área de test . Una bomba de jeringa se puede conectar al puerto de extracción ( 31 ) con el fin de eliminar el plasma sanguíneo separado del canal de recogida ( 3 ) si es necesario. Si fuera necesario aumentar el tiempo de extracción, los electrodos 4 y 5 se pueden colocar para aplicar fuerzas eléctricas alternas sobre las partículas para evitar la obstrucción de la entrada de la zona de separación.

La figura 1 B muestra una sección transversal del dispositivo de separación en la que el canal de transporte ( 1 ) y el canal de recogida ( 3 ) se mecanizan en la parte superior ( 102 ) . El área de separación puede incluir una disposición de micropilares ( 2 ) y está mecanizada en la parte inferior ( 101 ) . La H2 altura se fija según el tamaño de las partículas a filtrar, mientras que la altura H1 de los canales 1 y 3 en la pieza superior ( 102 ) se fija según el espesor de líquido requerido por la prueba a realizar .

En el área de separación 2 las fuerzas capilares son mayores que en el canal de transporte de menor anchura 1c de tal manera que la velocidad de flujo de la muestra en el canal de transporte principal 1 se ralentiza con respecto a la velocidad de flujo del líquido extraído/filtrado en la zona de separación 2 con ello la obstrucción de la superficie de entrada a la zona de separación 2 puede ocurrir debido a la acumulación de partículas. Para resolver el problema de obstrucción, al canal de transporte principal se le ha realizado un estrangulamiento (1 b y 1 d) para aumentar la velocidad de flujo de las partículas cuando estas pasan por debajo de la zona de separación. La figura 2 ilustra los principios hidrodinámicos utilizados para evitar la obstrucción en la entrada de la zona de separación. En particular en la separación de plasma de la sangre, los glóbulos rojos tienden a migrar hacia el interior de los vasos y dejar la región adyacente a la pared del vaso libre de partículas (plasma skimming). Además, cuando un vaso se ramifica en dos, las células de la sangre tienden a moverse en la rama que tiene la mayor velocidad y dejar la rama que tiene menor velocidad de flujo, este efecto se conoce como efecto de bifurcación. Además de estos dos fenómenos, la reducción de sección del canal de transporte que se utiliza en la presente invención y la distribución simétrica del área de separación aumenta el tiempo hasta que se produce acumulación de partículas a la entrada del canal.

La Figura 2 ilustra el hecho de que la extracción de plasma de la sangre se incrementa debido al uso de un diseño de canal de filtración simétrico ((d1 =d2, ver figura 2)) que hace que se contrarresten las fuerzas capilares transversales en dirección opuesta, lo que resulta en una fuerza inadvertible en los glóbulos rojos que circulan por el canal de transporte y por consiguiente, la reducción de la obstrucción y el incremento de extracción de plasma.

La figura 3 ilustra otra versión del dispositivo de microfluídico en el que la dirección del flujo del canal principal 1a es paralela al flujo en el área de separación 2 para aumentar el rendimiento microdispositivo. Esto se ha logrado con la construcción del canal de transporte con una forma curvada. El plasma de la sangre (líquido extraído) fluye a través de la zona de separación más rápidamente que en la primera versión del microdispositivo porque la dirección de flujo es la misma que en el área de separación, pero el tiempo de llenado del canal de recogida se incrementará debido a la obstrucción de glóbulos rojos en la entrada de la zona de separación debido a que la fuerza centrífuga aplicada sobre éstos hace que se acumulen en la entrada de la zona de separación. Para evitar la obstrucción se pueden utilizar los electrodos 4 y 5 para aplicar fuerzas electroforéticas alternantes sobre los glóbulos rojos.

La figura 4 ilustra una versión modificada de la microdispositivo mencionado en la figura 3. En este caso, el canal de transporte es también es curvado, pero el canal de recogida se coloca por debajo de la entrada y la salida. Entonces la fuerza centrífuga que actúa sobre los glóbulos rojos/partículas los mueve lejos de la zona de separación. El plasma o líquido extraído fluye a través de la zona de separación más lentamente que en la versión de microdispositivo de la figura 3, debido a que la dirección del flujo de líquido (o sangre) es opuesta al flujo de líquido extraído (o plasma).

Otro efecto hidrodinámico para retrasar la obstrucción del área de separación es el aumento de las fuerzas de cizallamiento que actúan sobre las partículas y por lo tanto promover el flujo mediante el aumento de la fuerza capilar con la que el líquido es transportado a través del dispositivo.

La figura 5 y la figura 6 muestran otra versión del dispositivo microfluídico donde el canal principal 1e se extiende a través de una colección de microcanales paralelos 41 en la figura 5 o a través de una colección de micropilares circulares 51 en la figura 6. En los dos, las partículas son conducidas lejos de la zona de entrada del área de separación (2) por la fuerza de cizalla inducida debido a la fuerza capilar generada de éstas dos microbombas (41 o 51).

La figura 7 muestra un diseño de microdispositivo con tres etapas de separación que incluye tres áreas separadas 2 , 21 , 22 para aumentar la eficiencia de la separación . En la figura 7 la muestra suministrada en el orificio de entrada 11 fluye a través de un canal principal 1a primario que está conectado a un canal principal de menor anchura 1c a través de una constricción curvada 1b. La muestra introducida en el canal principal 1 se divide en el área 2 y un a canal de transporte secundario 15 que está diseñado para aumentar la fuerza de cizalla inducida en las partículas antes de alcanzar a la siguiente zona de separación 21. Las tres zonas de separación 2 , 21 , 22 están conectadas a un canal de recogida 3 que se utiliza para recoger el líquido extraído (o plasma). La separación se produce mientras que el canal de transporte que no está completamente lleno, porque una vez lleno la velocidad del flujo es tan lenta que las partículas tienden a obstruir la entrada del área de separación. En la figura 7 un canal principal final 25 ha sido añadido al final del canal de transporte para aumentar la resistencia al flujo y por lo tanto el tiempo para conseguir su llenado por completo. Por último, el canal principal final 25 está conectado a un puerto de salida 12 donde se recoge la muestra de líquido concentrado La figura 8 muestra otro diseño de tres etapas como el anterior (Figura 7), en éste la longitud del canal principal 1a se reduce para optimizar el tiempo de trabajo del dispositivo y también se reducen las longitudes de los canales de transporte 15 entre áreas de separación, para que el tiempo de separación sea más rápido y en consecuencia se pueda maximizar la cantidad de fluido extraído.

La figura 9 muestra un diseño con seis etapas de separación. En este diseño, la muestra suministrada en un puerto de entrada 11 fluye a través de un canal principal 1a primario que está conectado a un canal de menor anchura 1c a través de una restricción 1d curvada. La muestra introducida en el canal en menor anchura 1c se divide hacia el área de separación 2 y un canal de transporte secundario 15 y después de la separación de estas tres fases en la primera parte de separación 200, la muestra de líquido se transmite a la segunda parte de separación 300 por un canal de transporte 35. Dos canales de recogida paralelos 3 están diseñados para recoger el líquido extraído de cada parte de separación y así aumentar el volumen separado. En el caso de separación de plasma de la sangre, estos dos canales distintos crean una posibilidad para hacer dos análisis de sangre diferentes al mismo tiempo en el mismo dispositivo.