WÜRL, Susanne (Kobellstraße 24, Mannheim, 68167, DE)
EFFENHAUSER, Carlo (Am Ziegelhof 4, Weinheim, 69469, DE)
BÖHM, Christoph (Kiesstraße 29, Viernheim, 68519, DE)
OOSTERBROEK, Edwin (Gartenstraße 7, Cham, CH-6330, CH)
F. HOFFMANN-LA ROCHE AG (Grenzacherstraße 124, Basel, CH-4070, CH)
AUGSTEIN, Manfred (Rotannenweg 13, Mannheim, 68305, DE)
WÜRL, Susanne (Kobellstraße 24, Mannheim, 68167, DE)
EFFENHAUSER, Carlo (Am Ziegelhof 4, Weinheim, 69469, DE)
BÖHM, Christoph (Kiesstraße 29, Viernheim, 68519, DE)
OOSTERBROEK, Edwin (Gartenstraße 7, Cham, CH-6330, CH)
| Patentansprüche Mikrofluidisches Element zur Analyse einer Flüssigkeitsprobe mit einem Substrat (5) und einer von dem Substrat (5) und einer Deckschicht umschlossenen Kanalstruktur (2), wobei das mikrofluidische Element (1 ) um eine Rotationsachse (4) rotierbar ist; die Kanalstruktur (2) einen Zuführkanal (6) mit einer Zuführöffnung (9), einen Entlüftungskanal (10) mit einer Entlüftungsöffnung (1 1 ) und wenigstens zwei Reagenzkammern (13) einschließt; die Reagenzkammern (13) über zwei Verbindungskanäle (14) derart miteinander verbunden sind, dass ein Fluidaustausch zwischen den Reagenzkammern (13) möglich ist, eine der Reagenzkammern (13) eine Einlassöffnung (23) aufweist, die in Fluidverbindung mit dem Zuführkanal (6) steht, so dass eine Flüssigkeitsprobe in die rotationsachsenferne Reagenzkammer (13a) fließen kann, die von beiden Reagenzkammern (13) weiter von der Rotationsachse entfernt angeordnet ist, wenigstens eine der Reagenzkammern (13) ein Reagenz (35) enthält, das mit der Flüssigkeitsprobe reagiert. Mikrofluidisches Element nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das mikrofluidisches Element (1 ) ein Testträger (3) ist, durch den sich die Rotationsachse (4) erstreckt. Mikrofluidisches Element nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kanalstruktur (2) ein Analysefunktionskanal (15) ist, der eine Messkammer (16) umfasst. Mikrofluidisches Element nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die rotationsachsenferne Reagenzkammer (13a) die Einlassöffnung (23) aufweist. Mikrofluidisches Element nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kanalstruktur (2) eine Mischkammer (22) umfasst, in der die Reagenzkammern (13) und die Verbindungskanäle (14) zwischen den Reagenzkammern (13) integriert sind. Mikrofluidisches Element nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass - die Mischkammer (22) eine rotationsachsennahe Einlassöffnung (23) aufweist und - in der Mischkammer (22) ein kapillarer Transportkanal (31 ) seitlich und radial außen an den Reagenzkammern (13) ausgebildet ist, dessen Querschnitt geringer ist als die Querschnitt der Verbindungskanäle (14), so dass Flüssigkeit durch den Transportkanal (31 ) von der rotationsachsennahen Einlassöffnung (23) zu der der Einlassöffnung (23) gegenüberliegenden rotationsachsenfernen Reagenzkammer (13a) fließt. Mikrofluidisches Element nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Reagenzkammern (13) derart in radialer Richtung in Reihe angeordnet sind, dass die Reihe der Reagenzkammern (13) einen Winkel von maximal 80° zur Radialrichtung einschließt. Mikrofluidisches Element nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Reagenzkammern (13) im Wesentlichen halbkugelförmig sind, wobei die Öffnungsfläche der Halbkugel (24) von der Deckschicht (34) des mikrofluidischen Elements (1 ) abgeschlossen wird. 9. Mikrofluidisches Element nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen zwei in der Mischkammer (22) benachbarten Reagenzkammern (13) sich senkrecht zur Deckschicht (34) erstreckende Stege (27) ausgebildet sind, durch die die Reagenzkam- 5 mern (13) in der Mischkammer (22) getrennt sind. 10. Mikrofluidisches Element nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die der Rotationsachse (4) benachbarte Reagenzkammer (13) die Einlassöffnung (23) aufweist und einen Luft- i o einlass (33) hat, der die Reagenzkammer (13) mit einem Entlüftungskanal (10) verbindet. 1 1. Mikrofluidisches Element nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der eine Verbindungskanal (14a) zwi- 15 sehen zwei benachbarten Reagenzkammern (13) derart angeordnet ist, dass er mit den Zentren der beiden Reagenzkammern (13) fluchtet. 12. Mikrofluidisches Element nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Verbindungskanal (14b) derart seitlich mit den beiden 20 Reagenzkammern (13) verbunden ist, dass er außerhalb einer die Zentren zweier benachbarter Reagenzkammern (13) verbindenden Zentralachse verläuft. 13. Mikrofluidisches Element nach einem der vorhergehenden Ansprüche, 25 dadurch gekennzeichnet, dass zwei benachbarte Reagenzkammern (13) derart angeordnet sind, dass ihr Abstand kleiner ist als die kleinste Dimension der Reagenzkammern (13) in Testträgerebene. 14. Mikrofluidisches Element nach einem der vorhergehenden Ansprüche, 30 dadurch gekennzeichnet, dass die Reagenzkammern (13) so ausgebildet sind, dass ein Befüllen mit einer Flüssigkeit und das Auflösen eines in der Reagenzkammer (13) enthaltenen Reagenz (35) erfolgt, ohne dass Flüssigkeit in die benachbarte Reagenzkammer (13) strömt. Mikrofluidisches Element nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Verbindungskanal (14) einen Querschnitt aufweist, bei dem die kleinste Querschnittdimension mindestens 150 μηη beträgt. |
Die vorliegende Erfindung betrifft ein mikrofluidisches Element zur Bestimmung eines Analyten in einer Flüssigkeitsprobe, bevorzugt in einer Körperflüssigkeitsprobe. Das Element umfasst ein Substrat und eine Kanalstruktur, die von dem Substrat und einer Deckschicht umschlossen wird.
Mikrofluidische Elemente zum Analysieren einer Flüssigkeitsprobe und zum Durchmischen einer Flüssigkeit mit einem Reagenz werden in diagnostischen Tests (In-Vitro-Diagnostik) eingesetzt. Bei diesen Tests werden Körperflüssig- keitsproben auf einen darin enthaltenen Analyten für medizinische Zwecke untersucht. Der Begriff Durchmischen umfasst dabei sowohl die Möglichkeit, dass das Reagenz in flüssiger Form vorliegt, dass also zwei Flüssigkeiten miteinander gemischt werden. Daneben umfasst der Begriff die Möglichkeit, dass das Reagenz als Feststoff vorliegt und in einer Flüssigkeit aufgelöst und homogenisiert wird. In vielen Anwendungsfällen wird das feste Trockenreagenz in flüssiger Form in das fluidische Element eingebracht und in einem weiteren Schritt getrocknet, bevor das Element zur Analyse verwendet wird. Ein wichtiger Bestandteil bei der Analyse sind Testträger, auf denen mikroflui- dische Elemente mit Kanalstrukturen zur Aufnahme einer Flüssigkeitsprobe vorhanden sind, um die Durchführung aufwendiger und mehrstufiger Testführungen ("Testprotokolle") zu ermöglichen. Ein Testträger kann ein oder mehrere fluidische Elemente umfassen.
Testträger und fluidische Elemente bestehen aus einem Trägermaterial, üblicherweise aus einem Substrat aus Kunststoffmaterial. Geeignete Materialien sind beispielsweise COC (Cyclo-Olefin-Copolymer) oder Kunststoffe wie PMMA, Polycarbonat oder Polystyrol. Die Testträger weisen einen Probenanalysekanal auf, der von dem Substrat und einem Deckel oder einer Deckschicht umschlossen wird. Der Probenanalysekanal besteht häufig aus einer Aufeinanderfolge mehrerer Kanalabschnitte und dazwischen liegender im Vergleich zu den Kanalabschnitten erweiterter Kammern. Die Strukturen und Dimensionen des Probenanalysekanals mit seinen Kammern und Abschnitten werden durch eine Strukturierung von Kunststoffteilen des Substrats definiert, die beispielsweise durch Spritzgießtechniken oder andere Verfahren zur Herstellung von geeigneten Strukturen erzeugt werden. Auch ist es möglich, die Struktur durch materialabtragende Verfahren wie beispielsweise Fräsen ein- zubringen.
Fluidische Testträger werden beispielsweise bei immunchemischen Analysen mit einem mehrstufigen Testablauf verwendet, bei dem eine Trennung von gebundenen und freien Reaktionsbestandteilen stattfindet. Dazu ist ein gesteuerter Flüssigkeitstransport notwendig. Die Steuerung des Prozessablaufs kann mit internen (innerhalb des fluidischen Elements) oder mit externen (außerhalb des fluidischen Elements) Maßnahmen erfolgen. Die Steuerung kann auf der Anwendung von Druckunterschieden oder auch der Änderung von Kräften basieren, beispielsweise aus der Änderung der Wirkrichtung der Schwerkraft resultieren. Bei auftretenden Zentrifugalkräften, die auf einen rotierenden Testträger einwirken, kann eine Steuerung durch Änderung der Rotationsgeschwindigkeit oder der Drehrichtung oder durch den Abstand von der Drehachse vorgenommen werden. Analysesysteme mit derartigen Testträgern sind beispielsweise aus folgenden Publikationen bekannt:
US 4,456,581
5 US 4,580,896
EP 1 077 771 B1
EP 1 944 612 A1
Zur Durchführung der Analysen enthält der Probenanalysekanal der mikroflui- i o dischen Elemente zumindest ein Reagenz, das mit einer in den Kanal eingebrachten Flüssigkeit reagiert. Die Flüssigkeit und das Reagenz werden in dem Testträger miteinander so vermischt, dass eine Reaktion der Probenflüssigkeit mit dem Reagenz zu einer Änderung einer Messgröße führt, die für den in der Flüssigkeit enthaltenen Analyten charakteristisch ist. Die Messgröße wird an 15 dem Testträger selbst gemessen. Gebräuchlich sind optisch auswertbare Messverfahren, bei denen eine Farbänderung oder eine andere optisch messbare Größe detektiert werden.
Für die Durchführung der Analyse ist es entscheidend, dass das in getrockne- 20 ter Form vorliegende Reagenz von der Probenflüssigkeit gelöst und mit dieser durchmischt wird. Im Stand der Technik werden einige Anstrengungen unternommen, um das Durchmischen zu optimieren. Beispielsweise wird bei rotierenden Testträgern, die in einem Analysesystem um eine Rotationsachse gedreht werden, das Durchmischen durch schnelle Änderungen der Drehrich- 25 tung gefördert. Dieser entstehende "Schüttel-Modus" (Shake-Mode) ist in einer besonderen Ausprägung beispielsweise bei Markus Grumann, "Readout of Diagnostic Assays on a Centrifugal Microfluidic Platform", (Dissertation Universität Freiburg, 2005, URN (NBN): urn:nbn:de:bsz:25-opus-22723), beschrieben.
30
Weitere bekannte Methoden zur Verbesserung des Durchmischens von Probenflüssigkeit und Reagenz umfassen das Einbringen von Magnetpartikeln, die durch Einwirken eines Elektro- oder Permanentmagneten in Bewegung versetzt werden. Durch die Integration der Partikel steigt der Aufwand bei der Herstellung der Testträger. Zusätzlich müssen die Analysesysteme über weitere Komponenten, nämlich den Magneten, verfügen und wird deshalb teuer. Andere Methoden schließen z. B. Elemente ein, deren Kapillarkanäle spezielle Strömungshindernisse enthalten. Die Herstellung derartiger Hindernisse, wie zum Beispiel Rippen, müssen in der Mikrostruktur ausgebildet werden und sind deshalb teuer und erschweren den Herstellungsprozess des Testträgers. Außerdem eignen sich solche Strukturen nicht für alle Mischprozesse bzw. nicht für alle Reagenzien und Probenflüssigkeiten.
Trotz der vielfältigen Bemühungen, Mischvorgänge in mikrofluidischen Elementen, insbesondere das Durchmischen von getrockneten festen Reagenzien und Probenflüssigkeiten zu verbessern, besteht weiterer Bedarf an einem mikrofluidischen Element bzw. Testträger, bei dem das Durchmischen insbesondere von kleinen Probenflüssigkeiten verbessert ist. Des Weiteren soll das fluidische Element geeignet sein, um gleichzeitig unterschiedliche Reagenzien, die getrennt eingebracht sind und sich z. B. an unterschiedlichen räumlichen Stellen befinden, anzulösen und die Probenflüssigkeit mit unterschiedli- chen Reagenzien reagieren zu lassen.
Gelöst wird das bestehende Problem durch ein mikrofluidisches Element mit den Merkmalen des Anspruchs 1 . Im Folgenden wird die Erfindung und deren Vorteile unter Bezugnahme auf einen Testträger zur Analyse einer Körperflüssigkeitsprobe auf einen darin enthaltenen Analyten ohne Einschränkung der Allgemeinheit eines mikrofluidischen Elements beschrieben und erläutert. Neben Körperflüssigkeiten können auch andere Probenflüssigkeiten analysiert werden.
Im Rahmen der Erfindung wird unter einem mikrofluidischen Element ein Element mit einer Kanalstruktur verstanden, bei dem die kleinste Dimension der Kanalstruktur mindestens 1 pm und dessen größte Dimension (beispielsweise Länge des Kanals) höchstens 10 cm beträgt. Aufgrund der kleinen Dimensionen und der kapillaren Kanalstrukturen herrschen in den Kanälen bzw. Kanalabschnitten vorwiegend laminare Strömungsverhältnisse. Die daraus resultierenden schlechten Bedingungen für ein Durchmischen von Flüssigkeit und 5 Feststoff in solchen Kapillarkanälen werden durch das erfindungsgemäße mikrofluidische Element deutlich verbessert.
Das mikrofluidische Element rotiert um eine Rotationsachse. Die Rotationsachse erstreckt sich bevorzugt durch das mikrofluidische Element. Sie verläuft i o durch eine vorbestimmte Position, bevorzugt z. B. durch den Schwerpunkt oder den Mittelpunkt des Elements. In einer bevorzugten Ausgestaltung erstreckt sich die Rotationsachse senkrecht zur Oberfläche des fluidischen Elements, das bevorzugt eine flache, scheibenartige Form hat und z. B. eine runde Scheibe sein kann. Dazu ist das mikrofluidische Element beispielsweise
15 in einer Halterung eines Analysegeräts gehalten, wobei die Rotationsachse von einer Drehwelle des Geräts gebildet wird.
Durch eine entsprechende Strukturierung eines Substrats des Elements wird eine Kanalstruktur gebildet, die einen Zuführkanal mit einer Zuführöffnung und
20 einen Entlüftungskanal mit einer Entlüftungsöffnung sowie wenigstens zwei Reagenzkammern umfasst. In wenigstens einer der Reagenzkammern ist ein Reagenz enthalten, das bevorzugt in fester Form als Trockenreagenz vorliegt und das mit der Flüssigkeitsprobe, die in die Kanalstruktur eingebracht wird, reagiert. Je zwei benachbarte Reagenzkammern sind über wenigstens zwei
25 Verbindungskanäle derart miteinander verbunden, dass ein Fluidaustausch zwischen den beiden Reagenzkammern ermöglicht wird. Dabei hat eine der Reagenzkammern eine Einlassöffnung, die so in Fluidverbindung mit dem Zuführkanal steht, dass eine Flüssigkeitsprobe aus dem Zuführkanal in die Reagenzkammern einströmen kann. Erfindungsgemäß fließt die Flüssigkeits-
30 probe aus dem Zuführkanal in die Reagenzkammer, die von den (beiden) Reagenzkammern weiter von der Rotationsachse entfernt ist. Die Flüssigkeit fließt also in die rotationsachsenferne Reagenzkammer. Die im Sinne der Erfindung verwendeten Ausdrücke "rotationsachsenfern" und "rotationsachsennah" stellen keine absoluten Bereichsangaben dar, wo sich eine Struktur befindet, sondern geben an, wie weit eine Struktur von der Rotationsachse entfernt ist. Die Rotationsachse wird dabei als Nullpunkt einer Ent- fernungsskala verstanden, welche sich von der Rotationsachse radial nach außen erstreckt. Eine rotationsachsenferne Struktur ist in diesem Sinne weiter von der Rotationsachse entfernt als eine rotationsachsennahe Struktur. Eine rotationsachsenferne Reagenzkammer ist also die Reagenzkammer, die in Relation zu einer anderen Reagenzkammer weiter von der Rotationsachse entfernt ist. Bei zwei Reagenzkammern ist die rotationsachsenferne Reagenzkammer die Kammer, die im Vergleich zu anderen Kammern am weitesten von der Rotationsachse entfernt ist, also die Entfernteste der Reagenzkammern. In analoger Weise ist der Begriff "rotationsachsennah" zu verstehen. In diesem Sinne ist unter rotationsachsennaher Reagenzkammer die Reagenz- kammer zu verstehen, die - im Vergleich zu den anderen Reagenzkammern - am nächsten zur Rotationsachse angeordnet ist.
Im Rahmen der Erfindung wurde erkannt, dass - im Gegensatz zu den im Stand der Technik bekannten mikrofluidischen Elementen - mit den über wenigstens zwei Verbindungskanäle verbundenen Reagenzkammern mehrstufige Reaktionsführungen möglich sind und die Anordnung vielfältige Kontrollmöglichkeiten bietet. Insbesondere ermöglicht die Anordnung, unterschiedliche Reagenzien, die getrennt voneinander eingebracht wurden, ohne sich beim Eintrocknen zu vermischen, in einem einzigen Prozessschritt aufzu- lösen, wobei das Auflösen fluidisch nicht behindert wird.
Die wenigstens zwei Verbindungskanäle zwischen den beiden Reagenzkammern ermöglichen einen ungehinderten und schnellen Fluidaustausch. Im Rahmen der Erfindung wurde erkannt, dass mehr als zwei Verbindungskanäle vorteilhaft sind. Besonders bevorzugt werden drei Verbindungskanäle eingesetzt, die z. B. im Wesentlichen parallel zueinander angeordnet sein können. Die Reagenzkammern werden durch die beiden Verbindungskanäle fluidisch derart hintereinander geschaltet, dass eine Fluid-Reihenschaltung entsteht. Die Reagenzkammern sind geometrisch eigenständige Komponentenstrukturen und weisen ein eigenes Aufnahmevolumen auf. Fluidisch sind sie jedoch gemeinsam eine einzige Fluidkammer. Somit werden die positiven Eigenschaften von Einzelreagenzkammern mit den Eigenschaften einer einzigen 5 Fluidkammer kombiniert. Die festen Trockenreagenzien werden in flüssiger Form in die Kammern eingebracht und dann getrocknet. Dieses Eintrocknen geschieht entweder durch Erhitzen oder durch ein Gefrieren, dass bevorzugt bei Temperaturen von unter -60 °C, besonders bevorzugt bei ca. -70 °C stattfindet. Bevorzugt ist der Testträger, um das Eintrocknen des flüssigen Rea- i o genz zu verbessern, vorgekühlt. Insbesondere bei "tensidhaltigen" Reagenzien wird das "kalte Eintrocknen" durch Gefrieren bevorzugt.
Da die Reagenzkammern geometrisch voneinander getrennt sind, lassen sich in jede der Reagenzkammern unterschiedliche Reagenzien einbringen, ohne
15 dass es zu einem Vermischen der Reagenzien vor oder während dem Eintrocknen kommt. Dies wird durch eine entsprechende geometrische Gestaltung der Reagenzkammern unterstützt. Beispielsweise können die Kammern durch scharfe Begrenzungen wie Stege oder Kanten getrennt sein, um ein Durchmischen ("Crosstalk") durch Kriecheffekte zu verhindern. Die scharfkan-
20 tigen Begrenzungen bilden zwar für den Transport des Fluids aus einer Reagenzkammer hinaus ebenfalls eine Barriere. Diese kann jedoch durch die auftretenden externen Kräfte (Zentrifugalkraft, hydrostatische Kraft) leicht überwunden werden. Durch die Möglichkeit, jede Kammer mit einem unterschiedlichen Reagenz zu befüllen, können in nur einem Prozessschritt mehrere (un-
25 terschiedliche) Reagenzien angelöst und homogenisiert werden.
Die Anordnung der Reagenzkammern der Kanalstruktur ist derart ausgebildet, dass eine der Kammern rotationsachsenferner angeordnet ist als die andere Kammer, d. h. der Abstand der einen rotationsachsenfernen Reagenzkammer 30 von der Rotationsachse ist größer als der Abstand der anderen Kammer.
Durch die Rotation des mikrofluidischen Elements wird die in die Kanalstruktur eingegebene Flüssigkeit zunächst in die rotationsachsenferne Kammer geleitet, so dass diese Kammer zuerst gefüllt und das in der Kammer angelagerte Reagenz gelöst wird. Die Flüssigkeit reagiert mit dem Reagenz. Dabei sind die Flüssigkeitsmenge und das Volumen der ersten Reagenzkammer aufeinander abgestimmt. Erst wenn eine größere Flüssigkeitsmenge in die Kanalstruktur gegeben wird bzw. aus dem Zuführkanal in die Reagenzkammern einströmt, wird auch die zweite (und mögliche weitere rotationsachsennähere) Reagenzkammer gefüllt. Auf diese Weise können auch Reagenzien mit kleinen Probenmengen sehr gut gelöst werden. Es wird also zunächst die Reagenzkammer gefüllt, die am weitesten von der Rotationsachse entfernt ist. Die (relativ zu der entferntesten Reagenzkammer) näher an der Rotationsachse angeordneten Kammern werden erst in einem oder mehreren weiteren Schritten gefüllt, wobei die Reihenfolge der Befüllung vom Abstand zur Rotationsachse abhängt. Die Reagenzkammer mit dem geringsten Abstand zur Rotationsachse wird zuletzt gefüllt. Im Rahmen der Erfindung wurde erkannt, dass in vollständig gefüllten Reagenzkammern ein Lösen der Reagenzien zuverlässiger, vollständiger und schneller erfolgt als in nur teilgefüllten Kammern. Durch die Anordnung einer Mehrzahl von Reagenzkammern mit relativ kleinen Teilvolumen, z. B. 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 15 etc. Kammern, kann eine gute Durchmischung für eine gro- ße Zahl unterschiedlicher Volumen erzielt werden. Beispielsweise können drei oder fünf der z. B. 12 Reagenzkammern mit dem zu untersuchenden Volumen gefüllt werden, wobei alle (z.B. drei oder fünf) Kammern vollständig gefüllt sind. Wenn alle Reagenzkammern mit dem gleichen Reagenz bzw. der gleichen Zusammensetzung von Reagenzien gefüllt sind, kann auf diese Weise für unterschiedliche Volumina an Probenflüssigkeit eine sehr gute Durchmischung mit den Reagenzien erzielt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die jeweils zwei (oder mehreren) Verbindungskanäle zwischen zwei benachbarten Reagenzkammern parallel angeordnet. Die beabstandeten (getrennten) Verbindungskanäle werden bevorzugt durch gerade Kanalabschnitte gebildet. Bevorzugt ist die Länge wenigstens eines der Verbindungskanäle kleiner als die kleinste Dimension der Reagenzkammern in Testträgerebene. Die Testträgerebene ist die Ebene, die sich senkrecht zur Flächennormalen des Testträgers erstreckt, beispielsweise senkrecht zur Rotationsachse.
Vorteilhafterweise ist einer der wenigstens zwei Verbindungskanäle zwischen benachbarten Reagenzkammern zentral angeordnet. Er fluchtet mit den Zentren der beiden Reagenzkammern, die er verbindet. Bevorzugt ist der (andere) Verbindungskanal derart seitlich mit den Reagenzkammern verbunden, dass er außerhalb der die Zentren verbindenden Zentralachse verläuft. Besonders bevorzugt ist er tangential an den Reagenzkammern angeordnet, dass seine Außenseite (Außenwand) mit den Außenwänden der Reagenzkammern fluchtet. Bevorzugt ist der zentrische Verbindungskanal breiter (er hat einen größeren Querschnitt bei gleicher Kanalhöhe) als der seitlich angeordnete Kanal.
Die Verbindungskanäle zwischen zwei benachbarten Reagenzkammern sind so ausgebildet, dass beim Befüllen der Reagenzkammeranordnung die Flüssigkeit durch die Verbindungskanäle von der einen Kammer in die zweite fließen kann. Dabei fließt die Flüssigkeit bevorzugt durch einen der Verbindungskanäle. Gleichzeitig kann die in der noch nicht befüllten Kammer enthaltene Luft durch den anderen der beiden Kanäle, also den nicht von der Flüssigkeit benetzten Kanal entweichen, bevorzugt durch den zentrischen Verbindungskanal.
Besonders bevorzugt ist eine Ausführungsform mit drei Verbindungskanälen zwischen zwei benachbarten Reagenzkammern. Dabei erstreckt sich ein Ver- bindungskanal entlang der Zentralachse, die die Zentren von zwei benachbarten Reagenzkammern verbindet. Die beiden anderen Verbindungskanäle sind bevorzugt tangential an den Reagenzkammern angeordnet. Beim Befüllen der Reagenzkammern wird zunächst die rotationsachsenferne Reagenzkammer gefüllt. Dazu wird Flüssigkeit durch den (tangentialen) Verbindungskanal, der der Einlassöffnung benachbart ist, in die rotationsachsenferne Kammer geleitet. Beim Befüllen der rotationsachsenfernen Reagenzkammer entweicht Luft durch die beiden anderen Verbindungskanäle (den mittleren und den zweiten tangentialen Kanal) bis die Reagenzkammer gefüllt ist. Bei einem weiteren Befüllen wird die Luft in den beiden anderen Verbindungskanälen durch Flüssigkeit verdrängt, so dass ein weiteres Befüllen der rotationsachsennahen Reagenzkammer zunächst durch die beiden anderen Verbindungskanäle erfolgt und schließlich auch über den ersten Verbindungskanal, der der Einlass- Öffnung benachbart ist.
Bei einer Anordnung eines fluidischen Elements mit drei oder mehr Reagenzkammern sind die wenigstens zwei Verbindungskanäle (bevorzugt drei Verbindungskanäle) jeweils zwischen zwei benachbarten Reagenzkammern angeordnet. Zwei Reagenzkammern sind benachbart, wenn zwischen ihnen keine weitere Reagenzkammer angeordnet ist und ein Fluidaustausch zwischen ihnen direkt über die wenigstens zwei Verbindungskanäle erfolgt, ohne dass weitere fluidische Strukturen dazwischen geschaltet sind. Die erfindungsgemäße Kanalstruktur mit wenigstens zwei Reagenzkammern, die durch wenigstens zwei Verbindungskanäle direkt miteinander verbunden sind, bietet eine hohe Flexibilität, eine platzsparende und kompakte Anordnung sowie eine Reihe von funktionalen Vorteilen: 1. Mit zwei miteinander verbundenen Reagenzkammern ist eine zweistufige Reaktionsführung möglich. In einem ersten Schritt wird dabei eine Flüssigkeitsmenge, die dem Volumen der ersten Reagenzkammer entspricht, in die erste, rotationsachsenferne Reagenzkammer geleitet. Das darin enthaltene Trockenreagenz wird aufgelöst, so dass die erste Reaktion statt- finden kann. In einem weiteren Schritt wird eine zweite Flüssigkeitsteilmenge in die Anordnung der Reagenzkammern gefüllt, wobei die zweite Teilmenge dem Volumen der zweiten Reagenzkammer entspricht. Diese zweite Teilmenge der Flüssigkeit kann beispielsweise ein Puffermedium sein. Der Füllvorgang findet dadurch statt, dass die zusätzliche zweite Teilmenge durch die Zentrifugalkraft zunächst in die erste Kammer gedrückt wird und sich mit dem dort vorhandenen Fluid vermischt und erst dann in die zweite Reagenzkammer strömt. Durch eine entsprechende Steuerung der Rotationsgeschwindigkeit und Rotationsrichtung beginnt ein Mischvorgang, bei dem das Reagenz in der zweiten Reagenzkammer aufgelöst wird und eine zweite Reaktion mit dem zweiten Reagenz stattfindet. Da bei dem Anlösen jeweils beide Reagenzkammern vollständig gefüllt sind, wird eine gute Homogenisierung und Durchmischung in den unterschiedlichen Phasen in jeweils beiden Kammern erzielt.
Die Reagenzkammeranordnung bietet den Vorteil, dass ein optimiertes Anlösen eines Trockenreagenz in der rotationsachsenfernen ersten Kammer dadurch stattfindet, dass diese Kammer jeweils von dem gesamten Füllvolumen mehrfach, beim Vorhandensein von zwei Reagenzkammern zweifach durchströmt wird. Zunächst findet ein Durchströmen der ersten Reagenzkammer beim Füllen der Kammer statt. Das zweite Durchströmen findet beim Entleeren der Struktur statt. Auf diese Weise wird eine besonders gute Auflösung der Trockenreagenzien erzielt. Dies hat den weiteren Vorteil, dass auch die beim Eintrocknen von Reagenzien entstehenden Agglomerate, die durch die Zentrifugalkraft radial nach außen in die erste Kammer gedrückt werden, beim anschließenden Entleeren mit dem Fluid aus den radial innen liegenden Kammern "nachgespült" werden. Verluste an der Innenoberfläche der ersten Reagenzkammer werden vermieden.
Mit der erfindungsgemäßen Anordnung lassen sich auf einfache Weise Verdünnungsreihen realisieren. Da die Anordnung der Reagenzkammern eine sehr kompakte Kanalstruktur ermöglicht, können auf einem Testträger mehrere Kanalstrukturen ausgebildet sein. Zur Durchführung einer Verdünnungsreihe wird in den parallel angeordneten Kanalstrukturen jeweils nur die rotationsachsenferne erste Reagenzkammer mit Reagenzien bestückt. Zur Durchführung einer Verdünnungsreihe werden die parallelen Strukturen mit unterschiedlichen Volumina gefüllt, so dass für eine definierte Reagenzmenge unterschiedliche Verdünnungen in nur einem Prozessschritt erzeugt werden können. Der Vorteil einer derartigen sequentiellen Mikroreaktorkaskade mit einer so genannten Perlenkettenstruktur (Reihenschaltung von mehreren Kammern) liegt darin, dass die komplette Reaktion mit variablen Volumina durchgeführt werden kann, ohne Änderungen in der Geometrie der Kanalstruktur vornehmen zu müssen. Dabei ist das geringste Volumen der Probenflüssigkeit so groß wie das Volumen der ersten Reagenzkammer. Bevorzugt sind die zu untersuchenden Volumina ein Vielfaches der vorzugsweise gleichen Volumina der einzelnen Reagenz- 5 kammern.
4. Ein weiterer Vorteil der Reagenzkammerstruktur liegt darin, dass die einzelnen Reagenzkammern auf die zu untersuchenden Teilvolumina abgestimmt sein können. Im Rahmen der Erfindung wurde bei Untersuchungen i o zum Anlöse- und Mischverhalten erkannt, dass bei vollständig gefüllten
Kammern die Mischvorgänge optimiert ablaufen. Steht beispielsweise in einem ersten Befüllungsschritt nur eine Teilmenge des Fluids zur Verfügung, beispielsweise ein Verdünnungspuffer, der erst später mit einer Probenflüssigkeit aufgefüllt wird, so würde in einem "Ein-Kammer-System" die
15 Homogenisierung mit der ersten Teilmenge nur sehr schlecht ablaufen, da
Lufteinschlüsse gebildet werden würden. In einer Reagenzkammeranordnung mit mehreren Reagenzkammern sind die Kammern jeweils auf das Teilvolumen der zu untersuchenden Flüssigkeit ausgelegt und ermöglichen so ein optimiertes Anlösen und Mischen, da die einzelne Reagenzkammer
20 von dem Flüssigkeitsteilvolumen komplett gefüllt wird. Auch ein Schäumen der Lösung wird verhindert.
Um die Mischvorgänge in der Reagenzkammeranordnung weiter zu verbessern umfasst die Kanalstruktur in einer bevorzugten Ausführungsform eine
25 Mischkammer, in der die Reagenzkammern und die Verbindungskanäle zwischen den Reagenzkammern integriert sind. Auf diese Weise werden die Eigenschaften der einzelnen Reagenzkammern mit den Eigenschaften einer fluidischen Einzelkammer noch besser kombiniert. Bevorzugt sind die Reagenzkammern in der Mischkammer derart in radialer Richtung in Reihe ange-
30 ordnet, dass die Reihe der Kammern einen Winkel von maximal 80° zur Radialrichtung, besonders bevorzugt von maximal 60°, einschließt. Unter Radialrichtung ist dabei eine Gerade zu verstehen, die sich von der Rotationsachse des mikrofluidischen Elements bzw. des Testträgers nach außen erstreckt. Die Reagenzkammern müssen folglich nicht direkt radial nach außen gerichtet sein, sondern können einen Winkel zur Radialrichtung einschließen, der von 90° verschieden ist.
5 In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Reagenzkammern so ausgebildet, dass ein Befüllen mit einer Flüssigkeit und das Anlösen eines in der Reagenzkammer enthaltenen festen Trockenreagenz erfolgt, ohne dass die Flüssigkeit in die benachbarte Reagenzkammer strömt. Solange die Flüssigkeitsmenge das Volumen der Reagenzkammer nicht überschreitet, ver- i o bleibt die Flüssigkeit in der Reagenzkammer, in die sie einströmt. Dies ist beim ersten Befüllen stets die rotationsachsenferne Reagenzkammer. In der Regel weist sie deshalb die Einlassöffnung auf, die in Fluidverbindung mit dem Zuführkanal derart steht, dass eine Flüssigkeitsprobe in die rotationsachsenferne Reagenzkammer fließen kann.
15
Vorzugsweise weisen die Reagenzkammern eine runde Ausgestaltung auf. Ihre Grundfläche ist kreisförmig ausgebildet. Der Boden der einzelnen Kammern ist verrundet, so dass der Boden stetig in die Kammerwände übergeht, also ohne eine Kante. Bevorzugt sind die Reagenzkammern in Form einer
20 Halbkugel oder eines Halbkugelsegments ausgebildet. Zwischen zwei benachbarten Kammern ist ein Steg ausgebildet, der die beiden Kammern trennt. Am oberen Ende der Kammer ist eine Kante vorgesehen, so dass ein Kapillarstop gebildet wird, der einen Austritt von Flüssigkeit aus einer der Reagenzkammern verhindert. Diese stegartige Barriere wird in Fachkreisen als
25 Tellerrand bezeichnet. Selbstverständlich muss die Kante im Übergang nicht scharfkantig sein. Sie kann auch einen geringen Radius aufweisen. Allerdings ist der Radius so klein zu wählen, dass die Barrierefunktion erhalten bleibt.
Bevorzugt sind die Reagenzkammern, die jeweils von wenigstens zwei Ver- 30 bindungskanälen miteinander verbunden sind, in einer Mischkammer integriert. Die Mischkammer besteht aus den Reagenzkammern, den Verbindungskanälen, einer Zuführöffnung, durch die Flüssigkeit aus einem Zuführkanal in die Mischkammer eintreten kann, und einer Entlüftungsöffnung, die am Ende eines Entlüftungskanals, der mit der Mischkammer in Luftaustauschverbindung steht, angeordnet ist. Darüber hinaus kann die Mischkammer auch einen Transportkanal umfassen, der seitlich an den Reagenzkammern entlang geführt ist.
Reagenzkammern mit einem verrundeten Boden bzw. einer verrundeten Vertiefung als Struktur eignen sich auch unabhängig von dem Einsatz in rotierenden Testträgern und Zentrifugaldevices, um zwei oder mehrere Reagenzien einzeln in die Struktur einzubringen und erst beim Anlösen mit einer Flüssig- keit zu einem späteren Zeitpunkt gemeinsam zu vermischen. Dies gilt insbesondere für Reagenzien, die miteinander reagieren, aber erst zu einem Analysezeitpunkt (beispielsweise beim Anlösen mit Plasma) vermischt werden dürfen, vorher jedoch nicht. Erst in der Analyse sollen sie sich gemeinsam anlösen. Die in der Figurenbeschreibung gemachten Aussagen in Bezug auf rotierende Testträger lassen sich deshalb auch auf nicht rotierende Testträger übertragen, bei denen die Reagenzkammern einen abgerundeten Boden aufweisen und bevorzugt eine halbkugelförmige Gestalt haben.
Halbkugelförmige Reagenzkammern, die bevorzugt in einer Mischkammer zusammengefasst sind, weisen auch einen großen Vorteil beim Einbringen und beim Eintrocknen von Reagenzien auf. Die Reagenzien werden in flüssiger Form in die Reagenzkammern eingebracht und dort getrocknet. Während des Trocknungsvorgangs wirkt die Oberflächenspannung, so dass das dosierte flüssige Reagenz die Umgebung des Aufbringpunkts benetzt und sich lang- sam verteilt. Trifft es dabei auf Kanten oder ähnliche Stellen, die eine höhere Kapillarität haben, trocknet es dort konzentriert ein. Durch den verrundeten Boden wird ein derartiges Aufkonzentrieren verhindert. Da pro Reagenzkammer nur ein Reagenz appliziert wird, wird auch ein Zusammenfließen und Vermischen unterbunden. Dies wird durch die scharfkantigen oberen Ränder der Kammern unterstützt. Auch beim Anlösen der Reagenzien erweisen sich die Reagenzkammern mit rundem Boden als besonders vorteilhaft. Die Erfindung wird nachfolgend anhand von in den Figuren dargestellten besonderen Ausführungsformen näher erläutert. Dazu wird die Erfindung beispielhaft an einem rotierenden Testträger beschrieben. Die dort dargestellten Besonderheiten können einzeln oder in Kombination verwendet werden, um bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung zu schaffen, beispielsweise eine Kanalstruktur eines mikrofluidischen Elements, das nicht rotiert. Zur Verdeutlichung von Details stimmen die dargestellten Proportionen der einzelnen Komponenten teilweise nicht überein. Die beschriebenen Ausführungen stellen keine Einschränkung der durch die Ansprüche in ihrer Allgemeinheit defi- nierten Erfindung dar. Es zeigen:
Fig. 1 ein als Testträger ausgebildetes mikrofluidisches Element mit drei identischen Kanalstrukturen;
Fig. 2a, b, c Schnittbilder durch eine Kanalstruktur aus Fig. 1 ;
Fig. 3 einen alternativen Testträger;
Fig. 4 eine Detailzeichnung einer Kanalstruktur mit drei
Reagenzkammern;
Fig. 5 Detailzeichnungen einer Kanalstruktur mit drei
Reagenzkammern beim Befüllen;
Fig. 6 eine Ausführungsform mit zwei Reagenzkammern;
Fig. 7 eine Ausführungsform mit drei Reagenzkammern;
Fig. 8 eine perspektivische Ansichten der Anordnung aus Fig. 7;
Fig. 9 eine Anordnung mit sechs Reagenzkammern;
Fig. 10a, b, c eine Anordnung mit zwei Reagenzkammern beim Eintrocknen von flüssigen Reagenzien
Figur 1 zeigt ein mikrofluidisches Element 1 mit drei identisch aufgebauten Kanalstrukturen 2, die sich im Wesentlichen radial nach außen erstrecken. Vorzugsweise ist die kleinste Dimension der Kanalstruktur 2 wenigstens 0, 1 mm, besonders bevorzugt wenigstens 0,2 mm groß. Das mikrofluidische Element 1 ist ein Testträger 3, der als runde Scheibe ausgebildet ist und durch den sich eine Rotationsachse 4 mittig erstreckt, um die der scheibenförmige Testträger 3 rotiert. Die Kanalstruktur 2 wird von einem Substrat 5 und einer nicht gezeigten Deckschicht umschlossen, die den Testträger 3 von oben abdeckt.
Das mikrofluidische Element 1 ist zum Einsatz in einem Analysegerät oder 5 einem ähnlichen Gerät geeignet, dass eine Halterung aufweist, um das mikrofluidische Element aufzunehmen und rotieren zu lassen. Das Gerät ist vorzugsweise so ausgebildet, dass das mikrofluidische Element um eine Drehwelle des Geräts rotiert wird, wobei die Achse der Drehwelle mit der Rotationsachse 4 des mikrofluidischen Elements 1 fluchtet. Dazu kann sich die i o Drehwelle des Geräts durch eine Bohrung 4a des Testträgers 3 erstrecken.
Bevorzugt erstreckt sich die Rotationsachse 4 durch den Mittelpunkt oder den Schwerpunkt des Elements 1 .
Die Kanalstruktur 2 des mikrofluidischen Elements 1 schließt einen Zuführka- 15 nal 6 ein, der einen U-förmigen Kanalabschnitt 7 und einen geraden Kanalabschnitt 8 umfasst. Am Ende der beiden U-Schenkel des U-förmigen Kanalabschnitts 7 ist je eine Zuführöffnung 9 vorgesehen, durch die eine Flüssigkeitsprobe, bevorzugt beispielsweise eine Körperflüssigkeit wie Blut, in den Zuführkanal 6 eingegeben werden kann. Beispielsweise kann eine Proben- 20 flüssigkeit von einem Bediener manuell (mit einer Pipette) in eine Zuführöffnung 9 dosiert werden. Alternativ kann der Zuführkanal auch mittels einer Dosierstation eines Analysegerätes mit einer Flüssigkeit bestückt werden. Beim Dosieren einer Flüssigkeit in den Zuführkanal 6 wird in die Flüssigkeit durch eine der beiden Zuführöffnungen 9 hineingegeben, während die in dem 25 Kanal enthaltene Luft durch die zweite Zuführöffnung entweichen kann.
Die Kanalstruktur 2 umfasst weiter einen Entlüftungskanal 10 mit einer Entlüftungsöffnung 1 1 sowie zwei Reagenzkammern 13, die über drei Verbindungskanäle 14 so miteinander verbunden sind, dass ein Fluidaustausch zwischen 30 den beiden Reagenzkammern 13 erfolgt. Die Kanalstruktur 2 ist in einer bevorzugten Ausführungsform nach Figur 1 als Analysefunktionskanal 15 ausgebildet, der eine Messkammer 16, einen Messkanal 17 zwischen der Messkammer 16 und den Reagenzkammern 13 sowie eine Waste-Kammer 18 um- fasst, die über einen Entsorgungskanal 19 mit der Messkammer 16 verbunden ist. Die Messkammer 16 wird über einen eigenen Entlüftungskanal entlüftet. Die als Sammelbecken 20 ausgebildete Waste-Kammer 18 weist einen Entlüftungskanal 21 mit einem Auslassventil am Ende auf, durch den Luft aus der 5 Kanalstruktur 2 entweichen kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform, wie z. B. in Figur 1 gezeigt, schließt die Kanalstruktur 2 eine Mischkammer 22 ein, in die die beiden Reagenzkammern 13 und die drei Verbindungskanäle 14 integriert sind. Die Misch- i o kammer 22 hat eine Einlassöffnung 23, die in Fluidverbindung mit dem Zuführkanal 6 steht, so dass eine Flüssigkeitsprobe in die rotationsachsenferne Reagenzkammer 13a einfließen kann. Die rotationsachsenferne Reagenzkammer 13a hat eine größere Entfernung zu der Rotationsachse 4 als die andere Reagenzkammer 13b. Die rotationsachsennahe Reagenzkammer 13b
15 (näher an der Rotationsachse 4 als die Reagenzkammer 13a) steht über einem Luftauslass 33 in Fluidkontakt mit dem Entlüftungskanal 10, so dass Luft aus der Reagenzkammeranordnung und der Mischkammer 22 entweichen.
Wird eine Flüssigkeit in den U-förmigen Kanalabschnitt 7 gegeben und deren 20 Testträger 3 dann um die Rotationsachse 4 rotiert, so drückt die Zentrifugalkraft die Flüssigkeit durch den geraden Kanalabschnitt 8 des Zuführkanals 6 bis die Flüssigkeit die Mischkammer 22 durch die Einlassöffnung 23 erreicht. Die Flüssigkeit wird dann in der rotationsachsenfernen Reagenzkammer 13a gesammelt, bis sich diese gefüllt hat. Dabei wird ein in der Reagenzkammer 25 13a eingetrocknetes Trockenreagenz gelöst. Wird weiter Flüssigkeit in die Mischkammer 22 eingelassen, so fließt die Flüssigkeit nun durch die drei Verbindungskanäle 14 in die rotationsachsennähere Reagenzkammer 13b, wobei der radial am weitesten außen liegende Verbindungskanal 14 zuerst mit Flüssigkeit gefüllt wird. Die in der Mischkammer 22 enthaltene Luft entweicht 30 durch einen Lufteinlass 33 in den Entlüftungskanal 10 nach außen.
Durch geeignete Steuerung der Rotationsgeschwindigkeit, der Drehrichtung und der Beschleunigung kann ein optimiertes Anlösen der Reagenzien in den Reagenzkammern 13 erfolgen, was durch die verrundeten Reagenzkammern 13 unterstützt wird.
Figur 2a zeigt einen Schnitt entlang der Linie IIA aus Figur 1 durch die zwei 5 Reagenzkammern 13a, 13b. Die Reagenzkammern 13a, 13b sind bevorzugt halbkugelförmig ausgebildet, wobei die offene Öffnungsfläche der Halbkugeln 24 von der Deckschicht abgeschlossen wird. Die Reagenzkammern 13 sind an ihrem Boden so verrundet, dass keine scharfen Kanten auftreten. Der verrundete Kammerboden stellt also eine gleichmäßige Verteilung sowohl des i o Reagenz als auch ein gleichmäßiges Anlösen und eine gleichmäßige Strömungsgeschwindigkeit sicher. Die Übergänge zu den Verbindungskanälen sind bevorzugt nicht abgerundet sondern scharfkantig, d.h. an dem oberen Rand der Halbkugeln 24 ist eine scharfe Kante 25 ausgebildet, wobei die Kante 25 bevorzugt einen Winkel von 90° einschließt. Hierdurch entsteht eine Art
15 geometrisches Ventil, das einen Überlaufschutz bildet, da die Kante eine physikalische Barriere für den Weitertransport der Flüssigkeit darstellt.
Um die Reagenzien in die Kammer zu bringen, werden in den offenen Testträger 3 ohne Deckschicht die in flüssiger Form vorliegenden Reagenzien ein-
20 gebracht, beispielsweise durch Pipettieren. Die scharfen Kanten dienen dann als Begrenzung, die ein Kriechen der flüssigen Reagenzien während der Eintrocknung vermeiden. Die Struktur wird somit unabhängiger gegenüber Störeffekten während des automatischen Prozessierens bei der Eintrocknung. An die Reagenzkammern 13 schließt sich am oberen Rand ein Überlaufschutz 26
25 an, der verhindert, dass Reagenzien aus der Mischkammer 22 heraustreten können. Die Oberflächenvergrößerung durch den Überlaufschutz 26 kann sich zudem verlängernd auf die Mischzeit beim Vermischen bzw. Auflösen der Trockenreagenzien auswirken.
30 Figur 2b zeigt den Schnitt durch die Kanalstruktur 2 aus Figur 2a, jedoch mit dargestellten Trockenreagenzien 35 und Deckschicht 34. Die Reagenzkammern 13 und die Mischkammer 22 ist hier so ausgebildet, dass die Tiefe t des Überlaufschutzes 26 etwa ein Drittel der Tiefe T des Mischkanals 22 ist. Die Tiefe t des Überlaufschutzes 26 beträgt ca. 400 μηι. Zwei Drittel der Tiefe T des Mischkanals 22 wird durch die Reagenzkammern 13 gebildet. Das eingetrocknete Reagenz 35 bedeckt den Boden und die Innenflächen der Halbkugeln 24, wobei die Füllhöhe h des Trockenreagenz 35 am Boden ca. der hal- 5 ben Höhe H der Halbkugel 24 entspricht. An den Rändern fließt das Reagenz 35 während der Eintrocknung weiter hinauf; es wird jedoch durch die physikalische Barriere und die Kante 25 von einem Weiterkriechen über den zwischen den beiden Kammern 13a, 13b gebildeten Steg 27 gehindert. Der Steg 27 erstreckt sich bevorzugt zwischen zwei benachbarten Reagenzkammern 13 in i o Richtung zur Deckschicht 34 und trennt so die beiden Reagenzkammern 13a, 13b der Mischkammer 22.
Figur 2c zeigt eine dreidimensionale Ansicht im Bereich der Linie llc aus Figur 1 durch die Verbindungskanäle 14 der Kanalstruktur 2. Der Zuführkanal 6
15 weist eine Rücklaufsperre 28 auf, die als mikrofluidisches Ventil 29 ausgebildet ist. Die Tiefe des Zuführkanals 6 von der Oberfläche 30 des mikrofluidi- schen Elements 1 liegt in der gleichen Größenordnung wie die Tiefe der Verbindungskanäle 14. Sie ist aber deutlich größer als die Tiefe der rotationsachsenfernen Reagenzkammer 13a. Die Tiefe des Zuführkanals 6 beträgt also
20 ebenfalls ca. 400 μηη. Eine durch Rotationskraft aus dem Zuführkanal 6 in den Überlaufschutz 26 der Mischkammer 22 einfließende Flüssigkeit fließt über die Kante 25 in die halbkugelförmige Reagenzkammer 13a ein. Durch Rotation des Testträgers 3 wird die eingeflossene Flüssigkeit in der Reagenzkammer 13a bewegt und löst so das (hier nicht dargestellte) enthaltene Trockenrea-
25 genz an.
Beim Zuströmen weiterer Flüssigkeit wird sie durch die Verbindungskanäle 14a, 14b und 14c auch in die nicht dargestellten weiteren Reagenzkammern 13 geleitet. Im Rahmen der Erfindung wurde festgestellt, dass die von der als 30 Halbkugel 24 ausgebildeten Reagenzkammer 13 abgehenden Übergänge in die kapillaren Verbindungskanäle 14a, 14b, 14c vorzugsweise nicht kleiner als 0,4 x 0,4 mm im Querschnitt (bzw. deren Durchmesser nicht kleiner als 0,4 mm) sein darf und sich erst später graduell verjüngen darf. Bei Verbindungs- kanälen 14 mit einem kleineren Querschnitt ist die ausgeübte Kapillarkraft so groß, dass ein Überlaufen ("Crosstalk"), insbesondere der flüssigen Reagenzien vor dem Eintrocknen, entsteht.
5 Die Kanalstruktur 2 mit am Boden verrundeten Reagenzkammern 13 lässt sich auch in nicht rotierenden Testträgern einsetzen. Eine von einer (externen) Kraft getriebene Flüssigkeit fließt zunächst bei einem nicht rotierenden mikrofluidischen Element 1 in die erste Reagenzkammer 13a, füllt diese vollständig und löst das enthaltene Reagenz. Durch den verrundeten Boden der i o Kammer wird nicht nur eine gleichmäßige Verteilung des Reagenz sichergestellt. Das Anlösen des Reagenz erfolgt ebenfalls optimiert. Erst der Zustrom weiterer (Kraft getriebener) Flüssigkeit lässt sie die Kante 25 überwinden, so dass sie durch die Verbindungskanäle 14 in die benachbarte Reagenzkammer einströmen kann. Das hier enthaltene Reagenz wird folglich erst in einem
15 zweiten Schritt angelöst.
Figur 3 zeigt beispielhaft eine weitere Ausführungsform eines Testträgers 3, mit fünf identischen Kanalstrukturen 2. Der Zuführkanal 6 weist ebenfalls einen U-förmigen Kanalabschnitt 7 und einen geraden Kanalabschnitt 8 auf. Die 20 Mischkammer 22 weist an ihrem rotationsachsennahen Ende ebenfalls einen Entlüftungskanal 10 mit einer Entlüftungsöffnung 11 auf. Auch in dieser Anordnung ist die Kanalstruktur 2 als Analysefunktionskanal 15 ausgebildet und umfasst eine Messkammer 16.
25 Figur 4 zeigt eine Detailzeichnung der Mischkammer 22 aus Figur 3 mit den drei in Reihe geschalteten Reagenzkammern 13a, b, c und je zwei Verbindungskanälen 14, nämlich je einen zentralen Verbindungskanal 14a und einen seitlichen (rotationsachsennahen) Verbindungskanal 14b. Die Mischkammer 22 weist bevorzugt eine rotationsachsennahe Einlassöffnung 23 auf, durch die
30 Flüssigkeit aus dem Zuführkanal 6 in die Mischkammer 22 eintritt. Ein kapillarer Transportkanal 31 ist bevorzugt am rotationsachsenfernen langen Rand 36 der Mischkammer 22 angeordnet. Der Transportkanal 31 verläuft seitlich und radial außen an den in Reihe angeordneten Reagenzkammern 13. Seine Tiefe (von der Oberfläche 30 des Testträgers 3 aus betrachtet) ist mit ca. 150 bis 200 μηη geringer als die Tiefe der Verbindungskanäle. Die eintretende Flüssigkeit wird durch den Transportkanal 31 in die Reagenzkammer 13a geleitet. Der Entlüftungskanal 10 ist breiter als der Zuführkanal 8 und als die Verbindungskanäle 14 zwischen den Reagenzkammern 13. Auf diese Weise wird von dem Entlüftungskanal 10 eine kleinere Kapillarkraft erzeugt, so dass keine Flüssigkeit in den Entlüftungskanal 10 dringt. Zudem ist der Entlüftungskanal 10 stets rotationsachsennah angeordnet, so dass die Flüssigkeit während der Rotation nicht aus den Reagenzkammern 13 in den Entlüftungskanal 10 gelangen kann. Schon beim Befüllen der Reagenzkammer 13a entweicht die darin enthaltene Luft durch die Verbindungskanäle 14a und 14b in die nächste Reagenzkammer 13c. Sobald die Reagenzkammer 13a komplett gefüllt ist, fließt Flüssigkeit durch die beiden Verbindungskanäle 14a und 14b in die Reagenzkammer 13c. Das Befüllen der zweiten Reagenzkammer 13c erfolgt also zunächst auch mindestens teilweise durch die Verbindungskanäle 14a, 14b und durch den Transportkanal 31.
Die in der zweiten Reagenzkammer 13c enthaltene Luft entweicht durch die Verbindungskapillare 14a und 14b, die die Verbindung zur rotationsachsennahen Reagenzkammer 13b bilden. Auf diese Weise wird gewährleistet, dass keine Luft in den Reagenzkammern 13a, 13b und 13c eingeschlossen wird. Aus der Reagenzkammer 13b entweicht die Luft über den Entlüftungskanal 10. Auf diese Weise wird ein bevorzugtes Befüllen der Reagenzkammern 13 von radial außen nach radial innen ermöglicht.
Die erfindungsgemäße Anordnung erlaubt ein Vermischen der Flüssigkeiten schon beim Anlösen der Reagenzien, insbesondere beim Anlösen der Reagenzien in der zweiten und weiteren Reagenzkammer 13. Der Grad des An- lösens ist deshalb besonders hoch und effektiv.
Das Befüllen der Reagenzkammern 13a, b, c der Mischkammer 22 wird anhand der Figuren 5a bis 5c näher erläutert. In die Mischkammer 22 eintreten- de Flüssigkeit wird über den kapillaraktiven Transportkanal 31 , der der Einlassöffnung 23 benachbart ist, an den beiden rotationsachsennahen Reagenzkammern 13b, 13c vorbeigeleitet und fließt in die rotationsachsenferne Reagenzkammer 13a ein (Pfeilrichtung F). Die einströmende Flüssigkeit wird 5 dabei durch Kapillarwirkung in dem Transportkanal 31 gehalten. Während der Rotation des Testträgers 3 (in Pfeilrichtung R, hier im Uhrzeigersinn) wird die Flüssigkeit dann am rotationsachsenfernen Ende der Mischkammer 22 in die Reagenzkammer 13a gedrückt und löst das dort enthaltene Trockenreagenz an. Beim Befüllern entweicht Luft aus der Reagenzkammer 13a über die Ver- i o bindungskanäle 14a, 14b und die Kammern 13c, 13b sowie den Entlüftungskanal 10. Sobald weitere Flüssigkeit nachfließt, wird diese durch den Transportkanal 31 in die Reagenzkammer 13a geleitet und von dort zunächst zumindest teilweise durch den zentralen Verbindungskanal 14a und den tangentialen Verbindungskanal 14b in die mittlere Reagenzkammer 13c geleitet. Das
15 weitere Befüllen erfolgt direkt über den Transportkanal 31 bis die Reagenzkammer 13c gefüllt ist. Beim weiteren Einströmen von Flüssigkeit aus dem Zuführkanal 6 wird schließlich auch die rotationsachsennahe Reagenzkammer 13b gefüllt, indem die Flüssigkeit zunächst durch die zentrischen und tangentialen Verbindungskanäle 14a, b und auch durch den Transportkanal 31 und
20 später direkt in die Kammer 13b einfließt. Die in den Reagenzkammern 13 enthaltene Luft entweicht schließlich durch den Luftauslass 33 und den Entlüftungskanal 10.
In dem Beispiel weisen gemäß den Figuren 4 und 5 die Reagenzkammern 13 25 ein Einzelvolumen von 3 μΙ auf, so dass die drei Reagenzkammern gemeinsam ein Volumen von ca. 9 μΙ haben. Bevorzugt liegen die Volumina der einzelnen Reagenzkammern 13 zwischen 3 μΙ und 10 μΙ. Reagenzkammern mit einem Volumen von 2 μΙ oder nur 1 μΙ sind ebenfalls denkbar, genauso Reagenzkammern 13 mit einem Volumen von 20 μΙ, 50 μΙ, 100 μΙ oder 500 μΙ.
30
Figur 6 zeigt eine weitere bevorzugte Ausführungsform mit einer Mischkammer 22, in der zwei Reagenzkammern 13a, 13b integriert sind. Auch hier ist ein kapillarer Transportkanal 31 vorgesehen, durch den in die Mischkammer 22 eintretende Flüssigkeit zu der rotationsachsenfernen Reagenzkammer 13a geführt wird, die von den beiden Reagenzkammern 13a, 13b die am weitesten von der Rotationsachse entfernte Reagenzkammer ist. Die verrundeten Reagenzkammern 13, mit den gerundeten Böden, die bevorzugt als Halbkugel 24 ausgebildet sind, sorgen nicht nur für eine homogene Reagenzapplikation des noch flüssigen Reagenz. Sie erweisen sich auch als äußerst geeignet, wenn der Testträger 3 in einem Shake-Mode betrieben wird, bei dem die Rotationsgeschwindigkeit und Drehrichtung gemäß einer bevorzugt sägezahnförmigen Ansteuerungskurve verändert wird. Bei diesem als "Euler-Mischen" bekannten Verfahren, dass eine gute Homogenisierung und Auflösung der Trockenreagenzien garantiert, kann durch die verrundete Geometrie das Vermischen weiter gesteigert werden. Im Rahmen der Erfindung wurde erkannt, dass der effektivste Austausch und das effektivste Durchmischen an den Rändern und Wänden der Reagenzkammern 13 stattfindet. Bevorzugt sind deshalb in wenigstens einer der zwei benachbarten Reagenzkammern 13 die Verbindungskanäle 14 randlagig, z. B. tangential zu den Reagenzkammern 13, angeordnet. Dabei hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Verbindungskanäle 14 ohne Kantenübergänge an den Reagenzkammern 13 anzuformen. Darüber hinaus wurde im Rahmen der Erfindung erkannt, dass mehrere Reagenzkammern mit Verbindungskanälen während des "Euler-Mischens" das Fluid durch die Verbindungskanäle 14 von Kammer 13 zu Kammer 13 transportiert und in Kombination mit den gerundeten Flächen ein diffuser Austausch und eine gute Mischeffizienz geschaffen werden kann.
Da die Reagenzkammern 13 bevorzugt derart benachbart angeordnet sind, dass ihr Abstand kleiner ist als die kleinste Dimension der Reagenzkammern 13 in der Testträgerebene, ist auch ein schneller Fluidtransport von einer Kammer 13 in die andere möglich. Der kleinste Abstand wird im Rahmen der Erfindung definiert als die kleinste Entfernung zwischen den Reagenzkammern 13 bzw. zwischen den Reagenzkammeraußenwänden. Wenigstens der zentral gelegene Verbindungskanal 14a zwischen zwei Reagenzkammern 13 ist deshalb kürzer als die kleinste Dimension der Reagenzkammern 13. In dem in Fig. 6 gezeigten Beispiel ist der zentrale Verbindungskanal 14a etwa 0,2 mm lang. Seine Breite und Tiefe ist jeweils 0,4 mm. Die Reagenzkammern 13 haben eine Höhe von 1 ,4 mm. Der Durchmesser der Reagenzkammern beträgt 1 ,95 mm. Durch diese geometrische Anordnung ist ein Fluidtransport 5 zwischen zwei benachbarten Reagenzkammern 13 ungehindert möglich.
Durch die kurzen Verbindungskanäle 14 kann das Fluid schnell von einer Kammer zur anderen transportiert werden. Der Transport geschieht direkt ohne dazwischen liegende Ventil strukturen, Heberanordnungen oder siphonartige Kanalstrukturen, deren Länge ein Mehrfaches der Reagenzkammern i o beträgt. Hierdurch ist der Prozessablauf mit den erfindungsgemäßen Reagenzkammern sehr schnell und spart Zeit. Es lassen sich außerdem eine gesteuerte und definierte Auflösung von unterschiedlichen Trockenreagenzien, die in einzelnen Reagenzkammern 13 enthalten sind, durchführen.
15 Durch den modularen Aufbau mit kleinen Reagenzkammern 13, ist es möglich Testträger 3 vorzusehen, die auf diesem Prinzip beruhend beliebig erweiterbar sind. So lassen sich nicht nur zwei oder drei, sondern auch mehrere Kammern in Reihe schalten.
20 Neben den runden halbkugelförmigen Reagenzkammern sind auch andere Formen der Reagenzkammern möglich, beispielsweise tropfenförmige Reagenzkammerformen oder bei der Verwendung von zwei Reagenzkammern, die in einer Mischkammer 22 integriert sind z. B. so genannte "Yin- Yang- Ausformungen". Bevorzugt sind auch diese Reagenzkammern am Boden ver-
25 rundet. Vorteilhaft erweisen sich vor allem ovale und runde Kammerformen.
Figur 7 zeigt eine sternförmige Anordnung von drei Reagenzkammern 13 in einer Mischkammer 22. Auch in dieser Anordnung wird über den Transportkanal 31 die rotationsachsenferne Mischkammer 13a zuerst befüllt. Bei einem 30 Einfließen von weiterer Flüssigkeit werden dann die beiden rotationsachsennäheren Reagenzkammern 13b, 13c gemeinsam gefüllt. Zwischen den Reagenzkammern 13a und 13b ist nur ein zentraler Verbindungskanal 14a vorgesehen, da der kapillare Transportkanal 31 als zweiter Verbindungskanal sehen, da der kapillare Transportkanal 31 als zweiter Verbindungskanal 14b dient.
In den Figuren 8a und 8b sind dreidimensionale Ansichten einer derartigen sternförmigen Reagenzkammeranordnung gezeigt. Deutlich zu erkennen sind die verrundeten Verbindungskanäle 14 zwischen den Reagenzkammern 13 sowie die verrundeten halbkugelförmigen Reagenzkammern 13 selbst. In dieser Ausführungsform ist zu erkennen, dass der Transportkanal 31 fluidisch auch als Verbindungskanal 14 fungiert.
Figur 9 zeigt, dass auch eine sternförmige oder kreisförmige Anordnung von Reagenzkammern 13 erweitert werden kann. So lassen sich, wie hier gezeigt, sechs Reagenzkammern 13 fluidisch zusammenschalten, wobei das Prinzip beibehalten wird, dass die rotationsachsenfernste Reagenzkammer 13a zu- erst befüllt wird. Ein Befüllen der weiteren Kammern geht dann von der rotationsachsenfernen Kammer 13a aus, die am weitesten von der Rotationsachse 4 entfernt ist.
Während des Rotierens des Testträgers wird das Fluid durch alle Reagenz- kammern bewegt, bei der sternförmigen Anordnung genauso wie bei der reihenförmigen Anordnung. Auf diese Weise lässt sich ein sehr effizientes Anlösen und Vermischen sowie eine gezielte Steuerung der Flüssigkeitsmengen erzielen. Die dabei erhaltene sehr kompakte und kleine Anordnung hat den Vorteil, dass mehrere kaskadierte Kanalstrukturen 2 auf einen Testträger 3 angeordnet sein können.
Anhand der Figuren 10a bis 10c wird der Eintrocknungsprozess von zwei Reagenzien in einem mikrofluidischen Element 1 zu unterschiedlichen Zeitpunkten erläutert, wobei in jeder Figur sowohl eine Ansicht von oben als auch ein Schnitt dargestellt ist.
Ausgehend von zwei Reagenzkammern 13, die von einander getrennt sind und über Verbindungskanäle 14 miteinander in Fluidverbindung stehen, wird das Eintrocknen der zunächst flüssigen Reagenzien erläutert. Die beiden Reagenzkammern 13a, 13b sind in einer Mischkammer 22 integriert. Zwischen den beiden Reagenzkammern 13a, 13b ist ein Steg 27 angeordnet, so dass die beiden Kammern 13 räumlich voneinander beabstandet sind. In dem Steg 5 27 sind die Verbindungskanäle 14 eingelassen. Die hier gezeigte Ausführungsform weist drei Verbindungskanäle 14a, 14b und 14c auf, wobei der Verbindungskanal 14a ein zentraler Kanal ist und die beiden weiteren Verbindungskanäle 14b und 14c jeweils seitlich angeordnet sind. i o Figur 10a zeigt, dass ein flüssiges Reagenz in die halbkugelförmigen Reagenzkammern 13a, 13b eingebracht wird. Pro Reagenz wird eine Reagenzkammer 13 verwendet, die auf Grund ihrer Form auch als "Perle" bezeichnet wird. Insgesamt liegt in der Mischkammer 22 also eine "Perlenkettenstruktur" vor. Das Reagenz wird jeweils in die Mitte der Reagenzkammer 13a, 13b ap-
15 pliziert. Während des folgenden Trocknungsvorgangs benetzt das Reagenz die Umgebung des Dosierpunktes und bildet dabei einen gleichmäßigen Film. Da die Reagenzkammern frei von Kanten oder Ecken sind, in denen das Reagenz aufkonzentrieren könnte, findet eine sehr gleichmäßige Verteilung statt. Erreicht das flüssige Reagenz die Verbindungskanäle 14, so tritt es in sie hin-
20 ein. Durch den Flusswiderstand der Verbindungskanäle 14 wird es jedoch abgebremst und fließt nicht bis zum Übergang in die benachbarte Reagenzkammer 13. Erreicht das flüssige Reagenz den oberen Rand der Reagenzkammer 13, die den Abschluss zur Oberfläche des mikrofluidischen Elements 1 bilden, so stoppt das Reagenz an der Kante und fließt nicht weiter. Die er-
25 folgende Querschnittserhöhung hat folglich eine Kapillarstopwirkung.
Die Verbindungskanäle 14 weisen bevorzugt einen derartigen Querschnitt auf, dass die Flüssigkeit in den Verbindungskanälen 14 gebremst und nicht auf Grund von Kapillarkräften in die benachbarte Reagenzkammer 13 transportiert 30 wird. Auf der einen Seite muss der Querschnitt folglich groß genug sein, damit die entstehenden Kapillarkräfte klein genug sind, so dass die Verbindungskanäle nicht vollständig mit dem Reagenz gefüllt werden und sich die Reagenzien in den Verbindungskanälen vermischen. Auf der anderen Seite muss der Querschnitt der Verbindungskanäle klein genug sein, damit der Flusswiderstand ausreicht, um einströmendes Reagenz in den Verbindungskanälen 14 abzubremsen.
5 Die geeignete Wahl des Querschnitts der Verbindungskanäle 14 beeinflusst nicht nur den Eintrocknungsprozess, wenn lediglich Kapillarkräfte wirken. Die Querschnitte haben auch Einfluss auf die Mischeffizienz und den Austausch von Flüssigkeiten zwischen zwei Reagenzkammern 13. Damit ausreichend hohe Strömungsgeschwindigkeiten erzielt werden, die einen Fluidaustausch i o zwischen den Kammern 13 ermöglichen, ist der Querschnitt der Verbindungskanäle wenigstens 0, 1 mm 2 , bevorzugt 0,4 x 0,4 mm 2 groß. Querschnitte von weniger als 0,05 mm 2 haben sich als nicht geeignet erwiesen.
Die halbkugelförmigen oder am Boden verrundeten Reagenzkammern 13 zei- 15 gen, dass es bei einem Füllen mit einem flüssigen Reagenz mit einem Volumen von maximal 70 % des Kammervolumens ein problemloses Eintrocknen der Reagenzien möglich ist. Ein Vermischen von zwei Reagenzien in zwei benachbarten Kammern 13 wird zuverlässig verhindert. Bevorzugt ist das zu applizierende Volumen des flüssigen Reagenz kleiner 60 % des Kammervo- 20 lumens, besonders bevorzugt kleiner 55 %.
Figur 10c zeigt die beiden Reagenzkammern 13, nachdem das flüssige Reagenz aufgespreitet ist. Die Verbindungskanäle 14 sind jeweils nur an ihrem Anfang mit Flüssigkeit benetzt. Die größte Strecke der jeweiligen Verbin- 25 dungskanäle 14 ist frei von Flüssigkeit, so dass ein Vermischen der beiden Reagenzien zuverlässig verhindert wird.
Im Rahmen der Erfindung hat sich gezeigt, dass die Reagenzkammern 13 mit einem verrundeten Boden, insbesondere wenn sie bevorzugt in einer Misch- 30 kammer 22 integriert sind, nicht nur für das Eintrocknen von zwei unterschiedlichen Reagenzien besonders geeignet sind, sondern dass derartige Reagenzkammern 13 in nicht rotierenden mikrofluidischen Elementen 1 eingesetzt werden können. Die zur Steuerung der Flüssigkeiten und zum Anlösen der Reagenzien benötigte Kraft wird durch eine externe Kraft erzeugt. Alternativ zur Zentrifugalkraft bzw. Rotationskraft können Druckkräfte erzeugt werden, die beispielsweise durch eine externe Pumpe hervorgerufen werden. Auch kann diese Kraft auf einem hydrostatischen Druck basieren. Die für rotierende Testträger gemachten Aussagen im Rahmen dieser Erfindung gelten deshalb auch für nicht rotierende mikrofluidische Elemente. Die anhand der Figuren 2 bis 9 beschriebenen Besonderheiten können entsprechend auch in nicht rotierende Anordnungen und Kanalstrukturen verwendet werden.