Mikrofluidsystem

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf mikro fluidische Systeme wie Mikroreaktoren oder „Lab on a Chip".

Mikrofluidische Systeme sind aufgrund der Möglichkeit, in diesen Reaktionen mit hohem Durchsatz und hoher Geschwindigkeit bei geringem Materialeinsatz durchzuführen, von großem Interesse.

Jedoch ist diese Technik noch bei weitem nicht ausgereizt, insbesondere was die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der durchführbaren Reaktionen betrifft.

Es besteht daher die Aufgabe, alternative und neue Systeme bereitzustellen, bei denen die Nachteile der bestehenden Systeme zumindest teilweise überwunden werden können.

Diese Aufgabe wird durch ein mikro fluidisches System nach Anspruch 1 sowie ein Verfahren zur Durchführung von Reaktionen in mikro fluidischen Systemen nach Anspruch 7 gelöst.

Demgemäß wird ein mikro fluidisches System vorgeschlagen, umfassend mindestens ein Basissubstrat sowie mindestens zwei Zonen, welche an dem Basissubstrat angeordnet sind, - wobei jeder der Zonen eine Größe von >10μm ² und ≤lOOmm ² aufweist und einen

Katalysator umfasst, wobei die Katalysatorkonzentration von > 1 amol/cm ² und <

1 μmol/cm ² beträgt. Die Katalysatorkonzentration bezieht sich hierbei auf die Fläche an die der Katalysator gekoppelt wird. wobei mindestens zwei der Zonen entlang einer Vorzugsrichtung angeordnet sind und das System über einen Flussgenerator verfügt, der in der Lage ist, in der Vorzugsrichtung einen laminaren Fluss mit einer Stärke von >0,5μl/min und

<1000μl/min einzustellen.

überraschenderweise hat sich bei einem derartigen System herausgestellt, dass bei vielen Anwendungen der vorliegenden Erfindung mindestens einer der vorliegenden Vorteile erzielt werden kann:

Durch das System ist es möglich, auch schwierige Stoffwechselprozesse mit einer zumindest zufriedenstellenden Genauigkeit zu simulieren

Die durch ein solches System realisierbaren Reaktionen sind mit einer höheren Ausbeute und Selektivität durchführbar

Ein derartiges System ermöglicht eine kontrollierte Zuführung / Abführung von

Zwischenprodukten

Durch die Verwendung eines laminaren Flusses sind Diffusionsprozesse kontrollierbar

über einen Austausch der Katalysator-Oligonucleotid-Konjugate ist eine Regenerierbarkeit des Mikrofluidiksystems möglich.

Die Katalysatoranordnung ist frei konfigurierbar.

In dem System lassen sich die Katalysatormengen einstellen.

Als ein weiterer Vorteil, der insofern eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung darstellt, hat sich herausgestellt, dass es mittels eines erfindungsgemäßen Systems möglich ist, mit einer hohen Genauigkeit Metabolismen zu simulieren.

Unter „mikrofluidisches System" im Sinne der vorliegenden Erfindung werden insbesondere und insofern bevorzugt alle Reaktionsgefäße und/oder -Systeme verstanden, deren dreidimensionale Strukturen innere Abmessungen von etwa 10-1000 μm betragen und/ oder deren Oberfläche: Volumenverhältnis im Bereich von ≥IO.OOO m ² /m ³ beträgt.

Unter „Basissubstrat" im Sinne der vorliegenden Erfindung wird insbesondere und insofern bevorzugt ein fester Träger verstanden, auf dem - ggf. getrennt durch weitere Schichten und/oder Zonen - Katalysatoren aufgebracht werden können. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Basissubstrat eine Trägerplatte aus Glas und/oder Polymeren sowie Mischungen daraus.

Unter „Zone" im Sinne der vorliegenden Erfindung wird insbesondere und insofern bevorzugt ein zweidimensionaler Abschnitt auf dem Basissubstrat und/oder einem Abschnitt auf dem Basissubstrat zuordbarer Bereich verstanden, in dem ein dieser Zone zuordbarer Katalysator angeordnet und/oder anordbar ist, wobei die „Konzentration" dieses Katalysators (gemessen am Anteil der Gesamtkonzentration an Katalysatoren in der Zone) >70% (Mol:Mol) bevorzugt >80 %, ferner bevorzugt >90 %, sowie am meisten bevorzugt >95% beträgt.

Dabei bedeutet oder umfasst „anordnen" sowohl eine Anordnung mittels kovalenter und/oder Wasserstoffbrückenbindungen, jedoch soll der Begriff „anordnen" auch umfassen, dass die Katalysatoren (z.B. über sog. ,,packed-Beads"-Anordnungen) an der Zone physikalisch angeordnet sind.

Unter „Katalysator" im Sinne der vorliegenden Erfindung wird insbesondere und insofern bevorzugt ein Biokatalysator wie ein Enzym und/oder ein Antikörper und/oder ein Hapten und/oder Rezeptor verstanden.

- A -

Jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt, so dass gemäß einer alternativen bevorzugten Ausführungsform unter einem „Katalysator" auch sämtliche im Stand der Technik bekannten Katalysatoren zum Einsatz kommen, darunter - aber nicht beschränkend - Metalle und/oder Metallkomplexe, insbesondere übergangsmetalle und/oder übergangsmetallkomplexe, sowie Kolloide, Vesikel, Liposomen, Micellen und Nanopartikel.

Besonders bevorzugte Kolloide und Nanopartikel umfassen Kolloide und/oder Nanopartikel, welche Metalle mit hohen Redoxpotentialen, bevorzugt ausgewählt aus Silber, Gold und/oder Platin enthalten. Besonders bevorzugt sind dabei Kolloide und/oder Nanopartikel, welche Golde luster, insbesondere Goldcluster der Größe Au ₃ O - Auso, besonders bevorzugt AU55

Alternativ umfassen bevorzugte Nanopartikel Halbleiter-Nanopartikel, insbesondere CdS / CdSe / CdTe oder ZnO/ ZnS / ZnSe sowie TiO ₂ enthaltende Partikel.

Besonders bevorzugt sind weiterhin membranumschlossene Vesikel, insbesondere membranumschlossene Vesikel, welche membranständige und/oder transmembranale Proteine enthalten (auch Mikrosomen bzw. Baculosomen genannt). Dabei umfasst das Baculosom CYP-Isoformen, in speziellen das Cytchrom P450. In einer weiteren Ausführungsform umfasst ein Baculosom eine CYP-Isoform und eine NADPH-Reduktase.

Unter „Vorzugsrichtung" im Sinne der vorliegenden Erfindung wird insbesondere und insofern bevorzugt verstanden, dass mehrere Zonen entlang eines Kanals angeordnet sind

Unter „laminarem Fluss" im Sinne der vorliegenden Erfindung wird insbesondere und insofern bevorzugt verstanden, dass innerhalb des mikrofluidischen Systems ein Fluss an Lösemittel bzw. Reaktionsmedium stattfindet, bei dem keine oder nur wenig Turbulenzen auftreten. Bevorzugt ist das Lösemittel Wasser bzw. eine wässrige Lösung.

Unter „Flussgenerator" im Sinne der vorliegenden Erfindung wird insbesondere und insofern bevorzugt verstanden, ein Pumpensystem zur Applikation von Druck bzw. Unterdruck auf die Kanäle wie z.B. Spritzenpumpen, Schlauchpumpen sowie Gravitation oder Kapillarkraft getriebene Systeme.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Verfahren zur Durchführung von Reaktionen in einem mikrofluidischen System, umfassend

- mindestens ein Basissubstrat sowie

- mindestens zwei Zonen, welche an dem Basissubstrat angeordnet sind,

- wobei jede der Zonen eine Größe von >10μm ² und <2mm ² aufweist und einen Katalysator umfasst, wobei die Katalysatorkonzentration von > 1 amol/cm ² und <

1 μmol/cm ² beträgt. Die Katalysatorkonzentration bezieht sich hierbei auf die Fläche an die der Katalysator gekoppelt wird und nicht auf die Größe der Zone.

- wobei mindestens zwei der Zonen entlang einer Vorzugsrichtung angeordnet sind

wobei zumindest während eines Teils der Reaktion in der Vorzugsrichtung ein laminarer Fluss mit einer Stärke von >0,5μl/min und <1000μl/min eingestellt ist.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich ausserdem auf ein mikro fluidisches System, umfassend

- mindestens ein Basissubstrat sowie - mindestens zwei Zonen, welche an dem Basissubstrat angeordnet sind,

- wobei jede der Zonen eine Größe von >10μm ² und <2mm ² aufweist und einen Katalysator umfasst, wobei die Katalysatorkonzentration von > 1 amol/cm ² und <

1 μmol/cm ² beträgt. Die Katalysatorkonzentration bezieht sich hierbei auf die Fläche an die der Katalysator gekoppelt wird und nicht auf die Größe der Zone. - wobei die Katalysatoren mit dem Basissubstrat mittels DDI verbunden sind

Der Term „DDI" im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet dabei „DNA-directed- immobilization". Darunter wird verstanden, dass zum einen die Katalysatoren mit Oligonucleotiden und/oder Molekülen versehen sind, die in der Lage sind, Duplexe mit Oligonucleotiden zu bilden und so selbstorganisiert an Oberflächen binden, die zuvor mit einer komplementären Sequenz versehen wurden.

überraschenderweise hat sich bei einem derartigen System herausgestellt, dass bei vielen Anwendungen der vorliegenden Erfindung mindestens einer der vorliegenden Vorteile erzielt werden kann:

- Durch das System ist es möglich, auch schwierige Stoffwechselprozesse mit einer zumindest zufriedenstellenden Genauigkeit zu simulieren

Die durch ein solches System realisierbaren Reaktionen sind mit einer höheren

Ausbeute und Selektivität durchführbar

Ein derartiges System ermöglicht eine kontrollierte Zuführung / Abführung von Zwischenprodukten

Durch die Verwendung eines laminaren Flusses sind Diffusionsprozesse kontrollierbar

über einen Austausch der Katalysator-Oligonucleotid-Konjugate ist eine

Regenerierbarkeit des Mikrofluidiksystems möglich

Die Katalysatoranordnung ist frei konfigurierbar - In dem System lassen sich die Katalysatormengen einstellen

Durch die Oligonucleotidsequenz besitzen die Katalyatoren einen gewissen Abstand von der Oberfläche des Basissubstrats, so dass meist keine Einbussen bei der Aktivität messbar sind

Die Methode zur Aufbringung der Katalysatoren ist äußerst schonend, so dass auch empfindliche Katalysatoren wie Enzyme innerhalb des mikrofiuidischen Systems verwendet werden können.

Die Methode ermöglicht das „Auswechseln" von Katalysatoren. Dies stellt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar und soll im Folgenden kurz beschrieben werden. Um einen Katalysator „auszuwechseln", wird dieser mit einem Strang versehen, welcher in der Lage ist, mit einem Strang zu hybridisieren, der einem bisherigen Katalysator zugeordnet ist. Bevorzugt hat der neu einzuführende Katalysator eine ähnliche, wenn nicht sogar höhere Affinität. Beim „Auswechselprozess" wird nun der neue Katalysator in einer Konzentration zugegeben, die ausreicht, den bisherigen Katalysator zu verdrängen. Durch ggf. Einstellen eines Flusses oder Zugabe von Hilfsreagentien kann dieser Prozess noch unterstützt werden.

Innerhalb dieser Erfindung soll der Term „Oligonucleotid(e)" für sämtliche oligomeren oder polymeren Moleküle verwendet werden, die in der Lage sind, mit Oligonucleotiden Duplexe über Wasserstoffbrückenbindungen zu bilden. Dabei sollen somit auch alle „künstlichen" Nucleotide wie PNA, Bicylo-/Tricylo- DNA, LNA, Pyranosyl-NA, HNA, CeNA aber auch Hybride aus DNA, RNA und den aufgeführten DNA Analoga mit dem Begriff „Oligonucleotid(e)" mit umfasst sein, aus Gründen der Lesbarkeit wird jedoch im Folgenden nur von „Oligonucleotiden" gesprochen, auch wenn damit auch andere Moleküle mit gemeint und umfasst sind.

Bevorzugt weisen dabei entweder die Katalysatoren und/oder die Oberflächen Sequenzen auf, die bei >6 Basenpaaren liegen, wobei Sequenzen von >10 oder >25 Basenpaaren bevorzugt sind.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich ausserdem auf die Herstellung eines mikrofluidischen Systems umfassend mindestens einen „Spotting"-Schritt.

Dabei wird unter „Spotting verstanden, dass mechanische positionieren der Fängersubstanzen auf dem Basissubstrat z.B. mit Hilfe von Nadel- oder Piezospotting Geräten.

Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das mikrofluidische System mindestens zwei Zonen. Bevorzugt sind dabei mikrofluidische Systeme, welche mindestens drei, noch bevorzugt mindestens vier, noch bevorzugt mindestens fünf bis zehn Zonen umfassen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung weist jede der Zonen Katalysatorfelder einer Größe von >10μm ² und ≤lOOmm ² _j bevorzugt <40mm ² , noch bevorzugt <20mm ² sowie am meisten bevorzugt ≤lOmm ² auf. Dies hat sich in der Praxis bewährt, da so eine effektive Reaktionsführung möglich ist. Weiterhin bevorzugt weist zumindest eine, bevorzugt jede der Zonen eine Größe von >200μm ² und <6mm ² , noch bevorzugt >1000μm ² und <3mm ² , ferner bevorzugt >5000μm ² und <2mm ² sowie am meisten bevorzugt >10000μm ² und ≤lmm ² auf.

Gemäß der vorliegenden Erfindung beträgt die Katalysatorkonzentration innerhalb einer Zone > 1 amol/cm ² und < 1 μmol/cm ² . Die Katalysatorkonzentration bezieht sich hierbei auf die Fläche an die der Katalysator gekoppelt wird und nicht auf die Größe der Zone. Auch diese Werte haben sich in der Praxis bewährt, da so zum einen sichergestellt ist, dass überhaupt eine Reaktion stattfindet, auf der anderen Seite die Katalysatoren optimal wirken können. Bevorzugt beträgt die Katalysatorkonzentration innerhalb einer Zone (unabhängig von den anderen Zonen) > 1 amol/cm ² und < 1 μmol/cm ² , noch bevorzugt > 10 amol/cm ² und < 10 nmol/cm ² , ferner bevorzugt > 100 amol/cm ² und < 100 pmol/cm ² , sowie am meisten bevorzugt > 1 fmol/cm ² und < 1 pmol/cm ² Die Katalysatorkonzentration bezieht sich hierbei auf die Fläche an die der Katalysator gekoppelt wird und nicht auf die Größe der Zone.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist der Flussgenerator in der Lage, in der Vorzugsrichtung einen Fluss mit einer Stärke von >0,5μl/min und <1000μl/min einzustellen. Dies hat zur Folge, dass zum einen eine Reaktion der im Fluss befindlichen Reaktanden mit den Katalysatoren möglich wird, zum anderen Verluste oder störende Effekte durch Querdiffusion weitgehend vermieden werden. Bevorzugt beträgt die Stärke des Flusses >lμl/min und

<100μl/min, noch bevorzugt, >l,5μl/min und <50μl/min, weiter bevorzugt, sowie am meisten bevorzugt >2μl/min und <10μl/min

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Basissubstrat einen Glasträger. Die Katalysatoren sind dabei auf dem Glasträger bevorzugt über DDI angebracht.

Weiterhin bevorzugt ist es, dass das mikrofluidische System über mindestens eine weitere, auf dem Basissubstrat angebrachte oder mit diesem über weitere Schichten verbundene Schicht verfügt, in der Kanäle und/oder andere Führungselemente für den Fluss und/oder die Herstellung der Vorzugsrichtung angebracht sind. Dabei haben sich in der Praxis besonders Schichten bewährt, die auf Polymeren wie z.B. Polycarbonaten, Polypropylen oder Polysiloxanen oder hybriden Polymeren wie z.B. Ormoceren, insbesondere bevorzugt PDMS aufgebaut sind.

Bevorzugt wird diese weitere Schicht durch ein Verfahren mit dem Basissubstrat verbunden, welches einen Schritt der Sauerstoffplasmabehandlung der aufzubringenden Schicht (im Folgenden: „Führungsschicht" genannt), in der Kanäle und/oder andere Führungselemente für den Fluss und/oder die Herstellung der Vorzugsrichtung angebracht sind, enthält.

Dies hat sich in vielen Fällen, insbesondere dann, wenn PDMS benutzt wird, als vorteilhaft herausgestellt, da so eine besonders gute Verbindung hergestellt werden kann. Dieses Verfahren ist unabhängig von dem vorgestellten Mikrosystem von eigenständiger erfinderischer Bedeutung.

Bevorzugt wird die Sauerstoffbehandlung bei >30 W und <80 W, bevorzugt >40 W und <60 W, für >5s und <40 s, bevorzugt >15s und <25 s, sowie bevorzugt bei einem Druck von >10 mTorr und <50 mTorr, bevorzugt >20 mTorr und <30 mTorr durchgeführt.

Weiterhin umfasst das Verfahren bevorzugt die Behandlung der plasmabehandelten Führungsschicht mit einem reaktiven Silan. Bevorzugt sind dabei Silane, welche über Halogen oder Alkoxy- Abgangsgruppen verfügen. Besonders bevorzugt sind Silane der folgenden Struktur:

H ₂ N - (CH) _x - Si - R ¹ R ² R ³ ,

wobei n von 1 bis 5 beträgt und R ¹ , R ² , R ³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe enthaltend Halogene, Alkoxygruppen, bevorzugt Methoxy, Ethoxy, Propyloxy, Isopropyloxy und Butyloxy .

Ein insbesondere bevorzugtes Silan ist Aminopropyltriethoxysilan.

Dadurch kann die Haftung der Führungsschicht an das Basissubstrat in vielen Fällen nochmals erhöht werden; in vielen Fällen ist durch das Verfahren auch eine Anbindung ohne Aktivierung des Basissubstrats möglich.

Besonders bevorzugt wird die Behandlung bei einer Temperatur von >20°C und <40°C in einem polaren Lösemittel, bevorzugt Ethanol durchgeführt.

Wie oben bereits beschrieben, umfassen die innerhalb dieser Erfindung besonders bevorzugten Katalysatoren Enzyme.

Dabei umfassen gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die Katalysatoren mindestens ein Enzym sog. „Phase I und Phase II" aus der Leber. Im Einzelnen sind u.a. mindestens eins oder mehrere Enzyme der folgenden Gruppen bevorzugt:

- Cytochrome P450 besonders bevorzugt die die Cytochrome CYP3A4, CYP2D6, CYP2C8/9 und CYPl A/2

- Flavin monooxygenasen (FMOs)

- UDP-glycosyltransferasen (UGTs)

- Glutathiontransferasen (GSTs)

- Sulfotransferasen (SULTs) - N-acetyltransferasen (NATs)

sowie Mischungen dieser Enzyme.

Es hat sich herausgestellt, dass es mittels des erfindungsgemäßen Systems möglich ist, insbesondere den Metabolismus der Phase I und/oder Phase II besonders verlässlich zu simulieren, was somit ermöglicht mittels einer Ausführungsform der Erfindung die Stoffwechselprozesse und/oder Metabolismen dieses wichtigen Systems zu simulieren. Dies stellt insofern eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.

Weiterhin umfassen die Katalysatoren gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung eines oder mehrere Syntheseenzyme der Klassen:

- Oxyreductasen

- Transferasen

- Hydrolasen - Lyasen

- Isomerasen

- Ligasen

- Oxigenasen, Monooxygenasen, Hydrolasen, Lypasen, Acylasen, Aldolasen,

Glycosidasen, Nucleasen, Proteasen, Polymerasen, Amidasen, Aminotransferasen, Kinasen, Phosphatasen, sowie Mischungen daraus.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind zumindest einem Teil der Katalysatoren mindestens ein weiteres Co-Immobilisat zugeordnet.

Dabei bedeutet und/oder umfasst „Co-Immobilisat" insbesondere mindestens ein Agens und/oder Molekül, welches in der Lage ist, die Aktivität und/oder Stabilität des Katalysators zu erhöhen.

Der Term „zugeordnet" bedeutet und/oder umfasst insbesondere, dass der Co-Immobilisat in räumlicher Nähe (Entfernung bevorzugt < 500 nm) des Katalysators angeordnet ist.

Besonders bevorzugte Co-Immobilisate sind u.a.

Fettsäuren, Steroide, substituierte Aromaten: Diese Co-Immobilisate haben sich besonders beim Einsatz von Enzymen bewährt, da so die chemische Umgebung der

Enzyme günstig beeinflusst werden kann; - Komplexe: Diese Co-Immobilisate haben sich besonders bei Enzymen (welche in ihrer Umgebung bestimmte Metall-Ionen benötigen) sowie bei Metallkatalysatoren bewährt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist mindestens ein Co-Immobilisat mit dem Basissubstrat mittels DDI verbunden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind zumindest einem Teil der Katalysatoren mindestens ein weiterer Co-Katalysator zugeordnet.

Dabei bedeutet und/oder umfasst „Co-Katalysator" insbesondere mindestens ein Agens und/oder Molekül, welches in der Lage ist, mittels Katalyse die Aktivität und/oder Stabilität des Katalysators zu erhöhen, z.B. dadurch dass benötigte Kofaktoren etc. regeneriert werden.

Der Term „zugeordnet" bedeutet und/oder umfasst insbesondere, dass der Co-Katalysator in räumlicher Nähe des zugeordneten Katalysators (Entfernung bevorzugt < 500 nm ) angeordnet ist.

Besonders bevorzugte Co-Katalysatoren sind gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung Enzyme, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe

NADH Oxidoreductasen

NADPH Oxidoreductasen

FADPH ₂ Oxidoreductasen - P450 Reductasen

Adenylatkinasen regenerierende Enzyme aus den Klassen der Oxyreductasen, wie z.B. Alkohol-

Dehydrogenase, Formiat-Reduktase, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen,

Ligasen.

sowie Mischungen daraus.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist mindestens ein Co-Katalysator mit dem Basissubstrat mittels DDI verbunden.

Die vorgenannten sowie die beanspruchten und in den Ausführungsbeispielen beschriebenen erfindungsgemäß zu verwendenden Bauteile unterliegen in ihrer Größe, Formgestaltung, Materialauswahl und technischen Konzeption keinen besonderen Ausnahmebedingungen, so

dass die in dem Anwendungsgebiet bekannten Auswahlkriterien uneingeschränkt Anwendung finden können.

Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile des Gegenstandes der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen sowie aus der nachfolgenden Beschreibung der zugehörigen

Zeichnungen, in denen - beispielhaft - mehrere Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Systems dargestellt sind. In den Zeichnungen zeigt:

Fig. 1 eine schematische dreidimensionale Darstellung eines Basissubstrats mit darauf aufgebrachten Zonen sowie einer PDMS-Schicht, die mit dem Basissubstrat verbunden werden soll;

Fig. 2 ein Foto, welches das Ergebnis einer mittels des mikrofluidischen Systems durchgeführten Reaktion zeigt; sowie

Fig. 3 eine Grafik, welches das Ergebnis einer weiteren mittels des mikrofluidischen

Systems durchgeführten Reaktion zeigt.

Fig. 4 eine Grafik mit gekoppelte Umsetzung von Amplex Red mit Quantum Dots und Horseradishperoxidase (HRP).

Fig. 5 eine Grafik über die Quantifizierung vor und nach der Stangverdrängung mit cDNA-D und cDNA-D.

Fig. 6 eine Grafik mit den Ergebnissen über die Immobilsierung von DNA Goldnanopartikeln.

Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand folgender Beispiele erklärt, in dem - rein illustrativ - ein mikrofluidisches System gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung gezeigt ist.

Beispiel 1 :

Das mikrofluidische System 1 wurde anhand eines Mikrofluid-Chips realisiert, bei dem auf einem Basissubstrat 10, basierend auf Glas, verschiedene Zonen 20 mit Fängeroligonucleotiden durch Spotting verankert wurden. Anschließend wurde eine PDMS- Schicht 30 aufgebracht. Mit der DDI Technik wurden im Folgenden Katalysatoren ortsspezifisch in den Zonen immobilisiert.

Im einzelnen wurden für die Herstellung der verschiedenen Zonen Mikroarray-Techniken benutzt, wie sie z.B. bei R.Benters, CM. Niemeyer, D. Wöhrle, ChemBioChem, 2001, VoI 2, 686-694 beschrieben sind, wobei dieser Artikel durch Zitierung inkorporiert wird.

Die Fängeroligonucleotide werden mittels Spotting-Technik aufgebracht. Hierzu wurden mittels einer piezogetriebenen Spottingvorrichtung dünne Linien mit einer Breite von ca. 500 μm und ca. 2 mm Breite auf dem Substrat gespottet, indem mehrmals ca. zehn Tropfen (jeweils ca. 0,4nl) einer 10 μM Lösung der jeweiligen Oligonucleotide, welche die Katalysatoren an der Oberfläche verankern aufgebracht wurden. Dabei betrug der Abstand zwischen den Linien etwa 1 mm, so dass definierte Zonen entstanden, in denen jeweils >95% der Katalysatoren einheitlich sind. Die Größe der Zonen betrug ca. 500-2000μm x 400μm.

Das entstandene Glassubstrat wurde anschließend mit dem PDMS verbunden. Hierzu wurde Polydimethylsiloxan als Reagens benutzt; die genaue Herstellung ist in B. Graß, A. Neyer, M. Jönck, D. Siepe, F. Eisenbeiß, G. Weber, and R. Hergenröder. Sensors and Actuators B 2001,VoI. 72, pp. 249-258 beschrieben, wobei dieser Artikel durch Zitierung inkorporiert wird.

Die Verbindung erfolgte dergestalt, dass zunächst eine Sauerstoffbehandlung des PDMS bei 5OW für 20s bei 25 mTorr durchgeführt wurde, anschließend wurde das PDMS für 30 min mit Aminotriethoxysilan (5% in Ethanol) behandelt. Es folgte ein Trocknungsschritt bei 37 ⁰ C für 10 min, danach wurde das PDMS auf das Basissubstrat aufgebracht.

Im genaueren wurde eine Form aus Nickel als Replikationsvorlage benutzt, um mikro fluidische Kanäle mit einer Breite von 100 μm und einer Tiefe of 25 μm herzustellen

Um ein PDMS-Substrat, welches die gewünschten mikro fluidischen Kanäle 40 enthält, zu gewinnen wurde auf die Nickelform eine Prepolymer-Lösung von Sylgard 184 (Dow Corning) gegeben, im Vakuum evakuiert und bei 70 ⁰ C für 2h gehärtet. Danach wurde das PDMS-Substrat von der Nickelform entfernt und an das Basissubstrat angebracht.

Fig. 1 zeigt einen schematischen Aufbau des Basissubstrats mit den aufgebrachten Katalysatoren sowie das mit den Kanälen versehene PDMS-Substrat.

Anschließend wurden mehrere Enzyme eines Multienzymsystems in dem mikrofluidischen System per DDI aufgebracht. Dabei wurden zum einen Glucoseoxidase (GOx), zum anderen Horseradishperoxidase (HRP) verwendet. Die Enzym-DNA Konjugate wurden gemäß L. Fruk, J. Müller, G. Weber, A.Narvaez, E. Dominguez C. M. Niemeyer, 2007, Chem. Eur. J., 13, 5223-5231 gewonnen, dieser Artikel wird durch Zitierung inkorporiert.

Dieses Multienzymsystem wurde gewählt, da sich eines der Reaktionsprodukte einfach per Fluoreszenz nachweisen lässt. Im Einzelnen oxidiert das GOx α-D-glucose zu Gluconolacton und H ₂ O ₂ . Letzteres reagiert mit einem Farbstoff Amplex Red unter der Einwirkung der HRP zu Resorufm, welches eine ausgeprägte Fluoreszenz zeigt. Alternativ können auch andere Substrate wie z.B. Tyramid-Cy5 verwendet werden.

Das Multienzymsystem als solches ist Stand der Technik und z.B. in Mao H., Yang T., Cremer P. S. Analytical Chemistry, Vol. 74, No. 2, January 15, 2002 beschrieben; dieser Artikel wird durch Zitierung inkorporiert.

GOx und HRP wurden ortsspezifisch immoblisiert, indem GOx -F5 und HRP-F9-Konjugate, welche zu den gebundenen Nucleotiden cF5 und cF9 komplementär sind, hybridisiert wurden.

Die Sequenzen cF5 und cF9 sind in der folgenden Tabelle 1 gezeigt:

Tabelle I

Dabei wurde ein Puffer, bestehend aus 20 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, fettarmes Trockenmilchpulver 0,25%, 0,25 mM EDTA, 0,05 mg/ml denat. Heringssperma DNA, 0,01% Azid (im Folgenden als Puffer B bezeichnet) verwendet.

Um die Wirkungsweise des Systems zu zeigen wurde eine Tyramid-Signal Amplifikation (TSA) durchgeführt. Dabei wurde Tyramid-Cy5-Substrat (Pierce) 1 :20 in einer Lösung von 10 mM Glucose in einem 200 mM Phosphatpuffer (KH ₂ PO ₄ / K ₂ HPO ₄ ), pH 7 (im folgenden als Puffer C bezeichnet) gelöst und durch das mikrofluidische System mit einer Flussrate von 2 μl/min for 30 min geleitet. Nach Waschen mit Puffer B wurde das System mit einem Mikroarrayscanner (Bioanalyzer, LaVision Biotec) untersucht. Fig. 2 zeigt ein Bild der Messung, wobei das Signal des Cy5 gemessen wurde. Die Akkumulation des Cy5-Substrats ist deutlich sichtbar, resultierend aus der gesteigerten Wirkungsweise des Mikroenzymkomplexes

In einer zweiten Testreaktion wurde die Oxidation von Amplex Red untersucht. Dabei wurde eine Lösung von 1OmM Glucose und 10 μM Amplex Red in Puffer C durch das System geleitet; dabei wurde die Lösung nach Verlassen des Systems gesammelt, wobei immer nach 5 Minuten ein neues Aliquot genommen wurde.

Alle Aliquots wurden mit Wasser 1 :10 verdünnt und in einem Miktotiterplattenreader (Synergy 2, BioTek) auf Resorufϊn Fluoreszenz untersucht (in Fig.3 „GOx /HRP").

Danach wurde die Reaktion unter den gleichen Bedingungen, jedoch in umgekehrter Flussrichtung wiederholt (in Fig.3 „HRP/ GOx").

Die Ergebnisse sind in Fig. 3 zu sehen. Dabei ist deutlich sichtbar, dass die Bildung des Resorufms von der Aktivität des GOx abhängt, d.h. dass die Reaktion kontrolliert abläuft.

In Fig. 4 sind die Ergebnisse der Kopplung zweier Reaktionen, von denen die erste durch Halbleiter-Nanopartikel und die zweite durch HRP katalysiert wird, dargestellt. Halbleiter- Nanopartikel aus CdS, die auch als Quantumdots (QD) bezeichnet werden, erzeugen unter Lichteinwirkung (UV-Bestrahlung) reaktive Sauerstoffspezies, auch ROS genannt. Diese ROS können von Peroxidase-Enzymen benutzt werden, um organische Substrate zu oxidieren. Wenn das organische Substrat dadurch zum Fluorophor werden kann, kann damit das System ausgelesen werden.

Dazu wurden CdS Quantum Dots aus wässriger Lösung auf PAMAM Dendrimer beschichteten Mikroarraysubstraten immobilisiert. Diese Quantum Dots bilden das erste Reaktionsfeld mit einer Länge von 3 cm und lOOμm Breite. In Flussrichtung wird zweites Feld 2 (lern x lOOμm) von Oligonucleotid cF9 auf der Microarrayoberfläche angebunden. Durch DNA vermittelte Immobilisierung wird ein Konjugat aus Oligonucleotid F9 und HRP

im Kanal auf Feld 2 gekoppelt. Anschließend wurde 10 μM Amplex Red in Puffer C durch das System geleitet und die gebildete Menge an Resorufm im Fluoreszenzspekrotmeter (Cary Eclipse, Varian) in einer Durchflussküvette (Starna) gemessen. Der Fluss wurde bei diesen Versuchen konstant bei 5μl/min gehalten.

Die gekoppelte Umsetzung von Amplex Red mit Quantum Dots und Horseradishperoxidase (HRP) ist in Fig.4 zu sehen. Die gepunktete Linie zeigt das An- und Ausschalten der UV- Lampe, die durchgehende Linie das fluoreszensspektroskopisch detektierte Resorufm. Der Signalpeak bei t = 20 min beruht auf Druckschwankungen im mikro fluidischen System. Es ist deutlich erkennbar, dass nach Einschalten der Lampe das Fluoreszenzsignal ansteigt (t = 40 min und 100 min) während das Fluoreszenzsignal abnimmt, wenn die Lampe ausgeschaltet wird (t = 55 min und 110 min). Die Verzögerung des Auftretens des Signals nach Einschalten der Lampe ist die Zeit, die das Produkt von den Reaktionsfeldern zum Detektor benötigt.

In Fig. 5 sind die Ergebnisse der Ablösung angebundener Protein-DNA Konjugate durch Strangverdängung dargestellt.

Dazu wurden zwei unterschiedliche Fängeroligonucleotide verwendet, die zu einem Einzelstrangüberhang am 5 '-Ende beziehungsweise am 3 '-Ende im immobiliserten Konjugat führen. Die Zugabe eines komplementären Oligonucleotids zum Protein-DNA Konjugate führt zur Ablösung des Protein-DNA Konjugates.

Dazu wurden auf einem Microarraysubstrat 8 Felder mit den Sequenzen cDNA-A-5, cDNA- A-3, cDNA-B-5, cDNA-B-3, cDNA-C-5, cDNA-C-3, cDNA-D-5, cDNA-D-3 gebunden. Die Sequenzen sind in Tabelle II gezeigt. Im Kanal wurden dadurch Felder der Größe 200 μm x 100 μm erhalten. Auf den Feldern wurden mittels DDI kovalente Konjugate aus fluoreszenzmarkiertem Streptavidin und den komplementären DNA Strängen A bis D immobilisiert. Nach der Detektion der Ausgangssignale mittels Fluoreszenzscanner (Bioanalyzer, La Vision Biotec) wurden die über DNA-A und DNA-D gebundenen Proteine

durch einleiten der Oligonucleotide cDNA-A und cDNA-D verdrängt. Die Sequenzen sind in Tabelle II gezeigt.

Die Quantifizierung der Fluoreszenzsignale ist in Fig. 5 vor und nach der Strangverdrängung mit cDNA-A und cDNA-D zu sehen. Die Protein-DNA Konjugate P-DNA-B und P-DNA-C werden nur in geringem Maße abgelöst. Letzteres kann durch Auswahl optimierter Oligonucleotidsequenzen verhindert werden, die zu stabileren Doppelstrangaddukten führen. Es ist ebenfalls sichtbar, dass die Konfiguration cDNA-X-5 deutlich besser durch Strangverdrängung abgelöst werden kann als die Konfiguration cDNA-X-3. In der Fig. 5 ist das Signal nach der Verdrängung bei cDNA-B-3 höher als das Ausgangssignal. Dies ist durch die Abweichung der Messfelder begründet. Die bessere Ablösung der über DNA-X-5 immobilisieten Konjugate kommt durch eine bessere Zugänglichkeit der überstehenden Sequenz der gebundenen DNA-Proteinkonjugate zustande.

Tabelle II

In der Fig. 6 werden Daten zur Immobiliserung von Goldnanopartikeln (DNA-AuNPs) gezeigt. Die DNA-gerichtete Immobiliserung von Goldnanopartikeln (DNA-AuNPs) auf dem mikrofluidischen System wird durch die Verwendung von einer 2 nM Lösung der DNA-

AuNPs in einem Puffer A (20 nM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1 % (w/v) Tween-20) erzielt. Die Lösung wird für 10 min durch einen Mikrokanal mit einer Flussrate von 0.5 μL/ min gepumpt. Nach der Immobilisierung der DNA-AuNPs können diese wieder von der Oberfläche entfernt werden, indem eine 50 mM NaOH-Lösung mit 0.1 % SDS injiziert werden.

Die Quantifizierung der Absorption der Goldnanopartikel mit Hilfe der Graustufenanalyse der Mikroskopischen Aufnahmen des Kanals zeigt in Fig. 6 das die Goldnanopartikel mittels DDI im Kanal immobilisiert werden konnten und nach dem Waschschritt mit NaOH Lösung nahezu vollständig abgetrennt werden konnten.