In der Gentechnik und Biochemie ist es allgemein bekannt, mit sog. DNA-Chips Proben aus genetischen Materialien zu untersu- chen. Auf einem DNA-Chip sind mehrere tausend mikroskopisch kleine Proben arrayartig auf einer Trägerplatte angeordnet.

Die Proben enthalten die zu untersuchenden Biomoleküle, bspw.

DNA, RNA, Proteine oder Antikörper. Die Proben können bereits markiert sein, wenn sie später z. B. nach einer Reaktion oder anderweitigen Veränderung mit optischen Methoden detektiert werden sollen. Übliche Detektionsverfahren sind Messungen der Fluoreszenz, Chemolumineszenz oder Radioaktivität. Für andere Detektionsverfahren, wie z. B. Massenspektrometrie, Absorpti- onsmessungen, oder Adsorptionsmessungen können die Probenmo- leküle auch unmarkiert sein. Die Zielmolekülanordnung auf der Trägerplatte wird mit einer Testlösung überschichtet, die die Probenmoleküle enthält. Bei Hybridisierung von bestimmten Probenmolkülen aus der Testlösung an die auf der Trägerplatte immobiliesierten Zielmoleküle kann an den entsprechenden Zielmolekülen ein Signal gemessen werden, dass typischerweise ein Fluoreszenzsignal ist.

Um mit einem einzelnen Chip eine möglichst große Anzahl von Proben parallel verarbeiten zu können, wurde in der DNA-Chip- Technologie bisher das Hauptaugenmerk auf die reproduzierbare und genaue, hochdichte Ablage von Proben auf der Trägerplatte gerichtet. Im praktischen Einsatz wurde die, bspw. mit einem Picking-/Spotting-Roboter beschickte, Trägerplatte mit der Testlösung überschichtet und die Testlösung mit einem Deck- glas abgedeckt. Das Deckglas, wie es bspw. aus der Mikrosko- pie bekannt ist, ist ein Plättchen mit einer möglichst gerin- gen Dicke, das auf der Testlösung aufschwimmt und über die Oberflächenspannung über der Trägerplatte mit Abstand von den Proben gehalten wird. Diese herkömmliche Technik der Kombina- tion einer Trägerplatte mit einem dünnen Deckglas besitzt den Vorteil eines geringen Testlösungsverbrauchs im Bereich von 10 ul bis 20 ul pro Chip. Sie besitzt aber auch die im Fol- genden erläuterten wichtigen Nachteile.

Der Probendurchsatz an einem DNA-Chip ist bisher durch die mit den gegenwärtig verwendeten Robotern erzielbare Proben- dichte beschränkt. Es besteht aber in der modernen molekula- ren Genetik ein starkes Interesse an einer weiteren Erhöhung des Probenduchsatz (Zahl der pro Experiment bzw. pro Zeilen- einheit behandelten oder verwendeten Proben). Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass ein Verbund aus beschickter Trä- gerplatte, überschichteter Testlösung und Deckglas schwer zu handhaben ist. Eine automatisierte Manipulierung des Gesamt- aufbaus, z. B. für eine reproduzierbare und gleichmäßige Zu- fuhr der Testlösung, ist ausgeschlossen.

Zur Fluidbehandlung von Proben sind auch flache, schichtför- mige Küvetten bekannt, die geschlossene Probenkammern bilden und insbesondere für optische Messungen durch die Küvetten ausgelegt sind. Derartige Küvetten besitzen zwar den Vorteil einer hohen Stabilität und entsprechend guten Handhabbarkeit.

Ihre Anwendung als DNA-Chip ist jedoch ausgeschlossen, da die inneren Küvettenwände nicht zur Probenablage mit der allge- mein verwendeten Spotting-Technik ausgelegt sind.

Die genannten Probleme treten nicht nur bei Aufgaben der mo- lekularen Genetik auf. Auch für die Fluidbehandlung trägerge- bundener Einzelproben besteht ein Interesse an Probenkammern, die eine schnelle und einfache Handhabung der Probe gewähr- leisten und dennoch einen stabilen, zuverlässigen Aufbau be- sitzen.

Es ist die Aufgabe der Erfindung, eine verbesserte Probenkam- mer zur Flüssigkeitsbehandlung mindestens einer trägergebun- denen Probe anzugeben, die einen einfachen und stabilen Auf- bau besitzt und eine Probenhandhabung und-behandlung unter reproduzierbaren Bedingungen gewährleistet. Die Probenkammer soll auch eine sichere Handhabung von radioaktiv markierten Probenlösungen ermöglichen. Die Probenkammer soll insbesonde- re für eine Erhöhung des Probendurchsatzes ausgelegt sein und die Untersuchung von Proben nach Wechselwirkung mit einer Testlösung erleichtern. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, ein Verfahren zur Durchführung gentechnischer Untersu- chungen mit DNA-Chips anzugeben.

Diese Aufgaben werden durch eine Probenkammer und ein Verfah- ren mit den Merkmalen gemäß Anspruch 1 bzw. 14 gelöst. Vor- teilhafte Ausführungsformen und Verwendungen der erfindungs- gemäßen Probenkammer ergeben sich aus den abhängigen Ansprü- chen.

Die Grundidee der Erfindung besteht in der Schaffung einer Probenkammer aus einer Trägerplatte und einer Deckplatte, die durch einen Abstandshalter in Form eines am Rand der zueinan- derweisenden Flächen der Träger-und Deckplatten umlaufenden Streifens voneinander getrennt angeordnet sind, wobei in den Abstandhaltern mindestens ein Fluidanschluss integrierbar ist und der Aufbau aus Träger-und Deckplatten und dem Abstands- halter durch eine flüssigkeitsdichte Folie zusammengehalten wird. Die Folie wird vorzugsweise durch mindestens einen Fo- lienstreifen gebildet, der als umlaufender Umschlag die Rän- der der Träger-und Deckplatten und den Abstand zwischen den Platten abdeckt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist auf dem Verbund zwischen den Platten und der Folie eine Wachsabdichtung vorgesehen. Die Wachsabdichtung umfasst eine Wachsschicht, die mindestens den auf den Platten aufliegenden Rand der umlaufenden Folie abdeckt.

Die Träger-und Deckplatten, die vorzugsweise dieselbe Größe besitzen, und der Abstandshalter sind an sich separate Be- standteile der Probenkammer, die als Verbund (Sandwich- Aufbau) lediglich durch die flüssigkeitsdichte Folienverbin- dung zusammengehalten und ggf. durch die Wachsabdichtung ab- gedichtet wird. Der Abstandshalter kann eine derart geringe Dicke besitzen, dass die erfindungsgemäße Probenkammer im We- sentlichen ein Kammervolumen entsprechend einer Testlösungs- menge besitzt, wie sie auch bei den herkömmlichen DNA-Chips mit freiem Deckglas verwendet wird. Im Unterschied zu den herkömmlichen Chips wird jedoch ein stabiler und dichter Auf- bau geschaffen, der sich als Ganzes zuverlässig handhaben lässt. Des weiteren erfüllt die Deckplatte im Unterschied zu herkömmlichen DNA-Chips nicht nur eine Abdeckfunktion. Die Deckplatte ist, insbesondere zur Erhöhung des Probendurchsat- zes, selbst wie die Trägerplatte als Träger einer weiteren Probenanordnung und/oder als Träger einer optischen Filter- einrichtung ausgelegt.

Eine erste Ausführungsform der erfindungsgemäßen Probenkam- mer, bei der die Deckplatte eine Probenanordnung (z. B. DNA- Array) trägt, besitzt den Vorteil, dass bei einer Testlö- sungsbeschickung parallel gleich zwei Experimente durchge- führt werden können. Der Probendurchsatz verdoppelt sich. Zu- sätzlich ist von Vorteil, dass die Reaktionsbedingungen für beide Probenanordnungen jeweils auf der Träger-bzw. Deck- platte identisch sind.

Auch bei der zweiten bevorzugten Ausführungsform der Erfin- dung, bei der die Deckplatte mindestens einen optischen Fil- ter trägt, ergibt sich eine Erhöhung des Probendurchsatzes.

Fluoreszenzmessungen an den träger-und/oder deckplattenge- bundenen Proben können ohne Weiteres durch eine einfache Lichtdetektion (Abbildung der Deckplatte) durchgeführt wer- den. Die Messzeit verringert sich gegenüber den herkömmlichen Fluoreszenzmessungen an den DNA-Chips. Pro Zeiteinheit können mehr Proben zur Reaktion gebracht werden. Vorteilhafter Weise wird eine Online-Detektion ermöglicht.

Gegenstand der Erfindung ist anwendungsabhängig eine Proben- kammer mit oder ohne Medienanschluss. Eine Probenkammer ohne Medienanschluss kann als vorkonfektionierter Reaktionsansatz bereitgestellt werden, der erst bei Einsatz z. B. mit Fluid- anschlüssen versehen wird.

Bei Einsatz einer geeigneten Abbildungstechnik, die eine ge- trennte Fokussierung auf die zum Kammerinneren weisenden Flä- chen der Träger-und Deckplatten ermöglicht, kann die Deck- platte sowohl auf der Innenseite eine Probenanordnung als auch auf der Außenseite eine Filteranordnung tragen. Die Deckplatte kann auch selbst durch ein Filtermaterial gebildet werden.

Ein besonderer Vorteil der Erfindung ist die Stabilität des lediglich durch einen Folienstreifen zusammengehaltenen Ver- bundes aus Platten und Abstandshaltern. Dies ermöglicht die Kombination der Probenkammer mit anwendungsabhängig gestalte- ten Halterungseinrichtungen. Als Halterungseinrichtung ist bspw. ein Thermoblock vorgesehen, in den die Probenkammer wie in einen Rahmen eingespannt werden kann. Der Thermoblock ent- hält eine Heizeinrichtung zur Einstellung einer bestimmten Reaktionstemperatur in der Probenkammer. Bei einer alternati- ven Gestaltung wird die Probenkammer mit einer Kante an einer schwenkbaren Halterungsleiste befestigt. Dies ermöglicht ein an sich bekanntes Verschwenken der Probenkammer während der Beschickung mit der Testlösung und/oder während der Reaktion, ohne dass es zu Stabilitätsproblemen kommt. Dies ist insbe- sondere bei gentechnischen Aufgaben für eine gleichmäßige Hybridisierung von Vorteil.

Die Erfindung besitzt die folgenden Vorteile. Mit an sich einfachen und mit der üblichen Labortechnik kompatiblen Mit- teln wird eine Probenkammer zur Fluidbehandlung geschaffen, die hinsichtlich der Stabilität, der Handhabbarkeit, der Brauchbarkeit und des Probendurchsatzes den herkömmlichen DNA-Chips weit überlegen ist. Die Erfindung ist ohne Be- schränkung mit beliebigen, für die jeweiligen Experimentier- bedingungen interessierenden Plattengrößen realisierbar. Die Reaktionsbedingungen sind für alle Proben ausgeglichen und unabhängig von etwaigen manuellen Einflüssen des Experimenta- tors. Die erfindungsgemäße Probenkammer ist für den Einsatz in einem automatisierten System und zur Kombination mit ver- schiedenen Detektionsverfahren, insbesondere optischen Mes- sungen, Aktivitätsmessungen, Oberflächenplasmonenresonanzmes- sungen und dgl., geeignet.

Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung werden im Folgenden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen be- schrieben. Es zeigen : Figur 1 eine erste Ausführungsform einer erfindungsgemä- ßen Probenkammer in Schnittansicht, Figur 2 eine zweite Ausführungsform der erfindungsgemäßen Probenkammer in Schnittansicht, Figur 3 eine Draufsicht auf eine erfindungsgemäße Proben- kammer, Figur 4 eine schematische Illustration einer temperierba- ren Halterungseinrichtung, und Figur 5 eine schematische Perspektivansicht einer ver- schwenkbaren Halterungseinrichtung.

Die Erfindung wird im Folgenden am Beispiel einer Mikrohybri- disierungskammer für gentechnische Aufgaben erläutert, ohne jedoch auf diese Anwendung beschränkt zu sein. Die Realisie- rung der Erfindung ist insbesondere bei allen Verfahren an- wendbar, bei denen die Wechselwirkung von trägergebundenen Proben (Einzelproben oder Probenanordnungen), wie z. B. Chro- mosomen (in situ Hybridisierungen) oder Gewebe (Immunostai- ning), einer Fluidbehandlung unterzogen werden.

Figur 1 illustriert in schematischer Schnittansicht eine ers- te Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Probenkammer 100.

Aus Übersichtlichkeitsgründen sind einzelne Bauteile der Pro- benkammer 100 schematisch voneinander beabstandet gezeichnet, obwohl sie in der Realität formschlüssig und zum Teil flüs- sigkeitsdicht aneinander liegen. Die Probenkammer 100 wird durch die Grundplatte 10, die Deckplatte 20 und den Abstands- halter 30 gebildet, in den mindestens ein Medienanschluss 40 eingelassen ist. Der Medienanschluss ist ein Fluid-oder Gas- anschluss. Eine Draufsicht auf den Verbund aus Träger-und Deckplatten 10,20 und der Folie 50 ist in Figur 3 illust- riert. Die Trägerplatte 10 ist eine ebene Glasplatte mit ei- ner Fläche im Bereich von ca. 20 mm'20 mm bis ca. 80 mm 120 mm. Sie trägt auf der zum Kammerinneren weisenden Seite eine Probenanordnung 11. Die Probenanordnung 11 ist bspw. ein DNA-Array. Die Proben werden vor der Reaktion im auseinander gebauten Zustand der Probenkammer 100 auf die Trägerplatte 10 mit an sich bekannten Verfahrensweisen (z. B. Spotting) auf- gebracht und enthalten bspw. jeweils ein DNA-Molekül oder- Abschnitt. Die Trägerplatte 10 besitzt in der Regel den sel- ben Aufbau wie ein Substrat bei herkömmlichen DNA-Chips oder Hybridisierungskammern. Die Dicke der Trägerplatte 10 beträgt ca. 0.1 mm bis 2 mm. Die Deckplatte 20 ist bei der in Figur 1 dargestellten Ausführungsform wie die Trägerplatte 10 eine Glasplatte mit einer auf der zum Kammerinneren weisenden Sei- te aufgebrachten Probenanordnung 21. Die Träger-und Deck- platten 10,20 sind bei dieser Gestaltung identisch. Die Pro- benanordnungen 11,21 können bspw. DNA-Arrays, Protein-Arrays oder Immuno-Arrays umfassen.

Zwischen den Platten 10,20 ist der Abstandshalter 30 ange- ordnet. Der Abstandhalter 30 besitzt die Form eines an den Rändern der Plattenoberflächen umlaufenden Streifens. Der Streifen besteht bspw. aus Siliconkautschuk oder PMMA und be- sitzt eine Breite von 1 mm bis 3 mm bzw. eine Dicke von ca.

0.05 bis 1.0 mm. Die Dicke des Abstandshalters 30 ist an die jeweiligen Versuchsbedingungen angepasst und vorzugsweise so gewählt, dass ein nadelförmiger Fluidanschluss 40 ohne Berüh- rung der angrenzenden Platten durch den Abstandshalter durch- gestoßen werden kann. Von besonderem Vorteil ist es, dass zwischen dem Abstandshalter 30 und den angrenzenden Platten 10,20 lediglich ein formschlüssige Berührung gegeben sein muss. Es ist nicht zwingend erforderlich, dass eine flüssig- keitsdichte Verbindung ausgebildet wird. Dementsprechend ist es auch nicht zwingend erforderlich, dass der Abstandshalter 30 aus einem einstückigen, umlaufenden Streifen gebildet wird. Er kann auch aus mehreren Teilstücken, deren Enden bün- dig aneinander liegen, zusammengesetzt sein.

Der Medienanschluss 40 wird vorzugsweise durch mindestens ei- ne Injektionsnadel gebildet. So zeigt bspw. die Draufsicht gemäß Figur 3 drei Injektionsnadeln 41,42 und 43 zur Fluid- zufuhr (Injektion einer Testlösung) bzw. zur Fluidabfuhr und zum Auslass des bei der Fluidzufuhr aus der Probenkammer ver- drängten Gases. Eine Injektionsnadel 41 besitzt bspw. einen Außendurchmesser von ca. 0.04 mm bis 0.4 mm.

Die Folie 50 verschließt den Plattenaufbau flüssigkeitsdicht entlang seinen Rändern. Die Folie 50, die ggf. aus mehreren einander überlappenden Folienstreifen besteht, bildet an je- der Seite der Probenkammer 100 einen Umschlag mit U-förmigem Querschnitt, der die angrenzenden Ränder der Träger-und Deckplatten 10,20 und den durch den Abstandshalter 30 gebil- deten Zwischenraum abdeckt. Die Folie 50 besteht vorzugsweise aus einem selbstklebenden Folienmaterial (z. B. sog. Parafilm "M", Hersteller :"Laboratory Film", American National Can Chicago, USA). Es kann aber auch ein Folienstreifen mit ei- ner Klebeschicht vorgesehen sein. In diesem Fall muss jedoch ein Flüssigkeitsaustausch zwischen dem Inneren der Probenkam- mer und der Folie 50 ausgeschlossen sein.

Figur 1 zeigt zusätzlich noch eine Abdichtungsschicht 60, die die Folie 50 an den Rändern der Platten 10,20 bedeckt. Die Abdichtungsschicht 60 ist kein zwingendes Merkmal der Erfin- dung. Sie wird jedoch mit Vorteil zur weiteren Erhöhung der Dichtsicherheit an den Kammerrändern eingesetzt. Die Aufbrin- gung der Abdichtungsschicht 60 erfolgt bspw., indem die Pro- benkammer 100 mit ihren Kanten, die mit der Folie 50 ver- schlossen sind, in ein Wachsschmelzbad getaucht wird. Der Ab- dichtungswachs kann aus jeder geeigneten Wachs-und/oder Pa- raffinmischung, z. B. aus Haushaltskerzenwachs bestehen.

Figur 2 zeigt eine alternative Ausführungsform der Erfindung, bei der die Probenkammer 100 im Wesentlichen den gleichen Aufbau besitzt wie bei der Ausführungsform gemäß Figur 1. Der Unterschied bezieht sich lediglich auf die Deckplatte 20, die eine Filtereinrichtung 22 trägt. Die Filtereinrichtung 22 ist schematisch als äußere Beschichtung dargestellt. Ein opti- sches Filtermaterial kann ersatzweise auch im Inneren der Probenkammer 100 angebracht sein. Die Deckplatte 20 kann auch selbst aus dem Filtermaterial bestehen.

Die Filtereinrichtung 22 ist vorzugsweise ein Mehrfach- Bandpass-Filter (z. B. ein Doppel-Bandpass-Filter), der für mindestens zwei (z. B. vier oder mehr) getrennte Lichtwellen- längen durchlässig ist. Dies erlaubt die Detektion verschie- dener Fluoreszenzmarker, die je nach dem Reaktionsergebnis an bestimmten Proben gebunden werden.

Die Figuren 4 und 5 illustrieren verschiedene Formen von Hal- terungseinrichtungen, mit denen die erfindungsgemäße Proben- kammer mit Vorteil verwendet wird. Die Halterungseinrichtung 70 gemäß Figur 4 umfasst einen Thermoblock 71, in den die Probenkammer 100 (gestrichelt gezeichnet) eingelassen ist.

Die Probenkammer 100 wird auf dem Thermoblock 71 mit einem Aufsatz 72 festgehalten, der der Fixierung der Probenkammer 100 und der Ausrichtung von Anschlussleitungen 80 dient. Die Anschlussleitungen 80 sind mit den Fluidanschlüssen (z. B. 41 -43) der Probenkammer 100 verbunden. Der Aufsatz 72 besitzt ein Fenster entsprechend der Größe der Probenanordnung auf der Trägerplatte und ggf. der Deckplatte. Durch das Fenster 73 erfolgt die Fluoreszenzdetektion an den Proben.

Für Aufgabenstellungen, bei denen es besonders auf eine gleichmäßige Verteilung einer Testlösung in der Reaktionskam- mer ankommt, ist die Halterungseinrichtung 70 gemäß Figur 5 vorgesehen. Die Halterungseinrichtung 70 umfasst mindestens eine Halterungsleiste 75, an der eine Probenkammer (nicht dargestellt) mit einer Seitenkante angeklemmt werden kann und die Proben eine horizontal ausgerichtete Drehachse verschwenkbar sind. Bei der in Figur 5 dargestellten Ausfüh- rungsform ist eine sternförmige Halterungseinrichtung 70 mit acht Paaren von Halterungsleisten 75,76,... vorgesehen, mit denen entsprechend simultan sechzehn Probenkammern ver- schwenkt werden können. Zur weiteren Erhöhung des Proben- durchsatzes können eine Vielzahl derartiger sternförmiger Halterungseinrichtungen entlang einer gemeinsamen Welle ange- ordnet sein. Typische Schwenkgeschwindigkeiten liegen im Be- reich von typischerweise 10 Umdrehungen je Minute.

Eine erfindungsgemäße Probenkammer wird wie folgt verwendet.

Zunächst wird die Trägerplatte 10 und ebenfalls auch die Deckplatte 20 mit einer Probenanordnung entsprechend den o. g. Beispielen beschickt. Es werden bspw. ca. 100.000 Proben auf die Platten gespottet. Anschließend wird der Abstandshal- ter 30 (siehe Figur 1) auf die Trägerplatte 10 aufgelegt und die Deckplatte 20 auf den Abstandshalter 30 aufgelegt. Der Aufbau wird durch Anbringung der umlaufenden Folie 50 ver- schlossen. Anschließend wird die Probenkammer ggf. zusätzlich durch Eintauchen in eine Wachsschmelze abgedichtet.

Danach erfolgt die Beschickung durch Injektion einer Testlö- sung, die bspw. Test-DNA enthält. Hierzu wird die Folie 50 und der Abstandshalter 30 an vorbestimmten Positionen mit dem Fluidanschluss 40 durchstochen. Ein besonderer Vorteil der Erfindung ist dadurch gegeben, dass dieses Durchstechen ohne zusätzliche Abdichtungsvorkehrungen durchgeführt werden kann.

Die Injektion erfolgt, wenn eine Probenkammer gemäß Figur 4 in einem Thermoblock verankert ist, über die Anschlussleitun- gen 80.

Anschließend erfolgt die eigentliche Reaktion zwischen der Testlösung und den Proben 11 bzw. 21 und/oder anwendungsab- hängig ein Zuführen von Wasch-und/oder Detektionslösungen.

Zum Auslesen des Reaktionsergebnisses wird die Probenkammer mit einer in Abhängigkeit vom verwendeten Markierungsfarb- stoff gewählten Wellenlänge bestrahlt. Die Fluoreszenzdetek- tion erfolgt durch die Deckplatte 20.

Zur Fluoreszenzdetektion kann vorgesehen sein, dass wie bei herkömmlichen DNA-Chips die Probenanordnung 11 bzw. 21 punkt- weise von einem Anregungslaser abgescannt und synchron die Fluoreszenz gemessen wird. Es kann auch eine Anregung mit ei- ner mit Emissionsfiltern ausgerüsteten Weißlichtquelle vorge- sehen sein. Ersatzweise ist bei Verwendung der Filtereinrich- tung 22 (siehe Figur 2) eine simultane Anregung aller Proben mit einem aufgefächerten Anregungslaser und eine parallele Detektion der Lichtemissionen durch die Filtereinrichtung 22 vorgesehen.

Gemäß einer Abwandlung der Erfindung kann die Probenkammer mit einer elektronischen Filtereinrichtung ausgestattet sein, die eine Elektronenoptik für massenspekroskopische Untersu- chungen der Proben bildet.

Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirkli- chung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.