실시예 1: 염색체 삽입용 벡터 (pDZ) 를 이용한 리보뉴클레오시드 히드롤라아제 유전자의 구조가 파괴된 균주 제작

본 실시예에서는 리보뉴클레오시드 히드롤라아제 1 및 리보뉴클레오시드 히드롤라아제 2 를 코딩하는 유전자에서 염기의 삽입, 치환 또는 결실에 의한 서열 변이를 통해 상기 유전자를 불활성화시켜 이노신 분해 경로를 차단하고자 대장균 클로닝용 벡터 pACYC177 (New England Biolab, GenBank accession # X06402) 유래의 pDZ 벡터를 재조합 벡터로 이용하였다(국내 특허 07-94433).

도 1 및 도 2 는 각각 리보뉴클레오시드 히드롤라아제 1(rih1) 및 리보뉴클레오시드 히드롤라아제 2(rih2) 를 코딩하는 유전자의 구조를 파괴하기 위한 pDZmrih1 및 pDZmrih2 벡터의 작제도를 도시한다.

리보뉴클레오시드 히드롤라아제 1 및 리보뉴클레오시드 히드롤라아제 2 를 코딩하는 유전자를 증폭하기 위해 먼저 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 의 염색체 DNA 를 주형으로 각각 서열번호 1 내지 4 의 프라이머 및 서열번호 5 내지 8 의 프라이머를 이용하여 하기와 같이 PCR 을 수행하였다.

코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 의 염색체 DNA 를 주형으로, 각각 서열번호 1 과 2 및 서열번호 3 과 4 의 프라이머를 이용한 PCR 를 수행하여 rih1-A 단편 및 rih1-B 의 단편을 수득하였다. 그 후, 수득된 rih1-A 및 rih1-B 단편을 주형으로 서열번호 1 및 4 의 프라이머를 이용한 PCR 을 수행하여 변형된 서열구조를 갖는 변이 유전자 단편인 mrih1 을 수득하였다. 또한, 리보뉴클레오시드 히드롤라아제 2 의 서열구조가 변형된 변이 유전자 단편인 mrih2 를 수득하기 위해, 상기 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 의 염색체 DNA 를 주형으로, 각각 서열번호 5 와 6 및 서열번호 7 과 8 의 프라이머를 이용한 PCR 을 수행하여 rih2-A 및 rih2-B 단편을 수득하고, 상기 수득된 rih2-A 및 rih2-B 를 주형으로 서열번호 5 와 8 의 프라이머를 이용한 PCR 을 수행하였다. 상기에서 rih1-A, rih1-B, rih2-A 및 rih2-B 를 수득하기 위해 수행된 PCR 의 조건은 94 ℃에서 5 분의 예비 변성 및 그에 뒤이은 94 ℃ 30 초, 52 ℃ 30 초 및 72 ℃ 1 분으로 구성된 사이클의 20 회 반복 및 72 ℃에서 7 분의 최종 신장이었고, 각 A 단편과 B 단편을 통합하여 변이된 유전자 단편을 얻기 위한 PCR 조건은 94 ℃에서 5 분의 예비 변성 및 그에 뒤이은 94 ℃에서 30 초, 50 ℃에서 30 초 및 72 ℃에서 1 분으로 구성된 사이클의 25 회 반복 및 72 ℃에서 7 분의 최종 신장이었다. 상기 증폭된 mrih1 및 mrih2 와 pDZ 를 각각 제한효소 XbaI 으로 처리한 후, T4 리가아제에 의한 반응을 통해 유전자 구조 파괴용 재조합 벡터인 pDZmrih1 과 pDZmrih2 를 수득하였다.

코리네박테리움의 염색체 상의 rih2 유전자의 서열을 염기 결실에 의해 변이시키기 위하여 제작된 pDZmrih2 벡터를 야생형인 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 에 전기천공법(Electroporation)으로 형질전환한 후(Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545 에 의한 형질전환법 이용), 카나마이신 (kanamycin) 25mg/L 를 함유한 선별 배지에서 염색체상의 동 유전자와 상동성 재조합에 의해 상기 벡터가 삽입된 균주를 선별하였다. 벡터의 성공적인 염색체 삽입은 X-gal (5- 브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드)을 포함한 고체 배지에서 청색을 나타내는가 여부를 조사하여 확인하였다. 1 차 재조합에 의해 벡터가 염색체에 삽입된 균주를 영양 배지에서 30 ℃에서 8 시간 동안 진탕배양한 후, 각각 10 ^-4 으로부터 10 ^-10 까지 희석하여, X-gal 을 포함하고 있는 고체 배지에 도말하였다. 대부분의 콜로니가 청색을 띄는데 반해 낮은 비율로 나타나는 백색의 콜로니를 선별함으로써, 2 차 교차(crossover)에 의해 벡터 서열이 염색체로부터 제거된 균주를 선별하였다. 이에 의해, 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 균주의 염색체상의 rih2 유전자의 262 번째 G 가 결실된 균주를 수득하였다. 그 후, rih1 유전자에서 염기 치환에 의해 서열을 변이시키기 위해, 상기에서 수득된 rih2 유전자의 서열에 결실을 포함하는 균주에 pDZmrih1 을 형질전환에 의해 도입하고, 상기 rih2 유전자의 변이 균주의 선별과 동일한 방법을 수행하여 rih1 유전자의 148 번째 G 가 T 로 치환되어 이노신 분해 경로가 차단된 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0092 를 수득하였다. 상기 선별된 균주는 최종적으로 항생제 카나마이신에 대한 감수성 여부 및 PCR 을 통한 유전자 서열 분석을 통해 확인하였다. 상기 균주의 변이된 rih1 및 rih2 는 각각 서열번호 9 및 10 으로 표시되는 서열을 가졌다.

실시예 2: 아데닌 누출형 요구성 변이주 CN04-0093 의 선별

실시예 1 에서 수득된 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0092 를 포스페이트 완충액(pH 7.0) 혹은 시트레이트 완충액(pH 5.5) 에 10 ⁷ 내지 10 ⁸ 세포/ml로 현탁한 후, N- 메틸-N-니트로- N- 니트로소구아닌을 최종농도가 10 내지 50 ㎍/ml가 되도록 첨가하여 실온 혹은 30 내지 32 ℃에서 40 내지 90 분 동안 처리하여 돌연변이를 유발하였다. 원심분리 후 수득된 균주를 3 회에 걸쳐서 0.85% 식염수로 세척한 후, 이를 한천 2% 가 함유된 상기 표 1 에 표시된 조성을 갖는 최소 배지에 적절히 희석하여 도말한 후, 온도 30 내지 34 ℃에서 4 내지 5 일간 배양하여 콜로니를 얻었다. 수득된 콜로니들을 각각 아데닌이 0mg/l 및 100mg/l 이 되도록 첨가된 배지에 옮겨 3~4 일 배양 후 아데닌이 포함되지 않은 배지에서 성장하나 100mg/l 이 포함된 배지에서는 성장이 더욱 촉진되는 콜로니들을 선별하였다. 이와 같이 선별된 균주를 아데닌 누출형 요구성을 갖는 균주로 확인한 후, 수득된 각각의 콜로니를 상기 표 1 에 표시된 조성을 갖는 영양 배지에서 배양하고, 뒤이어 종 배지에서의 24 시간 배양 및 발효 배지에서의 5 내지 6 일간의 배양을 통해 이노신 생산량이 가장 우수한 균주를 선별하여, CN04-0093 균주로 명명하였다.

실시예 3: 구아닌 누출형 요구성 변이주 CN04-0027(KCCM 10905) 의 선별

실시예 2 에서 수득된 코리네박테리움 암모니아게네스 CN04-0093 을 포스페이트 완충액(pH 7.0) 혹은 시트레이트 완충액(pH 5.5) 에 10 ⁷ 내지 10 ⁸ 세포/ml로 현탁한 후, N- 메틸-N-니트로- N- 니트로소구아닌을 최종농도가 10 내지 50 ㎍/ml가 되도록 첨가하여 실온 혹은 30 내지 32 ℃에서 40 내지 90 분 동안 처리하여 돌연변이를 유발하였다. 원심분리 후 수득된 균주를 3 회에 걸쳐서 0.85% 식염수로 세척한 후, 이를 한천 2% 가 함유된 상기 표 1 에 표시된 조성을 갖는 최소 배지에 적절히 희석하여 도말한 후, 온도 30 내지 34 ℃에서 4 내지 5 일간 배양하여 콜로니를 얻었다. 수득된 콜로니들을 각각 구아닌이 0mg/l 및 100mg/l 이 되도록 첨가된 배지에 옮겨 3~4 일 배양 후 구아닌이 포함되지 않는 배지에서 성장하나 100mg/l 이 포함된 배지에서는 성장이 더욱 촉진되는 콜로니들을 선별하였다. 선별된 각각의 콜로니를 상기 표 1 에 표시된 조성을 갖는 영양 배지에서 배양하고, 뒤이어 종 배지에서의 24 시간 배양 및 발효 배지에서의 5 내지 6 일간의 배양을 통해 이노신 생산량이 가장 우수한 균주를 선별하였다. 상기와 같이 선별된, 이노신 분해 경로가 차단되고, 아데닌 누출형 요구성 및 구아닌 누출형 요구성을 가지며, 이노신을 고수율 및 고농도로 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스를 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CN04-0027 로 명명하고, 이를 부다페스트 조약 하에 서울 서대문구 홍제1동 소재의 한국미생물보존센터 (Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM) 에 2007 년 12 월 20 일 자로 수탁번호 KCCM 10905 로 기탁하였다.

실시예 4: 삼각플라스크 발효 역가

상기 표 1 에 표시된 조성을 갖는 종 배지 3ml 를 직경 18mm 의 시험관에 분주하고 120 ℃ 온도에서 10 분간 가압살균 후 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 균주, 리보뉴클레오시드 히드롤라아제 1 및 2 의 유전자가 파괴된 균주 CN04-0092, 리보뉴클레오시드 히드롤라아제 1 및 2 유전자의 파괴 및 아데닌 누출형 요구성을 갖는 균주 CN04-0093, 리보뉴클레오시드 히드롤라아제 1 및 2 유전자의 파괴, 아데닌 누출형 요구성 및 구아닌 누출형 요구성을 갖는 균주 CN04-0027 을 각각 접종하고 37 ℃ 온도에서 24 시간 진탕 배양하여 종 배양액으로 사용하였다. 상기 표 1 에 표시된 조성을 갖는 발효 배지 27ml 를 250ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 120 ℃ 온도에서 10 분간 가압살균 후 종 배양액 3ml 을 접종한 다음 5 내지 6 일 동안 진탕 배양하였다. 진탕 배양기의 회전수는 분당 220 회(rpm), 온도 32 ℃, pH 7.2 로 조절하였다. 배양 결과, 배지 내 이노신 축적량은 모 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 의 경우 0g/L 이었으며 CN04-0092 균주는 약 1g/l 였다 . 추가적으로 아데닌 누출형 요구성이 부여된 변이주인 CN04-0093 는 CN04-0092 보다 이노신 축적량이 약 2g/l 증가하였으며, 추가적으로 구아닌 누출형 요구성이 부여된 변이주인 CN04-0027 는 CN04-0093 보다 약 2g/l 가 증가한 약 5g/l 의 이노신을 생산했다. 각 균주의 이노신 생산성은 하기의 표 2 에 표시된다.

표 2