La presente invención se encuadra en el campo de la producción de biocombustibles a partir de microalgas, en concreto se refiere a un nuevo microorganismo del género Tetraselmis, la cepa Tetraselmis sp. var. repsoliensis, que posee un elevado contenido en lípidos, lo que la convierte en una cepa idónea para la producción de biocombustibles. ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La demanda de energía así como el uso de combustibles fósiles han aumentado y seguirán aumentando a nivel global. Esta necesidad no deja de aumentar entre las poblaciones en crecimiento y las naciones emergentes. El aumento de los costes de estos combustibles y las amenazas de escasez de suministro de los mismos han hecho que se manifestase la necesidad de desarrollar fuentes de combustible nuevas y alternativas a los productos basados en el petróleo. Por lo tanto, existe un especial interés en identificar fuentes de carbono renovables como recurso alternativo a los combustibles fósiles. Una ventaja que ofrecen los biocombustibles es que son medioambientalmente favorables debido a que el carbono de éstos procede principalmente del dióxido de carbono, ya sea atmosférico o de origen industrial. Las microalgas para la producción de fuentes renovables de energía han despertado un gran interés desde hace mucho tiempo, ya que tienen el potencial de generar cantidades significativas de biomasa y son consideradas como una fuente de lípidos neutros apropiada para la producción de biocombustibles (US2012028338, US201 1306101 , WO201 1 159650, FR2953856). Sin embargo, para que ésta sea una práctica viable, es necesario optimizar diferentes aspectos relacionados con su producción en masa como son el aumento en la tasa de crecimiento, aumento en el tamaño celular, aumento en el contenido en lípidos o reducción en costos de producción, entre otros. En este sentido, es complicado encontrar una cepa de microalgas que reúna todas estas características idóneas para su uso en la producción de biocombustibles, como por ejemplo, biodiesel.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una nueva cepa de microalga de la especie Tetraselmis suecica que posee un mayor contenido lipídico, un mayor tamaño celular y una mayor tasa de crecimiento que otras cepas de su mismo género, incluso de su misma especie, lo cual la convierte en una cepa de elevado interés en la industria de los biocombustibles, debido a su capacidad de producción de biomasa con mayor contenido en lípidos.

En la presente invención se proporciona, por tanto, la cepa Tetraselmis sp. var. repsoliensis obtenida a partir de una población salvaje de Tetraselmis suecica sometida a un proceso de selección por mayor contenido en lípidos y a aislamientos sucesivos mediante citometría de flujo y el uso del marcador fluorescente rojo de nilo (C ₂ oHi8N ₂ 0 ₂ ), como se verá en los ejemplos.

Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un microorganismo de la especie de microalga Tetraselmis suecica con número de acceso en el Banco Español de Algas BEA D01_1 1 . A este microorganismo también se hará referencia en la presente invención como "microorganismo o cepa de la invención" o "cepa Tetraselmis sp. var. repsoliensis" . La clasificación científica de la cepa BEA D01_1 1 de la presente invención es: reino Protista I División Chlorophyta I Clase Chlorophyceae I Orden Volvocales I Familia Chlamydomonadaceae I Género Tetraselmis I Especie Tetraselmis suecica. Dicho microorganismo de la invención ha sido depositado en el Banco Español de Algas (BEA) el 25 de agosto de 201 1 y le correspondió el n° de depósito BEA D01_1 1 . La dirección de dicha Autoridad Internacional de Depósito es: Centro de Biotecnología Marina, Universidad de las Palmas de Gran Canaria, en Muelle de Tallarte s/n, 35214 Telde - Las Palmas, España.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una población de microalgas que comprende la cepa de la invención, de ahora en adelante "población de microalgas de la invención". Esta población de microalgas puede estar formada por otras cepas de microorganismos pertenecientes a la misma especie o a especies distintas a la especie de la cepa de la invención. Una "población de microalgas" es un conjunto de al menos dos células en cualquier fase del estado de desarrollo, de las cuales al menos una es del microorganismo de la invención. Como ya se ha mencionado, la cepa de la invención posee un mayor contenido lipídico, un mayor tamaño celular y una mayor tasa de crecimiento que otras cepas de su mismo género, incluso de su misma especie, lo cual la convierte en una cepa de elevado interés en la industria de los biocombustibles. Por ello, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un microorganismo que pertenece a la especie de microalga Tetraselmis suecica o al uso de una población de microalgas que comprende un microorganismo de la especie Tetraselmis suecica, para la producción de biocombustibles. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el microorganismo que pertenece a la especie de microalga Tetraselmis suecica es el microorganismo de la invención y la población de microalgas que comprende un microorganismo de la especie Tetraselmis suecica es la población de microalgas de la invención.

En la presente invención se entiende por "biocombustible" aquel combustible que proviene de la biomasa, es decir, de materia orgánica originada en un proceso biológico, espontáneo o provocado, utilizable como fuente de energía renovable. Ejemplos de biocombustibles son, aunque sin limitarnos, bioetanol, biodiesel o hidrobiodiesel. Según la naturaleza de la biomasa y el tipo de biocombustible deseado, se pueden utilizar diferentes métodos para obtener biocombustibles, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, procesos mecánicos (como astillado, trituración o compactacion), termoquímicos (como combustión, pirólisis o gasificación), biotecnológicos (como microbacterianos o enzimáticos) o extractivos. Si se aplican métodos termoquímicos es posible extraer metanol, aceites, gases, etc.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el biocombustible es biodiesel. En la presente invención se entiende por "biodiesel" el éster que se obtiene a partir de diversos tipos de grasa o aceite, preferiblemente de lípidos naturales, con o sin uso previo, mediante procesos industriales de, por ejemplo aunque sin limitarnos, trans- esterificación, y que se aplica en la preparación de sustitutos totales o parciales del petrodiesel o gasóleo obtenido del petróleo. La elaboración del biodiesel está basada en, por ejemplo aunque sin limitarnos, la llamada "trans-esterificación" de los glicéridos, mediante la utilización de catalizadores. En la reacción de trans-esterificación, una molécula de un triglicérido reacciona con tres moléculas de metanol o etanol para dar tres moléculas de monoésteres y una de glicerol. Estos ésteres metílicos o etílicos (biodiesel) se mezclan con el combustible diésel convencional en cualquier proporción o se utilizan como combustible puro (biodiesel 100%). El glicerol desplazado se puede recuperar como un subproducto de la reacción.

En otra realización preferida, el biocombustible es hidrobiodiesel, biocombustible obtenido mediante hidrogenación catalítica de aceites y grasas y formado por parafinas, normal- e iso-, en el rango de preferiblemente C15 a C18. Este hidrobiodiesel se puede obtener, por ejemplo, aunque sin limitarnos, bien por hidrogenación catalítica o bien por craqueo catalítico en lecho fluido (FCC).

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de producción de un biocombustible, de ahora en adelante "procedimiento de la invención", que comprende las siguientes etapas: a. cultivar un microorganismo de la especie de microalga Tetraselmis suecica, preferiblemente el microorganismo de la invención, o una población de microalgas que comprende un microorganismo de la especie Tetraselmis suecica, preferiblemente la población de microalgas de la invención;

b. extraer los ácidos grasos producidos por el microorganismo o por la población de microalgas cultivados en el paso (a); y

c. llevar a cabo un proceso de trans-esterificación o de hidrogenación de los ácidos grasos extraídos en el paso (b). Según una realización preferida, el biocombustible producido en el procedimiento de la invención es biodiesel, en cuyo caso en el paso (c) se lleva a cabo una trans-esterificación.

En otra realización preferida, el biocombustible producido en el procedimiento de la invención es hidrobiodiesel, en cuyo caso en el paso (c) se lleva a cabo una hidrogenación. En el paso (a) del procedimiento de la invención el cultivo del microorganismo o de la población de microalgas se lleva a cabo en presencia de un medio de cultivo y de unas condiciones de cultivo que favorezcan el crecimiento de dicho microorganismo o población de microalgas. Así, preferiblemente, las condiciones de cultivo de este paso del procedimiento de la invención son: irradiación 16 uE m ^"1 sec ^"1 , fotoperiodo 16/8 h luz/oscuridad, 22 °C, medio de cultivo f/2, líquido.

En el paso (b) del procedimiento de la invención la extracción de ácidos grasos se puede llevar a cabo mediante cualquier método conocido por los expertos en la materia de extracción de ácidos grasos a partir de cultivos celulares, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante protocolos de extracción con cloroformo y metanol. En la presente invención se entiende por un proceso de "trans- esterificación" la reacción de moléculas de triglicéridos (cuyo número de átomos de las cadenas está comprendido, preferiblemente, entre 15 y 23, siendo el más habitual de 18) con alcoholes de bajo peso molecular (como por ejemplo, aunque sin limitarnos, metanol, etanol, propanol o butanol) para producir ésteres y glicerina. Como se verá en los ejemplos, los triglicéridos son los principales componentes de la cepa de la presente invención. El esquema de reacción de un proceso de trans-esterificación es el siguiente:

Otra manera alternativa de obtener un biocombustible de origen renovable, sería hidrogenando aceites mediante un proceso de hidrotratamiento. Con la hidrogenación del aceite se liberan los ácidos grasos de los triglicéridos, formándose propano y se produce la eliminación de los átomos de oxígeno de los grupos carboxilo. El proceso de eliminación de oxígeno puede transcurrir por dos mecanismos: mediante descarboxilación en la que el oxígeno es extraído del ácido graso en forma de monóxido o dióxido de carbono, y/o mediante hidrodesoxigenación, que implica la eliminación de oxígeno en forma de agua. El producto obtenido está compuesto de parafinas e isoparafinas que son indistinguibles de un gasóleo mineral.

Además, se producen como subproductos propano, agua, monóxido de carbono, dióxido de carbono y en según qué condiciones también puede formarse metano. Este proceso de hidrotratamiento implica trabajar con elevadas presiones de hidrógeno (por ejemplo, aunque sin limitarnos, entre 20 y 70 bar), temperatura de reacción moderada (por ejemplo, aunque sin limitarnos, entre 300 y 350 °C) y la presencia de catalizadores metálicos. De esta manera se obtiene como producto final un combustible de muy buena calidad denominado, entre otras muchas formas, hidrobiodiésel, (conocido como "Hydrogenated Vegetal Oil" o HVO) el cual puede ser mezclado con el diésel sin mermar su poder calorífico.

Las condiciones usadas en el proceso de hidrogenación son muy similares a las que se usan en las unidades de hidrodesulfuración (HDS), lo que facilita la posibilidad de alimentar una mezcla de triglicéridos y fracciones del petróleo en las refinerías ya existentes. Este hecho implica un menor coste de implantación y constituye una ventaja importante sobre el proceso de fabricación del biodiésel. Además de los pasos especificados anteriormente, el procedimiento de la invención puede comprender otros pasos adicionales, por ejemplo, aunque sin limitarnos, relacionados con la recuperación del biocombustible obtenido tras el paso (c).

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Selección de cepas a partir de una población de cepas salvajes de T. suecica según el contenido en lípidos. A. Muestra el diagrama de dispersión de la cepa salvaje de T. suecica. Células teñidas con rojo de nilo, emisión de fluorescencia en el amarillo: canal FL2 del citómetro Epics- Altra (575 nm). El 10% corresponde a la parte de la población desde la cual se aisló una única célula, la cepa de la invención, mediante citometría de flujo. B. Placas de siembra en las cuales fue puesta una única célula, la cepa de la invención, proveniente del 10% de la población. Fig. 2. Curvas de crecimiento de la cepa salvaje de Tetraselmis suecica y de la cepa seleccionada Tetraselmis sp. var. repsoliensis.

Círculos: cepa salvaje de T. suecica. Rombos: cepa seleccionada mediante citometría de flujo. La cepa seleccionada, o cepa de la invención, presenta una tasa de crecimiento más alta en comparación con la cepa salvaje. Fig. 3. Diagramas de dispersión de la cepa salvaje de T. suecica (A) y de la cepa seleccionada Tetraselmis sp. var. repsoliensis (B). Mediante la media, muestra la fluorescencia relativa del rojo de nilo, equivalente al contenido en lípidos.

Fig 4. Tamaño celular de la cepa salvaje de Tetraselmis suecica (4A) y de la cepa seleccionada Tetraselmis sp. var. repsoliensis (4B). Las medidas fueron hechas con microscopio óptico. (A): cepa salvaje de T. suecica. Tamaño celular: longitudinal 1 1 ,3 μΐη (+/- 0,34) n= 50; transversal 8,748 μΐτι (+/- 0,41 ). (B): cepa seleccionada por citometría de flujo Tetraselmis sp. var. repsoliensis. Tamaño celular: longitudinal 16,33 μΐη (+/- 0,015) n=50; transversal 10,03 μΐη (+/- 0,29) n= 50.

EJEMPLOS DE REALIZACIÓN

Ejemplo 1 : Selección de la cepa Tetraselmis sp. var. repsoliensis.

La selección de células mediante citometría de flujo ("fluorescence- activated cell sorting") se realizó en un citómetro Epics-Altra equipado con un láser de argón de 488 nm. Tras la excitación con el láser, y diluirse en los lípidos neutrales de las células, el rojo de nilo muestra fluorescencia en el amarillo, alcanzando su pico de emisión a los 570 nm. La señal del rojo de nilo fue detectada por el sistema óptico del citómetro en el canal FL2 (575 nm).

Las células de la población salvaje de Tetraselmis suecica se tiñeron con rojo de nilo y acetona (0,1 mg-ml ^"1 ), para una concentración final de 3 μΜ. Para la mezcla se usaron 10 μΙ de rojo de nilo por mililitro de cultivo, en agitación discontinúa (1000 rpm), usando un vortex, durante 15 minutos, a 20 °C y oscuridad. La solución teñida fue pasada por citometría de flujo, donde se detectaron las células marcadas con rojo de nilo (canal FL2: 575 nm). Se seleccionó el 10% de la población con mayor contenido en lípidos (Fig. 1A y B), teniendo como premisa que la relación entre la emisión con rojo de nilo y el contenido en lípidos es directamente proporcional. La autofluorescencia en el amarillo (canal FL2: 575 nm) de la cepa salvaje de Tetraselmis suecica sin tinción, fue usada como control. La media aritmética y la desviación estándar fueron usadas como medidas de descripción.

De la población de la cepa salvaje de T. suecica marcada como las células con mayor contenido en lípidos, se seleccionó y aisló mediante citometría de flujo una única célula. A partir de esta única célula se obtuvo un cultivo de una cepa de T. suecica con mayor contenido en lípidos. El proceso de selección se repitió, a partir de los nuevos cultivos, hasta la tercera generación. Todos los cultivos obtenidos fueron incubados en cámara de cultivo a 23 °C, 15 μΐηοΐβε fotones m ^"2 .sec ^"1 y fotoperiodo 16:8 luz: oscuridad.

Basados en la tasa de crecimiento según la densidad óptica (Fig. 2), el contenido en lípidos según la fluorescencia del rojo de nilo (Fig. 3A y B) y el tamaño celular según medidas hechas al microscopio (Fig. 4A y B), la cepa seleccionada desde la cepa salvaje de T. suecica recibió el nombre de Tetraselmis sp. var. repsoliensis.

Adicional a estas pruebas se realizó un análisis genético, basado en la generación de códigos de barras moleculares de ADN. Este análisis permitió diferenciar genéticamente la cepa seleccionada por citometría de flujo de la cepa salvaje de T. suecica. Se analizaron las diferencias en el operón que codifica ARN ribosomal. Tras haber secuenciado los genes en cuestión en ambas cepas fue posible calcular el porcentaje de nucleótidos diferentes entre ambas cepas para cada gen. Los resultados concluyeron que ambas cepas son genéticamente diferentes; se encontraron diferencias significativas en las secuencias de ADN (del 25% en las regiones ITS), que sitúan a las dos cepas en lados diferentes del árbol filogenético. Las secuencias de 18S rDNA de ambas cepas fueron analizadas filogenéticamente y ocupaban ciados distintos dentro del árbol filogenético del género Tetraselmis.