Prinzipiell hat die natürliche Produktion von niedermolekula- ren Substanzen mit Hilfe von Mikroorganismen zugenommen und auch der Markt für rekombinante Proteinpharmazeutika („Biolo- gics") ist in den letzten Jahren stark gewachsen. Aufgrund des starken Kostendrucks bei der fermentativen Produktion, insbesondere für Pharmawirkstoffe auf Proteinbasis, wird laufend nach effizienteren und damit kostengünstigeren Verfahren und

Systemen für deren Herstellung gesucht. Als Produzenten können verschiedene Mikroorganismen, wie Bakterien, Hefen, filamentö- se Pilze oder auch Pflanzenzellen oder Tierzellen verwendet werden. Wirtschaftlich ausschlaggebend ist hierbei eine kos- tengünstige Fermentation, hohe Produktausbeuten und bei Proteinen eine korrekte Faltung bzw. Modifikation, die zu einem funktionellen Protein führt. Aufgrund seiner sehr gut untersuchten Genetik und Physiologie, der kurzen Generationszeit und der einfachen Handhabung, ist das Gram-negative Enterobak- terium Escherichia coli (E. coli) gegenwärtig der am häufigsten verwendete Organismus zur Produktion niedermolekularer Substanzen und Proteine.

Grundsätzlich werden zwei unterschiedliche Mikroorganismen verwendet, die Mikroorganismen, die die Substanzen natürlicherweise produzieren und solche, die genetisch modifiziert wurden. Die zur genetischen Modifikation benötigten technischen Verfahren sind im Stand der Technik seit langem bekannt. Ziel ist es dabei die Gene, die für die Zielproteine bzw. zur Synthese der niedermolekularen Substanzen notwendig sind in die Wirtszelle einzubringen. Diese werden von der Wirtszelle transkribiert, translatiert , soweit nötig modifiziert und eventuell in das Medium ausgeschleust. Die Wirtschaftlichkeit eines biotechnologischen Verfahrens hängt entscheidend von den erzielten Ausbeuten des Produktes ab. Diese können durch das Expressionssystem (Wirtszelle, ge- netische Elemente etc.), den Fermentationsparametern und den Nährmedien optimiert werden.

Grundlegend können die Wirtszellen in zweierlei Weise modifiziert werden. So kann die neue genetische Information ins Ge- nom integriert werden (filamentöse Pilze, Hefen, etc.) und o- der auf einem extrachromosomalen Element (z.B. Plasmid) eingebracht werden (Prokaryonten, Hefen etc.) . Bei der genetischen Integration der Gene ins Genom bleiben diese auch ohne Selektionsdruck gut in der Wirtszelle erhalten. Nachteilig ist aber, dass bei Prokaryonten nur eine Kopie des Gens im Wirt vorhanden ist und die Integration weiterer Kopien desselben Gens zur Steigerung der Produktbildung über den Gendosiseffekt, aufgrund von sequenzspezifischen Rekombinationsereignissen sehr anspruchsvoll ist (EP 0284126 Bl) .

Bei der Nutzung extrachromosomaler DNA wird in der Regel die genetische Information des Zielproteins in Form eines Plasmids in den E. coli Produktionsstamm transformiert. Da sich auch hier der Gendosis-Effekt auswirkt, wird eine möglichst hohe Anzahl an Plasmidkopien pro Zelle angestrebt. Da ein solches genetische Element aufgrund der Belastung, sowohl durch die Replikation des Plasmids als auch durch die Produktion des Zielproteins, leicht aus der Zelle verloren geht, muss über die gesamte Kultivierung ein Selektionsdruck ausgeübt werden. Standardmäßig werden als Selektionsmarker Antibiotika- Resistenzgene verwendet, die damit der Zelle, die ein solches Element aufweist, ein Wachstum in Gegenwart von Antibiotika ermöglicht. Entsprechend können sich nur die Zellen vermehren, die ein Plasmid tragen. Da durch den Plasmidverlust auch die Fähigkeit zur Produktion der Zielsubstanz bzw. des Zielproteins verloren geht, hat dies einen direkten Effekt auf die Ausbeuten, die in der Fermentation erzielt werden können. Der Einsatz von Antibiotikaresistenzen als Selektionsmarker wird in den letzten Jahren zunehmend kritisch betrachtet. Zum einen ist der Einsatz von Antibiotika recht teuer, insbesondere, wenn die Resistenz auf einem Antibiotika abbauenden Enzym beruht, da das Antibiotikum stetig nachdosiert werden muss.

Andererseits trägt der weitverbreitete Einsatz in der Medizin und anderen Gebieten zur Ausbreitung der Resistenzgene auf andere, teilweise pathogene Stämme bei. Dies hat negative Folgen für die Behandlung von Krankheiten.

Im Stand der Technik sind inzwischen auch antibiotikafreie Selektionssysteme entwickelt worden. Mehrere unterschiedliche antibiotikafreie Systeme wurden entwickelt. Diese können in drei unterschiedliche Grundsysteme unterteilt werden. Die Ver- wendung von Auxotrophien, Toxin-Antitoxin-Systemen und weiteren Verfahren.

In die Kategorie der weiteren Verfahren fallen Mechanismen, die keinem allgemeinen Prinzip folgen, z.B. Suppressor t-RNAs, fab I/Triclosan (FA-Synthese) , Operator/Repressor Titration

(Peubez et al . Microbial Cell Fac, 2010, 9:65). Diese Verfahren werden aber in der Regel zur Synthese von DNA und DNA- Fragmenten zur Gentherapie eingesetzt und sind nicht für die Produktion hoher Ausbeuten an Zielsubstanzen optimiert. Teil- weise werden anstatt von Antibiotika andere Stoffe z. B. Tric- losan, Herbizide und Schwermetalle, zur Selektion eingesetzt, die aber auch mit gesundheitlichen Bedenken behaftet sind. So werden beispielsweise von Herrero et al . (1990, J . Bacteriol . 172, 6557-6567) Resistenzgene gegen Herbizide und Schwermetal- le als Selektionsmarker beschrieben.

Toxin-Antitoxin-Systeme (Hok-Sok, ccdA/B etc.) bestehen aus zwei genetischen Elementen, die sowohl beide auf dem Plasmid, als auch chromosomal und auf dem Plasmid kodiert sein können (Gerdes et al . Proc Natl Acad Sei USA, 1986, 83:3116-20). Das Antitoxin wirkt dabei neutralisierend auf das Toxin. Bei Verlust des Plasmids fehlt dieser Mechanismus und die plasmid- freie Zelle stirbt aufgrund des chromosomal kodierten bzw. langlebigen Toxins.

Eine weitere bekannte Methode zur Selektion ist die Komplemen- tierung auxotropher Stämme. Hier werden Gene im Genom des Produktionsstammes entfernt bzw. inaktiviert, die essentielle Funktionen im Stoffwechsel haben. Entsprechend werden solche Gene als essentielle Gene bezeichnet. Die somit entstandenen auxotrophen Stämme können nur dann wachsen, sich vermehren o- der überleben, wenn die StoffWechselfunktion umgangen oder wieder hergestellt wird. Dies kann sowohl durch Fütterung entsprechender Vorstufen oder Endprodukte des Stoffwechsels (Aminosäuren, Basen etc.) oder durch Einbringen des Gens, das im Wirtsgenom deaktiviert wurde, erreicht werden. Das Patent EP 0284126 Bl nennt Auxotrophiemarker des Aminosäurestoffwechsels. Da Auxotrophien leicht durch Zugabe des notwendigen StoffWechselproduktes ins Medium supplementiert werden können, lassen sich diese Stämme einfach erzeugen. Denn die Zellen können in Gegenwart des StoffWechselprodukts auch ohne Plasmid kultiviert werden. Durch Transformation wird die Information zur Synthese der Aminosäure/Base wieder in die Zelle eingeführt und die Zelle kann auch ohne Supplementation wachsen. Entsprechend muss die Selektion auf Minimalmedien ohne das Supplement erfolgen.

In der Praxis konnte sich der Einsatz solcher Auxotrophien als Selektionsmarker bisher nicht durchsetzen, da in der industriellen Fermentation üblicherweise Medien mit komplexer Zusammensetzung verwendet werden. Hier sind in der Regel aus Kos- tengründen Abfallstoffe Bestandteil des Fermentationsmediums, wie z.B. Rückstände von Getreide (Ethanolherstellung) , Mais (Stärkeherstellung) , Kartoffeln (Stärkegewinnung) oder Hefeextrakt. Diese dienen sowohl als Kohlenstoff- als auch als Stickstoffquellen . Teilweise sind diese Bestandteile nicht ge- nau definiert, enthalten aber Aminosäuren, Basen, Vitamine etc., die aus dem Medium aufgenommen werden können. In der industriellen Fermentation ist es daher schwer, wenn nicht un- möglich, einen ausreichenden Selektionsdruck mit auxotrophen Stämmen aufzubauen.

Auch die Verwendung einer Auxotrophie im Glukosestoffwechsel, wie sie in WO 2008/135113 AI beschrieben wird, hat in den industriell verwendeten Medien keine ausreichende Selektivität. Zwar können die Mikroorganismen besonders gut auf Glucose wachsen und sich schneller vermehren, als dies in Medien mit anderen C-Quellen der Fall ist, aber wegen der höheren Belas- tung durch das Plasmid bzw. die Produktion der Zielsubstanz wird dieser Vorteil wieder aufgehoben. Andere C-Quellen stehen in komplexen Medien zur Verfügung und werden von den Zellen verwendet . Dies gilt auch für die in WO 07039632 AI beschriebene Verwendung des pyrC-Gens (Dihydroorotase) als Auxotrophiemarker . Dieses Enzym befindet sich am Anfang der Pyrimindin-Basen Synthese und die Inaktivierung führt auch zur Inhibition der De- novo Synthese. Jedoch können die Basen aus dem Medium aufge- nommen und verwertet werden und ein entsprechender Selektionsdruck kann in industriellen Medien nicht aufgebaut werden.

Ausnahmen stellen Auxotrophien für das essentielle Thymidin und D-Alanin dar, die auch in komplexen Bestandteilen ledig- lieh in Spuren oder gar nicht in den Fermentationsmedien vorkommen (EP 0251579 AI; EP 0185512 Bl) . Aber auch diese Systeme sind nicht geeignet für die effiziente Produktion im Hochzelldichte-Verfahren, das in der Regel angestrebt wird. Da bei diesem Verfahren die Zellen teilweise absterben und lysieren, werden entsprechend Thymidin und D-Alanin bzw. andere Aminosäuren etc. freigesetzt, die wiederum die Auxotrophien supple- mentieren können.

Insgesamt muss festgestellt werden, dass trotz jahrelanger Er- fahrung zur fermentativen Produktion von niedermolekularen

Substanzen und Proteinen bisher kein universell einsetzbares System entwickelt wurde, außer jenem über teure oder gesundheitlich bzw. ökologisch bedenkliche Substanzen, wie Antibio- tika. Auch die verschiedenen Ansätze zur Selektion über

Auxotrophiemarker haben wegen der in der Industrie verwendeten komplexen Wachstumsmedien bisher nur zu dürftigen Ergebnissen geführt .

Dies gilt prinzipiell für Mikroorganismen, aber insbesondere für weniger robuste Produktionsstämme, wie z.B. leaky Stämme, die aufgrund ihrer speziellen Eigenschaften (Freisetzung von Proteinen ins Medium) genutzt werden. Bei der industriellen Nutzung dieser Stämme im technischen Maßstab werden üblicherweise komplexe Bestandteile im Medium verwendet.

Die Nutzung definierter Medien aus gereinigten Bestandteilen ist für die Herstellung von industriell genutzten Produkten aus Kostengründen nicht wirtschaftlich.

Aufgabe der Erfindung ist es, einen Mikroorganismenstamm zur Produktion von niedermolekularen Substanzen oder Proteinen bereitzustellen, der auch in Medien mit Komplexbestandteilen stabil bleibt und bei dem das Produktionsplasmid nicht durch ein Antibiotikum/Resistenzmarker-System in der Zelle stabilisiert wird.

Diese Aufgabe wird gelöst durch einen Mikroorganismenstamm enthaltend in seinem Genom eine Mutation in einem Gen, welche eine Auxotrophie des Stammes bewirkt, sowie ein Produktionsplasmid kodierend mindestens ein Enzym zur Produktion einer niedermolekularen Substanz oder mindestens ein rekombinantes Protein sowie eine funktionelle Kopie des Gens, dessen chromo- somale Inaktivierung die Auxotrophie bewirkt, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Auxotrophie um eine nicht füt- terbare Auxotrophie handelt .

Im Rahmen der Erfindung ist unter einer nicht fütterbaren Auxotrophie zu verstehen, dass die Auxotrophie das Wachstum der Mikroorganismenzelle vermindert oder den Tod der Mikroorganismenzelle bewirkt und nicht durch Zugabe von Stoffwechsel- spezifischen Vor-, Zwischen- und/oder Endprodukten in das Wachstumsmedium supplementierbar ist.

Ein vermindertes Wachstum liegt im Sinne der Erfindung vor, wenn die Wachstumsrate des Stammes in einer Fermentation nach der Mutation des Gens im Vergleich zu der Wachstumsrate des Stammes vor der Mutation des Gens auf < 10% erniedrigt ist, bevorzugt wenn kein Wachstum mehr stattfindet.

Besonders bevorzugt führt die Mutation zur Inaktivierung eines Gens, bewirkt so eine nicht fütterbaren Auxotrophie und, damit den Tod der Mikroorganismenzelle.

Im Genom einer Zelle des erfindungsgemäßen Mikroorganismenstammes ist demnach ein Gen inaktiviert, welches essentiell für einen für das Wachstum oder Überleben der Zelle notwendi- gen anabolen Stoffwechselweg ist, wobei Wachstum oder Überleben der Zelle nicht durch Zugabe von stoffwechselspezifischen Vor-, Zwischen- und/oder Endprodukten in das Wachstumsmedium wieder erreicht werden kann. Ein nicht fütterbares Auxotrophie-Gen im Sinne der Erfindung ist ein Gen im Genom einer Mikroorganismenzelle, dessen Inaktivierung nicht durch Zugabe von stoffwechselspezifischen Vor-, Zwischen- und/oder Endprodukten in das Wachstumsmedium komplementiert werden kann und dessen Inaktivierung zu einer verminderten Wachstumsrate oder zum Tod der Mikroorganismenzelle führt.

Vorzugsweise führt die Mutation des Gens, welche die nicht fütterbare Auxotrophie des Stammes bewirkt, zur Inaktivierung dieses Gens oder zur Inaktivierung der Aktivität des durch das Gen kodierten Genprodukts.

Beispiele für nicht fütterbare Auxotrophie-Gene (lethale Gene) sind in Baba et al . (2006, Mol. Syst. Biol . 2:2006.0008) be- schrieben. Bevorzugt handelt es sich um die Gene map, pyrH, ftsL, rpsB, tsf, plsC oder deren homologe Gene. Besonders bevorzugt handelt es sich um das pyrH-Gen oder das plsC-Gen oder homologe Gene mit gleicher Funktion bzw. Aktivität . Ein Gen im Sinn der vorliegenden Erfindung umfasst neben dem DNA Abschnitt der transkribiert wird auch die DNA Abschnitte, die an der Regulation dieses . Kopiervorgangs beteiligt sind, also die regulatorischen Elemente des Gens, wie bevorzugt Promotoren und Terminatoren.

Unter homologen Genen sind vorzugsweise Gene zu verstehen, die für ein Protein mit der gleichen Aktivität kodieren wie das durch das genannte Gen kodierte Protein und eine SequenzIdentität größer 30%, besonders bevorzugt größer 70%, zu den je- weils aus Datenbanken bekannten Sequenzen der genannten Gene im jeweiligen Mikroorganismus aufweisen.

Das pyrH-Gen kodiert für das Enzym UMP-Kinase (EC: 2.7.4.22; ÜK, Uridinmonophosphat Kinase, Uridylatkinase , Uridin 5"- Monophosphat (UMP) Kinase) . Dieses Enzym aktiviert UMP zu UDP unter Verwendung von ATP. UDP wird in einem nächsten Schritt von einer weiteren Kinase (UDP-Kinase) zu UTP aktiviert, dass sowohl zur Synthese von RNA also auch zur Synthese von CTP (Cytosintriphosphat ) und TTP (Thymidintriposhpat) verwendet werden kann. CTP und TTP sind wiederum Bestandteil von RNA

(CTP) und DNA (dCTP und dTTP) . UMP ist damit der Ursprung für Pyrimidinbausteine von RNA und DNA. Da eine Umwandlung von Uracil in Cytosin oder Thymidin erst auf der Ebene des

Triphosphats erfolgt führt eine Deaktivierung der UMP-Kinase zu einem völligen Block dieses Syntheseweges.

Grundsätzlich kann die Zelle nur die Monophosphate der drei Basen aus dem Medium aufnehmen. Für die Umwandlung des UMP zu UTP ist die UMP-Kinase essentiell. Damit ist diese Auxotrophie nicht durch Fütterung supplementierbar und somit unabhängig von der Medienzusammensetzung.

Das pyrJf-Gen ist charakterisiert durch SEQ ID No . 1. Das pyrH- Genprodukt (PyrH) ist charakterisiert durch SEQ ID No . 2. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind pyrH-Homologe Gene, die für ein Protein mit PyrH Aktivität kodieren und die eine Sequenzidentität größer 30% zu SEQ ID No . 1 aufweisen. Besonders bevorzugt ist eine Sequenzidentität größer 70% zu SEQ ID No. 1. Insbesondere bevorzugt handelt es sich um das pyrH-Gen.

PyrH-Homologe sind Proteine mit einer Sequenzidentität größer 30% zu SEQ ID No. 2, die eine UMP-Kinase-Aktivität gemäß EC- Nummer 2.7.4.22 aufweisen. Besonders bevorzugt weisen PyrH- Homologe eine UMP-Kinase-Aktivität gemäß EC-Nummer 2.7.4.22 und eine Sequenzidentität größer 70% zu SEQ ID No . 2 auf. Insbesondere bevorzugt handelt es sich um das PyrH Protein.

Die PyrH Aktivität in einer Zelle kann entsprechend dem von Bucurenci et al . (1998, J. Bact . 180: 473-77) beschriebenen Test bestimmt werden.

Das plsC-Gen kodiert für das Enzym 1-Acylglycerol- 3 -Phosphat O-Acyltransferase (EC: 2.3.1.51). Dieses Enzym überträgt eine Fettsäure von Acyl-CoA auf ein Acylglycerol- 3 -Phosphat unter Freisetzung eines CoA-SH. Das entstehende Diacylglycerol 3- Phoshat wird zur Synthese essentiellen Membranbestandteilen wie Triglyceriden und Glycerophospholipiden verwendet. Damit ist dieser Schritt für die Produktion der Membransysteme von E. coli notwendig. In E. coli ist zwar eine Aufnahme von Fettsäuren möglich, aber Triglyceride und Glycerophospholipide müssen in der Zelle bzw. in der Membran synthetisiert werden. Das plsC-Gen ist charakterisiert durch SEQ ID No . 3. Das plsC- Genprodukt (PlsC) ist charakterisiert durch SEQ ID No . 4.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind plsC-Homologe Gene, die für ein Protein mit PlsC Aktivität kodieren und die eine Sequenzidentität größer 30% zu SEQ ID No . 3 aufweisen. Besonders bevorzugt ist eine Sequenzidentität größer 70% zu SEQ ID No. 3. Insbesondere bevorzugt handelt es sich um das plsC-Gen.

PlsC-Homologe sind Proteine mit einer Sequenzidentität größer 30% zu SEQ ID No. 4, die eine 1-Acylglycerol-3 -Phosphat 0- Acyltransferase-Aktivität gemäß EC-Nummer 2.3.1.51 aufweisen. Besonders bevorzugt weisen PlsC-Homologe eine 1-Acylglycerol- 3 -Phosphat O-Acyltransferase-Aktivität gemäß EC-Nummer

2.3.1.51 und eine Sequenzidentität größer 70% zu SEQ ID No . 4 auf . Insbesondere bevorzugt handelt es sich um das PlsC Pro- tein.

Die PlsC Aktivität in einer Zelle kann entsprechend dem von Monrand et al . (1998, Biochem. Biophys . Res. Commun. 244: 79- 84) beschriebenen Test bestimmt werden.

Der Grad der DNA- Identität wird durch das Programm „nucleotide blast", zu finden auf der Seite

htt : //blast . ncbi . nlm . nih . gov/ , bestimmt, welches auf dem blastn-Algorithmus basiert. Als Algorithmus -Parameter für ein Alignment zweier oder mehrerer Nukleotidsequenzen wurden die voreingestellten Parameter genutzt. Die voreingestellten generellen Parameter sind: Max target sequences = 100; Short que- ries = "Automatically adjust parameters for short input sequences"; Expect Treshold = 10; Word size = 28; Automatically adjust parameters for short input sequences = 0. Die entsprechenden voreingestellten Scoring Parameter sind:

Match/Mismatch Scores = 1,-2; Gap Costs = Linear.

Für den Vergleich von Proteinsequenzen wird das Programm „pro- tein blast", auf der Seite http : //blast . ncbi . nlm . nih . gov/ , genutzt. Dieses Programm greift auf den blastp-Algorithmus zurück. Als Algorithmus-Parameter für ein Alignment zweier oder mehrerer Proteinsequenzen wurden die voreingestellten Parameter genutzt. Die voreingestellten generellen Parameter sind: Max target sequences = 100; Short queries = "Automatically adjust parameters for short input sequences"; Expect Treshold = 10; Word size = 3; Automatically adjust parameters for short input sequences = 0. Die voreingestellten Scoring Parameter sind: Matrix = BLOSUM62; Gap Costs = Existence: 11 Extension: 1; Compositional adjustments = Conditional compositional score matrix adjustment. Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Stamms wird in einen geeigneten Mikroorganismenstamm ein temperatursensitives Plasmid eingebracht, welches eine funktionelle Kopie eines nicht fütterbaren Auxotrophie-Gens , das mutiert oder deletiert wer- den soll, besitzt. Anschließend wird das entsprechende nicht fütterbare Auxotrophie-Gen im Genom des Stammes inaktiviert. Danach wird in diesem Stamm das temperatursensitive Plasmid bei nicht-permissiver Temperatur gegen ein Produktionsplasmid ausgetauscht, wobei das Produktionsplasmid kodierend mindes- tens ein Enzym zur Produktion einer niedermolekularen Substanz oder mindestens ein rekombinantes Protein auch eine funktionelle Kopie des nicht fütterbaren Auxotrophie-Gens enthält.

Durch dieses Verfahren wird sichergestellt, dass das Produkti- onsplasmid während eines Fermentationsprozesses zur Herstellung niedermolekularer Verbindungen oder von rekombinanten Proteinen auch in komplexen Medien stabil in der Zelle erhalten bleibt. Somit können erfindungsgemäße Stämme plasmidver- lustfrei in Abwesenheit eines zugesetzten selektiven Agens bzw. eines Auxotrophie kompensierenden Additivs kultiviert werden .

Als Ausgangsstamm zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Stammes ist grundsätzlich jeder Mikroorganismenstamm geeignet, der ein Gen besitzt, dessen Inaktivierung zu einer nicht- fütterbaren Auxotrophie des Stamms führt.

Bevorzugt handelt es sich bei dem Ausgangsstamm zur Erzeugung eines erfindungsgemäßen Stammes um einen Enterobacteriaceen- Stamm, insbesondere bevorzugt um einen Stamm der Spezies E- scherichia coli.

Bei den E.coli Stämmen sind solche bevorzugt, die eine „ leaky" -Mutation aufweisen. Unter einer „Leaky-Mutation" ist eine Mutation in einem Gen für ein Stukturelement der äußeren Zellmembran oder der Zellwand, ausgewählt aus der Gruppe der omp-Gene, tol-Gene, excD-Gen, excC-Gen, lpp-Gen, pal-Gen, env- Gene und lky-Gene zu verstehen, die dazu führt, dass die Zel- len vermehrt periplasmatische Proteine ins Medium abgeben (Shokri et al . , Appl . Microbiol . Biotechnol . 60 (2003), 654- 664) . Vorzugsweise handelt es sich um eine „ leaky" -Mutation im lpp-Gen, besonders bevorzugt um eine Mutation ausgewählt aus der Gruppe lppl-Mutation, lpp-Deletionsmutation und Mutation des Glycin-Rests an Position 14 des Lpp-Proteins (Zählweise inkl. Signalpeptid) , wie z.B. die lpp-3-Mutation. Eine lppl- Mutation ist eine Mutation im lpp-Gen, die zu einem Austausch des Arginin-Rests an Position 77 gegen einen Cystein-Rest führt, eine lpp3 -Mutation ist eine Mutation im lpp-Gen, die zu einem Austausch des Glycin-Rests an Position 14 gegen einen Asparaginsäure-Rest führt. Diese Mutationen sind in

US2008254511 detailliert beschrieben. Bei der lpp-Deletionsmutation handelt es sich vorzugsweise um eine Deletion von mindestens einem Nukleotid im lpp-Gen selbst oder in der Promotorregion des lpp-Gens, welche dazu führt, dass die Zellen eine erhöhte Leakiness für periplasmatische Proteine aufweisen. Unter erhöhter Leakiness ist im Sinne der vorliegenden Erfindung zu verstehen, dass nach einer Fermentation der Zellen eine höhere Konzentration von periplasmatischen Proteinen, z. B. der Alkalischen Phosphatase, im Nährmedium vorliegt, als bei einer Fermentation des E. coli-Stammes W3110 (ATCC 27325) un- ter den gleichen Bedingungen.

Verfahren zur Inaktivierung eines Gens in einem Mikroorganismenstamm sind im Stand der Technik bekannt. Sie sind im Folgenden detailliert für die Mutation der beiden bevorzugten Ge- ne (pyrH-Gen und plsC-Gen) sowie deren Genprodukte beschrieben. Analog sind diese Verfahren auch für andere Gene, deren Inaktivierung eine nicht fütterbare Auxotrophie eines Mikroorganismenstammes bewirkt, anwendbar. Das temperatursensitive Plasmid enthält einen temperatursensitiven Replikationsursprung und eine funktionelle Kopie des nicht fütterbaren Auxotrophie-Gens . Außerdem enthält dieses Plasmid ein Selektionsmarker-Gen für die Selektion von Trans- formanten. Bei dem Selektionsmarker handelt es sich beispielsweise um eine Antibiotikaresistenz.

Ein bevorzugtes Beispiel für einen temperatursensitiven Repli- kationsursprung ist „oriRlOl & repA101-ts", ein Abkömmling des Replikationsursprunges von Plasmid pSCIOl (Hashimoto-Gotoh et al. _; Gene, 2000, 241:1:185-191), der u.a. auf den Plasmiden pKD20 und pKD46 (Datsenko und Wanner, 2000, P.N.A.S. 97: 6640- 6645) lokalisiert ist. Das temperatursensitive Plasmid wird mit einer dem Fachmann bekannten Transformationstechnik, z.B. TSS-, CaCl/RbCl-, Elektroporations-Methode, in die Zelle eingebracht.

Auf Zellen, die das temperatursensitive Plasmid beinhalten, wird mittels des Selektionsmarkers , der auf dem temperatursensitiven Plasmid vorhanden ist, selektiert, während die Zellen bei für das Plasmid permissiver Temperatur inkubiert werden.

Ein derartiges temperatursensitives Plasmid lässt sich gegen das Produktionsplasmid austauschen, indem der Mikroorganismenstamm nach der Transformation mit dem Produktionsplasmid bei einer für das temperatursensitive Plasmid nicht-permissiven Temperatur kultiviert wird. Ein bevorzugter nicht-permissiver Temperaturbereich ist 37-45°C, besonders bevorzugt 39-43°C.

Das Produktionsplasmid wird mit einer dem Fachmann bekannten Transformationstechnik, z.B. TSS-, CaCl/RbCl-, Elektroporations -Methode, in die Zelle eingebracht. Die Kultivierung der Transformanten kann sowohl auf Agar-

Platten wie in Flüssigkultur erfolgen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Mikroorganismenstamm unmittelbar nach der Transformation mit dem Produktionsplasmid für 30-90 min, bevorzugt 60 min, einem Temperaturschock bei 47-55°C, bevor- zugt bei 52 °C, ausgesetzt. Anschließend erfolgt die weitere Inkubation bei der oben genannten nicht permissiven Temperatur. Dadurch wird in einem Schritt das temperatursensitive Plasmid gegen das Produktionsplasmid ausgetauscht und ein er- findungsgemäßer Produktionsstamm zur antibiotikafreien Produktion von niedermolekularen Substanzen oder rekombinanten Proteinen generiert. Als Produktionsplasmid wird beispielsweise einer der folgenden bekannten Expressionsvektoren verwendet: pJF118EH, pKK223-3, pUC18, pBR322, pACYC184, pASK-IBA3 oder pET.

Das Produktionsplasmid enthält neben der funktionellen Kopie des nicht fütterbaren Auxotrophie-Gens ein oder mehrere Ziel- gene sowie die zur Expression dieser Zielgene notwendigen Expressionssignale, wie z.B. Promotor-, Operator-, und Terminatorsequenzen. Die Zielgene kodieren für mindestens ein Enzym zur Produktion einer niedermolekularen Substanz oder mindes- tens ein rekombinantes Protein.

Bei den niedermolekularen Substanzen handelt es sich um Grundbausteine (Basen, Aminosäuren, Fettsäuren etc.) sowie Sekun- därmetabolite (Vitamine, Antioxidantien etc.) die der Organismus synthetisieren kann. Bevorzugt sind Aminosäuren, besonders bevorzugt die Aminosäure L-Cystein und davon abgeleitete Verbindungen.

Bei den rekombinanten Proteinen handelt es sich vorzugsweise um heterologe Proteine .

Unter einem heterologen Protein ist ein Protein zu verstehen, das nicht zum Proteom, d.h. der gesamten natürlichen Protein- Ausstattung, des Wirtsorganismus gehört. Bevorzugt handelt es sich bei dem heterologen Protein um ein eukaryotisches Protein, besonders bevorzugt um ein Protein, welches eine oder mehrere Disulfid-Brücken enthält oder welches in seiner funktionellen Form als Di- oder Multimer vorliegt, d.h. dass das Protein eine Quartärstruktur besitzt und aus mehreren identischen (homologen) oder nicht-identischen (heterologen) Untereinheiten aufgebaut ist. Eine bevorzugte Klasse von Proteinen, die aus mehreren Proteinuntereinheiten besteht, sind Antikörper oder Fragmente von Antikörpern. Besonders bevorzugt sind funktionelle Fab- Antikörperfragmente .

Im Folgenden wird die Herstellung eines erfindungsgemäßen Mikroorganismenstammes beschrieben, bei dem das nicht fütterbare Auxotrophie-Gen pyrH mutiert ist. Als AusgangsStämme für die Herstellung eines erfindungsgemäßen Mikroorganismenstammes mit einer genomischen pyrH Inaktvierung ist grundsätzlich jeder Wirtsorganismus geeignet, der ein Gen für die UMP-Kinase PyrH besitzt. Verfahren zur Inaktivierung des pyrH-Gens in einem Mikroorganismenstamm sind im Stand der Technik bekannt. Das pyrH-Gen kann beispielsweise dadurch inaktiviert werden, dass eine Mutation (Substitution, Insertion oder Deletion einzelner oder mehrerer Nukleotide) in den Leserahmen des pyrH-Gens einge- bracht wird, welche dazu führt, dass die spezifische Aktivität von PyrH inaktiviert wird. Dem Fachmann sind Verfahren zur Erzeugung solcher pyrH-Allele bekannt. So kann beispielsweise mittels des in Link et al . (1997, J. Bacteriol . 179: 6228-37) beschriebenen Verfahrens die Einführung chromosomaler Mutatio- nen in ein Gen über den Mechanismus der homologen Rekombination erfolgen. Die chromosomale Deletion des gesamten pyrH-Gens oder eines Teils davon ist beispielsweise mit Hilfe des λ-Red Rekombinase-Systems nach der von Datsenko und Wanner (2000, Proc. Natl. Acad. Sei. U S A. 97: 6640-5) beschriebenen Metho- de möglich. pyrH-Allele können auch über eine Transduktion mittels Pl-Phagen oder Konjugation aus einem Stamm mit pyrH- Mutation auf einen pyrH-Wildtyp-Stamm übertragen werden, wobei das pyrH-Wildtyp-Gen im Chromosom gegen das entsprechende pyrH-Allel ersetzt wird.

Darüber hinaus kann das pyrH-Gen einer Zelle auch dadurch inaktiviert werden, dass mindestens ein für die Expressionsregulation notwendiges Element (z.B. Promotor, Enhancer, Riboso- men-Bindestelle) durch Substitution, Insertion oder Deletion einzelner oder mehrerer Nukleotide mutiert wird. Eine Inakti- vierung im Sinne der Erfindung liegt vor, wenn die Wachstums- rate der Zellen in einer Fermentation durch die Inaktivierung des Gens im Vergleich zu den Zellen vor der Mutation auf <^ 10% erniedrigt ist, bevorzugt wenn kein Wachstum mehr stattfindet. Besonders bevorzugt führt die Mutation zum Tod der Mikroorganismenzelle . Da die Inaktivierung des pyrH-Gens zu einer nicht-fütterbaren Auxotrophie führt, muss eine funktionelle Kopie des pyrH-Gens bereits vor der chromosomalen Inaktivierung in der Zelle vorhanden sein. Dies kann durch das transiente Einbringen eines temperatursensitiven Plasmids, das eine funktionelle Kopie des pyrH-Gens enthält, erreicht werden.

In solchen Zellen, die das temperatursensitive Plasmid enthalten, kann nun durch die genannten Methoden das pyrH-Gen im Genom inaktiviert werden.

In einem weiteren Schritt wird dieses temperatursensitive Plasmid gegen das Produktionsplasmid, das auch eine funktionelle Kopie des pyrH-Gens enthält, ausgetauscht. Dies geschieht vorzugsweise in der bereits beschriebenen Art und Wei- se .

Analog lassen sich erfindungsgemäße Mikroorganismenstämme mit einem inaktivierten plsC-Gen oder einem anderen mutierten nicht fütterbaren Auxotprophie-Gen herstellen. Bei der Herstellung von rekombinanten Proteinen unterscheidet man zwischen einer cytoplasmatischen und einer sekretorischen Produktion. Während bei der cytoplasmatischen Produktion das Zielprotein im Cytoplasma der Zelle angehäuft wird, wird bei der sekretorischen Produktion das Zielprotein in das Periplas- ma bzw. in das Kulturmedium transloziert . Im Rahmen der Erfindung wird die sekretorische Produktion bevorzugt. Insbesondere bevorzugt ist die sekretorische Produktion des Zielproteins in das Kulturmedium. Für die sekretorische Produktion von Proteinen, d.h. für die Translokation des Proteins aus dem Cytoplasma in das Periplas- ma bzw. das Kulturmedium, ist es notwendig, das 5' -Ende des Gens des zu produzierenden Proteins in frame mit dem 3 '-Ende einer Signalsequenz für den Protein-Export zu verknüpfen. Dazu sind prinzipiell die Gene aller Signalsequenzen geeignet, die in E. coli zu einer Translokation des Zielproteins in das Pe- riplasma führen. In E. coli sind drei Haupttranslokationswege bekannt: der SEC-, TAT- und SRP-Weg. Bevorzugt sind solche

Signalsequenzen, die eine Translokation über den SEC-Apparat ermöglichen. Verschiedene derartige Signalsequenzen sind im Stand der Technik beschrieben, so z.B. die Signalsequenzen der folgenden Gene: phoA, ompA, pelB, ompF, ompT, lamB, malE, dsbA, Staphylococcal protein A, Stil und andere (Choi and Lee, Ap l . icrobiol. Biotechnol . 64 (2004), 625-635).

Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Signalsequenz des phoA- oder des ompA-Gens von E. coli oder die Signalsequenz für eine Cyc- lodextrin-Glycosyltransferase (CGTase) aus Klebsiella pneumo- niae M5al, oder die von dieser Signalsequenz abgeleitete Sequenz, die in US2008076157 offenbart ist.

Die Kultivierung (Fermentation) der Zellen, die ein Produkti- onsplasmid enthalten, erfolgt nach üblichen, dem Fachmann bekannten Fermentationsverfahren in einem Bioreaktor (Fermenter) ohne Zugabe von Antibiotika.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von niedermolekularen Substanzen oder rekombinanten Proteinen mittels eines Mikroorganismenstamms, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein erfindungsgemäßer Mikroorganismenstamm eingesetzt wird und ein antibiotikafreies Fermentationsmedium verwendet wird.

Die Fermentation findet in einem üblichen Bioreaktor, bei- spielsweise einem Rührkessel, einem Blasensäulen-Fermenter o- der einem Airlift-Fermenter statt. Bevorzugt ist ein Rührkessel-Fermenter im technischem Maßstab und damit mit einer Größe von >100 1. Bei der Fermentation werden die Zellen des erfindungsgemäßen Stammes in einem Flüssigmedium kultiviert, wobei verschiedene Parameter wie z.B. die Nährstoffzufuhr, der Sauerstoff- Partialdruck, der pH-Wert und die Temperatur der Kultur laufend kontrolliert und genau gesteuert werden. Der Zeitraum der Kultivierung beträgt vorzugsweise 16-150 h, besonders bevorzugt 24-72 h. Als Fermentationsmedien kommen alle gängigen, dem Fachmann bekannten Medien für die Kultivierung von Mikroorganismen in Frage. Diese Fermentationsmedien sind jedoch frei von einem Antibiotikum . Es können Komplexmedien oder Minimalsalzmedien, denen ein definierter Anteil von Komplex-Komponenten wie z.B. Pepton, Trypton, Hefeextrakt, Melasse oder Corn Steep Liquor zugesetzt wird, verwendet werden. Bevorzugt wird ein Medium mit Komplexmedienkomponenten .

Als primäre Kohlenstoffquelle für die Fermentation können alle von den Zellen verwertbaren Zucker, Zuckeralkohole oder organische Säuren bzw. deren Salze verwendet werden. Dabei werden bevorzugt Glucose, Laktose oder Glycerin eingesetzt. Besonders bevorzugt sind Glucose und Laktose. Auch ist eine kombinierte Fütterung mehrerer verschiedener Kohlenstoffquellen möglich. Die Kohlenstoffquelle kann dabei zu Beginn der Fermentation vollständig im Fermentationsmedium vorgelegt werden oder es wird nichts oder nur ein Teil der Kohlenstoffquelle zu Beginn vorgelegt und die Kohlenstoffquelle wird über den Verlauf der Fermentation zugefüttert. Besonders bevorzugt ist dabei eine Ausführungsform, bei der ein Teil der Kohlenstoffquelle vorgelegt wird und ein Teil gefüttert wird. Besonders bevorzugt wird die Kohlenstoffquelle in einer Konzentration von 10- 30 g/1 vorgelegt, die Fütterung gestartet, wenn die Konzentration auf kleiner 5 g/1 abgefallen ist und so gestaltet, dass die Konzentration unter 5 g/1 gehalten wird. Der Sauerstoff-Partialdruck (p0 ₂ ) in der Kultur beträgt vorzugsweise zwischen 10 und 70 % Sättigung. Bevorzugt wird ein p0 ₂ zwischen 20 und 60 %, besonders bevorzugt liegt der p0 ₂ zwischen 45 und 55 % Sättigung.

Der pH-Wert der Kultur liegt vorzugsweise zwischen pH 6 und pH 8. Bevorzugt wird ein pH-Wert zwischen 6,5 und 7,5, besonders bevorzugt liegt der pH-Wert der Kultur zwischen 6,8 und 7,2. Die Temperatur der Kultur liegt zwischen 15 und 45 °C. Bevorzugt ist ein Temperaturbereich zwischen 18 und 40 °C, besonders bevorzugt ist ein Temperaturbereich zwischen 25 und 35 °C, ganz besonders bevorzugt sind 30 °C. Bei einer bevorzugten Ausrichtung handelt es sich bei der Fermentation um eine Hochzelldichte-Fermentation. Unter einer Hochzelldichte-Fermentation ist eine Fermentation zu verstehen, in deren Verlauf Zelltrockengewichte von mehr als 50 g/1 erreicht werden. Besonders bevorzugt werden Zelltrockengewich- te von mehr als 70 g/1.

Fig. 1 zeigt eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pKD46 aus Bsp . 2.

Fig. 2 zeigt eine Restriktions- und Funktionskarte des Plas- mids pAF-ts-pyrH hergestellt in Bsp. 2.

Fig. 3 zeigt eine Restriktions- und Funktionskarte das Plasmids pAF-ts-plsC hergestellt in Bsp. 2.

Fig. 4 zeigt eine Restriktions- und Funktionskarte das Plasmids pMTl verwendet in Bsp. 5.

Fig. 5 zeigt eine Restriktions- und Funktionskarte des Expres- sionsplasmids pcysEX-GAPDH-ORF306_tetR hergestellt in Bsp. 5. Fig. 6 zeigt eine Restriktions- und Funktionskarte des Expres- sionsplasmids pCGT_tetR hergestellt in Bsp. 6.

Fig. 7 zeigt eine Restriktions- und Funktionskarte des Expres- sionsplasmids pFab-anti-Lysozym_tetR hergestellt in Bsp. 7.

Fig. 8 zeigt eine Restriktions- und Funktionskarte des Expres- sionsplasmids pcysEX-GAPDH-ORF306_pyrHl_tetR hergestellt in Bsp. 8. Fig. 9 zeigt eine Restriktions- und Funktionskarte des Expres- sionsplasmids pCGT_pyrHl_tetR hergestellt in Bsp. 8.

Fig. 10 zeigt eine Restriktions- und Funktionskarte des Ex- pressionsplasmids pFab-anti-Lysozyme_pyrHl_tetR hergestellt in Bsp. 8.

Fig. 11 zeigt eine Restriktions- und Funktionskarte des Ex- pressionsplasmids pcysEX-GAPDH-ORF306_plsCl_tetR hergestellt in Bsp . 8.

Fig. 12 zeigt eine Restriktions- und Funktionskarte des Ex- pressionsplasmids pCGT_plsCl_tetR hergestellt in Bsp. 8.

Fig. 13 zeigt eine Restriktions- und Funktionskarte des Ex- pressionsplasmids pFab-anti-Lysozyme_plsCl_tetR hergestellt in Bsp . 8.

Fig. 14 zeigt eine Restriktions- und Funktionskarte des erfin- dungsgemäßen Produktionsplasmids pcysEX-GAPDH-ORF306_pyrH hergestellt in Bsp. 9.

Fig. 15 zeigt eine Restriktions- und Funktionskarte des erfindungsgemäßen Produktionsplasmids pCGT_pyrH hergestellt in Bsp. 9.

Fig. 16 zeigt eine Restriktions- und Funktionskarte des erfindungsgemäßen Produktionsplasmids pFab-anti -Lysozym_pyrH hergestellt in Bsp . 9.

Fig. 17 zeigt eine Restriktions- und Funktionskarte des erfindungsgemäßen Produktionsplasmids pcysEX-GAPDH-ORF306_plsC her- gestellt in Bsp. 9.

Fig. 18 zeigt eine Restriktions- und Funktionskarte des erfindungsgemäßen Produktionsplasmids pCGT_plsC hergestellt in Bsp. 9.

Fig. 19 zeigt eine Restriktions- und Funktionskarte des erfin- dungsgemäßen Produktionsplasmids pFab-anti-Lysozym_plsC hergestellt in Bsp . 9.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. Sämtliche eingesetzten molekularbiologischen und mikrobiologischen Verfahren wie Polymerase-Ketten-Reaktion

(PCR) , Gensynthese, Isolierung und Reinigung von DNA, Modifikation von DNA durch Restriktionsenzyme, Klenow-Fragment und Ligase, Transformation, PI-Transduktion etc., wurden in der dem Fachmann bekannten, in der Literatur beschriebenen oder von den jeweiligen Herstellern empfohlenen Art und Weise durchgeführt . Beispiel 1: Amplifikation des Marker-Gens (pyrff- oder plsC) Gens mit eigenem Promotor

Ein etwa 1,0 kb großes DNA-Fragment, welches für das pyrH-Gen inklusive nativer Promotoregion kodiert, wurde mit den Primern pyrH-Ncol-fw (SEQ ID No . 5) und pyrH-Ncol-rev (SEQ ID No . 6) amplifiziert . Als Matrize für die PCR-Reaktion diente chromosomale DNA des E. coli Stammes W3110 (ATCC 27325) .

Das etwa 1,0 kb große PCR-Fragment wurde über eine Agarose- Gelelektrophorese gereinigt und mit dem "QIAquick Gel

Extraction Kit" (Qiagen GmbH, Hilden, D) nach Angaben des Herstellers aus dem Agarosegel isoliert. Anschließend wurde das gereinigte PCR-Fragment mit dem Restriktionsenzym Ncol verdaut und bei -20°C gelagert. Analog wurde ein etwa 1,0 kb großes DNA-Fragment, welches für das plsC-Gen inklusive nativer Promotorregion kodiert, amplifiziert , gereinigt, verdaut und gelagert. Für die Amplifikation wurden die Primer plsC- Ncol-fw (SEQ ID No. 7) und plsC-NcoI-rev (SEQ ID No . 8) verwendet .

Beispiel 2: Generierung der Plasmide pAF-ts-pyrH und pAF-ts- plsC mit temperatursensitivem Replikationsursprung

Als Ausgangsplasmid für die Konstruktion der Plasmide pAF-ts- pyrH und pAF-ts-plsC mit temperatur-sensitivem Replikationsursprung wurde das Plasmid pKD46 verwendet (Datsenko und Wanner,

2000, P.N.A.S. 97: 6640-6645) . Eine Restriktions- und Funkti- onskarte von Plasmid pKD46 ist in Fig. 1 gezeigt. In die Ncol- Schnittstelle von pKD46 wurden die in Beispiel 1 beschriebenen, und mit Ncol verdauten PCR-Produkte kloniert, welche für das pyrH-Gen oder plsC-Gen mit eigenem Promotor kodieren. Die Ligationsansätze wurde in „DH5oi™-TlR E. coli- Zellen" (Life Technologies GmbH) transformiert, in diesen Zellen vermehrt und die DNA-Sequenz der isolierten Plasmide mittels Sequenzierung verifiziert. Zwei der insgesamt 4 möglichen Konstrukte, welche auf diese Art und Weise generiert wurden, tragen die Bezeichnungen pAF-ts-pyrH und pAF-ts-plsC (siehe Fig. 2 und 3) .

Beispiel 3: Transformation ausgewählter E. coli Stämme mit pAF-ts-pyrH oder pAF-ts-plsC

Die in Beispiel 2 beschriebenen Plasmide pAF-ts-pyrH und pAF- ts-plsC mit temperatur- sensitivem Replikationsursprung wurden mit der dem Fachmann bekannten CaCl ₂ - ethode in die beiden E. coli Stämme W3110 (ATCC 27325) und W3110lpp3 (beschrieben in US2008076158 AI als „ leaky" -Stamm) transformiert. Die Selektion der transformierten Zellen erfolgte auf LB-Agarplatten, die 100 mg/1 Ampicillin enthielten. Die auf diese Art und Weise generierten Stämme tragen die Bezeichnungen W3110/pAF-ts-pyrH, W3110lpp3/pAF-ts-pyrH, W3110/pAF-ts-plsC und W31101pp3/pAF-ts- plsC.

Beispiel 4: Deletion des Gens pyrH (Inaktivierung Uridylat- kinase) bzw. des Gens plSC (Inaktivierung l-Acylglycerol-3- Phosphat O-Acyltransferase) in E. coli

A) Deletion des Gens pyrH

Das Gen pyrH, welches in E. coli für das Enzym Uridylatkinase (PyrH) kodiert, wurde nach der von Datsenko und Wanner entwickelten „λ-Red- ethode" in den E. coli Stämmen W3110/pAF-ts- pyrH und W3110lpp3/pAF-ts-pyrH deletiert (Datsenko und Wanner, 2000, P.N.A.S. 97: 6640-6645) . Ein DNA-Fragment, welches für das Kanamycin-Resistenzmarkergen (kanR) codiert, wurde mit den Primern pyrH-fw (SEQ ID No. 9) und pyrH-rev (SEQ ID No . 10) amplifiziert . Der Primer pyrH-fw kodiert für eine Sequenz, bestehend aus 30 Nukleotiden, welche homolog zum 5' -Ende des pyrJi-Gens ist, und eine 20 Nukleotide umfassende Sequenz, die komplementär zu einer DNA-Sequenz ist, welche eine der beiden FRT-sites (FLP-recognition target) auf dem Plasmid pKD13 (Coli Genetic Stock Center (CGSC) No . 7633) kodiert. Der Primer pyrH- rev kodiert für eine Sequenz, bestehend aus 30 Nukleotiden, welche homolog zum 3 "-Ende des pyrH-Gens ist, und eine 20 Nukleotide umfassende Sequenz, die komplementär zu einer DNA- Sequenz ist, welche die zweite FRT-site auf dem Plasmid pKD13 kodiert . Das amplifizierte PCR-Produkt wurde mittels Elektroporation in die E. coli Stämme W3110/pAFts-pyrH und W3110lpp3/pAF-ts-pyrH (siehe Beispiel 3) eingebracht. Die Selektion auf Zellen mit chromosomaler Integration des Kanamycin-Resistenz-Markergens (kanR) erfolgte auf LB-Agarplatten, die 50 mg/1 Kanamycin und 100 mg/1 Ampicillin enthielten. Die Entfernung des chromosomal eingebrachten Kanamycin-Resistenz-Markergens (kanR) erfolgte mit dem Enzym FLP-Rekombinase , welches auf dem Plasmid pCP20 (CGSC No. 7629) kodiert ist. Die Selektion auf pCP20 -enthaltene Zellen erfolgte auf LB-Agarplatten, die 100 mg/1 Ampicillin

(Selektion auf pAF-ts-pyrH) und 34 mg/1 Chloramphenicol (Selektion auf pCP20) enthielten. Aufgrund eines temperatursensitiven Replikationsursprunges (ori) kann das Plasmid pCP20 nach erfolgter Transformation durch Kultivierung der E. coli Zellen bei nicht permissiver, d.h. erhöhter Temperatur, z.B. bei 42°C, wieder entfernt werden.

Eine erste Selektion auf Verlust des temperatursensitiven Plasmids pCP20 bei gleichzeitigem Erhalt des temperatur- sensitiven Plasmids pAF-ts-pyrH, erfolgte auf LB-Agarplatten, die 100 mg/1 Ampicillin enthielten (Selektion auf pAF-ts-pyrH) . Im weiteren Verlauf wurden die vorselektierten Ampicillin-resistenten Bak- terien-Klone auf Kanamycin-Sensitivität , d.h. den Verlust des chromosomal eingebrachten Kanamycin-Markergens , sowie auf Chlo- ramphenicol-Sensitivität , d.h. den Verlust des temperatursensi - tiven Plasmids pCP20 überprüft.

Nur Kanamycin-, sowie Chloramphenicol -sensitive aber Ampicillin-resistente Klone wurden abschließend mit den Primern pyrH- check-for (SEQ ID No . 11) und pyrH-check-rev (SEQ ID No . 12) auf die chromosomale Deletion des pyrff-Gens hin überprüft. Als Template für die Überprüfung der chromosomalen pyrif-Deletion mittels PCR diente chromosomale DNA der selektierten Ampicillin-resistenten, Chloramphenicol- und Kanamycin- sensitiven Klone .

Die auf diese Art und Weise generierten und überprüften Ampi- cillin-resistenten E. coli-Stämme mit chromosomaler pyrH-

Deletion und Plasmid-kodierter pyrH-Expression tragen die Bezeichnungen W3110ÄpyrH/pAF-ts-pyrH und W31101pp3ÄpyrH/pAF-ts- pyrH . B) Deletion des plsC-Gens

Analog zum pyrH-Gen wurde das Gen plsC, welches in E. coli für das Enzym 1-Acylglycerol- 3 -Phosphat O-Acyltransferase (PlsC) kodiert, in den E. coli Stämmen W3110/pAF-ts-plsC und

W31101pp3/pAP- ts-plsC deletiert (Datsenko und Wanner, 2000, P.N.A.S. 97: 6640-6645). Ein DNA-Fragment, welches für das Ka- namycin-Resistenzmarkergen (kanR) kodiert, wurde mit den Primern plsC-fw (SEQ ID No. 13) und plsC-rev (SEQ ID No . 14) amplifiziert . Der Primer plsC-fw kodiert für eine Sequenz, bestehend aus 30 Nukleotiden, welche homolog zum 5 '-Ende des plsC-Gens ist, und eine 20 Nukleotide umfassende Sequenz, die komplementär zu einer DNA-Sequenz ist, welche eine der beiden FRT-sites (FLP-recognition target) auf dem Plasmid pKD13 (Coli Genetic Stock Center (CGSC) No . 7633) kodiert. Der Primer plsC- rev kodiert für eine Sequenz, bestehend aus 30 Nukleotiden, welche homolog zum 3 '-Ende des plsC-Gens ist, und eine 20 Nukleotide umfassende Sequenz, die komplementär zu einer DNA- Sequenz ist, welche die zweite FRT-site auf dem Plasmid pKD13 kodiert .

Das amplifizierte PCR-Produkt wurde mittels Elektroporation in die E. coli Stämme W3110/pAFts-plsC und W3110lpp3/pAF-ts-plsC (siehe Beispiel 3) eingebracht. Die Entfernung des chromosomal eingebrachten Kanamycin-Resistenz-Markergens (kanR) erfolgte wieder mit dem Enzym FLP-Rekombinase (kodiert auf Plasmid pCP20).Die Selektion auf pCP20-enthaltene Zellen erfolgte auch hier auf LB-Agarplatten, die 100 mg/1 Ampicillin (Selektion auf pAF-ts-pyrH) und 34 mg/1 Chloramphenicol (Selektion auf pCP20) enthielten. Eine erste Selektion auf Verlust des temperatursen- sitiven Plasmids pCP20 bei gleichzeitigem Erhalt des tempera- tur- sensitiven Plasmids pAF-ts-plsC, erfolgte auf LB- Agarplatten, die 100 mg/1 Ampicillin enthielten (Selektion auf pAF-ts-pyrH) . Im weiteren Verlauf wurden die vorselektierten Ampicillin-resistenten Bakterien-Klone auf Kanamycin- Sensitivität , d.h. den Verlust des chromosomal eingebrachten Kanamycin-Markergens , sowie auf Chloramphenicol-Sensitivität , d.h. den Verlust des temperatursensitiven Plasmids pCP20 überprüft . Diese Klone wurden abschließend mit den Primern plsC-check- for (SEQ ID No. 15) und plsC-check-rev (SEQ ID No . 16) auf die chromosomale Deletion des plsC-Gens hin überprüft. Als Template für die Überprüfung der chromosomalen plsC-Deletion mittels PCR diente chromosomale DNA der selektierten Ampicillinresistenten, Chloramphenicol- und Kanamycin- sensitiven Klone. Die auf diese Art und Weise generierten und überprüften Ampicillin-resistenten E. coli-Stämme mit chromosomaler plsC- Deletion und Plasmid-kodierter plsC-Expression tragen die Be- Zeichnungen W3110ÄplsC/pAF-ts-plsC und W31101pp3ÄplsC/pAF-ts- plsC.

Beispiel 5: Generierung eines Produktionsplasmides mit Antibio- tikaresistenzgen für die Produktion von Cystein

Als Ausgangsplasmide für die Klonierung und Expression der Gene cysEX (kodiert für feedbackresistente Variante der Serin

Acyltransferase ; CysE) und orf306 (kodiert für O-Acetylserin / Cystein-Exporter ; EamA) diente das Basisplasmid pMTl sowie das in EP0885962B1 beschriebene Produktionsplasmid pACYC184-LH- cysEX-orf306.

pMTl enthält neben dem Tetracyclin-Resistenzgen (teti?) noch den tac-Promotor, der durch das Laclq-Genprodukt , dessen Gen ebenfalls auf dem Plasmid vorliegt, reprimiert wird und der durch einen Induktor wie z.B. D-Lactose oder Isopropyl- ß-D- thiogalactopyranosid (IPTG) angeschaltet werden kann.

Eine Restriktions - und Funktionskarte von Plasmid pMTl ist in Fig. 4 gezeigt. Die Sequenz des Plasmides pMTl ist im Sequenzprotokoll (SEQ ID No. 17) hinterlegt.

Für die Generierung eines neuen Produktionsplasmides für die Produktion von Cystein, auf Basis von pMTl, wurde ein Ncol- BsaBI-Fragment des Plasmides pACYC184-LH-cysEX-orf306 (beschrieben in EP0885962 Bl) , welches für die Gene cysEX und orf306 kodiert, mit einem 2458 bp großen NcoI-PvuII-Fragment (kodiert für ColEl-ori und Tetracyclinresistenz , tetR) des Plasmides pMTl ligiert.

Der Ligationsansatz wurde in „DH5a™-TlR E. coli-Zellen" (Life Technologies GmbH) transformiert, in diesen Zellen vermehrt und die DNA-Sequenz der isolierten Plasmide mittels Sequenzierung verifiziert. Das resultierende Expressionsplasmid trägt die Bezeichnung pcysEX-GAPDH-ORF306_tetR (siehe Fig. 5) . Beispiel 6: Generierung eines Produktionsplasmides mit Antibio- tikaresistenzgen für die Produktion von c-CGTase

Als Ausgangsplasmide für die Klonierung und Expression des Cyc- lodextrin-Glycosyl-Transferase (CGTase) -Gens aus Klebsiella pneumoniae M5al (Genbanknr. M15264) diente erneut das Plasmid pMTl sowie das in US2008076158 AI beschriebene Plasmid pCGT. Für die Generierung eines neuen Produktionsplasmides für die Produktion der CGTase, auf Basis von pMTl, wurde ein MauBI- Bsal-Fragment des Plasmides pCGT, welches für das CGTase-Gen aus Klebsiella pneumoniae M5al kodiert, mit einem 4004 bp großen MauBI-Bsal-Fragment des Plasmides pMTl ligiert. Dieses 4004 bp große Fragment des Plasmides pMTl kodiert für den ColEl-ori, den lac/tac-Operator und das Tetracylinresistenzgen {tetR) . Der Ligationsansatz wurde in „DH5of™-TlR E. coli-Zellen" (Life Technologies GmbH) transformiert, in diesen Zellen vermehrt und die DNA-Sequenz der isolierten Plasmide mittels Sequenzierung verifiziert. Das resultierende Expressionsplasmid trägt die Bezeichnung pCGT_tetR (siehe Fig. 6) . Beispiel 7: Generierung eines Produktionsplasmids mit Antibio- tikaresistenzgen für die Produktion von Fab-anti-Lysozym

Als Ausgangsplasmide für die Klonierung und Expression der Gene des Anti-Lysozym-Fab-Fragments diente erneut das Plasmid pMTl sowie das in US20080076158 AI beschrieben pFab-anti-Lysozym. Für die Generierung eines neuen Produktionsplasmids für die Produktion des Antikörperfragmentes Fab-anti-Lysozym, auf Basis von pMTl, wurde ein MauBI-Bsal- Fragment des Plasmids Fab-anti- Lysozym, welches für die beiden Ketten, d.h. die schwere Kette (V _H -C _H 1-Domänen) und die leichte Kette (V _L -C _L -Domänen) des Anti- Lysozym-Fab-Fragments kodiert, mit einem 4004 bp großen MauBI- Bsal-Fragment des Plasmides pMTl ligiert. Dieses 4004 bp große Fragment des Plasmides p Tl kodiert für den ColEl-ori, den lac/tac-Operator und das Tetracylinresistenzgen (tetR) .

Der Ligationsansatz wurde in „DH5a™-TlR E. coli-Zellen" (Life Technologies GmbH) transformiert, in diesen Zellen vermehrt und die DNA-Sequenz der isolierten Plasmide mittels Sequenzierung verifiziert. Das resultierende Expressionsplasmid trägt die Bezeichnung pFab-anti-Lysozym_tetR (siehe Fig. 7) .

Beispiel 8: Generierung von Produktionsplasmiden mit den

Markergenen pyrH oder plsC als Grundlage für die Erstellung erfindungsgemäßer Produktionsplasmide ohne Antibiotikaresistenz- gen

Als Ausgangsplasmide für die Generierung von Produktionsplasmi- den mit pyrH oder plsC als Markergen dienten die in den Beispielen 5 bis 7 beschriebenen Plasmide pcysEX-GAPDH- ORF306_tetR, pCGT_tetR und pFab-anti-Lysozym_tetR . All diese Plasmide besitzen eine einzelne Ncol-Restriktionsschnittstelle (siehe Abbildungen 5 bis 7) . Diese universelle Ncol- Schnittstelle wurde für die Klonierung bzw. Integration der Gene pyrH oder plsC genutzt.

Hierfür wurden die in Beispiel 1 beschriebenen, und mit dem Restriktionsenzym Ncol geschnittenen PCR-Produkte mit den Plasmiden pcysEX-GAPDH-ORF306_tetR, pCGT_tetR und pFab-anti- Lysozyme_tetR ligiert, nachdem diese ebenfalls mit Ncol geschnitten wurden. Die einzelnen Ligationsansätze wurden in „DH5a™-TlR E. coli-Zellen" (Life Technologies GmbH) transformiert, in diesen Zellen vermehrt und die DNA-Sequenz der isolierten Plasmide mittels Sequenzierung verifiziert. Die resul- tierenden Konstrukte tragen, je nach Orientierung und verwendeten Markergen, folgende Bezeichnungen: pcysEX-GAPDH-ORF306_pyrHl_tetR (siehe Fig. 8) und pcysEX- GAPDH-ORF306_pyrH2_tetR

pCGT_pyrHl_tetR (siehe Fig. 9) und pCGT_pyrH2_tetR

pFab-anti-Lysozyme_pyrHl_tetR (siehe Fig. 10) und pFab- anti-Lysozyme pyrH2 tetR pcysEX-GAPDH-ORF306_plsCl_tetR (siehe Fig. 11) und pcysEX- GAPDH-ORF306_plsC2_tetR

pCGT_plsCl_tetR (siehe Fig. 12) und pCGT_plsC2_tetR pFab-anti-Lysozyme_plsCl_tetR (siehe Fig. 13) und pFab- anti-Lysozyme_plsC2_tetR

Für die finale Entfernung des teti?-Gens wurde mit den Varianten pcysEX-GAPDH-ORF306_pyrHl_tetR, pCGT_pyrHl_tetR, pFab-anti- Lysozyme_pyrHl_tetR, pcysEX-GAPDH-ORF306_plsCl_tetR,

pCGT__plsCl_tetR und pFab-anti-Lysozyme_plsCl_tetR weitergearbeitet (siehe Fig. 8 bis 13) .

Beispiel 9: Entfernung des Antibiotka-Resitenzgens tefci? und Transformation der Produktionsplasmide mit pyrH bzw. plsC als verbleibendem Markergen in E. coli Stämme mit chromosomaler pyrH- bzw. pIsC-Deletion

Als Ausgangsplasmide für die Generierung von Produktionsplasmi- den ohne das Antibiotikaresistenzgen tetR und mit pyrH oder plsC als Markergen dienten die in Beispiel 8 beschriebenen Plasmide pcysEX-GAPDH-ORF306_ pyrHl__tetR, pCGT_ pyrHl_tetR, pFab-anti-Lysozyme_ pyrHl_tetR, pcysEX-GAPDH-ORF306_

plsCl_tetR, pCGT_ plsCl_tetR und pFab-anti -Lysozyme_

plsCl_tetR. Die Entfernung des Antibiotikaresistenzgens tetR von den in Beispiel 8 beschriebenen Plasmiden pFab-anti-

Lysozyme_ pyrHl_tetR und pFab-anti-Lysozym_plsCl_tetR erfolgte über einen Verdau mit dem Restriktionsenzym Clal und anschließender Religation.

Für die Plasmide pcysEX-GAPDH-ORF306_ pyrHl_tetR bzw. pcysEX- GAPDH-ORF306_ plsCl_tetR wurde ähnlich verfahren, nur dass das Gen tetR über einen Partialverdau mit Clal entfernt wurde, da sich zwei weitere Clal-Schnittstellen in den Strukturgenen cy- sEX und orf306 befinden (siehe Fig. 8 und 11) .

Im Falle von pCGT_plsCl_tetR wurde das tetR-Gen über einen Ver- dau mit den Enzymen StuI (schneidet blunt End) und Fspl

(schneidet blunt End) vom Plasmid entfernt.

Im Falle von pCGT_pyrHl_tetR wurde das teti?-Gen ebenfalls über einen Partialverdau mit den Enzymen StuI (schneidet blunt End) und Fspl (schneidet blunt End) entfernt, da sich eine weitere Fspl -Schnittstelle im pyrß-Gen befindet (siehe Fig. 9) .

Die jeweiligen linearen Vektorfragmente ohne tetR wurden nach dem Restriktionsverdau über eine Agarose-Gelelektrophorese gereinigt und mit dem "QIAquick Gel Extraction Kit" (Qiagen GmbH, Hilden, D) nach Angaben des Herstellers aus dem

Agarosegel isoliert. Anschließend wurde das jeweilige tetR- freie Vektorfragment religiert.

Die entsprechenden Ligationsansätze wurden mit einer abgewan- delten CaCl ₂ -Methode in die im Beispiel 4 beschriebenen Stämme W3110ApyrH/pAF-ts-pyrH bzw. W3110lpp3ÄpyrH/pAF-ts-pyrH oder W3110ÄpyrH/pAF-ts-plsC bzw. W3110lpp3ÄpyrH/pAF-ts-plsC transformiert. Für die Transformation, d.h. die Einbringung der Antibiotikaresistenz-freien Produktionsplasmide mit pyrH oder plsC als Markergen in E. coli Stämme mit entsprechender chromosomaler Deletion (pyrH oder plsC) wurde folgendermaßen erfahren :

Nach der Zugabe von 5 bis 20 μΐ des jeweiligen Ligationsansat- zes zu 100 μΐ CaCl ₂ -kompetenter Zellen der Stämme

W3110ÄpyrH/pAF-ts-pyrH und W3110lpp3ÄpyrH/pAF-ts-pyrH bzw.

W3110ÄplsC/pAF-ts-plsC und W3110lpp3ÄplsC/pAF-ts-plsC wurden die Zellen für weitere 30 Minuten auf Eis inkubiert. Nach einem kurzzeitigen Hitzeschock für 45 Sekunden bei 42 °C wurden die Zellen 2 min auf Eis abgekühlt. Anschließend wurden dem Trans- formationsansatz 900 μΐ LB-Medium zugesetzt und die Zellen, nicht wie üblich bei 37°C, sondern 30 bis 90 min bei 47°C bis 55 °C inkubiert / regeneriert. Die weitere Inkubation bei erhöhter nicht permissiver Temperatur erfolgte dann für 15 bis 24 h bei 40-45°C auf LB-Agarplatten oder in flüssigem LB-Medium ohne Antibiotikum (z.B. ohne Tetracyclin) .

Die 30 - 90 minütige Regenerationsphase bei 47°C bis 55°C sowie die Kultivierung für 15 bis 24 h bei erhöhter, nicht permissiver Temperatur erleichtert den Austausch der temperatursensitiven Plasmide pAF-ts-pyrH bzw. pAF-ts-plsC gegen das finale, An- tibiotikaresistenz -freie Produktionsplasmid mit pyrH oder plsC als neuem Selektionsmarkergen . Die besten Transformations-Ergebnisse wurden erzielt, wenn die transformierten Zellen 60 min bei 52 °C regeneriert und anschließend 20 h bei 42 °C auf LB-Agarplatten inkubiert wurden. Eine Vorab-Selektion auf Verlust des temperatursensitiven Plas- mids pAF-ts-pyrH bzw. pAF-ts-plsC bei gleichzeitigem Austausch gegen das jeweilige pyrH- oder plsC-haltige Produktionsplasmid ohne Tetracyclinresistenzgen tetR erfolgte zunächst auf LB- Agarplatten ohne Antibiotikum.

Anschließend wurden die vorselektierten Bakterien-Klone auf Am- picillin-Sensitivität , d.h. den Verlust des temperatursensitiven Plasmides pAF-ts-pyrH bzw. pAF-ts-plsC überprüft.

Die pyrH- oder plsC-kodierenden Produktionsplasmide aus Ampi- cillin-sensitiven Klonen wurden abschließend mittels Restrikti- onsverdau überprüft. Restriktionskarten der pyrH-kodierenden Produktionsplasmide pcysEX-GAPDH-ORF306_pyrH , pCGT_pyrH und pFab-anti-Lysozyme_pyrH, jeweils ohne das Antibiotikaresistenz- gen tetR, sind in den Abbildungen 14 bis 16 dargestellt. Restriktionskarten der plsC-kodierenden Produktionsplasmide pcysEX- GAPDH-ORF306_plsC, pCGT_plsC und pFab-anti-Lysozyme_plsC, je- weils ohne das Antibiotikaresistenzgen tetR, sind in den Abbildungen 17 bis 19 dargestellt.

Die auf diese Art und Weise generierten und überprüften Antibiotikaresistenz-freien E. coli-Stämme mit pyrH- oder plsC- kodierendem Produktionsplasmid und chromosomaler pyrH- bzw. plsC-Deletion tragen die Bezeichnungen:

• W3110ApyrH/pcySE -GAPDH-ORF306_pyrH

• W3110lpp3ApyrH/pCGT_pyrH

· W3110lpp3ApyrH/pFab-anti-Lysozym_pyrH

• W3110AplsC/pcysEX-GAPDH-ORF306_plsC

• W3110lpp3AplsC/pCGT_plsC

• W3110lpp3AplsC/pFab-anti-Lysozym_plsC Beispiel 10: Cystein-Fermentation Vorkultur 1 : 20 ml LB-Medium wurden in einem Erlenmeyerkolben (100 ml) mit dem jeweiligen E. coli Stamm W3110/pcysEX-GAPDH-ORF306_tetR, W3110ÄpyrH/pcysEX-GAPDH-ORF306_pyrH oder W3110AplsC/pcysEX- GAPDH-ORF306_plsC beimpft und für sieben Stunden auf einem Schüttler (150 rpm, 30 °C) inkubiert. Für eine Kultivierung von Konstrukt W3110/pcysEX-GAPDH-ORF306_tetR im Sinne des Stands der Technik, d.h. mit Antibiotikum als Selektionsmittel, wurde das Medium mit 15 mg/L Teracyclin supplementiert . Vorkultur 2 ;

Anschließend wurde die Vorkultur 1 vollständig in 100 ml SM1- Medium überführt (12 g/1 K ₂ HP0 ₄ , 3 g/1 KH ₂ P0 ₄ , 5 g/1 (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ , 0,3 g/1 MgS0 ₄ x 7 H ₂ 0, 0,015 g/1 CaCl ₂ x 2 H ₂ 0, 0,002 g/1 FeS0 ₄ x 7 H ₂ 0, 1 g/1 Na ₃ Citrat x 2 H ₂ 0, 0,1 g/1 NaCl, 1 ml/1 Spurenele- mentlösung, bestehend aus 0,15 g/1 Na ₂ Mo0 ₄ x 2H ₂ 0, 2,5 g/1 H ₃ B0 ₃ , 0,7 g/1 CoCl ₂ x 6 H ₂ 0, 0,25 g/1 CuS0 ₄ x 5 H ₂ 0, 1,6 g/1 MnCl ₂ x 4 H ₂ 0, 0,3 g/1 ZnS0 ₄ x 7 H ₂ 0) , das mit 5 g/1 Glucose und 5 mg/1 Vitamin Bl supplementiert war. Die Kulturen wurden in Erlenmeyerkolben (1 1) bei 30 °C für 17 h mit 150 rpm geschüttelt. Nach dieser Inkubation lag die optische Dichte bei 600 nm (OD ₆₀₀ ) zwischen 3 und 5. Für die Kultivierung von W3110/pcysEX-GAPDH- ORF306_tetR im Sinne des Stands der Technik, d.h. mit Antibiotikum als Selektionsmittel, wurde das Medium mit 15 mg/L

Teracyclin supplementiert.

Hauptkultur:

Die Fermentation wurde in Fermentern des Typs BIOSTAT B der Firma Sartorius Stedim durchgeführt. Es wurde ein Kulturgefäß mit 2 1 Gesamtvolumen verwendet. Das Fermentationsmedium (900 ml) enthält 15 g/1 Glucose, 10 g/1 Trypton (Difco) , 5 g/1 Hefeextrakt (Difco) , 5 g/1 (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ , 1,5 g/1 KH ₂ P0 ₄ , 0,5 g/1 NaCl , 0,3 g/1 MgS0 ₄ x 7 H ₂ 0, 0,015 g/1 CaCl ₂ x 2 H ₂ 0, 0,075 g/1 FeS0 ₄ x 7 H ₂ 0, 1 g/1 Na ₃ Citrat x 2 H ₂ 0 und 1 ml Spurenelementlösung (siehe oben) und 0,005 g/1 Vitamin Bl . Der pH-Wert im Fermenter wurde zu Beginn durch Zupumpen einer 25% NH ₄ OH-Lösung auf 6,5 eingestellt . Während der Fermentation wurde der pH-Wert durch automatische Korrektur mit 25% NH ₄ 0H auf einem Wert von 6,5 gehalten. Zum Animpfen wurden 100 ml der Vorkultur 2 in das Fer- mentergefäß gepumpt. Das Anfangsvolumen betrug somit etwa 1 1. Die Kulturen wurden zu Beginn mit 400 rpm gerührt und mit 2 vvm einer über einen Sterilfilter entkeimten Druckluft begast. Unter diesen Startbedingungen war die Sauerstoff-Sonde vor der Inokulation auf 100% Sättigung kalibriert worden. Der Soll -Wert für die 0 ₂ -Sättigung während der Fermentation wurde auf 50 % eingestellt. Nach Absinken der 0 ₂ -Sättigung unter den Soll-Wert wurde eine Regulationskaskade gestartet, um die 0 ₂ -Sättigung wieder an den Soll -Wert heranzuführen. Dabei wurde zunächst die Gaszufuhr kontinuierlich erhöht (auf max . 5 vvm) und anschließend die Rührgeschwindigkeit (auf max. 1.500 rpm) kontinuierlich gesteigert.

Die Fermentation wurde bei einer Temperatur von 30 °C durchgeführt. Nach 2 h Fermentationszeit erfolgte die Zufütterung ei- ner Schwefelquelle in Form einer sterilen 60 % Natrium-

Thiosulfat x 5 H ₂ 0 - Stammlösung mit einer Rate von 1 , 5 ml pro Stunde. Sobald der Glukose-Gehalt im Fermenter von anfänglich 15 g/1 auf ca. 2 g/1 abgesunken war, erfolgte eine kontinuierliche Zudosierung einer 56% Glukose-Lösung . Die Fütterungsrate wurde so eingestellt, dass die Glukosekonzentration im Fermenter 2 g/1 fortan nicht mehr überstieg.

Die Glukose-Bestimmung wurde mit einem Glukoseanalysator der Firma YSI (Yellow Springs, Ohio, USA) durchgeführt. Für die Fermentation von Konstrukt W3110/pcysEX-GAPDH-ORF306_tetR im Sinne des Stands der Technik, d.h. mit Antibiotikum als Selektionsmittel, wurde das Medium mit 15 mg/L Teracyclin supplemen- tiert .

Die Fermentationsdauer betrug 48 Stunden. Danach wurden Proben entnommen und der Gehalt von L-Cystein und den davon abgeleite- ten Derivaten im Kulturüberstand (v.a. L-Cystein und Thiazoli- din) und im Niederschlag (L-Cystin) jeweils getrennt voneinander bestimmt. Zu diesem Zweck wurde jeweils der colorimetrische Test von Gaitonde verwendet (Gaitonde, M. K. (1967) , Biochem. J. 104, 627-633) . Das im Niederschlag befindliche L-Cystin musste zuerst in 8% Salzsäure aufgelöst werden, bevor es auf dieselbe Art quantifiziert werden konnte. Die in Tabelle 1 aufgeführten Werte für Gesamtcystein entsprechen der Summe aus den L-Cystein im Kulturüberstand und L-Cystin im Niederschlag. Dabei entspricht jedes Molekül L-Cystin zwei Molekülen L-Cystein.

Tabelle 1: Gehalt an Gesamtcystein (L-Cystein _{Kulturüberstand} + L- Cystin _Niederschlag ) in der Kulturbrühe nach 48 h und Stabilität der Produktionsplasmide

*Konstrukt im Sinne des Stands der Technik (Vergleichsbeispiel)

**erfindungsgemäßes Konstrukt Beispiel 11: Sekretorische Produktion einer Cyclodextrin- Glycosyl-Transferase im 10 1-Maßstab (Fermentation)

Mit Hilfe einer 2pp-Mutante von E. coli können biotechnologisch relevante Enzyme wie beispielsweise CGTasen produziert und ins Medium sekretiert werden (US2008076158 AI) .

Die sekretorische Produktion der CGTase erfolgte in 10 L Rührkesselfermentern mit den Stämmen W3110lpp3/pCGT_tetR (Kontrolle) , W3110lpp3ÄpyrH/pCGT_pyrH und W31101pp3ÄpyrH/pCGT_plsC .

Der mit 6 1 des Fermentationsmediums FM4 (1,5 g/1 KH ₂ P0 ₄ ; 5 g/1 (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ ; 0,5 g/1 MgS0 ₄ x 7 H ₂ 0; 0,15 g/1 CaCl ₂ x 2 H ₂ 0, 0,075 g/1 FeS0 ₄ x 7 H ₂ 0; 1 g/1 Na ₃ Citrat x 2 H ₂ 0; 0,5 g/1 NaCl; 1 ml/1 Spurenelementlösung (0,15 g/1 Na ₂ Mo0 ₄ x 2 H ₂ 0; 2,5 g/1 Na ₃ B0 ₃ ; 0,7 g/1 CoCl ₂ x 6 H ₂ 0; 0,25 g/1 CuS0 ₄ x 5 H ₂ 0; 1,6 g/1 MnCl ₂ x 4 H ₂ 0; 0,3 g/1 ZnS0 ₄ x 7 H ₂ 0) ; 5 mg/1 Vitamin Bi; 3 g/1 Phyton; 1,5 g/1 Hefeextrakt; 10 g/1 Glukose) befüllte Fermenter wurde im Verhältnis 1:10 mit einer Vorkultur, die über Nacht im glei- chen Medium kultiviert wurde, angeimpft. Während der Fermentation wurde eine Temperatur von 30 °C eingestellt und der pH- Wert durch Zudosierung von NH ₄ OH bzw. H ₃ P0 ₄ bei einem Wert von 7,0 konstant gehalten. Glukose wurde über die Fermentation hin- weg zudosiert, wobei eine maximale Glukose-Konzentration im

Fermentationsmedium von < 10 g/1 angestrebt wurde. Die Induktion der Expression erfolgte durch Zugabe von Isopropyl- ß-D- thiogalactopyranosid (IPTG) ad 0,1 mM am Ende der logarithmischen Wachstumsphase.

Für die Fermentation des Konstruktes W3110lpp3/pCGT_tetR im

Sinne des Stands der Technik, d.h. mit Antibiotikum als Selektionsmittel, wurde das Medium mit 15 mg/L Teracyclin supplemen- tiert .

Nach 72 h Fermentation wurden Proben entnommen, die Zellen durch Zentrifugation vom Fermentationsmedium abgetrennt und der CGTase-Gehalt im Fermentationsüberstand, wie in Beispiel 4 von US2008076158A1 beschrieben, bestimmt.

In Tabelle 2 sind die Ausbeuten an funktioneller CGTase sowie die Aktivitäten im Fermentationsüberstand aufgelistet.

Tabelle 2 : Cyclodextrin-Glycosyltransferase-Ausbeuten im Fermentationsüberstand nach 72 Stunden Fermentation

*Konstrukt im Sinne des Stands der Technik (Vergleichsbeispiel)

* *erfindungsgemäßes Konstrukt

Beispiel 12; Sekretorische, fermentative Produktion des Fab- Antikörperfragments Anti-Lysozym-Fab im 10 1-Maßstab

Mit Hilfe einer Ipp-Mutante von E. coli können auch funktionel- le Fab-Antikörperfragmente extrazellulär hergestellt werden (US2008076158A1) . Dabei muss die Zelle die entsprechenden Fragmente der leichten Kette, welche die Domänen V _L und C _L umfasst, und der schweren Kette, welche die Domänen V _H und CHI umfasst, gleichzeitig synthetisieren und dann in das Periplasma und schließlich in das Fermentationsmedium sekretieren. Außerhalb des Cytoplasmas erfolgt dann die Assemblierung der beiden Ketten zum funktionellen Fab-Fragment .

Das vorliegende Beispiel beschreibt die Produktion eines Fab- Fragments des gut charakterisierten Anti-Lysozym-Antikörpers Dl.3.

Die Plasmide pFab-anti-Lysozym_tetR, pFab-anti-Lysozym_pyrH und pFab-anti-Lysozym_plsC enthalten neben den Markergenen tetR, pyrH bzw. plsC u.a. auch die Strukturgene für die HC und die LC des Fab-Fragments in Form eines Operons. Dabei ist die HC in frame an das 3 '-Ende der ompA-Signalsequenz (ompA ^ss ) und die LC in frame an das 3 '-Ende einer CGTase-Signalsequenz (cgt ^ss ) anfusioniert. Die Expression des ompA ^ss -HC-cgt ^ss -LC-Operons steht unter der Kontrolle des tac-Promotors . Die Produktion des Anti-Lysozym-Fab-Fragments im 10 1-Maßstab erfolgte analog dem in Beispiel 11 anhand der CGTase beschriebenen Verfahren mit den Stämmen W31101pp3/pFab-anti- Lysozym_tetR, W3110lpp3ÄpyrH/pFab-anti-Lysozym_pyrH und

W3110lpp3ÄplsC/pFab-anti-Lysozym_plsC . Für die Fermentation von E. coli W3110lpp3/pFab-anti-Lysozym_tetR im Sinne des Stands der Technik, d.h. mit Antibiotikum als Selektionsmittel, wurde das Medium mit 15 mg/L Teracyclin supplementiert .

Nach 72 h Fermentation wurden Proben entnommen und anschließend die Zellen durch Zentrifugation vom Fermentationsmedium abgetrennt .

Die Reinigung des Anti-Lysozym-Fab-Fragments aus den Fermenta- tionsüberstanden erfolgte mittels Affinitätschromatographie wie in Skerra (1994, Gene 141, 79-84) beschrieben. Die Quantifizierung sowie die Bestimmung der Aktivität des gereinigten Anti-Lysozym-Fab-Fragments erfolgte über einen ELISA- Test mit Lysozym als Antigen (Skerra, 1994, Gene 141, 79-84) . In Tabelle 2 sind die hochgerechneten Ausbeuten an funktionellem Anti-Lysozym-Fab-Fragment im Fermentationsüberstand aufgelistet, basierend auf isolierten Mengen aus jeweils 20 ml Fermentationsüberstand nach 72 h Fermentation. Tabelle 3: Anti-Lysozym-Fab-Fragment-Ausbeuten im Fermentationsüberstand nach 72 h Fermentation

*Konstrukt im Sinne des Stands der Technik (Vergleichsbeispiel)

** erfindungsgemäßes Konstrukt Beispiel 13: Bestimmung der Plasmidstabilität

Die Plasmidstabilität wurde mittels Plasmidpräparation mit anschließendem Restriktionsverdau überprüft. Hierfür wurden nach Beendigung der Kultivierung der Produktionsstämme (z.B. nach 72 h Fermentation) verschiedene Verdünnungen der Kulturen auf LB- Agarplatten ausplattiert. Für die anschließende Ermittlung der Plasmidstabilität, d.h. die Identifizierung Plasmid- tragender Zellen (Kolonien) wurden nur LB-Platten mit Einzelkolonien für die Auswertung herangezogen.

Insgesamt wurden 50 einzelne Kolonien in flüssigem LB-Medium für 15 bis 20 Stunden kultiviert und anschließend Plasmid-DNA aus diesen Kulturen isoliert. Anhand charakteristischer Restriktionsmuster für die einzelnen Produktionsplasmxde wurde die Richtigkeit der isolierten Plasmide verifiziert.

SEQUENCE LISTING

<110> Consortium für elektrochemische Industrie - Wacker Chemie

AG

Bornhövd, Dr. Carsten

Thon, Dr. Marcel

<120> Mikroorganismenstamm und Verfahren zur antibiotikafreien,

fermentativen Herstellung von niedermolekularen Substanzen und Proteinen

<130> Coll517

<150> Coll517

<151> 2015-08-27

<160> 17

<170> Patentin version 3.5

210> 1

211> 726

212> DNA

213> Escherichia coli

220>

221> gene

222> (1) .. (726)

223 > pyrH

400> 1

atggctacca atgcaaaacc cgtctataaa cgcattctgc ttaagttgag tggcgaagct 60 ctgcagggca ctgaaggctt cggtattgat gcaagcatac tggatcgtat ggctcaggaa 120 atcaaagaac tggttgaact gggtattcag gttggtgtgg tgattggtgg gggtaacctg 180 ttccgtggcg ctggtctggc gaaagcgggt atgaaccgcg ttgtgggcga ccacatgggg 240 atgctggcga ccgtaatgaa cggcctggca atgcgtgatg cactgcaccg cgcctatgtg 300 aacgctcgtc tgatgtccgc tattccattg aatggcgtgt gcgacagcta cagctgggca 360 gaagctatca gcctgttgcg caacaaccgt gtggtgatcc tctccgccgg tacaggtaac 420 ccgttcttta ccaccgactc agcagcttgc ctgcgtggta tcgaaattga agccgatgtg 480 gtgctgaaag caaccaaagt tgacggcgtg tttaccgctg atccggcgaa agatccaacc 540 gcaaccatgt acgagcaact gacttacagc gaagtgctgg aaaaagagct gaaagtcatg 600 gacctggcgg ccttcacgct ggctcgtgac cataaattac cgattcgtgt tttcaatatg 660 aacaaaccgg gtgcgctgcg ccgtgtggta atgggtgaaa aagaagggac tttaatcacg 720 gaataa 726 <210> <211> 241

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1) .. (241)

<400> 2

Met Ala Thr Asn Ala Lys Pro Val Tyr Lys Arg Ile Leu Leu Lys Leu 1 5 10 15

Ser Gly Glu Ala Leu Gin Gly Thr Glu Gly Phe Gly Ile Asp Ala Ser

20 25 30 Ile Leu Asp Arg Met Ala Gin Glu Ile Lys Glu Leu Val Glu Leu Gly

35 40 45

Gin Val Gly Val Val Ile Gly Gly Gly Asn Leu Phe Arg Gly Ala 50 55 60

Gly Leu Ala Lys Ala Gly Met Asn Arg Val Val Gly Asp His Met Gly 65 70 75 80

Met Leu Ala Thr Val Met Asn Gly Leu Ala Met Arg Asp Ala Leu His

85 90 95

Arg Ala Tyr Val Asn Ala Arg Leu Met Ser Ala Ile Pro Leu Asn Gly

100 105 110 Val Cys Asp Ser Tyr Ser Trp Ala Glu Ala Ile Ser Leu Leu Arg Asn

115 120 125

Asn Arg Val Val Ile Leu Ser Ala Gly Thr Gly Asn Pro Phe Phe Thr 130 135 140

Thr Asp Ser Ala Ala Cys Leu Arg Gly Ile Glu Ile Glu Ala Asp Val 145 150 155 160

Val Leu Lys Ala Thr Lys Val Asp Gly Val Phe Thr Ala Asp Pro Ala

165 170 175

Lys Asp Pro Thr Ala Thr Met Tyr Glu Gin Leu Thr Tyr Ser Glu Val

180 185 190 Leu Glu Lys Glu Leu Lys Val Met Asp Leu Ala Ala Phe Thr Leu Ala 195 200 205

Arg Asp His Lys Leu Pro Ile Arg Val Phe Asn Met Asn Lys Pro Gly

210 215 220

Ala Leu Arg Arg Val Val Met Gly Glu Lys Glu Gly Thr Leu Ile Thr

225 230 235 240

Glu

<210> 3

<211> 738

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<220>

<221> gene

<222> (1) .. (738)

<223> plsC

<400> 3

atgctatata tctttcgtct tattattacc gtgatttaca gcatcttagt ctgtgtattc 60 ggctccattt actgcctttt cagcccgcgt aacccgaaac atgtggccac ctttgggcat 120 atgtttggcc gtcttgcgcc gctgtttggc ctgaaagttg agtgccgtaa acctacagac 180 gctgaaagct acggcaatgc tatctatatc gctaaccacc agaacaacta tgacatggtg 240 acagcatcga acatcgtgca accgccgacg gtgacggtag gtaaaaagag cttgctgtgg 300 atccccttct tcgggcagtt gtactggtta accggcaact tattgatcga cagaaacaat 360 cgcactaaag ctcacggcac cattgcggaa gtagtgaatc acttcaaaaa acgccgtatt 420 tccatctgga tgttcccgga aggaacccgc agccgtggtc gcggcctgct accgttcaag 480 actggagcat ttcacgcggc aattgcggcg ggcgtcccga ttattcccgt gtgcgtctct 540 acaacttcga ataagattaa tcttaatcga ctgcacaacg gtctggtgat tgtcgaaatg 600 ctgccgccaa ttgacgtcag tcagtatggc aaagatcagg ttcgtgagct ggctgcccat 660 tgtcgttcga taatggaaca aaaaatcgcc gagctcgata aagaagtcgc agaacgcgaa 720 gccgccggaa aagtttaa 738 <210> 4

<211> 245

<212> PRT

<213> Escherichia coli <220>

<221> PEPTIDE

<222> (1) .. (245)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1) .. (245)

<223> PlsC

<400> 4

Met Leu Tyr Ile Phe Arg Leu Ile Ile Thr Val Ile Tyr Ser Ile Leu 1 5 10 15

Val Cys Val Phe Gly Ser Ile Tyr Cys Leu Phe Ser Pro Arg Asn Pro

20 25 30

Lys His Val Ala Thr Phe Gly His Met Phe Gly Arg Leu Ala Pro Leu

35 40 45

Phe Gly Leu Lys Val Glu Cys Arg Lys Pro Thr Asp Ala Glu Ser Tyr 50 55 60

Gly Asn Ala Ile Tyr Ile Ala Asn His Gin Asn Asn Tyr Asp Met Val 65 70 75 80

Thr Ala Ser Asn Ile Val Gin Pro Pro Thr Val Thr Val Gly Lys Lys

85 90 95

Leu Leu Trp Ile Pro Phe Phe Gly Gin Leu Tyr Trp Leu Thr Gly

100 105 110

Asn Leu Leu Ile Asp Arg Asn Asn Arg Thr Lys Ala His Gly Thr

115 120 125

Ala Glu Val Val Asn His Phe Lys Lys Arg Arg Ile Ser Ile Trp Met 130 135 140

Phe Pro Glu Gly Thr Arg Ser Arg Gly Arg Gly Leu Leu Pro Phe Lys 145 150 155 160

Thr Gly Ala Phe His Ala Ala Ile Ala Ala Gly Val Pro Ile Ile Pro

165 170 175

Val Cys Val Ser Thr Thr Ser Asn Lys Ile Asn Leu Asn Arg Leu His

180 185 190

Asn Gly Leu Val Ile Val Glu Met Leu Pro Pro Ile Asp Val Ser Gin 195 200 205

Tyr Gly Lys Asp Gin Val Arg Glu Leu Ala Ala His Cys Arg Ser Ile

210 215 220

Met Glu Gin Lys Ile Ala Glu Leu Asp Lys Glu Val Ala Glu Arg Glu

225 230 235 240

Ala Ala Gly Lys Val

245

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> synthetisches Oligonukleotid

<220>

<221> raisc_feature

<223> Oligonukleotid: pyrH-Ncol-fw

<400> 5

ccccccatgg ccatcttgta aattcagcta acccttgtgg 40 <210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> synthetisches Oligonukleotid

<220>

<221> misc_feature

<223> Oligonukleotid: pyrH-Ncol-rev

<400> 6

ggggccatgg atcctcacgt acttttgtac gctccggttg 40

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> synthetisches Oligonukleotid <220>

<221> tnisc_feature

<223> Oligonukleotid: plsC-NcoI-fw

<400> 7

ccccccatgg atttgctcca tgtaaaactg gctaaag 37

<210> 8

<211> 40

<212> DNA <213> synthetisches Oligonukleotid

<220>

<221> misc_feature

<223> Oligonukleotid: plsC-NcoI -rev

<400> 8

ggggccatgg tgaaaccgtt gtttattcat gcgttgcgat

<210> 9

<211> 71

<212> DNA

<213> synthetisches Oligonukleotid

<220>

<221> misc_feature

<223> synthetisches Oligonukleotid: pyrH-fw

<220>

<221> misc_feature

<223> Oligonukleotid: pyrH-fw

<400> 9

cagtcttaat tatcaaaaag gagccgcctg agggcggctt ctttttgtgc cgtgtaggct 60 ggagctgctt c 71

210> 10

211> 70

212> DNA

<213> synthetisches Oligonukleotid

<220>

<221> misc_feature

<223> Oligonukleotid: pyrH-rev

<400> 10

gtaatcgtct ggattattag gctattttat ttgccatttt ggccccgggc atgggaatta 60 gccatggtcc 70

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> synthetisches Oligonukleotid

<220>

<221> misc_feature

<223> Oligonukleotid: pyrH-check- for

<400> 11

gcataacgct gaagtgactg gcttcatccg 30 <210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> synthetisches Oligonukleotid

<220>

<221> misc_feature

<223> Oligonukleotid: pyrH-check-rev

<400> 12

cagaccagac agtcacacac agtggaagtg 30

210> 13

211> 71

212 > DNA

<213> synthetisches Oligonukleotid

<220>

<221> misc_feature

<223> Oligonukleotid: plsC-fw

<400> 13

ctgacgtcaa ttggcggcag catttcgaca atcaccagac cgttgtgcag cgtgtaggct 60 ggagctgctt c 71

210> 14

211> 71

212> DNA

<213> synthetisches Oligonukleotid

<220>

<221> misc_feature

<223> Oligonukleotid: plsC-rev

<400> 14

ctgacgtcaa ttggcggcag catttcgaca atcaccagac cgttgtgcag cgtgtaggct ggagctgctt c

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> synthetisches Oligonukleotid

<220>

<221> misc_feature

<223> Oligonukleotid: plsC-check- for

<400> 15

cgagattcaa gtagcggcgg aacgggtagc 30 <210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> synthetisches Oligonukleotid

<220>

<221> misc_feature

<223> Oligonukleotid: plsC- check-rev

<400> 16

gttaagtcgt catccggcag cgtattcaac 30

210> 17

211> 4487

212 > DNA

213> Plasmid

<220>

<221> misc__feature

<222> (1) .. (4308)

<223> Plasmid pMTl

<400> 17

tcgtgtcgct caaggcgcac tcccgttctg gataatgttt tttgcgccga catcataacg 60 gttctggcaa atattctgaa atgagctgtt gacaattaat catcggctcg tataatgtgt 120 ggaattgtga gcggataaca atttcacaca ggaaacagaa ttcccgggga tccgtcgacc 180 tgcagccaag cttggctgtt ttggcggatg agagaagatt ttcagcctga tacagattaa 240 atcagaacgc agaagcggtc tgataaaaca gaatttgcct ggcggcagta gcgcggtggt 300 cccacctgac cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg 360 gtctccccat gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga 420 aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa 480 atccgccggg agcggatttg aacgttgcga agcaacggcc cggagggtgg cgggcaggac 540 gcccgccata aactgccagg catcaaatta agcagaaggc catcctgacg gatggccttt 600 ttgcgtttct acaaactctt ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc 660 atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt 720 cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag tccatggcgg ccgccgatct 780 aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc 840 actgagcgtc agaccccgta 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