CAMPO TÉCNICO

La presente divulgación se relaciona con la identificación, caracterización y uso de microorganismos que poseen la capacidad de impedir el desarrollo de hongos fitopatógenos, particularmente del género Botrytis spp. Dichos microorganismos son inocuos para el cultivo vegetal sobre el que sé aplica, y controlan la esporulación, establecimiento y desarrollo de hongos fitopatógenos sobre cultivos, hortalizas o frutas.

ANTECEDENTES

La totalidad de las cosechas agrícolas del mundo son susceptibles a ataques por hongos. Botrytis spp. es un género de hongos fitopatógenos nativos de climas húmedos y por ello afectan principalmente cosechas que dependen de volúmenes grandes de riego o lluvia, pero se ha descrito en literatura que infectan (aunque con menos intensidad) cosechas en todo tipo de climas. Lo anterior representa un serio problema en el ámbito fitosanitario (7). Este problema se ha incrementado en las últimas décadas principalmente debido a la gran demanda de exportaciones de productos frutícolas y de cereales desde los mercados asiáticos. Particularmente, Botrytis cinérea es un hongo fitopatógeno capaz de infectar más de 250 especies vegetales diferentes, entre los cuales se encuentran papas, maíz, legumbres, manzanas, paltas, zanahorias, té, tabaco, tomate, duraznos, peras, lechugas, uvas, cítricos y muchos otros. B. cinérea infecta en promedio un 5% de las cosechas en épocas o zonas áridas, y un 15% en épocas o zonas húmedas, pudiendo llegar a infectar hasta un 40% de las cosechas en instancias de humedad particularmente alta (1 ,2).

Por lo mismo, existen desde hace tiempo centenas de fungicidas sintéticos disponibles en el mercado, pero que han generado grandes daños al medioambiente y la población, incluso seleccionando a los hongos y volviéndolos cada vez más resistentes (3). Adicionalmente, se han usado por muchas décadas composiciones basadas en cobre o azufre, los que, si bien resultan efectivos en el control de hongos fitopatógenos, afectan la composición y microbiota de los suelos e incluso sus residuos presentes en la post-cosecha pueden significar riesgos para la salud de los consumidores (4,5,6).

Esto ha llevado a que surjan soluciones enfocadas en proveer control de los hongos fitopatógenos en cultivos agrícolas sin alterar los suelos y en algunos casos incluso estimulando el sistema inmune vegetal y su crecimiento. Estas soluciones son todas relativamente nuevas y, si bien se encuentran revolucionando el mercado de los fungicidas a nivel mundial, no carecen de desventajas (Tabla 1 ). Tabla 1. de productos fungicidas en el mercado mundial.

De esta manera se obtiene como balance que ia mayoría de las soluciones existentes al problema presentan peligros de impacto ambiental, ya que incluso al ser menos nocivos que los fungicidas sintéticos, su efecto inespecífico altera la microbiota y la composición de los suelos. Además, ninguna de estas soluciones es capaz de eliminar por completo un brote infeccioso, y tienden a tener un mejor efecto de prevención, lo que a su vez lleva a que sea necesario aplicarlos repetidas veces durante el periodo de cosecha, encareciendo los costos por temporada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Placa A: La muestra proviene de un compost maduro desarrollado en la Región Metropolitana, Chile, diluido 1 :200 en agua desionizada; la placa fue incubada a temperatura ambiente durante 3 días. Los resultados muestran un gran crecimiento de microorganismos en el medio M523 agar. Se resalta una colonia con un halo de supresión dé crecimiento microbiológico, la cual fue denominada como C1.

Placa B: La muestra proviene de un compost maduro desarrollado en la Región Metropolitana, Chile, diluido 1 :200 en agua desionizada; esta placa fue incubada a temperatura ambiente durante 3 días. Los resultados muestran un gran crecimiento de microorganismo én el medio M523 agar. Se resalta una colonia con un halo de supresión de crecimiento microbiológico, la cual fue denominada como C2.

Placa C: La muestra proviene de suelo correspondiente a la Región de Valparaíso, Chile, diluido 1 :200 en agua desionizada; la placa fue incubada a temperatura ambiente durante 3 días. Los resultados muestran un gran crecimiento de microorganismos en el medio M523 agar. Se resalta una colonia con un halo de supresión de crecimiento microbiológico, la cual fue denominada como 2PR1.

Figura 2. Análisis de actividad supresora del crecimiento de hongo filamentoso en cepas aisladas desde muestras de suelo. Se evaluó el efecto de las colonias aisladas desde muestras de suelo. C1 corresponde a la colonia aislada desde las muestras de suelo compost 1 ; C2 corresponde a la colonia aislada desde la muestra de suelo compost 2; 2PR1 corresponde a la colonia aislada desde la muestra de suelo. H1 y 1 PA1 son microorganismos aislados desde muestras de suelo que no presentaron colonias con características supresoras del crecimiento microbiológico. Ambas fueron aisladas desde humus y suelo de la Isla de Rapa Nui, Chile, respectivamente.

Figura 3. Efecto del sobrenadante de los medios de cultivo en Botrytis spp. Se observan placas de Botrytis spp. en medio PDA, las cuales fueron sometidas a aspersión de: A: Agua; B: sobrenadante del medio de cultivo de cepa C1 ; C: sobrenadante del medio de cultivo de cepa C2; D: sobrenadante del medio de cultivo de cepa 2PR1.

Figura 4. Análisis del efecto biocontrolador de los sobrenadantes de Botrytis cinérea aislada de muestra de tomate. Un ensayo equivalente a la figura 2, donde se evaluó el efecto de los sobrenadantes de las cepas C1 , C2 y 2PR1 , en el hongo aislado desde tomate. La fila superior corresponde a la imagen de los hongos antes de la aplicación de los sobrenadantes (2 días de cultivo) y la columna derecha el resultado posterior a la aplicación, luego de 5 días adicionales de incubación.

Figura 5. Efecto de las diluciones del sobrenadante de las cepas biocontroladoras de Botrytis spp. Se realizaron pruebas con diluciones desde el concentrado, dilución 1 :5 y 1 :50. Se dejó crecer al hongo por 2 días, posteriormente se le aplico por aspersión cada sobrenadante del cultivo. Luego de 5 días más de incubación se tomaron las imágenes. A: cepa 2PR1 ; B: cepa C1 ; C: cepa C2.

Figura 6. Comparación del efecto del sobrenadante de la cepa 2PR1 sin tratamiento y esterilizados mediante autoclave; y su efecto sobre el hongo aislados de arándano. El hongo fue sembrado y se dejó crecer por 2 días. Posteriormente fue rociado con el sobrenadante sin autoclavar (figura superior) y el esterilizado mediante autoclave (figura inferior). La placa en solitario corresponde al control rociado con agua estéril. La placa A corresponde al tratamiento control (agua estéril), B: efecto del sobrenadante de 2PR1 concentrado, C: efecto del sobrenadante de 2PR1 concentrado autoclavado.

Figura 7. Comparación del efecto de los sobrenadantes de las cepas C1 y C2 sin tratamiento y esterilizados mediante autoclave; y su efecto sobre Botrytis cinérea aislados de arándano. El hongo füe sembrado y se dejó crecer por 2 días. Posteriormente fueron rociados con los sobrenadantes sin autoclavar

(figuras superiores) y los esterilizados mediante autoclave (figuras inferiores). La placa en solitario corresponde al control rociado con agua. La placa A corresponde al tratamiento control (agua estéril), B: efecto del sobrenadante de C1 concentrado, C: efecto del sobrenadante de C2 concentrado, D: efecto del sobrenadante de C1 concentrado autoclavado, E: efecto del sobrenadante de C2 concentrado autoclavado.

Figura 8. Secuencia del amplificado del DNA ribosomal 16S de la cepa C1.

Figura 9. Secuencia del amplificado del DNA ribosomal 16S de la cepa C2.

Figura 10. Secuencia del amplificado del DNA ribosomal 16S de la cepa 2PR1.

Figura 11. Evaluación de la capacidad de biocontrol sobre hongos de las cepas Pseudomonas aeruginosa C1 y C2 respecto a la cepa de colección PA01. Para el desarrollo de este experimento, una muestra de micelio de Botrytis cinérea fue sembrado en el centro de una placa PDA, y en tres posiciones equidistantes se colocaron sensidiscos, sobre los cuales se cargaron 20 uL de una dilución 1 :50 del sobrenadante de Cada uno de los cultivos de Pseudomonas aeruginosa ensayados. La placa se dejó crecer 7 días en condiciones de oscuridad, posterior á lo cual se midió el radio del halo de inhibición generado por cada cepa al desarrollo del micelio de Botrytis cinérea. Figura 12. Evaluación de la capacidad de biocontrol sobre hongos de la cepa Pseudomonas putida 2PR1 respecto a la cepa de colección Pseudomonas putida ATCC 12633. Para el desarrollo de este experimento, una muestra de micelio de Botrytis cinérea fue sembrado en el centro de una placa PDA, y en dos posiciones equidistantes se colocaron sensidiscos, sobre los cuales se cargaron 20 uL de una dilución 1 :50 del sobrenadante del cultivo de Pseudomonas putida ensayado. La placa se dejó crecer 3 días en condiciones de oscuridad, posterior a lo cual se midió el radio del halo de inhibición generado por cada cepa al desarrollo del mjcelio de Botrytis cinérea.

Figura 13. Gráfico que expone las áreas de inhibición del crecimiento de Botrytis cinérea obtenidas a partir dél experimento desarrollado en las Figuras 11 y 12.

Figura 14. Efecto de toxicidad de los sobrenadantes de C1 , C2 y 2PR1 sobre brotes de pepino. Se sembraron semillas esterilizadas de pepino en tierra de hojas. Cada macetero fue tratado con agua destilada, así como el sobrenadante de medio de cultivo de las cepas C1 , C2 y 2PR1 diluido 50 veces. Se aplicaron por aspersión las preparaciones 6 veces sobre los brotes.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La invención consiste en el uso microorganismos, aquí identificados y caracterizados, que son efectivos en el control de hongos fitopatógenos y que no presentan efectos adversos en el desarrollo de especies vegetales. Dentro de los lugares en que se han buscado biocontroladores de hongos fitopatógenos, se cuentan muestras de suelo, frutas no infectadas en un locus de contaminación, muestras de . agua, entre otras. En particular, microorganismos provenientes desde muestras de suelo de diversos orígenes, con parámetros edafológicos y de niveles de materia orgánicas muy diversos. Los microorganismos provienen desde muestras de suelo de las regiones chilenas de Valparaíso, Araucanía, Ñuble y Región Metropolitana, Chile, capaces de suprimir el establecimiento y desarrollo de microorganismos y hongos fitopatógenos.

Los microorganismos con efectos biocontroladores, así como sus cultivos y sobrenadantes, son capaces de suprimir el establecimiento y desarrollo de hongos filamentosos, incluyendo hongos fitopatógenos del género Botrytis spp., dentro del que se encuentra la especie Botrytis cinérea.

Los microorganismos con efectos biocontroladores se seleccionan a su vez del género Pseudomonas spp.

Pseudomonas aeruginosa es una especie de bacteria Gram negativo, aeróbica y motilidad unipolar. Es una bactéria de suelo, que procede numerosos componentes los cuales son responsables para el control de enfermedades. También se han descrito serovares qué tienen actividad patogénica oportunistas en humanos y plantas. En literatura se describen algunas cepas que liberan enzimas como quitinasas, proteasas, celulosas que degradan componentes extracelulares, además de moléculas súpresoras del crecimiento microbiológico como pirrolnitrilo, piolüetorína y fenazina (Dowling y O ^' Gara, 1994; Hass y Défago, 2005; Deshwal y cois, 201 1a; Deshwal y cois, 2011 d). Pseudomonas putida es una especie de bacteria Gram negativo, aeróbica y motilidad unipolar. Es una bacteria de suelo, que procede numerosos componentes los cuales son responsables para el control de enfermedades. También se han descrito serovares que tienen actividad patogénica oportunistas en humanos y plantas. En literatura se describen algunas cepas que liberan enzimas como quitinasas, proteasas, celulosas que degradan componentes extracelulares, además de moléculas supresoras del crecimiento microbiológico como pirrolnitrilo, pioluetorina y fenazina (Dowling y O ^' Gara, 1994; Hass y Défago, 2005; Deshwal y cois, 2011a; Deshwal y cois, 2011 d).

Los microorganismos con efectos biocontroladores pertenecientes al género Pseudomonas spp. se seleccionan del grupo comprendido por Pseudomonas putida 2PR1 , Pseudomonas aeruginosa C1 y Pseudomonas aeruginosa C2, llamados también, para efectos de esta divulgación, 2PR1 , C1 y C2, respectivamente.

Las cepas de Pseudomonas spp. 2PR1 , C1 y C2, fueron a su vez depositadas en la Institución de Depósito Autorizada (IDA) correspondiente a la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM) bajo los códigos RGM2447, RGM2448 y RGM2449, respectivamente, las tres con fecha de 13 de diciembre de

2017.

Ejemplo 1. Método de preparación y análisis microbiológico de las muestras.

La muestra de 10 g suelo se deja secar en una estufa a 25-30°C durante 24 horas. Posteriormente la muestra de suelo es pulverizada en un mortero cerámico procurando obtener una muestra con material particulado lo más fino posible. La pulverización debe realizarse girando la mano e ir machacando la muestra. Se realiza hasta que la tierra quede fina y sin granos. Si hay piedras debe someterse al proceso de colado de tal forma que retenga todo material no pulverizado. Una vez molida la muestra de suelo, se transfiere a un tubo Falcon de 50 mL, y se agregan 30 mL de agua destilada. La mezcla se agita vigorosamente por vortex y se incuba sin agitación por 2 horas a temperatura ambiente, permitiendo la decantación del material sólido. Posterior a lo cual, se generaron distintas diluciones de dichas muestras de suelo, desde 1 :10 hasta 1 :200, tomándose 30 uL de cada una de dichas diluciones las que fueron sembradas en placas de Petri con distintos medios de cultivo, cuya composición se expone en la siguiente Tabla.

Tabla 2. Composición medios de cultivo

Medios Reactivos Concentración

_ (g/L)

MLG Extracto de malta 10

Glucosa 2

_ Agar 15

IPS2 Extracto de levadura 4

(pH 7.2) Extracto de malta 10

Dextrosa 4

_ Agar _ 15

M523 Sacarosa 10

Hidrolizado caseína 8

Extracto de levadura 4

KH2PO4 2

MgSÓ ₄ 0.3

_ Agar _ 15 _

LB Triptona 10

NaCl 10

Extracto de levadura 5

Agar 15 Luego de distintos análisis y comparaciones de crecimiento de microorganismos del suelo en cada- uno de los medios preparados, se concluyó que el medio 523 es donde se desarrollaba una diversidad microbiológica mayor, tanto en número como en complejidad de microorganismos; por cuanto en dicho medio existía la presencia simultánea de bacterias y hongos (levadura y filamentosos), el cual permite desarrollar in situ un análisis de microorganismos supresores del crecimiento microbiológico.

Posteriormente las placas fueron incubadas a temperatura ambiente durante 2-4 días, hasta lograr apreciar colonias supresoras del crecimiento microbiológico en su entorno inmediato. Las primeras muestras analizadas fueron a las del compost, las que ^‘ presentaron colonias microbiológicas con actividad supresora por sobre las otras muestras. Placas representativas de este tipo de análisis se observan eri la Figura 1. Cada una de las colonias que se observó presentaban inhibición del crecimiento microbiológico en su locus de desarrollo, identificadas como Ci , C2 y 2PR1 , fueron seleccionadas y resembradas en al menos 5 pasajes en medio sólido M523 hasta asegurar el correcto aislamiento de las mismas.

Ejemplo 2. Análisis de biocontrol de las cepas aisladas sobre hongos fitopatógenos. Para analizar si las cepas aisladas tenían la capacidad de controlar microorganismos, y particularmente hongos, se sembró una placa de Petri con

2

medio solido M523 con un trozo de micelio de 1 cm . Se añadieron 20 uL de cultivo de las cepas aisladas C1 , C2 y 2PR1 ; además de dos colonias aisladas (H1 y 1 PA1 ) que no demostraron actividad supresora del crecimiento microbiológico.

Como se puede apreciar en la Figura 2, los clones C1 , C2 y 2PR1 generaron halos de supresión del micelio del hongo, mientras que las controles H1 y 1 PA1 fueron superados por el crecimiento de hongos. De este resultado es posible concluir primero que las cepas C1 , C2 y 2PR1 tienen una alta capacidad decontrol de hongos, pero más relevante es que se genera una zona de supresión del crecimiento del micelio, lo que sugiere fuertemente que dichas bacterias podrían estar liberando sustancias al medio extracelular que generan dicho efecto.

Ejemplo 3. Análisis de biocontrol de los sobrenadantes de las cepas aisladas sobre Botrytis.

Se desarrollaron cultivos líquidos de las cepas en medio M523 (15mL), los que fueron incubados durante 16 hr a 30 °C con una agitación de 150 rpm. Posteriormente los cultivos fueron centrifugados a 6000 rpm por 30 minutos, y se recuperó el sobrenadante de cada uno de ellos.

En paralelo una muestra de micelio de hongo aislado desde arándanos fue sembrado y se dejó crecer por 3 días, posterior a lo cual se aplicó por aspersión agua como control negativo, y los sobrenadantes de las cepas C1 , C2 y 2PR1. Se aplicaron 2 aspersiones sobre el micelio de hongos, lo que equivale a la aplicación de aproximadamente 300 uL. Luego de la aspersión de las soluciones, se dejó crecer el hongo pór 5 días a temperatura ambiente y en condiciones de oscuridad, posterior a lo cual se analizó el crecimiento del micelio. Como se observa en la Figura 3, luego de 5 días de incubación los sobrenadantes de las tres cepas ensayadas tuvieron un efecto supresor del crecimiento del micelio del hongo, a diferencia del control con agua, que siguió creciendo; lo que confirma la hipótesis de que dichas cepas liberan a su medio de cultivo moléculas de una naturaleza no determinada que poseen un efecto controlador. Este resultado nos permite concluir además que las cepas C1 , C2 y 2PR1 tienen la capacidad de evitar el establecimiento de una contaminación fúngica, sin embargo surge la pregunta de si el sobrenandante de dichas cepas tiene la capacidad de controlar un hongo ya desarrollado.

Para caracterizar con mayor profundidad el efecto del sobrenandante de las cepas C1 , C2 y 2PR1 , se aplicaron dichos sobrenadantes por aspersión a micelios aislados de muestras de tomáte. Tal como en el caso anterior, se dejó crecer el micelio por dos días, momento en que se tomaron las fotos de la parte superior; y se aplicó por aspersión los sobrenadantes de las cepas a analizar, dejando crecer el micelio por cinco días más, momento en que se tomaron las fotos de la sección inferior de cada tratamiento. Como se puede observar en la Figura 4, cuando se aplicó agua sobre el micelio, este siguió su crecimiento. Sin embargo, cuando se aplicó sobrenandante de las cepas C1 , C2 y 2PR1 se detuvo el crecimiento del micelio, controlando su desarrollo. El siguiente paso en la caracterización de las cepas aisladas, fue analizar si el sobrenadante de los cultivos líquidos tenía un efecto Controlador a menores concentraciones. Para ello se desarrollaron diluciones de los sobrenadantes en agua estéril, los que fueron aplicados por aspersión sobre le micelio del hongo como se ha descrito anteriormente.

Como se puede observar en la Figura 5, los sobrenadantes de las cepas ensayadas aun diluidas 50 veces tienen la capacidad de controlar el desarrollo del micelio del hongo ensayado. Esto implica que a partir del medio de cultivo se puede diluir hasta cincuenta veces en agua para mantener el resultado de biocontrol. Cabe mencionar que cada placa fue aspereado con las diluciones solo una vez, por lo que un tratamiento con aplicación periódica puede dar un resultado altamente efectivo.

El siguiente paso fue evaluar si los metabolitos supresores del crecimiento suspendidos en el sobrenandante de las cepas ensayadas eran resistentes al proceso de esterilización por autoclave. Para ello se crecieron las cepas C1 , C2 y 2PR1 en 100 mi de medio liquido M523, los qué fueron crecidos a saturación por 16 horas a 30°C. Una vez obtenidos dichos cultivos, estos fueron centrifugados por 30 minutos a 6000 rpm, se recuperaron 10 mL de dicho sobrenandantes y el resto fue autoclavado para su esterilización.

Resulta importante destacar en este punto que los sobrenadantes de los cultivos de las cepas C1 , C2 y 2PR1 tienen una coloración verdosa muy intensa, la que luego de autoclavar tomo una tenue coloración café oscuro. De esta manera, se cultivaron hongos obtenidos de arándanos en placas PDA por dos días, momento en el cual se agregaron los sobrenadantes con o sin autoclave por aspersión. Como se puede observar en las Figuras 6 y 7, los sobrenadantes sin autoclavar mantuvieron su capacidad de biocontrolar el micelio del hongo, mientras que los sobrenadantes autoclavados no desarrollaron ningún tipo de control. La explicación más directa a lo anterior es que en los sobrenadantes los metabolitos secundarios presentes que desarrollan el control del hongo son termosensibles. En un momento se mantuvo la idea de que el metabolito podía ser de origen proteico, pero ensayo de extracción de proteínas y su aplicación sobre los hongos demostraron no tener actividad supresora del crecimiento.

Ejemplo 4. Caracterización microbiológica de los microorganismos aislados.

Se prepararon inóculos de 3 ml_ de medio de cultivo M523 para caracterizar los microorganismos aislados que dieron positivo para suprimir el crecimiento de Botrytis cinérea. Para ello se realizó un . análisis morfológico por microscopía óptica y por otra parte mediante biología molecular. El resultado de la tinción Gram evidenció la presencia de bacterias Gram negativo, determinado por su color rosado para todas las muestras. Morfológicamente se presentan células basilares, con ausencia de otras estructuras celulares que permitan determinar visualmente a que bacterias corresponden.

Ejemplo 5. Secuenciación de genes Diana para determinación de especies microbiológicas.

En literatura se han descrito una amplia variedad de genes como dianas moleculares en los estudios taxonómicos o de filogenia en las distintas especies bacterianas, constituyendo el. análisis del ARNr 16S el marcador inicial y en numerosas situaciones puede ayudar en la determinación de una bacteria. Sin embargo, en otras situaciones, la alta homología genética en determinados géneros bacterianos o un reciente cambio en su asignación taxonómica, no permite utilizar el ARNr 16S como blanco para la identificación de especie.

Se propusieron 3 genes para identificar los microorganismos aislados: 1.- ARNr 16S es un polirribonucleotido codificado por el gen rrs o ADN ribosómico ARNr 16S incluido en la subunidad 30S del cromosoma. bacteriano. De distribución universal y componente critico en la función celular, el ARNr 16S actúa como un cronometro molecular al presentar un alto grado de conservación. Se caracteriza por la presencia de regiones variables especie- especifica.

2.- rpoB

La ARN polimerasa es una enzima imprescindible en el proceso de transcripción y constituye la diana final de las diferentes rectas que controlan la expresión génica en los organismos vivos.

En bacterias es responsable de la síntesis de ARNm (mensajero), ARNr (ribosomal), ARNt (transferencia), ARNn (nucleolar) y snRNPs (small ARN). La parte central de la ARN polimerasa (400KDa) está compuesta de 5 subunidades. La subunidad beta, codificada por el gen rpoB, es el principal responsable de la actividad catalítica de la ARN polimerasa. Debido a su distribución universal en las bacterias se sugirió su amplificación como cronometro molecular de alta potencié.

3.- gyrB

Es el gen codificante de una subunidad de la ADN girasa o topoisomerasa II y está implicado en la replicación del ADN bacteriano. De distribución universal, la presencia de una copia de gyrB permite la discriminación e identificación de especies fuertemente relacionadas.

Es un marcador de gran utilidad en la sistemática bacteriana al presentar una tasa de sustituciones sinónimas o silentes que se estima al menos cuatro veces mayor que la ARNr 16S,

La ADN girasa cataliza la interconversión de los isómeros topológicos del ADN. Está formada por dos monómeros de cada Subunidad gyrA y gyrB, codificado por los genes gyrA y gyrB, respectivamente. Interviene en el proceso de transcripción del ADN a través de su actividad de superenrrollamiento, durante el que la subunidad B suministra la energía necesaria para la acción catalítica de la subunidad alfa por hidrólisis deATP. ^'

Se envió a sintetizar partidores para amplificar estos 3 genes. Además, se purifico el ADN genómico de cada muestra, ^' ios cuales serán sustrato para la amplificación mediante PCR para cada gen de interés. Se utilizó la polimerasa Pfu de la empresa Agilent ™ para realizar el proceso de amplificación. A continuación de informa el protocolo de reacción de PCR utilizado

Reacción Reacción

Concentración

Reactivo Stock Recomendada Optimizada final

[uL] [uL],

, Condición de reacción de PCR

Segmento Numero de Temperatura Duración

ciclos [min:seql

1 1 _ 95 02:00

95 00:30

2 30

TM 00:30

72 00:15/1 kb

3 1 72 03:00

4 1 04 oo

Los amplificados obtenidos mediante PCR fueron purificados y enviados a secuenciar a Macrogen USA. Las secuencias obtenidas a partir de los cromatogramas se muestran en las Figuras 8, 9 y 10 para las cepas C1 , C2 y 2PR1 , respectivamente. El análisis de BLAST de los mismos arrojó los siguientes resultados:

Cepa Organismo % de

_ _ _ identidad

En literatura se buscó antecedentes de dicho microorganismo asignado a través de los resultados de secuenciación.

Ejemplo 6. Evaluación del efecto biocontrolador de las cepas aisladas respecto a una cepa de Pseudomonas aeruginosa de colección.

Se quiso evaluar comparativamente la capacidad bioncontroladora de hongos de las cepas de Pseusomonas aeruginosa aisladas respecto a la cepa de colección PA01. Para el desarrollo de este experimento, una muestra de micelio de Botrytis cinérea fue sembrado en el centro de una placa PDA, y en tres posiciones equidistantes se colocaron sensidiscos, sobre los cuales se cargaron 20 uL de una dilución 1 :50 del sobrenadante de cada uno de los cultivos de Pseudomonas aeruginosa ensayados. La placa se dejó crecer 7 días en condiciones de oscuridad, posterior a lo cual se midió el radio del halo de inhibición generado por cada cepa al desarrollo del micelio de Botrytis, y con ese dato se calculó el área de inhibición que generó cada cepa. Este experimento se desarrolló en triplicado, cuyas placas se muestran en la Figura 1 1 , y el gráfico que expone las áreas de inhibición obtenidas se muestra en la Figura 13. Como se desprende de lo observado en las placas, y cuantificado en el gráfico de la Figura 13, las cepas P. aeruginosa C1 y C2 aisladas en el presente trabajo tienen una actividad biocontroladora significativamente superior a la cepa de colección PA01.

Ejemplo 7. Evaluación del efecto biocontrolador de las cepas aisladas respecto a una cepa de Pseudomonas putida de colección ATCC 12633.

Se quiso evaluar comparativamente la capacidad bioncontroladora de hongos de la cepa de Pseusomonas putida aislada respecto a la cepa de colección ATCC 12633. Para el desarrollo de este experimento, una muestra de micelio de Botrytis cinérea fue sembrado en el centro de una placa PDA, y en dos posiciones equidistantes se colocaron sensidiscos, sobre los cuales se cargaron 20 uL de una dilución 1 :50 del sobrenadante del cultivo de Pseudomonas putida ensayado. La placa se dejó crecer 7 días en condiciones de oscuridad, posterior a lo cual se midió el radio del halo de inhibición generado por cada cepa al desarrollo del micelio de Botrytis, y con ese dato se calculó él área de inhibición que generó cada cepa. Este experimento se desarrolló en triplicado, cuyas placas se muestran en la Figura 12, y el gráfico que expone las áreas de inhibición obtenidas se muestra en la Figura 13. Como se desprende de lo observado en las placas, y cuantificado en el gráfico de la Figura 13, la cepa P. putida 2PR1 aislada en el presente trabajo tiene una actividad biocontroladora significativamente superior a la cepa de colección ATCC 12633.

Ejemplo 8. Evaluación preliminar de toxicidad en brotes de pepino.

Un punto importante en el uso de cualquier sistema de biocontrol, es que este sea inocuo para las especies vegetales que busca proteger del ataque de patógenos. Para ello se analizó el efecto de los sobrenadantes de los cultivos de C1 , C2 y 2PR1 sobre el desarrollo temprano de plantas de pepino. Los extractos de medio de cultivo fueron aspereados sobre la tierra 6 veces antes de que aparecieran los brotes. Luego de 10 días post-emergencia se aspersó 3 veces en la tierra y 3 veces sobre los cotiledones. En el día 21 post-emergencia los sobrenadantes de cultivo se aspersaron 3 veces sobre la tierra, 3 veces sobre el haz y 3 veces en el envés de la primera hoja. Las imágenes de las distintas etapas de desarrollo de las plantas de pepino durante el proceso de aspersión son expuestos en la Figura 14. Como se puede observar la aplicación por pulverización de los sobrenadantes no generan ningún tipo de efecto adverso en el crecimiento de la planta BIBLIOGRAFÍA

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