Die vorliegende Erfindung betrifft Mikroorganismen und Verfahren zur Herstellung von mindestens einer schwefelhaltigen Verbindung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von L-Methionin oder L-Cystein in Corynebacterium glutamicum.

Aminosäuren werden als Zusatzstoffe in der Ernährung von Tieren und Menschen zu unterschiedlichen Zwecken verwendet. Beispielsweise wird Glutamat typischerweise als Geschmacksverstärkungsmittel benützt. Methionin ist eine essentielle Aminosäure, die mit der Nahrung aufgenommen werden muss. Sowohl Methionin als auch andere schwefelhaltige Aminosäuren wie Cystein sind nicht nur für die Proteinbiosynthese essentiell, sondern dienen auch als Vorläufer für verschiedene Metabolite wie Glutathion, S-Adenosylmethionin und Biotin und darüber hinaus als Methylgruppen-Donoren in verschiedenen zellulären Prozessen.

Der weltweite Verbrauch von Aminosäuren wird gegenwärtig auf über zwei Millionen Tonnen geschätzt. Der jährliche Bedarf an Aminosäuren wie Glutamat oder Futterzusatzstoffen, die hauptsächlich aus L-Lysin, L-Methionin und L- Threonin bestehen, wird auf mehr als eine Million Tonnen pro Aminosäure geschätzt. Der jährliche Bedarf an Aminosäuren, die in pharmazeutischen Produkten verwendet werden, beträgt alleine 15.000 Tonnen (Kusumoto, I. (2001), J. Nutr., 131. 2552S-2555S).

Während zu Beginn des letzten Jahrhunderts Aminosäuren hauptsächlich chemisch hergestellt oder durch Extraktion gewonnen wurden, erfolgt die Produktion bestimmter Aminosäuren wie z.B. Glutamat mittlerweile hauptsächlich durch Fermentationsverfahren. Dabei haben sich bestimmte Mikroorganismen wie z.B. Escherichia coli und Corynebacterium glutamicum als besonders geeignet zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren erwiesen. Die Herstellung von Aminosäuren durch Fermentation hat insbesondere den Vorteil, dass ausschließlich die natürlich verwendbaren L- Aminosäuren hergestellt werden, wohingegen bei chemischen Synthesen in der Regel ein racemisches Gemisch entsteht, wodurch häufig eine zeitintensiven und kostenträchtigen Aufarbeitung erforderlich wird.

Insbesondere besteht ein Bedarf an sog. schwefelhaltigen Verbindungen wie Methionin, Homocystein, S-Adenosylmethionin, Glutathion, Cystein, Biotin, Thiamin, Liponsäure etc., die in vielen Industriezweigen, einschließlich der Nahrungsmittel-, Futtermittel-, Kosmetik- und pharmazeutischen Industrie verwendet werden. Diese Substanzen, die auch als schwefelhaltige Feinchemikalien bezeichnet werden, umfassen organische Säuren, proteinogene und nicht¬ proteinogene Aminosäuren, Vitamine und Co-Faktoren.

Es wurde versucht, Mikroorganismen wie E. coli und C. glutamicum zur Herstellung der vorstehend genannten schwefelhaltigen Verbindungen einzusetzen. Aufgrund der großen Bedeutung der schwefelhaltigen Verbindungen wurden insbesondere Versuche zur Verbesserung der Herstellungsverfahren dieser Mikroorganismen, z.B. durch fermentationstechnische Maßnahmen, wie Rühren und Versorgung mit Sauerstoff, Zusammensetzung der Nährmedien etc., unternommen.

Daneben wurde versucht, über klassische Stammselektion Mutantenstämme der genannten Mikroorganismen zu entwickeln, die die genannten schwefelhaltigen Verbindungen in wesentlich größerem Maßstab als der jeweilige nicht-mutierte Wildtyp produzieren.

Die Verwendung von Mikroorganismen wie E. coli oder C. glutamicum hat sich dabei insbesondere bei der fermentativen Herstellung im industriellen Großmaßstab von schwefelhaltigen Aminosäuren wie Methionin und Cystein als schwierig erwiesen. Es besteht jedoch ein großer Bedarf gerade an diesen Aminosäuren, da sie unter anderem Vorläuferverbindungen für einige weitere der vorstehend genannten schwefelhaltigen Verbindungen sind.

Der Grund dafür, dass sich die fermentative Herstellung in Mikroorganismen für Methionin und Cystein im industriellen Maßstab bislang nicht als wirtschaftlich interessant erwiesen hat, liegt höchstwahrscheinlich in der Biosynthese bzw. den Stoffwechselwegen, die zur Herstellung von Methionin und Cystein führen. Die Biosynthese von Cystein und Methionin in E. coli ist allgemein bekannt (siehe z.B. Voet und Voet (1995) Biochemistry, John Wiley and Sons, Inc. USA). Die Biosynthese von Methionin und Cystein in Corynebacterium glutamicum ist Gegenstand intensiver Forschung und zuletzt in Rückert et al. (Rückert et al. (2003), J. ofBiotechnology, 104, 213-228) sowie Lee et al. (Lee et al. (2003), Appl. Microbiol. Biotechnol, 62, 459-467) beschrieben worden.

Der Schlüsselschritt in der Biosynthese von Methionin ist der Einbau von Schwefel in das Kohlenstoffgerüst. Bei der Schwefelquelle handelt es sich regelmäßig um Sulfat, das von den Mikroorganismen aufgenommen, aktiviert und reduziert werden muss. Diese Schritte führen zu einem Verbrauch von 7 Mol ATP und 8 Mol NADPH pro Mol Methionin (Neidhardt et al. (1990) Physiology ofthe bacterial cell: a molecular approach, Sunderland, Massachusetts, USA, Sinauer Associates, Inc.). Damit stellt Methionin die Aminosäure dar, deren Herstellung die Zelle am meisten Energie kostet.

Entsprechend sind von den Methionin-herstellenden Mikroorganismen Stoffwechselwege entwickelt worden, die unter einer strikten Regulationskontrolle bezüglich der Herstellung von Methionin, aber auch von Cystein stehen. Dies bedeutet, dass, z.B. durch Feedback-Regulationsmechanismen, die Methionin verwendenden Stoffwechselwege in ihrer Aktivität herunterreguliert werden, wenn die Zelle ausreichend Methionin hergestellt hat.

Dies hat dazu geführt, dass bislang Methionin als einzige Aminosäure im industriellen Maßstab ausschließlich chemisch hergestellt wird, obwohl dies die anschließende Enantiomerentrennung der L- und D-Formen von Methionin erfordert.

Über Methionin-produzierende Varianten von Corynebacterium glutamicum ist daher nur wenig bekannt. Derartige Mutanten wurden bereits 1975 identifiziert (Käse et al. (1975) Agric. Biol. Chem., 39, 153-160). Die dort beschriebenen Stämme sind jedoch für die industrielle Herstellung von Methionin in Mikroorganismen nicht interessant. Verbesserungen wurden seitdem nicht erzielt.

Die Ansätze im Stand der Technik zur Herstellung von Mikroorganismen, die eine erhöhte Produktion von Methionin erlauben, haben sich bislang darauf konzentriert, die Gene, die in den Biosyntheseweg von Methionin und anderen schwefelhaltigen Verbindungen involviert sind, zu identifizieren und dann durch Überexpression oder Repression, je nach der jeweiligen Funktion, der Gene die Produktion an Methionin oder der anderen Verbindungen zu erhöhen.

Solche Versuche sind z.B. in WO 02/10209 beschrieben. Als problematisch hat sich dabei herausgestellt, dass dort die Überexpression bzw. Repression nur einzelner Gene beschrieben wird, um die Herstellung z.B. von Methionin zu erhöhen. Da damit aber in der Regel nur der Kontrollmechanismus für einen Syntheseschritt der Biosynthese z.B. von Methionin ausgeschaltet wird und die anderen Regulationsmechanismen unberührt bleiben, kann auf diese Weise eine erhöhte Produktion von schwefelhaltigen Verbindungen nur in beschränktem Maß erreicht werden (siehe auch Abbildung 3 in Lee et al. vide supra). Durch die Überexpression eines einzelnen Gens, das in die Biosynthese von schwefelhaltigen Verbindungen involviert ist, werden daher in der Regel die oben erwähnten Regulations- mechanismen nicht ausreichend genug entkoppelt. Die zwar erzielten, aber nur geringen Steigerungen des Gehalts an Methionin oder anderen schwefelhaltigen Verbindungen reichen nicht aus, um das Verfahren für die fermentative Herstellung in Mikroorganismen im industriellen Maßstab interessant zu machen.

Dabei tritt bei der Herstellung von schwefelhaltigen Verbindungen wie z.B. Methionin in Mikroorganismen als besonderes Problem auf, dass die Gene des Biosynthesewegs von Methionin über das ringförmige Genom von Mikroorganismen verteilt sein können (siehe Rückert et al., vide suprä). Beispiele für Mikroorganismen mit derart über das Genom verteilten Genen des Biosynthesewegs von Methionin sind u.a. Coryneh acter ium glutamicum, Escherichia coli, Bacillus wie Bacillus subtilis, Serratia wie Serratia marcescens und Salmonella. Die Verteilung der für die Methionin-Biosynthese verantwortlichen Gene kann als ein Hinweis darauf gesehen werden, dass diese Gene z.B. nicht in einem Operon, d.h. in einer gemeinsamen Regulationseinheit organisiert sind. Wäre dies der Fall, könnten z.B. durch Beeinflussung, d.h. Überexpression oder Repression des molekularen Schalters, der dieses Operon reguliert, mehrere Regulationsmechanismen auf einmal entkoppelt werden und so eine effizientere Steigerung der von Mikroorganismen produzierten Methioninmenge erreicht werden. Dass solche Operons grundsätzlich trotz der Verteilung der in der Biosynthese von Methionin involvierten Gene im Genom von Corynebacterium glutamicum existieren können, wurde vor kurzem gezeigt (Rey et al. (2003), J. Biotechnol, 103, 51-65).

Rey et al. konnten zeigen, dass es sich bei dem Protein McbR um einen Transkriptionsrepressor handelt, der die Expression der in die Biosynthese von Methionin involvierten Gene metY (kodierend für O-Acetyl-L- Homoserinsulfhydrylase), metK (kodierend für S-Adenosyl-Methioninsynthetase), hom (kodierend für Homoserindehydrogenase, cysK (kodierend für L-Cysteinsynthase), cysl (kodierend für NADPH-abhängige Sulfidreduktase) sowie ssuD (kodierend für Alkansulfonatmonooxygenase) reguliert. Die vorgenannten Enzyme sind alle in die Biosynthese von Methionin und/oder Cystein involviert und die Autoren konnten entsprechend zeigen, dass in einem Knockout-Stamm von C. glutamicum für McbR erhöhte Mengen an Methionin produziert werden.

Angesichts dieser Ergebnisse besteht ein starkes Interesse daran, weitere Faktoren zu identifizieren, die in die zentrale Regulation der Biosynthesewege für schwefelhaltige Verbindungen in Mikroorganismen involviert sind, da es durch die Überexpression bzw. Repression (je nach Funktion) solcher zentralen Regulationsschalter möglich sein sollte, Mikroorganismen herzustellen, die signifikant erhöhte Mengen an schwefelhaltigen Verbindungen produzieren.

Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mikroorganismen zur Verfügung zu stellen, in denen schwefelhaltige Verbindungen hergestellt werden können.

Insbesondere ist es auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mikroorganismen und Verfahren zur Herstellung von schwefelhaltigen Verbindungen wie Methionin oder Cystein in Mikroorganismen wie E. coli oder Corynebacterium glutamicum zur Verfügung zu stellen, bei denen es durch Ausschalten eines zentralen Regulationselements der Biosynthesewege der schwefel- haltigen Verbindungen ermöglicht wird, signifikant erhöhte Mengen der vorstehend genannten schwefelhaltigen Verbindungen zu erhalten. Darüber hinaus ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Nukleinsäuresequenzen zu identifizieren, die verwendet werden können, um mutierte Organismen herzustellen, die im Vergleich zu ihrem jeweiligen Wildtyp erhöhte Mengen an schwefelhaltigen Verbindungen wie z.B. Methionin und/oder Cystein produzieren.

Diese und weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung, wie sie sich aus der Beschreibung ergeben, werden durch die unabhängigen Ansprüche gelöst.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den Unteransprüchen beschrieben.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte durch einen neuen Selektions- und Mutationsmechanismus in C. glutamicum ein Faktor, nämlich NCgl2640 (Genbank accession number der Entrez-Datenbank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov, SEQ ID No. 1) identifiziert werden, der einen zentralen Regulationsschalter in der Regulation von schwefelhaltigen Verbindungen in C. glutamicum und insbesondere von Methionin darstellt. Da eine Homologie-Suche mit der durch NCgl2640 kodierten Aminosäuresequenz (Genbank accession number: NP_601931, SEQ ID No. 2) mit dem BLAST-Programm am NCBI (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov) ergeben hat, dass mehrere Homologe in verschiedenen anderen Mikroorganismen wie z.B. E. coli bestehen, kann davon ausgegangen werden, dass angesichts der Konservierung von Biosynthesewegen für Aminosäuren und schwefelhaltige Verbindungen insbesondere zwischen den verschiedenen Mikroorganismen dieser Faktor auch in den anderen Mikroorganismen in die zentrale Regulation der Biosynthesewege von schwefelhaltigen Verbindungen involviert ist. Wie im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigt wird, können Mikroorganismen, bei denen der Gehalt und/oder die Aktivität von Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu Nukleinsäuren mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, im Vergleich zum Wildtyp erniedrigt ist, zur Herstellung von schwefelhaltigen Verbindungen verwendet werden.

Daher betrifft ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung einen Mikroorganismus, bei dem im Vergleich zum Wildtyp des Mikroorganismus der Gehalt und/oder die Aktivität von Proteinen erniedrigt ist, die durch Nukleinsäuren kodiert sind, die identisch mit oder funktionell homolog zu Nukleinsäuren mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind. Im folgenden wird dieser Gegenstand der vorliegenden Erfindung auch dadurch beschrieben, dass im Vergleich zum Wildtyp des Mikroorganismus der Gehalt und/oder die Aktivität von Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu Nukleinsäuren mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, erniedrigt ist.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die oben genannten Mikroorganismen, die aufgrund des/der im Vergleich zum Wildtyp erniedrigten Gehalts/ Aktivität von Proteinen, die durch Nukleinsäuren kodiert sind, die identisch mit oder funktionell homolog zu Nukleinsäuren mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, bzw. aufgrund des/der im Vergleich zum Wildtyp erniedrigten Gehalts/ Aktivität von Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu Nukleinsäuren mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, in der Lage sind, schwefelhaltige Verbindungen wie L-Methionin, L-Cystein, L-Homocystein, L-Cystathionin, S-Adenosyl-L-Methionin, Glutathion, Biotin, Thiamin und/oder Liponsäure, bevorzugt L-Methionin und/oder L-Cystein herzustellen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Mikroorganismen, bei denen im Vergleich zum Wildtyp der Gehalt und/oder die Aktivität von Proteinen, die durch Nukleinsäuren kodiert sind, die identisch mit oder funktionell homolog zu Nukleinsäuren mit der Sequenz SEQ ID No 1 sind, durch Disruption und/oder Deletion der entsprechenden genomischen Nukleinsequenz(en) erniedrigt worden ist.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Mikroorganismen, bei denen im Vergleich zum Wildtyp der Gehalt und/oder die Aktivität der Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu Nukleinsäuren mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, bzw. der Gehalt und/oder die Aktivität der durch diese Nukleinsäuren kodierten Proteine dadurch erniedrigt worden ist, dass in die genomischen Nukleinsäuresequenzen Mutationen eingeführt sind, die zur Expression von nicht-funktionellen Formen der durch die vorstehend genannten Nukleinsäuren kodierten Proteine fuhren.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Mikroorganismen, bei denen im Vergleich zum Wildtyp der Gehalt und/oder die Aktivität der Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu Nukleinsäuren mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, durch Antisense- Verfahren, durch Expression eines Ribozyms, das für die mRNA dieser Nukleinsäuren spezifisch ist, oder durch Expression von Ribonuklease-P-Konstrukten erniedrigt worden ist.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Mikroorganismen, bei denen im Vergleich zum Wildtyp der Gehalt und/oder die Aktivität der Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu Nukleinsäuren mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, bzw. der Gehalt und/oder die Aktivität der durch diese Nukleinsäuren kodierten Proteine dadurch erniedrigt worden ist, dass rekombinante Antikörper in den Mikroorganismen exprimiert werden, die für die durch die Nukleinsäuren kodierten Proteine spezifisch sind und deren Aktivität blockieren bzw. inhibieren. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Mikroorganismen, bei denen im Vergleich zum Wildtyp der Gehalt und/oder die Aktivität der Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu Nukleinsäuren mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, bzw. der Gehalt und/oder die Aktivität der durch diese Nukleinsäuren kodierten Proteine dadurch erniedrigt worden ist, dass eine nicht¬ funktionelle Form der durch die Nukleinsäuren kodierten Proteine in den Zellen überexprimiert wird.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Mikroorganismen, bei denen im Vergleich zum Wildtyp zusätzlich zu der Erniedrigung des Gehalts und/oder der Aktivität der Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu Nukleinsäuren mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, bzw. der Erniedrigung des Gehalts und/oder der Aktivität der durch diese Nukleinsäuren kodierten Proteine der Gehalt und/oder die Aktivität von Nukleinsäuren, die für McbR aus C. glutamicum oder Homologe davon kodieren, erniedrigt worden ist.

Ein Gegenstand der Erfindung betrifft somit Mikroorganismen, bei denen im Vergleich zum Wildtyp zusätzlich der Gehalt und/oder die Aktivität von Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu Nukleinsäuren mit der Sequenz SEQ ID No. 3 sind, bzw. der Gehalt und/oder die Aktivität von Proteinen, die zu Proteinen mit der Sequenz SEQ ID No. 4 identisch oder funktionell homolog sind, erniedrigt worden ist. Die Erniedrigung des Gehalts oder der Aktivität kann dabei in gleicher Weise wie vorstehend beschrieben erfolgen.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Mikroorganismen betrifft Mikroorganismen, bei denen die Expression der vorgenannten Nukleinsäuresequenzen bzw. dadurch kodierten Proteine im Wesentlichen vollständig unterdrückt ist.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Mikroorganismen, bei denen im Vergleich zum Wildtyp neben der Erniedrigung des Gehalts und/oder der Aktivität der Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu Nukleinsäuren mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, bzw. der dadurch kodierten Proteine, der Gehalt und/oder die Aktivität mindestens einer weiteren Nukleinsäure, die für ein Genprodukt des Biosynthesewegs der gewünschten schwefelhaltigen Verbindung kodiert, erhöht ist. In solchen Mikroorganismen können die letztgenannten Nukleinsäuren auch derart mutiert sein, dass das durch die Nukleinsäure kodierte Protein durch Stoffwechselmetabolite nicht in seiner Aktivität beeinflusst wird. In diesen Mikroorganismen können der Gehalt und/oder die Aktivität an McbR aus C. glutamicum bzw. an Homologen wie oben erwähnt dazu erniedrigt sein.

In gleicher Weise betrifft ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung Mikroorganismen, in denen neben der Erniedrigung des Gehalts und/oder der Aktivität von Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu Nukleinsäuren mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, bzw. von dadurch kodierten Proteinen zusätzlich der Gehalt und/oder die Aktivität mindestens einer weiteren Nukleinsäure, die für ein Genprodukt des Biosynthesewegs der gewünschten schwefelhaltigen Verbindung kodiert, im Vergleich zum Wildtyp erniedrigt ist. In diesen Mikroorganismen können der Gehalt und/oder die Aktivität an McbR aus C. glutamicum bzw. an Homologen wie oben erwähnt dazu erniedrigt sein.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von schwefelhaltigen Verbindungen in Mikroorganismen, die das Kultivieren eines erfindungsgemäßen Mikroorganismus umfassen. Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von L-Methionin und/oder L-Cystein benutzt dabei den Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum, bei dem der Gehalt und/oder die Aktivität von Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu Nukleinsäuren mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, bzw. der durch diese Nukleinsäuren kodierten Proteine im Vergleich zum Wildtyp erniedrigt wird.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Methionin und/oder L-Cystein unter Verwendung von Mikroorganismen, in dem zusätzlich zu der Erniedrigung des Gehalts und/oder der Aktivität der Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu Nukleinsäuren mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, bzw. der durch diese Nukleinsäuren kodierten Proteine der Gehalt und/oder die Aktivität von weiteren oben genannten Nukleinsäuren in der beschriebenen Weise erhöht oder erniedrigt ist.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der oben genannten Nukleinsäuren zur Herstellung von Mikroorganismen, die zur Herstellung von schwefelhaltigen Verbindungen verwendet werden können.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte ein neuer Regulator der Methionin- Biosynthese in C. glutamicum identifiziert werden. Dies wurde durch Anwendung einer neuartigen Selektions- und Mutationsstrategie möglich, die sich signifikant von den früher im Stand der Technik unternommenen Versuchen zur Identifizierung von Methionin-überproduzierenden C. glutamicum-St&mmen unterscheidet (siehe Beispiele).

Dabei konnte im Rahmen der vorliegenden Erfindung erstmals gezeigt werden, dass die Nukleinsäuresequenz mit der SEQ ID No. 1 (Genbank accession number: NCgl2640) für ein Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID No. 2 (Genbank accession number: NP_601931) kodiert, das aktiv in die Regulation des Biosynthesewegs von Methionin in C. glutamicum involviert ist. Weiterhin konnte im Rahmen der vorliegenden Erfindung erstmals gezeigt werden, dass bei Deletion bzw. funktioneller Disruption der Nukleinsäuresequenz mit der SEQ ID No. 1 in C. glutamicum Stämme erhalten werden, die aufgrund der ausgeschalteten Regulation des durch die SEQ ID No. 1 kodierten Proteins Methionin in verstärktem Maße produzieren.

Eine BLAST-Recherche am NCBI zeigte, dass Homologe zu NCgl2640 aus C. glutamicum in verschiedensten Mikroorganismen existieren. Da die Biosynthesewege für schwefelhaltige Verbindungen in verschiedensten Organismen konserviert sind, wird davon ausgegangen, dass Mikroorganismen, in denen im Vergleich zum Wildtyp der Gehalt und/oder die Aktivität von Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, erniedrigt ist, ebenfalls in der Lage sind, Methionin und/oder andere schwefelhaltige Verbindungen wie Cysteinϊn verstärktem Maße zu produzieren.

Unter NCgl2640 wird erfindungsgemäß ein Nukleinsäuremolekül mit der SEQ ID No. 1 verstanden. Das durch ein solches Nukleinsäuremolekül kodierte Protein hat die Sequenz SEQ ID No. 2.

Unter funktionellen Homologen zu der Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 bzw. dem Protein mit der Aminosäuresequenz No. 2 werden erfindungsgemäß solche Nukleinsäuremoleküle bzw. Proteine verstanden, deren Sequenz eine signifikante Homologie zu der Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 bzw. dem Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID No. 2 aufweisen. Unter dem Gehalt an NCgl2640 bzw. dem Gehalt an Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, wird erfmdungsgemäß die Menge an diesen Nukleinsäuren bzw. an den durch diese Nukleinsäuren kodierten Proteinen verstanden, wie sie für den entsprechenden Mikroorganismus bestimmt werden kann.

Unter der Aktivität von NCgl2640 bzw. von Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, wird erfindungsgemäß die zelluläre Aktivität der durch diese Nukleinsäuresequenzen kodierten Proteine verstanden. Die zelluläre Funktion von Proteinen, die durch Nukleinsäuren kodiert sind, die identisch mit oder funktionell homolog zu einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, ist in der Regulation der Biosynthese von schwefelhaltigen Verbindungen und insbesondere Methionin zu sehen. Ob eine zu den Nukleinsäuren mit den Sequenzen SEQ ID No. 1 und 2 homologe Nukleinsäure über die gleiche Aktivität wie die Nukleinsäure mit den Sequenzen SEQ ID No. 1 bzw. 2 in C. glutamicum verfugen, kann in einfacher Weise bestimmt werden. Dazu wird in den entsprechenden Mikroorganismen die entsprechende genomische Nukleinsäuresequenz deletiert und ermittelt, ob der Mikroorganismus trotz Zugabe des Strukturanalogons von Methionin wie z.B. D ,L- Ethionin noch in der Lage ist, Methionin oder andere schwefelhaltige Verbindungen zu produzieren.

Unter einem gegenüber dem Wildtyp veränderten Gehalt an Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, wird erfindungsgemäß eine im Vergleich zum Wildtyp erniedrigte Menge an diesen Nukleinsäuren bzw. an den durch diese Nukleinsäure kodierten Proteinen verstanden. Die Erniedrigung der Menge an diesen Nukleinsäuren bzw. an den durch diese Nukleinsäure kodierten Proteinen wird im Allgemeinen durch eine Erniedrigung des Gehalts an den endogenen Nukleinsäuren, bei denen es sich entweder um Nukleinsäuren mit der Sequenz SEQ ID No. 1 oder dazu funktionell homologe Nukleinsäuren handelt, erzielt.

Unter einem Wildtyp wird erfindungsgemäß der entsprechende, nicht genetisch veränderte Ausgangsorganismus verstanden.

Die Erniedrigung der Aktivität der Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, bzw. der durch diese Nukleinsäuren kodierten Proteine kann durch eine Erniedrigung der Menge bzw. des Gehalts der endogenen Nukleinsäuren bzw. der endogenen durch diese Nukleinsäuren kodierten Proteine erzielt werden. Daneben wird erfindungsgemäß unter der Erniedrigung der Aktivität an den genannten Nukleinsäuren bzw. den durch diese Nukleinsäuren kodierten Proteine verstanden, dass die Aktivität an endogenen Nukleinsäuren bzw. an durch diese endogenen Nukleinsäuren kodierten Proteinen unverändert bleibt, aber die Interaktion der durch die Nukleinsäuren kodierten Proteine mit ihren zellulären Bindungspartnern z.B. durch die Expression nicht funktioneller Formen von NP_601931 bzw. Homologen davon oder dafür spezifischen Antikörpern signifikant inhibiert wird.

Vorzugsweise beträgt die in den erfindungsgemäßen Mikroorganismen auftretende Erniedrigung des Gehalts und/oder der Aktivität an Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, bzw. an den durch diese Nukleinsäuren kodierten Proteine mindestens 5%, bevorzugt mindestens 10%, besonders bevorzugt mindestens 20%, ebenfalls besonders bevorzugt mindestens 40%, ebenfalls besonders bevorzugt mindestens 60%, insbesondere bevorzugt mindestens 80%, ebenfalls insbesondere bevorzugt mindestens 90%, ebenfalls insbesondere bevorzugt mindestens 95%, ebenfalls insbesondere bevorzugt mindestens 98% und am meisten bevorzugt 100%.

Der Begriff Repression der Expression von Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, bzw. von durch diese Nukleinsäuren kodierten Proteinen ist erfϊndungsgemäß synonym mit dem Begriff der Erniedrigung des Gehalts und/oder der Aktivität an diesen Nukleinsäuren bzw. an durch diese Nukleinsäuren kodierten Proteinen.

Wie bereits vorstehend angesprochen wurde, konnten durch eine BLAST- Analyse am NCBI Homologe von NCgl2640 in verschiedensten Organismen identifiziert werden. Da in Zukunft zunehmend weitere Sequenzdaten für unterschiedlichste Mikroorganismen zur Verfügung stehen werden, schließt die vorliegende Erfindung auch solche Mikroorganismen ein, in denen Nukleinsäuren bzw. dadurch kodierte Proteine bezüglich ihres Gehalts und/oder der Aktivität im Vergleich zum Wildtyp erniedrigt sind, sofern diese Nukleinsäuren bzw. die durch diese Nukleinsäuresequenzen kodierten Aminosäuresequenzen eine signifikante oder wesentliche Sequenzhomologie zu den Nukleinsäuren mit der Sequenz SEQ ID No. 1 bzw. Proteinen mit der Sequenz SEQ ID No. 2 zeigen.

Unter Identität zwischen zwei Nukleinsäuren bzw. Proteinen wird die Identität der Nukleinsäuresequenzen bzw. Aminosäursequenzen über einen bestimmten Sequenzbereich verstanden, vorzugsweise die gesamte Sequenzlänge, insbesondere die Identität, die durch Vergleich mit Hilfe der Lasergene-Software der Firma DNA Star Inc., Madison, Wisconsin (USA) unter Anwendung der CLUSTAL-Methode (Higgins et al, (1989), Comput. Appl. Biosci., 5 (2), 151) berechnet wird. Homologien können ebenfalls mit Hilfe der Lasergene-Software der Firma DNA Star Inc, Madison, Wisconsin (USA) unter Anwendung der CLUSTAL-Methode (Higgins et al, 1989), Comput. Appl. Biosci., 5 (2), 151) berechnet werden.

Nukleinsäuremoleküle sind identisch, wenn sie gleiche Nukleotide in gleicher 5 '-3'- Reihenfolge aufweisen.

Aminosäuremoleküle sind identisch, wenn sie von N- zum C-Terminus gleiche Aminosäuren in gleicher Reihenfolge aufweisen.

Unter signifikanter bzw. wesentlicher Sequenzhomologie wird erfindungsgemäß allgemein verstanden, dass die Nukleinsäuresequenz eines DNA-Moleküls bzw. die Aminosäuresequenz eines Proteins zu mindestens 30%, bevorzugt zu mindestens 40%, ebenfalls bevorzugt zu mindestens 50%, weiter bevorzugt zu mindestens 60% oder zu mindestens 70%, besonders bevorzugt zu mindestens 90%, insbesondere bevorzugt zu mindestens 95% und am meisten bevorzugt zu mindestens 98% zu den Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenzen SEQ ID No. 1 bzw. SEQ ID No. 2 oder deren funktionell äquivalenten Teilen identisch ist. Vorzugsweise wird die Homologie über die gesamte Sequenzlänge von SEQ ID No.1 bzw. SEQ ID No. 2 bestimmt.

Vorzugsweise wird die Homologie somit über den gesamten Aminosäure- bzw. Nukleinsäuresequenzbereich berechnet. Neben den oben genannten Programmen stehen dem Fachmann für den Vergleich verschiedener Sequenzen noch weitere Programme zur Verfügung, die auf verschiedenen Algorithmen beruhen. Dabei liefern die Algorithmen von Needleman und Wunsch oder Smith und Waterman besonders zuverlässige Ergebnisse. Für die Sequenzvergleiche kann z.B. auch das Programm PiIe Aupa verwendet werden (J. Mol. Evolution. (1987), 25, 351-360; Higgins et al., (1989) Cabgos, 5, 151-153) oder die Programme Gap und Best Fit (Needleman und Wunsch, (1970), J. Mol. Biol, 48, 443-453 sowie Smith und Waterman (1981), Adv., Appl. Math., 2, 482-489), die im GCG-Software-Paket der Genetics Computer Group (575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) enthalten sind.

Unter signifikanter oder wesentlicher Homologie bzw. Sequenzhomologie wird auch verstanden, dass diese Sequenzen funktionell homolog zu den Sequenzen mit den SEQ ID No. 1 und 2 sind.

Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der vorstehend genannten Nukleinsäuren zur Herstellung von Mikroorganismen, die in der Lage sind, im Vergleich zum Wildtyp erhöhte Mengen an schwefelhaltigen Verbindungen und insbesondere an Methionin und/oder Cystein zu produzieren. Dabei ist dem Fachmann klar, dass er zur Herstellung eines Mikroorganismus, der in der Lage ist, erhöhte Mengen an schwefelhaltigen Verbindungen zu produzieren, jeweils den Gehalt bzw. die Aktivität der Nukleinsäure im Vergleich zum Wildtyp reduzieren wird, die in dem jeweiligen Organismus dem funktionellen Homolog zu NCgl2640 aus C. glutamicum entspricht.

DNA-Sequenzen mit einer hohen Homologie, d.h. einer hohen Ähnlichkeit oder Identität sind bonafide Kandidaten für DNA-Sequenzen, die den Sequenzen SEQ ID No. 1 der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren entsprechen. Diese Gensequenzen können durch Standardmethoden, wie z.B. PCR und Hybridisierung isoliert werden, und ihre Funktion kann durch entsprechende Enzymaktivitätstests und andere Experimente durch den Fachmann bestimmt werden. Homologievergleiche mit DNA-Sequenzen können erfindungsgemäß auch verwendet werden, um PCR-Primer zu entwickeln, indem zunächst die Regionen identifiziert werden, die in den DNA- Sequenzen von verschiedenen Organismen am meisten konserviert sind. Solche PCR-Primer können dann benutzt werden, um in einem ersten Schritt DNA- Fragmente zu isolieren, die Bestandteile von Nukleinsäuren sind, die zu den Nukleinsäuren der Erfindung homolog sind.

Es gibt eine Reihe von Suchmaschinen, die für solche Homologievergleiche bzw. -suchen verwendet werden können. Diese Suchmaschinen umfassen z.B. die CLUSTAL-Programmgruppe des BLAST-Programms, das durch das NCBI zur Verfugung gestellt wird.

Darüber hinaus ist dem Fachmann eine Reihe von experimentellen Methoden bekannt, mit denen DNA-Sequenzen aus verschiedensten Organismen isoliert werden können, die zu den erfmdungsgemäßen Sequenzen homolog sind. Dazu gehört z.B. das Anfertigen und Screenen von cDNA-Bibliotheken mit entsprechend degenerierten Sonden.

Bei zur SEQ ID No. 2 homologen Sequenzen kann es sich z.B. um Sequenzen handeln, die für die folgenden Proteine kodieren: NP_601931.1; NP_739184.1; NP_940366.1 ; NP_962856.1 ; ZP_00226250.1 ; NP_214947.1 ; NP_334857.1 ; ZP_00058595.1; NP_925240.1; NP_969100.1; ZP_00019148.1; ZP_00199594.1; ZPJ)OO 15952.1; ZPJ)0160492. l; NP_770404.1; NP_866130.1; ZP_00026378.1; NP_280238.1; ZP_00029745.1; ZP_00226340.1; NP_882643.1; NP_459575.1; NP_879442.1; ZP_00213193.1; ZP_00221250.1; NP_806026.1; NP_521417.1; NP_455160.1; ZPJ)0185946.2; ZP_00203540.1; NP_415113.1; NP_752598.1; NP_286306.1; NP_902574.1; ZP_00052011.1; NP_706431.1; NP_822174.1; NP_745396.1 ; NP_739496.1 (bei den Nummern handelt es sich jeweils um Genbank accession numbers). Wie bereits erwähnt, kann die Änderung des Gehalts und/oder der Aktivität von an Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, bzw. von Proteinen, die durch diese Nukleinsäuren kodiert werden, auf verschiedene Weise erfolgen. Die Erniedrigung der Aktivität bzw. des Gehalts kann z.B. durch Ausschalten von stimulierenden Regulationsmechanismen auf Transkriptions-, Translations- und/oder Proteinebene oder durch Erniedrigung der Genexpression der jeweiligen Nukleinsäuren erfolgen.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Expression der jeweiligen genomischen Sequenzen reduziert sein. Bevorzugt wird es sich um Mikroorganismen handeln, in denen die genomischen Sequenzen für die Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, inaktiviert sind. Eine Inaktivierung dieser genomischen Sequenzen kann auf verschiedene Weisen erfolgen. Eine Möglichkeit ist es, die genomischen Sequenzen durch homologe Rekombination zu deletieren. Eine andere Möglichkeit ist es, in die genomischen Sequenzen Insertionen einzuführen, die wiederum die Expression der Nukleinsäuren verhindern bzw. zu nicht funktionellen Proteinen fuhren.

Unter nicht funktionellen Proteinen werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung solche Proteine bzw. Proteinfragmente verstanden, bei denen durch Punktmutationen, Insertionen oder Deletionen die Struktur und damit die Funktion des Proteins mit der Aminosäuresequenz SEQ ID No. 2 bzw. der Proteine, die dazu funktionell homolog sind, derart verändert wird, dass diese Proteine nicht mehr als zentrale Regulationsschalter in den Biosynthesewegen von schwefelhaltigen Verbindungen und insbesondere Methionin fungieren.

Ob durch die Einführung von Insertion, Deletion oder Mutation in die genomischen Sequenzen von Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, nicht-funktionelle Proteine bzw. Proteinfragmente erhalten werden, kann in einfacher Weise ermittelt werden. Dazu werden die Mikroorganismen, die die mutmaßlichen nicht-funktionellen Proteine bzw. Proteinfragmente exprimieren, daraufhin getestet, ob sie in Anwesenheit von Methionin-Strukturanaloga wie z.B. D, L-Ethionin in der Lage sind zu wachsen. Ist dies der Fall, handelt es sich um nicht-funktionelle Proteine bzw. Proteinfragmente.

Die Reduktion der Expression der genomischen Sequenzen, die zur SEQ ID No. 1 identisch bzw. funktionell homolog sind, durch Deletion der genomischen Sequenzen bzw. durch Einfuhren von Mutationen, Insertionen oder Deletionen, die zur nicht¬ funktionellen Proteinen bzw. Proteinfragmenten fuhren, wird im Allgemeinen als funktionelle Disruption der genomischen Sequenzen bezeichnet.

Die Deletion bzw. funktionelle Disruption von genomischen Segmenten durch homologe Rekombination kann dabei durch ein Verfahren umfassend die folgenden Schritte erfolgen:

a) Herstellen eines Vektors umfassend folgende Nukleinsäuresequenzen in 5 ' -3 ' -Orientierung: - eine in Mikroorganismen funktionelle Promotorsequenz, - operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die identisch oder homolog zu dem 5 '-Ende der Nukleinsäuresequenz ist, die zu der Sequenz mit der SEQ ID No. 1 identisch oder funktionelle homolog ist, - operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die für ein Resistenzgen kodiert, operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die identisch oder homolog zu dem 3 '-Ende der Nukleinsäuresequenz ist, die zu der Sequenz mit der SEQ ID No. 1 identisch oder funktionell homolog ist, operativ daran gebunden eine in Mikroorganismen funkionelle Terminationssequenz; und b) Übertragen des Vektors aus a) in den Mikroorganismus und gegebenenfalls Intergrieren des Vektors in dessen Genom.

Eine Möglichkeit zur homologen Rekombination kann den nachstehend dargestellten Beispielen entnommen werden. Dem Fachmann ist bekannt, dass für eine solche homologe Rekombination als Vektoren übliche Plasmide verwendet werden können, wie sie z.B. zur Überexpression von Nukleinsäuresequenzen in Mikroorganismen bekannt sind. Als Resistenzgene werden typischerweise Resistenzen für Antibiotika verwendet werden (siehe unten).

Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Beispiele für operativ verknüpfbare Sequenzen sind Aktivierungssequenzen, Enhancer und dergleichen. Weitere regulative Elemente umfassen selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Sollen in die genomischen Sequenzen Punktmutationen, Insertionen oder Deletionen eingeführt werden, die zu nicht-funktionellen Proteinen bzw. Proteinfragmenten führen, geschieht dies üblicherweise anhand von Techniken, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind (siehe u.a. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2001), 3. Auflage, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, USA sowie die sog. Quikchange Mutagenese-Methode von Stratagene, La Jolla, USA). Weitere Verfahren zur Einfuhrung von Punktmutationen, Insertionen oder Deletionen in genomische Sequenzen von Mikroorganismen sind u.a. in Jäger et al., (1992) J. Bacteriol. 174, 5462-5465 und WO 02/070685 beschrieben.

Weitere Möglichkeiten zur Reduktion des Gehalts und/oder der Aktivität der vorstehend genannten Nukleinsäuren kann z.B. durch eine Antisense-Strategie erfolgen. Dazu kann z.B. ein Verfahren verwendet werden, das die folgenden Schritte umfasst:

a) Herstellen eines Vektors, umfassend folgende Nukleinsäuresequenzen in 5 '-3 '-Orientierung: eine in dem jeweiligen Mikroorganismus funktionelle Promotersequenz, operativ daran gebunden eine antisense-Sequenz zu SEQ ID No.1 oder einem funktionellen Homologen davon, operativ daran gebunden eine in dem jeweiligen Mirkoorganismus funktionelle Terminationssequenz; und b) Übertragen des Vektors aus a) auf den Mikrooganismus und gegebenenfalls Integrieren des Vektors in dessen Genom.

Bei einer weiteren Ausfuhrungsform werden zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mikroorganismen Vektoren verwendet, die eine DNA-Sequenz enthalten, die für ein Ribozym kodiert, das spezifisch die mRNA der Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, erkennt. Dem Fachmann ist bekannt, wie Ribozyme, die gegen eine bestimmte mRNA gerichtete Endonukleaseaktivität besitzen, hergestellt werden können. Im Detail ist dies z.B. in Steineke et al., (Steineke et al. (1992) EMBO J., 11, 1525) beschrieben. Im Rahmen dieser Erfindung sind mit dem Begriff Ribozym auch solche RNA-Sequenzen gemeint, die neben dem eigentlichen Ribozym noch Führungssequenzen umfassen, die zu der mRNA der Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, komplementär sind und so das mRNA-spezifische Ribozym noch gezielter zum mRNA-Substrat des Ribozyms geführt wird.

Ein solches Verfahren umfasst z.B. die folgenden Schritte:

a) Herstellen eines Vektors, umfassend folgende Nukleinsäuresequenzen in 5 '-3 '-Orientierung: - eine in dem jeweiligen Mikroorganismus funktionelle Promotersequenz, - operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die für ein Ribozym kodiert, das spezifisch die mRNA einer Nukleinsäure der SEQ ID No. 1 oder deren funktionellen Homologen erkennt, operativ daran gebunden eine in dem jeweiligen Mirkoorganismus funktionelle Terminationssequenz; und b) Übertragen des Vektors aus a) auf den Mikrooganismus und gegebenenfalls Integrieren des Vektors in dessen Genom.

Eine weitere Alternative zur Herstellung von erfindungsgemäßen Mikroorganismen bietet die Übertragung von Nukleinsäuren durch Vektoren, die eine DNA-Sequenz bestehend aus Antisense-Sequenzen der Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, sowie eine für RNAse P kodierende Sequenz umfassen. Bei der Transkription solcher Vektoren entstehen in der Zelle RNA-Moleküle, die über eine Führungssequenz (die Antisense-Sequenz) verfügen, welche die RNAse P zur mRNA der Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, führt, wodurch die Spaltung der mRNA durch RNAse P bewirkt wird (siehe auch US-Patent Nr. 5,168,053). Vorzugsweise umfasst die Führungssequenz 10 bis 15 Nukleotide, die zur DNA- Sequenz der Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, komplementär sind.

Ein solches Verfahren kann z.B. die folgenden Schritte umfassen:

a) Herstellung eines Vektors, umfassend folgende Nukleinsäuresequenzen in 5 '-3 '-Orientierung: - eine in dem jeweiligen Mikroorganismus funktionelle Promotersequenz, - operativ daran gebunden eine Nukleinsäuresequenz, die zur Sequenz SEQ ID No. 1 oder einem funktionellen Homologen davon bzw. Teilen davon komplementär ist, - operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die für Ribonuklease P kodiert, - operativ daran gebunden eine in dem jeweiligen Mirkoorganismus funktionelle Terminationssequenz; und b) Übertragen des Vektors aus a) auf den Mikrooganismus und gegebenenfalls Integrieren des Vektors in dessen Genom.

Mit dem Begriff Komplementarität wird die Fähigkeit eines Nukleinsäuremoleküls beschrieben, mit einem anderen Nukleinsäuremolekül aufgrund von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basen zu hybridisieren. Dem Fachmann ist bekannt, dass zwei Nukleinsäuremoleküle nicht über eine 100%ige Komplementarität verfügen müssen, um miteinander hybridisieren zu können. Vorzugsweise ist eine Nukleinsäure, die mit einer anderen Nukleinsäure hybridisieren soll, zu dieser zu mindestens 40%, bevorzugt zu mindestens 50%, ebenfalls bevorzugt zu mindestens 60% oder zu mindestens 70%, besonders bevorzugt zu mindestens 80%, ebenfalls besonders bevorzugt zu mindestens 90%, insbesondere bevorzugt zu mindestens 95% und am meisten bevorzugt zu mindestens 98% bzw. 100% komplementär.

Bevorzugt sind Komplementaritätsgrade wie Homologie und Identitätsgrade über die gesamte Protein- bzw. Nukleinsäurelänge zu bestimmen.

Stringente in v/tro-Hybridisierungsbedingungen sind dem Fachmann bekannt und können der Literatur entnommen werden (siehe z.B. Sambrook et al., vide suprä). Der Begriff spezifische Hybridisierung bezieht sich auf den Umstand, dass ein Molekül unter stringenten Bedingungen präferentiell an eine Nukleinsäure mit einer bestimmten Nukleinsäuresequenz bindet, wenn diese Nukleinsäure mit der bestimmten Nukleinsäuresequenz Teil einer komplexen Mischung von z.B. DNA- oder RNA-Molekülen ist.

Der Begriff stringente Bedingungen bezieht sich damit auf Bedingungen, unter denen eine Nukleinsäuren präferentiell an eine Nukleinsäure mit einer Zielsequenz bindet, aber nicht oder zumindest wesentlich reduziert an Nukleinsäuren mit anderen Sequenzen.

Stringente Bedingungen sind von den Umständen abhängig. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Generell werden stringente Bedingungen so gewählt, dass die Hybridisierungstemperatur circa 5°C unter dem Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten ionischen Stärke und einem definierten pH- Wert liegt. Tm ist die Temperatur (bei einem definierten pH- Wert, einer definierten ionischen Stärke und einer definierten Nukleinsäurekonzentration), bei der 50% der Moleküle, die zu einer Zielsequenz komplementär sind, mit dieser Zielsequenz hybridisieren. Typischerweise umfassen stringente Bedingungen Salzkonzentrationen zwischen 0,01 und 1,0 M Natriumionen (oder eines anderen Salzes) und/oder einen pH zwischen 7,0 und 8,3. Die Temperatur beträgt mindestens 30°C für kurze Moleküle, z.B. für solche, die zwischen 10 bis 50 Nukleotiden umfassen. Zusätzlich können stringente Bedingungen die Zugabe von destabilisierenden Agenzien wie z.B. Formamid umfassen.

Typische Hybridisierungs- und Waschpuffer haben folgende Zusammensetzung.

Prähybridisierungslösung: 0,5 % SDS 5 x SSC 5O mM NaPO4, pH 6,8 0,1% Na-Pyrophosphat 5 x Denhardt's Reagenz 100 μg/ml Lachssperm

Hybridisierungslösung: Prähybridisierungslösung 1 x 106 cpm/ml Sonde (5 bis 10 min 95°C)

20 x SSC: 3 M NaCl 0,3 M Natriumeitrat ad pH 7 mit HCl

50 x Denhardt's Reagenz: 5 g Ficoll 5 g Polyvinylpyrrolidon 5 g Bovine Serum Albumine ad 500 ml A. dest.

Eine Hybridisierung wird üblicherweise folgendermaßen durchgeführt:

Optional: Blot 30 min in 1 x SSC/ 0,1% SDS bei 65°C waschen

Prähybridisierung: mindestens 2 h bei 50-55°C

Hybridisierung: über Nacht bei 55-6O0C

Waschen: 5 min 2 x SSC/ 0,1% SDS Hybridisierungstemp 30 min 2 x SSC/ 0,1% SDS Hybridisierungstemp 30 min I x SSC/ 0,1% SDS Hybridisierungstemp 45 min 0,2 x SSC/0,1% SDS 65°C 5 min 0,I x SSC Raumtemperatur

Die bei der Antisense-Strategie übertragenen Nukleinsäuren umfassen in der Regel zwischen 20 bis 1000 Nukleotide, bevorzugt zwischen 20 bis 750 Nukleotide, besonders bevorzugt um die 400 bis 800 und 500 bis 750 Nukleotide. Es können aber auch Nukleinsäuren verwendet werden, die zwischen 20 bis 500 Nukleotide, ebenfalls besonders bevorzugt zwischen 20 bis 300 Nukleotide, insbesondere bevorzugt zwischen 20 bis 150 Nukleotide, ebenfalls insbesondere bevorzugt zwischen 20 bis 75 Nukleotide und am meisten bevorzugt um die 20 bis 50 Nukleotide. Unter Umständen können die Sequenzen auch nur um die 20 oder 25 Nukleotide umfassen.

Wenn Nukleinsäuren auf die Mikroorganismen übertragen werden, deren Transkription in der Zelle zu Sequenzen führen, die zu mRNA der Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 bzw. dazu funktionell homologen Sequenzen komplementär sind (wie z.B. bei der antisense-Strategie), müssen diese Sequenzen nicht hundertprozentig komplementär zu der mRNA sein. Vielmehr reicht es aus, wenn diese Sequenzen zu mindestens 50%, bevorzugt zu mindestens 60%, besonders bevorzugt zu mindestens 70%, weiterhin besonders bevorzugt zu mindestens 80%, insbesondere bevorzugt zu mindestens 90% und am meisten bevorzugt zu mindestens 95% komplementär sind. Die Abweichungen können dabei durch Deletion, Substitution und/oder Insertion entstanden sein.

Generell gilt, dass nur solche komplementären Sequenzen erfindungsgemäß ver- wendet werden können, die in der Lage sind, spezifisch mit mRNA-Bereichen der Sequenz SEQ ID No. 1 bzw. der dazu funktionell homologen Sequenzen zu hybridisieren. Sequenzen, die in vivo mit RNA-Bereichen von anderen Proteinen als NP_601931 bzw. dazu homologen Proteinen hybridisieren und deren Repression bewirken, sind für die erfindungsgemäßen Verfahren nicht geeignet.

Einige der oben erwähnten Verfahren können auch mit Sequenzen durchgeführt werden, die nicht Bestandteil des kodierenden Teils der mRNA von Nukleinsäuren mit der Sequenz SEQ ID No.1 sind oder dazu komplementär sind. Es kann z.B. ausreichend sein, wenn es sich um Sequenzen aus dem 5'- oder 3'-untranslatierten Bereich handelt, sofern diese regulatorischen Sequenzen charakteristisch für die mRNA der Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 bzw. der dazu homologen Sequenzen sind.

Solche Sequenzen können insbesondere dann eingesetzt werden, wenn die Translation einer mRNA durch antisense-Konstrukte inhibiert wird. Daher umfasst der Begriff mRNA erfindungsgemäß nicht nur die kodierenden Bestandteile der mRNA der Nukleinsäure mit der SEQ ID No. 1 bzw. der dazu homologen Sequenzen, sondern auch alle regulatorischen Sequenzen, die in der prä-mRNA oder reifen mRNA auftreten und die für die mRNA der Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 bzw. der dazu homologen Sequenzen charakteristisch sind. Dies gilt entsprechend auch für die DNA-Sequenz. Dabei kann es sich z.B. um 5'- und 3'- untranslatierte Bereiche handeln, um Promotorsequenzen, um upstream activating sequences etc.

Wenn Vektoren verwendet werden, deren Transkription zu RNA-Molekülen fuhrt, die aus einer Führungssequenz und RNAse P bestehen, dann muss die Führungssequenz ausreichend komplementär sein, um spezifisch die mRNA der Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 bzw. der homologen Sequenzen zu erkennen. Welcher Bereich der mRNA durch die Führungssequenz erkannt wird, kann gemäß den jeweiligen Erfordernissen gewählt werden. Bevorzugt umfassen solche Führungssequenzen etwa 20 Nukleotide, sie sollten jedoch nicht wesentlich kürzer als 15 Nukleotide sein. Bei einer 100%-igenKomplementarität der Führungssequenz sollten auch zwölf Nukleotide ausreichend sein. Selbstverständlich können die Führungssequenzen bis zu 100 Nukleotide oder mehr umfassen, da dadurch lediglich ihre Spezifität für die jeweilige mRNA erhöht wird.

Wenn im Rahmen der vorliegenden Erfindung von sense-Sequenzen gesprochen wird, dann sind damit diejenigen Sequenzen gemeint, die dem kodierenden Strang der Gene für NCgl2640 bzw. dessen Homologen entsprechen oder Teile davon umfassen. Es handelt sich dabei um die Sequenz SEQ ID No. 1 bzw. deren funktionelle Homologe.

Wenn im Rahmen der vorliegenden Erfindung von antisense-Sequenzen gesprochen wird, dann sind damit diejenigen Sequenzen gemeint, die dem nicht kodierenden DNA-Strang der Gene für NP_601931 bzw. dessen Homologen entsprechen. Diese Sequenzen sind also komplementär zu SEQ ID No. 1 bzw. deren Homologen. Auch diese Sequenzen müssen selbstverständlich nicht hundertprozentig identisch mit der Sequenz des nicht-kodierenden DNA-Strangs sein, sondern können die vorstehend genannten Homologiegrade aufweisen. Dies kommt auch in dem Umstand zum Ausdruck, dass antisense-Sequenzen, die definitionsgemäß zu der mRNA eines Gens komplementär sind, nicht zu 100% komplementär zu dieser mRNA sein müssen. Sie können z.B. auch zu mindestens 50% komplementär, bevorzugt zu mindestens 60% komplementär, besonders bevorzugt zu mindestens 70% komplementär, weiterhin besonders bevorzugt zu mindestens 80% komplementär, insbesondere bevorzugt zu mindestens 90% komplementär und am meisten bevorzugt zu mindestens 95%, 98% und/oder 100% komplementär sein. Wie oben ausgeführt, ist es ausreichend, wenn die antisense-Sequenzen in der Lage sind, spezifisch mit der jeweiligen interessierenden mRNA von Nukleinsäuren mit der Sequenz SEQ ID No.1 zu hybridisieren. Die Hybridisierung kann entweder in vivo unter zellulären Bedingungen oder in vitro stattfinden.

Die Hybridisierung einer antisense-Sequenz mit einer endogenen mRNA-Sequenz findet typischerweise in vivo unter zellulären Bedingungen oder in vitro statt.

Die Begriffe sense und antisense sind darüber hinaus dem Fachmann bekannt. Dem mit der Genexpression vertrauten Fachmann ist entsprechend aus dem Stand der Technik auch bekannt, wie lang die zur Repression verwendeten Nukleinsäuremoleküle sein müssen und welche Homologie bzw. Komplementarität sie zu den jeweils interessierenden Sequenzen aufweisen müssen. Erfindungsgemäß können antisense-Sequenzen, die z.B. in vivo und/oder in vitro nicht spezifisch mit kodierenden sense-Sequenzen von NCgl2640 oder dessen Homologen hybridisieren können, d.h. auch mit den kodierenden sense-Sequenzen von anderen Protein- Klassen hybridisieren, nicht verwendet werden. Prinzipiell kann die antisense-Strategie mit einem Ribozym-Verfahren gekoppelt werden. Ribozyme sind katalytisch aktive RNA Sequenzen, die, gekoppelt an die antisense-Sequenzen, die Zielsequenzen katalytisch spalten (Tanner et al., (1999) FEMS Microbiol Rev. 23 (3), 257-75). Dies kann die Effizienz einer antisense- Strategie erhöhen.

Ferner ist eine Genrepression, aber auch die Genüberexpression, auch mit spezifischen DNA-bindenden Faktoren, z.B. Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren möglich.

Des weiteren können Faktoren in eine Zelle eingebracht werden, die das Zielprotein selber inhibieren. Die proteinbindenden Faktoren können z.B. Aptamere sein (Famulok et al., (1999) Curr Top Microbiol Immunol. 243, 123-36).

Die Repression kann auch durch Aptamere erfolgen. Aptamere können so entworfen werden, dass sie spezifisch anNP_601931 binden und durch Kompetitionsreaktionen die Aktivität der Proteine reduzieren. Die Expression von Aptameren erfolgt üblicherweise durch Vektor-basierte Überexpression. Entwurf, Selektion und Expression von Aptameren sind dem Fachmann wohl bekannt (Famulok et al., (1999) Curr. Top. Microbiol. Immunol., 243,123-36).

Als weitere Protein-bindende Faktoren, deren Expression in Mikroorganismen eine Reduktion des Gehalts und/oder der Aktivität an den durch Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, kodierten Proteinen bewirkt, kommen für diese Proteine spezifische Antikörper in Frage. Die Herstellung solcher monoklonalen, polyklonalen oder rekombinanten Antikörper folgt Standardprotokollen (Guide to Protein Purification, Meth. Enzymol. 182, 663-679 (199O)5 M. P. Deutscher, ed.). Die Expression von Antikörpern ist ebenfalls aus der Literatur bekannt (Fiedler et al., (1997) Immunotechnology 3, 205-216; Maynard and Georgiou (2000) Annu. Rev. Biomed. Eng. 2, 339-76).

Ein weiteres Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Mikroorganismen sieht vor, dass die Aktivität der endogenen Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, bzw. der dadurch kodierten Proteine dadurch verringert wird, dass in den Mikroorganismen nicht-funktionelle Mutanten dieser Nukleinsäuren bzw. Proteine exprimiert werden. Bei solchen nicht-funktionellen Mutanten bzw. Formen handelt es sich um Formen der Nukleinsäuren bzw. der durch die Nukleinsäure kodierten Proteine, die nicht mehr oder zumindest nur noch sehr beschränkt in der Lage sind, die Biosynthese von schwefelhaltigen Verbindungen und insbesondere Methionin in den Mikroorganismen zu regulieren. Solche nicht-funktionellen Mutanten können Punktmutationen, Insertionen und/oder Deletionen aufweisen. Sie sind insbesondere bei der Herstellung von erfindungsgemäßen Mikroorganismen nützlich, bei denen der Gehalt an endogenen Nukleinsäuren bzw. den durch diese Nukleinsäuresequenzen kodierten Proteine zwar nicht verändert wird, aber die Aktivität der endogenen Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, bzw. der durch diese Nukleinsäuresequenzen kodierten Proteine durch Überexpression der vorstehend genannten nicht- funktionellen Mutanten blockiert wird.

Solche nicht-funktionellen Mutanten verfügen erfindungsgemäß über im Wesentlichen gleiche Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenzen wie die Wildtyp- Formen, also z.B. die Sequenzen SEQ ID No. 1 und 2. Sie weisen jedoch an einigen Stellen Punktmutationen, Insertionen oder Deletionen von Nukleotiden oder Aminosäuren auf, die bewirken, dass die nicht-funktionellen Mutanten im Gegensatz zu den Wildtyp-Formen nicht oder nur sehr begrenzt in der Lage sind, mit ihren zellulären Bindungspartnern zu interagieren. Auf diese Weise kompetieren die nicht- funktionellen Mutanten die Interaktion der Wildtyp-Formen mit den zellulären Bindungspartnern aus und entkoppeln dadurch die Regulation der Biosynthese von schwefelhaltigen Verbindungen.

Solche erfmdungsgemäßen funktionellen bzw. nicht-funktionellen Mutanten von Nukleinsäuren mit der Sequenz SEQ ID No.1 können vom Fachmann in einfacher Weise identifiziert werden. Dem Fachmann stehen eine Reihe von Techniken zur Verfügung, mit denen es möglich ist, Punktmutation(en), Insertion(en) oder Deletion(en) in die Nukleinsäuresequenzen, die zur SEQ ID No. 1 identisch oder dazu homolog sind, einzufügen (siehe u.a. Sambrook (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. Auflage, CoId Spring Harbour Laboratory Press, Jäger et al, (1992) J. Bacteriol. 174, 5462-5465, WO 02/070685 sowie die sog. Quikchange Mutagenese-Methode von Stratagene, La Jolla, USA). Nach Einführung der Punktmutation, Insertion und/oder Deletion, die auch allgemein als Mutationen bezeichnet werden, kann der Fachmann durch entsprechende Tests, wie sie in den Beispielen dargestellt oder aus dem Stand der Technik bekannt sind, feststellen, ob die mutagenisierten Proteine noch über ihre normale Aktivität verfügen (siehe auch oben).

Erfindungsgemäß umfasst der Begriff "nicht-funktionelle Proteine bzw. Proteinfragmente" nicht solche Proteine, die keine wesentliche Sequenzhomologie auf Aminosäure- bzw. Nukleinsäureebene zu NCgl2640 bzw. dessen Homologen aufweisen. Nicht-funktionelle Mutanten werden im Rahmen der Erfindung auch als inaktivierte oder inaktive oder dominant-negative Proteine bezeichnet. Somit zeichnen sich die erfindungsgemäßen funktionellen und/oder nicht¬ funktionellen Mutanten, die die oben genannte Punktmutation(en), Insertion(en) und/oder Deletion(en) tragen, oder die funktionell äquivalenten Teile durch eine wesentliche Sequenzhomologie zu NCgl2640 aus.

Die Frage, ob es sich bei einer nicht-funktionellen Mutante um eine Mutante im Sinne der vorliegenden Erfindung handelt, kann vom Fachmann in einfacher Weise ermittelt werden. Dazu wird die gewünschte Mutation, also Punktmutation, Insertion oder Deletion in die genomische Nukleinsäuresequenz, die zu der SEQ ID No. 1 identisch oder dazu funktionell homolog ist, z.B. durch homologe Rekombination oder ortsspezifische Mutagenes (site-directed mutagenesis) eingeführt und überprüft, ob durch diese Verringerung des Gehalts und/oder der Aktivität an endogenen Nukleinsäuresequenzen die Regulation der Biosynthese von schwefelhaltigen Verbindungen entkoppelt wird, so dass diese Mikroorganismen erhöhte Menge dieser schwefelhaltigen Verbindungen produzieren. Ist dies der Fall, ist damit gezeigt, dass es sich um eine nicht-funktionelle Mutation handelt.

Die so ermittelte nicht-funktionelle Mutation kann dann in eine DNA-Sequenz eingeführt werden, die sich in einem Vektor befindet und operativ verknüpft ist mit Promotor- und Terminationssequenzen, die in Mikroorganismen funktionell sind. Nach Überfuhren dieser Vektoren in die Mikroorganismen können die nicht- funktionellen Mutanten überexprimiert werden und kompetieren die Interaktion der endogenen Wildtyp-Sequenzen bzw. Proteine mit deren zellulären Bindungspartnern aus.

Ein solches Verfahren kann z.B. die folgenden Schritte umfassen:

a) Herstellen eines Vektors, umfassend folgende Nukleinsäuresequenzen in 5 '-3 '-Orientierung: eine in Mikroorganismen funktionelle Promotersequenz, operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die für eine dominant¬ negative Mutante von NCgl2640 bzw. ein Homologes davon, kodiert, - operativ daran gebunden eine in Mikroorganismen funktionelle Terminationssequenz, b) Übertragen des Vektors aus a) auf den Mikroorganismus und gegebenenfalls Integrieren des Vektors in dessen Genom.

Dem Fachmann ist bekannt, wie Punktmutation(en), Insertionsmutation(en) oder Deletionsmutation(en) in die NP_601931 bzw. dessen Homologe kodierenden Nukleinsäuresequenzen eingeführt werden können. PCR-Techniken können z.B. zur Einführung von Punktmutationen bevorzugt sein ("PCR technology: Principle and Applications for DNA Amplification", H. Ehrlich, id, Stockton Press). Beispiele zur Einführung von Punktmutationen in Nukleinsäuren mit der Sequenz SEQ ID No.1 finden sich zudem in den Ausfuhrungsbeispielen.

Erfindungsgemäße Mikroorganismen können erfindungsgemäß auch derart hergestellt werden, dass z.B. ein rekombinanter Antikörper in den Mikroorganismen exprimiert wird, der spezifisch die Interaktion der durch die Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, kodierten Proteine mit anderen zellulären Bindungspartnern kompetitiert.

Wie solche rekombinanten Antikörper gegen NP_601931 bzw. dessen Homologe isoliert und identifiziert werden können, ist dem Fachmann bekannt und kann der Literatur entnommen werden (Harlow et al., 1999, Using antibodies: a laboratory manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press). Unter rekombinanten Antikörpern werden erfindungsgemäß die bekannten unterschiedlichen Formen von rekombinanten Antikörpern verstanden, wie sie z.B. in Skerra et al. (Curr. Opin. Immunol. (1993) 2, 250 - 262) beschrieben wurden. Die erfindungsgemäßen rekombinanten Antikörper umfassen dabei die sogenannten Fab- Fragmente, Fv-Fragmente, scFv-Antikörper, scFv-Homodimere, die über Disulfit- Brücken miteinander verknüpft sind und sog. VH-Ketten. Die Fab-Fragmente bestehen aus assemblierten vollständigen leichten und verkürzten schweren Ketten, wohingegen Fv-Fragmente aus nicht-kovalent miteinander verknüpften VH- und VL- Ketten bestehen. Ein Überblick über die genannten Fragmente und rekombinanten Antikörper findet sich in Conrad et al. (Plant Mol. Biol. (1998) 38, 101 - 109). Die genannten Fab- und Fv-Fragmente können in vivo miteinander assoziieren.

Da dieser Prozess unter Umständen jedoch nicht sehr effizient abläuft, werden erfindungsgemäß bevorzugt scFv- Antikörper eingesetzt. Diese bestehen aus dem variablen Anteil der leichten Kette und dem variablen Anteil der schweren Kette, die über ein flexibles Linkerpeptid miteinander fusioniert sind. Die Herstellung solcher scFv- Antikörper ist im Stand der Technik intensiv beschrieben worden (siehe u.a. Conrad et al., vide supra; Breitling et al. (1999) Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, New York). Die scFv-Antikörper weisen die gleiche Antigen- Spezifität und Aktivität wie normale Antikörper auf, müssen aber nicht wie andere natürliche oder rekombinante Antikörper in vivo aus Einzelketten assembliert werden. Sie eignen sich deshalb insbesondere für die erfindungsgemäßen Verfahren.

In den oben angegebenen Referenzen wird ausführlich dargestellt, wie Nukleinsäure- sequenzen, die für die erfindungsgemäß bevorzugten scFv- Antikörper kodieren, durch den Fachmann isoliert und hergestellt werden können. Üblicherweise wird dabei von bestehenden Hybridoma-Zelllinien ausgegangen, die monoklonale Antikörper produzieren. Danach werden die für die leichte und schwere Ketten des Antikörpers kodierenden cDNAs isoliert und in einem zweiten Schritt die kodierenden Regionen für die variable Region der leichten und der schweren Kette in einem Molekül miteinander fusioniert.

Ein weiterer, dem Fachmann bekannter Weg zur Erzeugung rekombinanter Antikörper ist das Screening von Bibliotheken rekombinanter Antikörper (sogenannte "phage display libraries", siehe auch Hoogenboom et al. (2000) Immunology Today 21, 371-378; Winter et al. (1994) Annu. Rev. Immunol. 12, 433- 455; De Wildt et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18, 989-994). Durch dem Fachmann bekannte Vorgehensweisen können bei diesem Verfahren rekombinante Antikörper gegen ein gegebenes Antigen angereichert, selektiert und isoliert werden.

Ein Verfahren zur Expression von Antikörpern gegen Proteine, die identisch mit oder homolog zu Proteinen mit der Sequenz SEQ ID No. 2 sind, kann z.B. die folgenden Schritte umfassen:

a) Herstellen eines Vektors, umfassend folgende Nukleinsäuresequenzen in 5 '-3 '-Orientierung: - eine in Mikroorganismen funktionelle Promotersequenz, - operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die für einen rekombinanten Antikörper kodiert, der für Proteine, die identisch mit oder homolog zu Proteinen mit der Sequenz SEQ ID No. 2 sind, spezifisch ist, - operativ daran gebunden eine in Mikroorganismen funktionelle Terminationssequenz; und b) Übertragen des Vektors aus a) auf den Mikroorganismus und gegebenenfalls Integrieren des Vektors in dessen Genom. Wenn im Rahmen der vorliegenden Erfindung davon gesprochen wird, dass der Gehalt und/oder die Aktivität der Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, bzw. der durch diese Sequenzen kodierten Proteine im Vergleich zum Wildtyp reduziert wird, wird dies ebenfalls dadurch beschrieben, dass die funktionelle Expression der Nukleinsäuren reduziert wird und bevorzugt vollständig unterbunden wird.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff schwefelhaltige Verbindung bzw. Feinchemikalie jede chemische Verbindung, die wenigstens ein kovalent gebundenes Schwefelatom enthält und durch ein erfindungsgemäßes Fermentationsverfahrens zugänglich ist.

Erfindungsgemäß umfassen die schwefelhaltigen Verbindungen u.a. L-Methionin, L- Cystein, L-Homocystein, L-Cystathionin, S-Adenosyl-L-Methionin, Glutathion, Biotin, Thiamin und/oder Liponsäure, und vorzugsweise L-Methionin und/oder L- Cystein.

Erfindungsgemäß handelt es sich bei den Mikroorganismen bevorzugt um die Mikroorganismen Actinobakterien, Cyanobakterien, Proteobakterien, Chloroflexus aurantiacus, Pirellula sp. 1, Halobakterien und/oder Methanokokken, bevorzugt Corynebakterien, Mycobakterien, Streptomycen, Salmonellen, Escherichia coli, Shigella und/oder Pseudomonas, Besonders bevorzugt sind Mikroorganismen ausgewählt aus Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli, Mikroorganismen der Gattung Bacillus, insbesondere Bacillus subtilis, und Mikroorganismen der Gattung Streptomyces. Der Begriff Stoffwechselmetabolit bezeichnet chemische Verbindungen, die im Stoffwechsel von Organismen als Zwischen- oder auch Endprodukte vorkommen und die neben ihrer Eigenschaft als chemische Bausteine auch modulierende Wirkung auf Enzyme und ihre katalytische Aktivität haben können. Dabei ist aus der Literatur bekannt, dass solche Stoffwechselmetabolite sowohl hemmend als auch stimulierend auf die Aktivität von Enzymen wirken können (Stryer, Biochemistry, (1995) W.H. Freeman & Company, New York, New York). In der Literatur ist auch beschrieben, dass es möglich ist, durch Maßnahmen wie Mutation der genomischen DNA durch UV-Strahlung, ionisierender Strahlung oder mutagene Substanzen und nachfolgender Selektion auf bestimmte Phänotypen in Organismen solche Enzyme zu produzieren, in denen die Beeinflussung durch Stoffwechselmetabolite verändert wurde (Sahm et al. (2000), Biologica! Chemistry 381(9-10): 899-910). Diese veränderten Eigenschaften können auch durch gezielte Maßnahmen erreicht werden. Dabei ist dem Fachmann bekannt, in Genen für Enzyme auch gezielt bestimmte Nukleotide der für das Protein kodierenden DNA so zu verändern, dass das aus der exprimierten DNA-Sequenz resultierende Protein bestimmte neue Eigenschaften aufweist, so zum Beispiel, dass die modulierende Wirkung von Stoffwechsel- metaboliten gegenüber dem nicht veränderten Protein verändert ist.

Als erfindungsgemäße Mikroorganismen eignen sich insbesondere coryneforme Bakterien, die einen im Vergleich zum Wildtyp erniedrigten Gehalt und/oder eine erniedrigte Aktivität an Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, bzw. an durch diese Nukleinsäuren kodierten Proteine aufweisen.

Diese Mikroorganismen können schwefelhaltige Feinchemikalien, insbesondere L- Methionin aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Aus der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum geeignet, die für ihre Fähigkeit bekannt ist, L- Aminosäuren zu produzieren.

Beispiele für geeignete Stämme coryneformer Bakterien sind solche der Gattung

Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), wie Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, und Corynebacterium melassecola ATCC 17965,

oder der Gattung Brevibacterium, wie Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, und Brevibacterium divaricatum ATCC 14020;

oder davon abgeleitete Stämme, wie Corynebacterium glutamicum KFCC 10065 und Corynebacterium glutamicum ATCC21608, welche ebenfalls die gewünschte Feinchemikalie oder deren Vorstufe(n) produzieren.

Die Abkürzung KFCC bezeichnet die Korean Federation ofCulture Collection, die Abkürzung ATCC die American Type Strain Culture Collection.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft Mikroorganismen, bei denen zusätzlich zu der Reduzierung des Gehalts und/oder der Aktivität der Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, bzw. der durch diese Sequenzen kodierten Proteine der Gehalt und/oder die Aktivität von Nukleinsäuren, die identisch mit oder homolog zu einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 3 sind, bzw. von durch diese letzteren Nukleinsäuren kodierten Proteinen im Vergleich zum Wildtyp reduziert ist.

Bei der Nukleinsäure mit der Seqeunz SEQ ID No. 3 handelt es sich um eine Nukleinsäure, die für das Protein McbR mit der Aminosäuresequenz SEQ ID No. 4 aus C. glutamicum kodiert. Für dieses Protein konnte gezeigt werden, dass es ein transkriptioneller Repressor für Gene der Biosynthesewege von schwefelhaltigen Verbindungen und insbesondere Methionin in C. glutamicum ist (Rey et al., vide suprä).

Durch die gleichzeitige Reduktion des Gehalts und/oder der Aktivität von Nukleinsäuren, die identisch mit bzw. funktionell homolog zu Nukleinsäuren mit den Sequenzen SEQ ID No. 1 und 3 sind, werden Mikroorganismen bereitgestellt, die in besonderem Maße zur Herstellung von schwefelhaltigen Verbindungen geeignet sind. Bei den schwefelhaltigen Verbindungen kann es sich um die vorstehend genannten Verbindungen handeln, wobei Methionin und Cystein besonders bevorzugt sind. Bei den Mikroorganismen kann es sich ebenfalls um die vorstehend genannten Organismen handeln, wobei C. glutamicum und E. coli bevorzugt sind.

Zur Erniedrigung des Gehalts und/oder der Aktivität von Nukleinsäuren, die identisch mit bzw. funktionell homolog zu Nukleinsäuren mit der Sequenz SEQ ID No. 3 sind, bzw. den durch diese Nukleinsäuren kodierten Proteine können die gleichen Verfahren und Vorgehensweisen eingesetzt werden, wie sie vorstehend für die Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, bzw. für die durch letztere Nukleinsäuren kodierten Proteine beschrieben worden sind. Begriffe wie Homologie, Komplementarität, funktionelle Formen, dominant-negative Mutanten etc. sind dabei gleichermaßen zu verstehen.

Eine weitere Ausführungsförm der erfindungsgemäßen Mikroorganismen betrifft Mikroorganismen, in denen neben der im Vergleich zum Wildtyp reduzierten Aktivität bzw. dem reduzierten Gehalt an Nukleinsäuren, die identisch mit oder funktionell homolog zu einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sind, bzw. an durch diese Nukleinsäuren kodierten Proteine der Gehalt und/oder die Aktivität mindestens einer weiteren Nukleinsäure, die für ein Gen des Biosynthesewegs der gewünschten schwefelhaltigen Verbindungen kodiert, im Vergleich zum Wildtyp erniedrigt sind.

Diese weiteren Nukleinsäuren werden vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe I umfassend:

- das für Homoserine-Kinase kodierende Gen thrB (EP 1 108 790; DNA-SEQ ID No. 3453), - das für Threonin-Dehydratase kodierende Gen ilvA (EP 1 108 790; DNA-SEQ ID No. 2328), - das für Threonin-Synthase kodierende Gen thrC (EP 108 790; DNA-SEQ ID No. 3486), - das für Meso-Diaminopimelat-D-Dehydrogenase kodierende Gen ddh (EP 1 108 790; DNA-SEQ ID No. 3494), - das für Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck (EP 1 108 790; DNA-SEQ ID No. 3157), - das für Glucose-6-Phosphat-6-Isomerase kodierende Gen pgi (EP 1 108 790; DNA- SEQ ID No. 950), - das für Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB (EP 1 108 790; DNA-SEQ ID No. 2873), - das für Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA (EP 1 108 790; DNA- SEQ ID No. 3476), - das für Dihydrodipicolinat-Reduktase kodierende Gen dapB (EP 1 108 790; DNA- SEQ ID No. 3477), - das für Diaminopicolinat-Decarboxylase kodierende Gen lysA (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ ID No. 3451), - das für Glycosyltransferase (Genbank accession number NP_600345) kodierende Gen (Genbank accession number NCgIl 072), und - das für Laktatdehydrogenase (Genbank accession number NP_602107) kodierende Gen (Genbank accession number NCgl2817).

Daneben können letztere erfindungsgemäße Organismen selbstverständlich auch bezüglich des Gehalts und/oder der Aktivität der Nukleinsäuren, die identisch mit bzw. funktionell homolog zu einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID No. 3 sind, bzw. des Gehalts und/oder der Aktivität der durch diese Nukleinsäuren kodierten Proteine im Vergleich zum Wildtyp reduziert sein.

Eine Reduzierung des Gehalts und/oder der Aktivität bezüglich der in der Gruppe I genannten Nukleinsäuresequenzen bzw. bezüglich der durch diese Sequenzen kodierten Proteine kann dabei in der gleichen Weise erreicht werden, wie dies oben z.B. für die SEQ ID No. 1 bis 4 beschrieben wurde. Dabei sind die Begriffe wie Homologie, dominant-negative Mutante etc. so wie oben definiert zu verstehen.

Alle bisher genannten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen Mikroorganismen, die zur Herstellung der oben genannten schwefelhaltigen Verbindungen verwendet werden können. Insbesondere bevorzugt sind dabei Mikroorganismen, die zur Herstellung von Methionin und/oder Cystein verwendet werden können, wobei es sich bei diesen Mikroorganismen um die vorstehend genannten handeln kann und C. gϊutamicum und E. coli bevorzugt sind. Dabei können zur Verringerung des Gehalts und/oder der Aktivität der vorstehend genannten Nukleinsäuren die vorstehend genannten Verfahren angewendet werden.

Eine weitere Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die vorstehend genannten Mikroorganismen, in denen zusätzlich der Gehalt und/oder die Aktivität für Nukleinsäuren, die für ein Genprodukt des Biosynthesewegs der herzustellenden schwefelhaltigen Verbindungen kodieren, im Vergleich zum Wildtyp erhöht sind. Als Stoffwechselwege kommen dabei insbesondere die Biosynthesewege der Schwefel-Assimilation, des Methionin-Stoffwechsels, des Trehalose-Stoffwechsels, des Pyruvat-Stoffwechsels, des Cystein-Stoffwechselwegs, der Aspartatsemialdehyd- Synthese, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Pentose-Phosphatstoffwechsels, des Zitronensäure-Zyklus oder des Aminosäure-Exports in Frage.

Insofern betreffen weitere Ausfuhrungsformen der vorliegenden Erfindung Mikroorganismen, in denen der Gehalt und/oder die Aktivität von Nukleinsäuren bzw. von Proteinen, die durch diese Nukleinsäuren kodiert werden, erhöht ist, wobei die Nukleinsäuren ausgewählt sind aus der Gruppe II, umfassend

- das für Aspartatkinase kodierende Gen lysC (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ ID No. 281), - das für Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase kodierende Gen asd (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ ID No. 282), - das für Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase kodierende Gen gap (Eikmanns (1992) Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), - das für 3-Phosphoglycerat-Kinase kodierende Gen pgk (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), - das für Pyruvat-Carboxylase kodierende Gen pyc (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), - das für Triosephosphat-Isomerase kodierende Gen tpi (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), - das für Homoserin-O-Acetyltransferase kodierende Gen metA (EP 1 108 790;DNA-SEQ ID No. 725), - das für Cystahionin-gamma-Synthase kodierende Gen metB (EP 1 108 790; DNA- SEQ ID No. 3491), - das für Cystahionin-gamma-Lyase kodierende Gen metC (EP 1 108 790; DNA- SEQ ID No. 3061), - das für Serin-Hydroxymethyltransferase kodierende Gen glyA (EP 1 108 790; DNA-SEQ ID No. 1110), - das für O-Acetylhomoserin-Sulfhydrylase kodierende Gen metY (EP 1 108 790; DNA-SEQ ID No. 726), - das für Methylentetrahydrofolat-Reduktase kodierende Gen metF (EP 1 108 790; DNA-SEQ ID No. 2379), - das für Phosphoserin-Aminotransferase kodierende Gen serC (EP 1 108 790; DNA- SEQ ID No. 928), - eines für Phosphoserin-Phosphatase kodierende Gen serB (EP 1 108 790; DNA- SEQ ID No. 334, DNA-SEQ ID No. 467, DNA-SEQ ID No. 2767), - das für Serinacetyl-Transferase kodierende Gen cysE (EP 1 108 790; DNA-SEQ ID No. 2818), - das für Homoserin-Dehydrogenase kodierende Gen hom (EP 1 108 790; DNA-SEQ ID No. 1306), und - das für Methionin-Synthase kodierende Gen metH (EP 1 108 790; DNA-SEQ ID No. 1663), - das für Methionin-Synthase (Genbank accession number NP_600367) kodierende Gen metE (Genbank accession number NCgIl 094), - das für Cystein-Synthase (Genbank accession number NP_601760) kodierende Gen (Genbank accession number NCgl2473), - das für Cystein-Synthase (Genbank accession number NP_601337) kodierende Gen (Genbank accession number NCgl2055), - das für Sulfit-Reduktase(Genbank accession number NP_602008) kodierende Gen (Genbank accession number NCgl2718), - das für Phosphoadenosin-Phosphosulfat-Reduktase (Genbank accession number NP_602007) kodierende Gen cysH (Genbank accession number NCgl2717), - das für Sulfatadenylyltransferase-Subunit 1 (Genbank accession number NP_602005) kodierende Gen (Genbank accession number NCgl2715), - das für CysN-Sulfatadenylyltransferase-Subunit 2 (Genbank accession number NP_602006) kodierende Gen (Genbank accession number NCgl2716), - das für Ferredoxin-NADP Reduktase (Genbank accession number NP_602009) kodierende Gen (Genbank accession number NC gl2719), - das für Ferredoxin (Genbank accession number NP_602010) kodierende Gen (Genbank accession number NCgl2720), - das für Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (Genbank accession number NP_600790) kodierende Gen (Genbank accession number NCgIl 514), und - das für Fructose-l-6-Bisphosphatase (Genbank accession number NP_601294) kodierende Gen (Genbank accession number NCgl2014).

Vorzugsweise beträgt die in erfindungsgemäßen Mikroorganismen bewirkte Erhöhung des Gehalts und/oder der Aktivität der durch die Nukleinsäuren der Gruppe II kodierten Proteine mindestens 5%, bevorzugt mindestens 20%, ebenfalls bevorzugt mindestens 50%, besonders bevorzugt mindestens 100%, ebenfalls besonders bevorzugt mindestens den Faktor 5, insbesondere bevorzugt mindestens den Faktor 10, ebenfalls insbesondere bevorzugt mindestens den Faktor 50, noch bevorzugter mindestens den Faktor 100 und am meisten bevorzugt den Faktor 1000.

Die Erhöhung des Gehalts und/oder der Aktivität der durch die Nukleinsäuren der Gruppe II kodierten Proteine kann auf verschiedene Weise erreicht werden. Bevorzugt wird dies dadurch geschehen, dass diese Nukleinsäuresequenzen in Form von DNA-Sequenzen in einen Vektor eingeführt werden, der zusätzlich einen in Mikroorganismen funktionellen Promotor, eine in Mikroorganismen funktionelle ribosomale Bindungsstelle sowie eine in Mikroorganismen funktionelle Terminationssequenz enthält. Dieser Vektor wird dann auf die Mikroorganismen übertragen und je nach gewähltem Vektor entweder extrachromosomal mit den Mikroorganismen mitrepliziert oder ins Genom der Mikroorganismen integriert. Dabei können im Wesentlichen die gleichen Vektoren bzw. Plasmide verwendet werden, wie sie vorstehend für die Erniedrigung des Gehalts und/oder der Aktivität bestimmter Nukleinsäuren bzw. der dadurch kodierten Proteine beschrieben wurden. Das Gleiche gilt für die verwendeten Selektionsmarker.

Darüber hinaus kann eine Erhöhung des Gehalts und/oder der Aktivität der durch die Nukleinsäuren der Gruppe II kodierten Proteine auch dadurch erreicht werden, dass funktionelle Äquivalente oder Analoga bzw. Homologe dieser Nukleinsäuren in den Mikroorganismen exprimiert werden. Bezüglich der Begriffe Homologie, Komplementarität etc. wird auf oben verwiesen.

Funktionale Äquivalente oder Analoga der konkret offenbarten Polypeptide sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung von diesen Polypetiden verschiedene Polypeptide, welche weiterhin die gewünschte biologische Aktivität, wie z.B. Substratspezifität, besitzen. Unter funktionalen Äquivalenten versteht man erfmdungsgemäß insbesondere Mutanten, welche in wenigstens einer der Sequenzpositionen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen, aber trotzdem eine wie oben genannten biologische Aktivität besitzen. Funktionale Äquivalente umfassend somit die durch eine oder mehrere Aminosäure- Additionen, -Substitutionen, -Deletionen und/oder - Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem oben erwähnten Eigenschaftsprofil fuhren. Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster zwischen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen, d.h. beispielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt werden.

Funktionale Äquivalente umfassen selbstverständlich auch Polypeptide welche aus anderen Organismen zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente Enzyme ermitteln.

Funktionale Äquivalente umfassen ebenfalls Fragmente, vorzugsweise einzelne Domänen oder Sequenzmotive, der erfindungsgemäßen Polypeptide, welche z.B. die gewünschte biologische Funktion aufweisen.

Funktionale Äquivalente sind außerdem Fusionsproteine, welche eine der vorstehend genannten Polypeptidsequenzen oder davon abgeleitete Äquivalente und wenigstens eine weitere, davon funktionell verschiedene, heterologe Sequenz in funktioneller N- oder C-terminaler Verknüpfung (d.h. ohne gegenseitige wesentliche funktionelle Beeinträchtigung der Fusionsproteinteile) aufweisen. Beispiele für derartige heterologe Sequenzen sind Signalpeptide, Enzyme, Immunoglobuline, Oberflächenantigene, Rezeptoren oder Rezeptorliganden.

Erfindungsgemäße funktionale Äquivalente sind Homologe zu den konkret offenbarten Proteinen. Diese besitzen wenigstens 30%, oder etwa 40%, 50%, vorzugsweise wenigstens etwa 60%, 65%, 70%, oder 75% insbesondere wenigstens 85%, wie z.B. 90%, 95% oder 99%, Homologie zu einer der konkret offenbarten Sequenzen.

Homologe der erfmdungsgemäßen Proteine oder Polypeptide können durch Mutagenese erzeugt werden, z.B. durch Punktmutation oder Verkürzung des Proteins. Der Begriff Homologes, wie er hier verwendet wird, betrifft eine Variante des Proteins, die als Agonist oder Antagonist der Protein- Aktivität wirkt.

Homologe der erfindungsgemäßen Proteine können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z.B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispielsweise kann eine variierte Bank von Protein- Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäureebene erzeugt werden, wie z.B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA- Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Proteinsequenzen kodieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (z.B. Narang al. (1983) Tetrahedron 39, 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53, 323; Itakura et al., (1984) Science 198, 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11, 477). Zusätzlich können Banken von Fragmenten des Protein-Codons verwendet werden, um eine variierte Population von Protein-Fragmenten zum Screening und zur anschließenden Selektion von Homologen eines erfindungsgemäßen Proteins zu erzeugen. Bei einer Ausfuhrungsform kann eine Bank von kodierenden Sequenzfragmenten durch Behandeln eines doppelsträngigen PCR-Fragmentes einer kodierenden Sequenz mit einer Nuklease unter Bedingungen, unter denen ein Nicking nur etwa einmal pro Molekül erfolgt, Denaturieren der doppelsträngigen DNA, Renaturieren der DNA unter Bildung doppelsträngiger DNA, die Sense-/ Antisense-Paare von verschiedenen genickten Produkten umfassen kann, Entfernen einzelsträngiger Abschnitte aus neu gebildeten Dupleces durch Behandlung mit Sl-Nuclease und Ligieren der resultierenden Fragmentbank in einen Expressionsvektor erzeugt werden. Durch dieses Verfahren kann eine Expressionsbank hergeleitet werden, die N-terminale, C-terminale und interne Fragmente mit verschiedenen Größen des erfindungsgemäßen Proteins kodiert.

Im Stand der Technik sind mehrere Techniken zum Screening von Genprodukten kombinatorischer Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt worden sind, und zum Screening von cDNA-Banken auf Genprodukte mit einer ausgewählten Eigenschaft bekannt. Diese Techniken lassen sich an das schnelle Screening der Genbanken anpassen, die durch kombinatorische Mutagenese von erfindungsgemäßer Homologer erzeugt worden sind. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Screening großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterliegen, umfassen das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren der geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorbank und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen der Nachweis der gewünschten Aktivität und die Isolation des Vektors, der das Gen kodiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert ist. Recursive- Ensemble-Mutagenese (REM), eine Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken vergrößert, kann in Kombination mit den Screeningtests verwendet werden, um Homologe zu identifizieren (Arkin t al. (1992) PNAS 89, 7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3), 327-331).

Die z.B. für das Enzym Methionin-Synthase (EC 2.1.1.13) kodierenden metH-Gene aus den Organismen obiger Gruppe II sind in an sich bekannter Weise isolierbar.

Zur Isolierung der metH-Gene oder auch anderer Gene der Organismen aus obiger Gruppe II wird zunächst eine Genbank dieses Organismus in E. coli angelegt. Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und Handbüchern ausfuhrlich beschrieben. Als Beispiel seien das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990), oder das Handbuch von Sambrook et al., vide supra genannt. Eine bekannte Genbank ist die des E. coli K- 12 Stammes W3110, die von Kohara et al. (1987, Cell 50, 495-508) in λ-Vektoren angelegt wurde.

Zur Herstellung einer Genbank von Enzymen z.B. der Gruppe II in E. coli können Cosmide, wie der Cosmidvektor SuperCos I (Wahl et al., (1987) PNAS, 84, 2160- 2164), aber auch Plasmide, wie pBR322 (BoIiVaI et al. (1979) Life Sciences, 25, 807-818 (1979)) oder pUC9 (Vieira et al. (1982), Gene, 19, 259-268) verwendet werden. Als Wirte eignen sich besonders solche E. co/z-Stämme, die restriktions- und rekombinationsdefekt sind. Ein Beispiel hierfür ist der Stamm DH5αmcr, der von Grant et al. (1990) PNAS, 87, 4645-4649) beschrieben wurde. Die mit Hilfe von Cosmiden Monierten langen DNA-Fragmente können anschließend wiederum in gängige, für die Sequenzierung geeignete Vektoren subkloniert und anschließend sequenziert werden, so wie es z.B. bei Sanger et al. (1977, PNAS, 74, 5463-5467), beschrieben ist. Die erhaltenen DNA-Sequenzen können dann mit bekannten Algorithmen bzw. Sequenzanalyse-Programmen, wie z.B. dem von Staden (1986, Nucleic Acids Research 14, 217-232), dem von Marck (1988, Nucleic Acids Research 16, 1829- 1836) oder dem GCG-Programm von Butler (1998, Methods of Biochemical Analysis 39, 74-97), untersucht werden.

Anleitung zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im Handbuch "The DIG System Users Guide für Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. (1991, International Journal ofSytematic Bacteriology, 41, 255-260). Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonukleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).

Weiterhin ist bekannt, dass Änderungen am N- und/oder C-Terminus eines Proteins dessen Funktion nicht wesentlich beeinträchtigen oder sogar stabilisieren können. Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Ben-Bassat et al. (1987, Journal of Bacteriology 169, 751-757), bei O'Regan et al. (1989, Gene 77, 237-251), bei Sahin-Toth et al. (1994, Protein Sciences 3, 240-247), bei Hochuli et al. (1988, Biotechnology 6, 1321-1325) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.

Als Plasmide für alle vorstehend genannten Verfahren zur Erhöhung bzw. Erniedrigung des Gehalts und/oder der Aktivität von Nukleinsäuren bzw. dadurch kodierten Proteinen eignen sich solche, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren, wie z.B. pZl Menkel et al. (1989, Applied and Environmental Microbiology 64, 549-554), pEKExl (Eikmanns et al., (1991, Gene, 102, 93-98) oder pHS2-l (Sonnen et al. (1991, Gene, 107, 69-74)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBLl oder pGAl. Andere Plasmidvektoren, wie z.B. pCLiK5MCS, oder solche, die auf pCG4 (US-A 4,489,160) oder pNG2 (Serwold-David et al. (1990) FEMS Microbiology Letters 66, 119-124) oder pAGl (US-A 5,158,891) beruhen, können in gleicher Weise verwendet werden.

Weiterhin eignen sich auch solche Plasmidvektoren mit Hilfe derer man das Verfahren der Genamplifikation durch Integration in das Chromosom anwenden kann, so wie es beispielsweise von Reinscheid et al. (1994, Applied and Environmental Microbiology, 60, 126-132 zur Duplikation bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise ρSUP301 (Simon et al. (1983), Biotechnology 1, 784-791), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73), Bernard et al. (1993, Journal ofMolecular Biology, 234, 534-541)), pEMl (Schrumpf et al. (1991), Journal of Bacteriology 173, 4510-4516) oder pBGS8 (Spratt et al. (1986), Gene 41, 337-342) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschließend durch Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (1988, Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362)), Dunican et al (1989, Biotechnology 7, 1067-1070) und Tauch et al. (1994, FEMS Microbiological Letters 123, 343.347) beschrieben. Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P.H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, wie beispielsweise Phagen, Transposons, IS- Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden.

Als Selektionsmarker eignen sich die verschiedenen Antibiotika wie z.B. Chlorampicilin, Kanamycin, Gentamycin, G418, Bleomycin, Hygromycin, etc.

In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich um Mikroorganismen, bei denen die Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, deren Gehalt und/oder die Aktivität im Vergleich zum Wildtyp verringert werden soll, durch homologe Rekombination aus dem Genom der Mikroorganismen entfernt worden ist bzw. durch homologe Rekombination derart verändert sind, dass es zu keiner funktionellen Expression dieser Nukleinsäuresequenzen mehr kommt.

Diese erfindungsgemäß bevorzugten Mikroorganismen sind also hinsichtlich der genomischen Nukleinsäuren, die identisch mit bzw. funktionell homolog zu Nukleinsäuren mit den Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 und den in der Gruppe I genannten Sequenzen sind, durch homologe Rekombination inaktiviert, so dass es zu keiner funktionellen Expression der durch die vorgenannten Nukleinsäure kodierten Proteine mehr kommt. In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich um Mikroorganismen, die zusätzlich Nukleinsäuren, die identisch mit bzw. homolog zu den Nukleinsäuren der Gruppe II sind, oder funktionelle Äquivalente davon überexprimieren.

Zur Erzielung einer Überexpression kann der Fachmann unterschiedliche Maßnahmen einzeln oder in Kombination ergreifen. So kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe der fermentativen L-Methionin-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzyms ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.

Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (1987, Biontechnology 5, 137-146), bei Guerrero et al. (1994, Gene 138, 35-41), bei Tsuchiya et al. (1988, Biotechnology, 6, 428-430), bei Eikmanns et al. (1991, Gene, 102, 93-98), in EP 0 472 869, in US 4,601,893, bei Schwarzer et al. (1991, Biotechnology 9, 84-87), bei Remscheid et al. (1994, Applied and Environmental Microbiology, 60,126-132, bei LaBarre et al. (1993, Journal of Bacteriology 175, 1001-1007), in WO 96/15246, bei Malumbres et al. (1993, Gene 134, 15-24), in JP- A-10-229891, bei Jensen et al. (1998, Biotechnology and Bioengineering, 58,.19I- 195), bei Makrides (1996, Microbiological Reviews, 60, 512-538) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.

Beispiele für Promotoren, die für im Rahmen der Erfindung angewendete Verfahren geeignet sind, umfassen die Promotoren groES, sod, eftu, ddh, amy, lysC, dapA, lysA aus Corynebacterium glutamicum, aber auch gram-positiven Promotoren SPO2 wie sie in Bacillus Subtilis andlts Closest Relatives, Sonenshein, Abraham L., Hoch, James A., Losick, Richard; ASM Press, District of Columbia, Washington und Patek M., Eikmanns B. J., Patek J., Salim H., Microbiology 1996, 142 1297-1309 beschrieben sind, oder aber auch cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, 1-PR- oder im 1-PL-Promotor, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Bevorzugt ist auch die Verwendung induzierbarer Promotoren, wie z.B. licht- und insbesondere temperaturinduzierbarer Promotoren, wie der PrPi-Promotor. Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen verwendet werden. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden. Weitere Beispiele für Promotoren sind in Patek M. et al., J. Biotechnol. 2003, 104, 311-323 beschrieben.

Die genannten regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Nukleinsäuresequenzen und, wo erwünscht, der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen oder erniedrigen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder Enhancer verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRN A verbessert wird.

Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, 1993, John Wiley & Sons, Incorporated, New York New York, PCR Methods, Gelfand, David H., Innis, Michael A., Sninsky, John J. 1999, Academic Press, Incorporated, California, San Diego, PCR Cloning Protocols, Methods in Molecular Biology Ser., Vol. 192, 2nd ed., Humana Press, New Jersey, Totowa. Sambrook et al., vide supra sowie in TJ. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zur Herstellung von schwefelhaltigen Verbindungen, bei denen es sich bevorzugt um die oben genannten schwefelhaltigen Verbindungen und insbesondere Methionin und/oder Cystein handelt. Diese Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, dass sie Verwendung von den erfindungsgemäßen Mikroorganismen machen und die schwefelhaltigen Verbindungen vorzugsweise durch fermentative Anzucht dieser Mikroorganismen in den Zellen oder im Zellmedium angereichert werden. Dabei ist dem Fachmann bekannt, dass durch Optimierung der bevorzugten Fermentationsverfahren weitere Ausbeutesteigerungen erzielt werden können. In den erfindungsgemäßen Verfahren können die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch- (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zur Produktion von schwefelhaltige Verbindungen, insbesondere L-Methionin, kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) zu finden.

Das zu verwendende Kulturmedium hat in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme zu genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods für General Bacteriology" der American Society für Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981) enthalten.

Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Medien umfassen gewöhnlich eine oder mehrere Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze, Vitamine und/oder Spurenelemente.

Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Zucker wie Mono-, Di- oder Polysaccharide. Besonders geeignete Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cellulose. Man kann Zucker auch über komplexe Verbindungen, wie Melassen, oder andere Nebenprodukte der Zucker-Raffinierung zu den Medien geben. Es kann auch vorteilhaft sein, Gemische verschiedener Kohlenstoffquellen zuzugeben. Andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z.B. Palmitinsäure, Stearinsäure oder Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin, Methanol oder Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure oder Milchsäure.

Stickstoffquellen sind gewöhnlich organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispielhafte Stickstoffquellen umfassen Ammoniak-Gas oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat oder Ammoniumnitrat, Nitrate, Harnstoff, Aminosäuren oder komplexe Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojamehl, Sojaprotein, Hefeextrakt, Fleischextrakt und andere. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Anorganische Salzverbindungen, die in den Medien enthalten sein können, umfassen Chlorid-, Phosphor- oder Sulfatsalze von Calcium, Magnesium, Natrium, Kobalt, Molybdän, Kalium, Mangan, Zink, Kupfer und Eisen.

Als Schwefelquelle für die Herstellung von schwefelhaltigen Feinchemikalien, insbesondere von Methionin, können anorganische schwefelhaltige Verbindungen wie beispielsweise Sulfate, Sulfite, Dithionite, Tetrathionate, Thiosulfate und Sulfide, aber auch organische Schwefelverbindungen, wie Mercaptane und Thiole, verwendet werden.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden.

Chelatbildner können zum Medium gegeben werden, um Metallionen in Lösung zu halten. Besonders geeignete Chelatbildner umfassen Dihydroxyphenole wie Catechol oder Protocatechuat oder organische Säuren wie Citronensäure.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Fermentationsmedien enthalten üblicherweise auch andere Wachstumsfaktoren, wie Vitamine oder Wachstumsförderer, zu denen beispielsweise Biotin, Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nikotinsäure, Panthothenat und Pyridoxin gehören. Wachstumsfaktoren und Salze stammen häufig von komplexen Medienkomponenten, wie Hefeextrakt, Melassen, Maisquellwasser und dergleichen. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genaue Zusammensetzung der Medienverbindungen hängt stark vom jeweiligen Experiment ab und wird für jeden spezifischen Fall individuell entschieden. Information über die Medienoptimierung ist erhältlich aus dem Lehrbuch "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Hrsg. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) S. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Wachstumsmedien lassen sich auch von kommerziellen Anbietern beziehen, wie Standard 1 (Merck) oder BHI (Brain heart infusion, DIFCO) und dergleichen.

Sämtliche Medienkomponenten werden, entweder durch Hitze (20 min bei 1,5 bar und 1210C) oder durch Sterilfiltration, sterilisiert. Die Komponenten können entweder zusammen oder nötigenfalls getrennt sterilisiert werden. Sämtliche Medienkomponenten können zu Beginn der Anzucht zugegen sein oder wahlfrei kontinuierlich oder chargenweise hinzugegeben werden.

Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise zwischen 150C und 450C, vorzugsweise bei 25°C bis 400C und kann während des Experimentes konstant gehalten oder verändert werden. Der pH-Wert des Mediums sollte im Bereich von 5 bis 8,5, vorzugsweise um 7,0 liegen. Der pH- Wert für die Anzucht lässt sich während der Anzucht durch Zugabe von basischen Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure kontrollieren. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie z. B. Fettsäurepolyglykolester, eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie z. B. Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie z. B. Umgebungsluft, in die Kultur eingetragen. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.

Die so erhaltenen, insbesondere L-Methionin enthaltenden, Fermentationsbrühen haben üblicherweise eine Trockenmasse von 7,5 bis 25 Gew.-%.

Vorteilhaft ist außerdem auch, wenn die Fermentation zumindest am Ende, insbesondere jedoch über mindestens 30% der Fermentationsdauer zuckerlimitiert gefahren wird. Das heißt, dass während dieser Zeit die Konzentration an verwertbarem Zucker im Fermentationsmedium auf > 0 bis 3 g/l gehalten, beziehungsweise abgesenkt wird.

Die Fermentationsbrühe wird anschließend weiterverarbeitet. Je nach Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmethoden, wie z. B. Zentrifugation, Filtration, Dekantieren oder einer Kombination dieser Methoden aus der Fermentationsbrühe entfernt oder vollständig in ihr belassen werden.

Anschließend kann die Fermentationsbrühe mit bekannten Methoden, wie z. B. mit Hilfe eines Rotationsverdampfers, Dünnschichtverdampfers, Fallfilmverdampfers, durch Umkehrosmose, oder durch Nanofiltration, eingedickt bzw. aufkonzentriert werden. Diese aufkonzentrierte Fermentationsbrühe kann anschließend durch Gefriertrocknung, Sprühtrocknung, Sprühgranulation oder durch anderweitige Verfahren aufgearbeitet werden.

Es ist aber auch möglich, die schwefelhaltigen Feinchemikalien, insbesondere L-Methionin, weiter aufzureinigen. Hierzu wird die produkthaltige Brühe nach dem Abtrennen der Biomasse einer Chromatographie mit einem geeigneten Harz unterworfen, wobei das gewünschte Produkt oder die Verunreinigungen ganz oder teilweise auf dem Chromatographieharz zurückgehalten werden. Diese Chromatographieschritte können ggf. wiederholt werden, wobei die gleichen oder andere Chromatographieharze verwendet werden. Der Fachmann ist in der Auswahl der geeigneten Chromatographieharze und ihrer wirksamsten Anwendung bewandert. Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration konzentriert und bei einer Temperatur aufbewahrt werden, bei der die Stabilität des Produktes maximal ist.

Die Identität und Reinheit der isolierten Verbindung(en) kann durch Techniken des Stands der Technik bestimmt werden. Diese umfassen Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie (HPLC), spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschichtchromatographie, NIRS, Enzymtest oder mikrobiologische Tests. Diese Analyseverfahren sind zusammengefasst in: Patek et al. (1994, Appl. Environ. Microbiol. 60, 133-140), Malakhova et al. (1996, Biotekhnologiya 11, 27-32), Schmidt et al. (1998, Bioprocess Engineer. 19, 67-70), Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996, Bd. A27, VCH: Weinheim, S. 89-90, S. 521-540, S. 540- 547, S. 559-566, 575-581 und S. 581-587); Michal, G (1999, Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons), Fallon et al. (1987, Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17).

Bevorzugt wird durch die erfindungsgemäßen Verfahren eine Steigerung der Herstellung von schwefelhaltigen Verbindungen, insbesondere von Methionin bzw. Cystein gegenüber dem Wildtyp um mindestens 5%, 10%, 50%, 75%, bevorzugt um mindestens den Faktor 2, 3, 4, 5, 7, 10, besonders bevorzugt mindestens um den Faktor 20, 40, 60, 80, 100, insbesondere bevorzugt um den Faktor 200, 500, 1000 und am meisten bevorzugt um den Faktor 10000 erreicht. In absoluten Mengen kann durch das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere eine Ausbeute von 1 g bis 150 g Methionin pro Liter Fermentationsbrühe erzielt werden.

Die Erfindung wird nun anhand der folgenden, nicht limitierenden Beispiele näher beschrieben:

Beispiele

1. Materialien und Methoden

1.1 Bakterienstämme, Medien und Plasmide

C. glutamicum ATCC 14752 oder ATCC 13032 wurden routinemäßig in CGXII- Minimalmedium (Keilhauer et al. (1993) J. Bacteriol. 175, 5595-5603) kultiviert. Die Transposonmutanten wurden in Gegenwart von Kanamycin (15 mg/ml" ) kultiviert. E. coli DH5α wurde für Standard-Klonierungen und E. coli ET12567 zur Plasmidamplifikation verwendet, wenn die Plasmide in C. glutamicum transformiert werden sollten.

Die in dieser Erfindung verwendeten Stämme und Plasmide sind in der Tabelle 1 dargestellt. Luria broth (LB) Medium, das mit entsprechenden Antibiotika (Kanamycin 50 μg ml"1, Chloramphenicol, 50 μg ml"1, Ampicillin, 100 μg ml"1) versetzt war, wurde als Standardmedium für E. co//-Stämme verwendet. LB- Medium, das mit 4 mM MgSO4 und 10 mM KCl (Psi-broth) versetzt war, wurde als "recovery"-Medium für chemisch transformierte E. coli verwendet. Das "recovery"- Medium für elektroporierte C. glutamicum-Stämme war LBHIS (Luria broth mit brain heart infusion) und Sorbitol (Liebl et al. (1989) FEMS Microbiol Lett, 65, 299- 304). Das Plasmid pCGL0040 (GenBank accession no. U53587) wurde als Donor für das Transposon TnJ5Ji (IS1207 Km1) verwendet und in E. coli ET12567 vervielfältigt.

1.2 Rekombinante DNA-Technologie

Die Transformation von E. co//-Zellen mit Plasmid-DNA wurde mit chemisch kompetentem E. coli DH5α oder ET12567 durchgeführt. Die Zellen wurden gemäß der Rubidium-Chlorid-Methode hergestellt [http://micro.nwfsc.noaa.gov/protocols/] und wie in Sambrook et al. (yide suprä) transformiert. Die Herstellung von kompetenten C. glutamicum-Zellen und die Elektrotransformation wurde wie in der Literatur beschrieben durchgeführt (Ankri (1996), Plasmid, 35, 62 - 66; Liebl et al., vide suprä).

Genomische DNA wurde unter Verwendung des Wizard® genomic DNA- Purification Kit (Promega) isoliert. Plasmidpräparationen aus E. co/ϊ-Zellen wurden routinemäßig mit dem QIAprep Miniprep Kit (Qiagen) durchgeführt. Restriktionsendonukleasen wurden von Roche Diagnostics bezogen. Verdaute DNA- Fragmente wurden aus Agarosegel mit QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen) gewonnen. Standard-DNA-Techniken wurden wie in der Literatur beschrieben durchgeführt (Sambrook et al., vide suprά). DNA- Sequenzierungen wurden unter Verwendung des Global Edition IR2 System (LI-COR Inc., Lincoln, Nebr.) durchgeführt.

Als Genomdatenbank zur Identifizierung von ORFs und Promotoren wurde die ERGO-Datenbank (Integrated Genomics, Chicago, USA) verwendet. Die im Text angegebenen NCgl-Nummern beziehen sich auf die C. glutamicum ATCC 13032 25

- 66 -

Genomsequenz der Genbank am NCBI (Genbank accession no. NC 003450). Die aus der ERGO-Datenbank abgeleiteten Promotoren für die Cystein-Synthase (NCgl2473, Promotorposition 2721625-2721822), Sulfitreduktase (NCgl2718, Promotorposition 3005188-3005389) und O-Acetylhomoserinsulfhydrolase (metY, NCglO625, Promotorposition 667771 -668107) wurden mittels PCR amplifiziert und über Xhόl und .ßαmHI-Linker an Promotor-freies lacZ im Plasmid pClik (Cm1) fusioniert, das durch die gleichen Restriktionsenzyme geöffnet worden war. Die erhaltenen Plasmide wurden als pClik-H185, pClik-H187 und pClik-H217 bezeichnet (siehe Tabelle 1). Eine einzelne Bglll-Restriktionsschnittstelle in diesen Plasmiden wurde benutzt, um mittels PCR amplifiziertes NCgl2640 einzuführen, wofür das Primerpaar 2640-fwd-BglII (5'-CCGCTGCTGCTGGTGGCGCTAGATCTGCTAACGGC-3l) und 2640-rev-BglII (S'-ATGTGTTGGGAGATCTCTTAAGTTATTTAGTCCAG-S') verwendet wurde. Das amplifizierte DNA-Fragment umfasste mutmaßliche regulatorische Elemente, die bis zu 370 Basenpaare stromaufwärts des NCgl2640- Gens lagen.

1.3 Transpose und Mutagenese, Screenen und Lokalisierung der Transpose- und Insertionsstellen

Das Plasmid pCGL0040 wurde aus E. coli ET 12567 isoliert. Anschließend wurde C. glutamicum ATCC 14752 mit dem Plasmid mittels Elektroporation transformiert. Die Transposon-Insertionsmutanten wurden durch Ausplattieren auf LBHIS, das 20 μg Kanamycin ml"1 enthielt, selektioniert. Alle erhaltenen Mutanten wurden vereinigt, zweimal mit sterilem 0,9 %-igem NaCl gewaschen und auf CGXII- Medium, das Kanamycin (20 μg ml"1) und Ethionin (7,5 g l"1) enthielt, in Form von 100 μl-Aliquots einer 106-Verdünnung des vereinigten Pols ausplattiert. Der am schnellsten wachsende Klon wurde für die weitere Analyse ausgewählt. Zur Lokalisation der Transposon-Insertionsstellen wurde genomische DNA aus den Mutanten isoliert. Die Insertionsstellen wurden dann durch Klonieren der Transposon-Chromosom- Verbindungsstellen in pUC18 und anschließende Sequenzierung mit dem Oligonukleotid Tn5531-Eco (51- CGGGTCTACACCGCTAGCCCAGG-3') (Simic et al. (2001) J. Bacteriol 183, 5317-5324) bestimmt. Die so erhaltenen Sequenzen wurden dann mittels des BLASTn-Programms gegenüber der NCBI-gene bank sequence und der ERGO- Datenbank analysiert. Verschiedene Sequenzanalysewerkzeuge (http://www.expasy.org/, http://npsa-pbil.ibcp.fr oder http://pfam.wustl.edu/ (Proteinfamiliendatenbank PFAM) wurden für Muster- und Profilsuchen mit der NCgl2640-Sequenz eingesetzt.

1.4 Chromosomale Deletion von NCgl2640 in C. glutamicum ATCC 13032

Mittels der zwei Primerpaaren 2640-SacBl (5'-GAGAGGGCCCATCAGCAGAACCTGGAACC-S') / 2640-SacB2 (5'-GATCCAGAGGTCCACAACC-S') und 2640-SacB3 (51-GATGGTTCAAGACGAACTCC-31) / 2640-SacB4 (5'-GAGAGTCGACCAGAATCAATTCCAGCCTTC-3I) wurden die stromaufwärts und stromabwärts liegende Region von NCgl2640 durch PCR aus chromosomaler DNA von C. glutamicum ATCC 13032 amplifiziert. Die erhaltenen Fragmente wurde mit ApalIXbal oder SpeVSall verdaut und zusammen in einen nicht-replikativen Vektor pClik-SacB kloniert, der mit ApallSaR verdaut wurde, wodurch das Plasmid pSdel-NCgl2640 erhalten wurde. C. glutamicum ATCC 13032 wurde dann mittels Elektroporation mit dem nicht-replikativen Plasmid pSdel-NCgl2640 transformiert. Kanamycin-resistente Klone enthielten die chromosomal integrierten Plasmide. Anschließend wurde auf den Verlust des Plasmids selektioniert, indem nach Saccharose-resistenten Mutanten gemäß der Methode von Schäfer et al. gescreent wurde (Schäfer et al. (1994) Gene 145:69-73). Die Deletion wurde mittels PCR- Analyse und Southern-Blotting verifiziert.

1.5 LacZ- Aktivitätsmessungen

Ausgewählte mutierte Stämme von C. glutamicum wurden mit den pClik-Plasmiden H185, Hl 87, und H217 oder den mit NCgl2640 komplementierten Derivaten davon (siehe Tabelle 1) komplementiert. Die Transformanten wurden in CGXII-Minimalmedium, das Kanamycin (20 μg ml"1) und Chloramphenicol (15 μg ml" ) enthielt, in der Gegenwart oder Abwesenheit von 10 mM L-Methionin angezogen. Zellen wurden bis zur frühen Log-Phase (OD6oo = 1 - 2) angezogen und hinsichtlich einer ß-Gal- Aktivität wie in Sambrook et al. beschrieben (Sambrook et al., vide suprä) untersucht. Die Assays wurden jeweils dreimal in vier unabhängigen Testserien durchgeführt.

1.6 Isolierung von DNA-bindenden Proteinen

Das Prinzip der Isolierung von DNA-bindenden Proteinen mittels DNA-Affmitäts- Chromatographie unter Verwendung von magnetischen Beads ist im Wesentlichen von Gabielsen et al. (1993), Methods EnzymoL, 218, 508-225) beschrieben worden und ein detailliertes Protokoll ist für C. glutamicum erhältlich, siehe Rey et al. (vide supra). Vorliegend wurde letzteres Protokoll mit einigen geringen Ausnahmen angewendet. Mit Ausnahme der Elutionspuffer wurden alle Puffer mit 2,5 mM L- Methionin versetzt. Unmittelbar nach der Zelldisruption, wurden die rohen Extrakte gegen Proteolyse durch ein Protease-Inhibitor (PMSF, Aprotinin, Leupeptin (Rosenberg et al. (1996) Protein Analysis and Purification. Benchtop Techniques, Boston, Birkhäuser) geschützt. Nach der Ultrazentrifugation des rohen Extrakts (200000 g, 40 min. 40°C) wurde die Proteinlösung durch Gelfiltration (Sephadex G25) entsalzt. Biotinylierte PCR-amplifizierte Promotor-DNA wurde auf Streptavidin-beschichteten Dynabeads® M270 (Dynal Biotech.) immobilisiert. Als ein negatives Kontrollfragment wurde ein 460 bp-Fragment aus der stromaufwärts liegenden Region des graES-Gens aus C. glutamicum amplifiziert. Die Waschpuffer enthielten hohe Mengen an unspezifischer Kompetitor-DNA (Lachssperma DNA, 0,4 mg ml"1, Sigma). I D-SDS-PAGE wurde mit einer 4%-igen Sammelgel und einem 12%-igen Trenngel (Schägger et al. (1987) Anal. Biochem. 166, 368-379) durchgeführt und die Proteine wurden mit kolloidalem Coomassie Brilliant Blue G-250 angefärbt. Das Protokoll für den tryptischen Verdau und die MALDI-TOF- Analyse entspricht im Wesentlichen dem in Hermann et al. (2001) Electrophoresis, 22, 1712-1723 beschriebenen Protokoll.

1.7 Bestimmung der extra- und intrazellulären Methionin-Konzentrationen

Methionin wurde in Form seines o-Phthaldialdehyd-Derivats durch HPLC (Molnar- Perl et al. (2001), J. Chromatogr. 913, 283-302) quantifiziert. C. glutamicum wurde bis zur stationären Phase in 500 ml-Schüttelbechern mit Kulturvolumen von 50-100 ml bei 30°C und 225 rpm angezogen. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation (10.000 g, 10 min. 4°C) entfernt und die Methionin-Konzentration durch HPLC- Analyse bestimmt. Für die Bestimmung von intrazellulären Methionin- Konzentrationen wurden die Zellen von der Flüssigkeit abgetrennt und durch Siliziumöl-Zentrifugation aktiviert (Ebbighausen et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol. , 31 , 184- 190). Anschließend wurden die Zellen durch Ultra¬ schallbehandlung oder durch einen "blue-capped" Ribolyser (FastPrep®, Q-Biogene) aufgeschlossen. Das lösliche Protein im Überstand wurde nach einem Bradford- Assay bestimmt. Der intrazelluläre Gehalt an löslichem Protein in C. glutamicum wurde somit empirisch als 250 mg ml"1 bestimmt. Basierend auf diesem Wert, wurde das komplette interne Zellvolumen einer Probe kalkuliert, um Methionin- Konzentration in Folge der HPLC- Analyse bestimmen zu können.

2. Ergebnisse

2.1 Selektion und Identifizierung von Ethionin-resistenten Transposon-Mutanten

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde von der Hypothese ausgegangen, dass eine Ethionin-Resistenz durch Überproduktion von Methionin erreicht werden kann, die wiederum durch Inaktivierung von putativen Repressoren, die in die Regulation der Methionin-Biosynthese in C. glutamicum involviert sein könnten, erreicht werden kann. Der Grund liegt darin, dass es sich bei Ethionin um ein Strukturanalogon von Methionin handelt, das nicht metabolisiert werden kann und somit hohe Konzentrationen an Methionin vorspiegelt. In Folge davon wird üblicherweise die Methionin-Biosynthese herunterreguliert und der Organismus stirbt schließlich an einem Mangel an Methionin.

Eine der Möglichkeiten, die ein Organismus einsetzen kann, um diese durch ein Antimetabolit verursachte Toxizität zu umgehen, ist den toxischen Wirkstoff auszukompetieren, indem der natürliche Metabolit, in diesem Fall Methionin, über¬ produziert wird. Auf diese Weise wurden bereits in den siebziger Jahren Methionin- resistente Stämme hergestellt (Käse et al., vide supra). Allerdings konnten damals keine Stämme erhalten werden, die Methionin in signifikanter Weise überproduzieren, vermutlich deshalb, weil in den damals durchgeführten Selektionsexperimenten keine Mutanten identifiziert wurden, die als Zentralregulator der Biosynthese von Methionin deaktivieren. Dies war einer der Gründe, warum vorliegend versucht wurde, die Mutationen durch Transposon- vermittelte Mutagenese einzuführen.

Es wurde daher C. glutamicum ATCC 14752 mit pCGL0040 als Donor für das Transposon Tn5531 transformiert. Auf diese Weise wurden etwa 7000 Mutanten auf LBHIS-Platten mit Kanamycin erhalten. Diese Mutanten wurden wie im Stand der Technik beschrieben gepoolt und auf Platten, die CGXII-Medium mit 7,5 g D5L- Ethionin F1 plus Kanamycin enthielten, ausplattiert. Es wurden etwa 100.000 colony forming units (CFU) ausplattiert, um sicherzustellen, dass sämtliche möglicherweise Ethionin-resistenten Mutanten wiedergewonnen werden konnten. Das Wachstum des Wildtyps war bei 6 g l"1 Ethionin für mindestens 4 Tage inhibiert. Nach 2 Tagen . konnten 11 Kanamycin und Ethionin-resistente Mutanten isoliert werden. Alle Mutanten enthielten die identische Tn5531-Insertion in dem ORL NCgl2640. Diese Mutation wurde als 14752-Δ2640 bezeichnet und ein Klon wurde für die weiteren Experimente ausgewählt (Tabelle 1).

2.2 Sequenzanalyse der Transposon-Insertionsstellen

Es konnte festgestellt werden, dass die Stelle der Transposon-Insertion in Stamm 14752::2640 in der C-terminalen Hälfte des putativen Proteins in der Position 2918026/2918027 (Genbank accession mmber tiC 003450) liegt. NCgl2640 ist von NCgl2639 durch 7 Basenpaare getrennt, so dass beide Gene vermutlich als ein Operon organisiert sind. NCgl2539 ist in der Datenbank (Genbank) als eine putative Hydrolase oder Acetyltransferase annotiert (siehe Abbildung 2). NCgl2640 kodiert für ein Protein von 42 kDa. Durch Homologie konnten mehr als 25 putative bakterielle Proteine von signifikanter Homologie (e-Wert < 2e-20) identifiziert werden, von denen keines bisher in funktioneller Weise annotiert worden ist. Durch eine Suche nach konservierten Domänen konnte ein Konsensus-Muster für Proteine unbekannter Funktion (COG2170) mit hoher Signifikanz identifiziert werden, ebenso wie für Motiv 04107 der Proteinfamilien-Datenbank (PFAM), das charakteristisch für die Glutamat-Cystein-Ligase-Familie ist. Weitere Konsensusmotive konnten nicht identifiziert werden. Insbesondere konnten keine DNA-bindenden Proteine identifiziert werden.

2.3 Verifizierung des Methionin-resistenten Phänotyps

C. glutamicum ATCC 14752 und der mutierte Stamm wurden dann in CGXII- Medium, das 3 g l"1 -Glukose enthielt, in Gegenwart oder Abwesenheit von 7,5 g l"1 (Mutante) oder 3,8 g l"1 (Wildtyp) D, L-Ethionin angezogen. Das Wachstum der Mutante in Gegenwart von Ethionin war weder vom Wachstum ohne Methionin noch vom Wachstum des Wildtyps ohne Ethionin unterscheidbar. Das Wachstum des Wildtyps in der Gegenwart wesentlich geringerer subletaler Konzentrationen von Ethionin war dagegen signifikant beeinträchtigt (siehe Abb. 3).

Um auszuschließen, dass Mutationen an anderen Stellen den Ethionin-resistenten Phänotyp verursacht haben könnten, wurde der Effekt einer Inaktivierung von NCgl2640 in C. glutamicum ATCC 13032 getestet. NCgl2640 wurde durch homologe Rekombination und die Selektion von Sucrose-toleranten Mutantenstämmen aus dem Genom von C. glutanicum ausgeschnitten. Diese Mutante, die als 13032::2640 bezeichnet wurde, war gegenüber D, L-Ethionin bei 7,5 g l'1 resistent, wohingegen kein Wachstum des Wildtyps ATCC 13032 auf diesen Platten detektiert werden konnte.

Damit konnte im Rahmen der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden, dass der Ethionin-resistente Phänotyp in der Tat ausschließlich auf der Inaktivierung von NCgl2640 beruht. 2.4 Veränderte Expression von Methionin-Biosynthese-Genen in der NCgl2640- Mutante

Es wurde dann untersucht, ob in der NCgl2640-Mutante die normalerweise strikte Regulation des Schwefeleinbaus, der einen Schlüsselschritt der Methionin- Biosynthese darstellt, verändert ist.

Es wurde von der Hypothese ausgegangen, dass, wenn es sich bei NCgl2640 um einen zentralen Regulator der Biosynthese von Schwefel Verbindungen in C. glutanicum handelt, dieser die Expression von Genen, die in die Assimilation von Schwefel involviert sind, reguliert und es zur Expression von erhöhten Methionin- Mengen kommen müsste, die für die Ethionin-Resistenz verantwortlich wären. Diese Hypothese wurde anhand des Einflusses eines NCgl2640 Knock-outs auf die Expressionslevels von metY, cysK und Sulfatoperongenen untersucht. Dafür wurden der Stamm 14752::2640, der bezüglich NCgl2640 deletiert ist, und der Wildtyp mit /αcZ-Reporterplasmiden pClik-PcysK, pClik-PmetY und pClik-Psulfat (siehe auch Tab. 1) transformiert. Der ATCC 14752- Wildtyp und der mutierte Stamm wurden dann bis zur Log-Phase (OD6O0 = 3) in CGXII-Medium mit oder ohne Zugabe von 10 mM L-Methionin angezogen und die Genexpression mittels der lacZ- Aktivität bestimmt.

Im Wildtyp reduzierte das Vorhandensein von Methionin die Expressionslevel aller untersuchten Gene. Die Expression des Sulfatoperons war komplett unterdrückt. In dem mutierten Stamm wurde eine signifikante Derepression für cysK und das Sulfatoperon beobachtet. Bei beiden Genen war die Expression von Methionin unabhängig, was eine komplette Derepression, d.h. eine komplette Deregulation des Biosyntheseweges für Methionin und andere Schwefel-haltige Verbindungen in dem mutierten Stammhintergrund andeutet (siehe auch Abb. 4). Um polare Effekte der Inaktivierung vonNCgl2640 auf das daneben liegende NCgl2639 (Hydrolase- oder Acetyltransferase, siehe Abb. 2) auszuschließen, wurde NCgl2640 über seinen Promotor in der Mutante exprimiert, was den Wildtyp-Phänotyp wieder herstellte, d.h. eine Methionin-induzierte Repression und geringere (cysK) oder höhere (Sulfatoperon) basale Transkriptionslevel (siehe auch Abb. 4) wurden beobachtet. Dieser Phänotyp ist in den komplementierten Stämmen sogar noch stärker ausgebildet als im Wildtyp. Der Grund liegt vermutlich darin, dass im komplementierten Stamm die Expression von NCgl2640, die von einem "medium copy"-Plasmid aus erfolgte, erhöht ist.

2.5 NCgl2640 bindet nicht an die Promotoren von cysK, wetFund Sulfatoperons

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte somit gezeigt werden, dass die Expression von cysK, dem Sulfatoperon und auch von metY durch NCgl2640 in zentraler Weise reguliert wird. Da klassische DNA-Bindungsmotive nicht in der Sequenz von NCgl2640 identifiziert werden konnten, wurde eine DNA- Affinitätsreinigung in einem so genannten "Pull-Down-Assay" angewendet, um zu überprüfen, ob NCgI an die jeweiligen Promotorregionen der oben genannten Gene binden kann. Die durch PCR amplifizierten und an Beads immobilisierten Promotoren wurden in Gegenwart von 2,5 mM L-Methionin mit rohen Extrakten von C. glutanicum-ZeÜQn, die in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 mM L-Methionin kultiviert worden waren, inkubiert. Proteine, die von den Promotoren bei Hochsalzkonzentration (> 200 mM) eluierten, wurden durch 1 D-SDS-PAGE aufgetrennt und mittels MALDI-TOF analysiert.

Mit einem ähnlichen Ansatz hatten Rey et al. (vide suprά) zuvor den McbR- Repressor zusammen mit vier weiteren Proteinen identifiziert, die spezifisch den met7-Promotor zu binden scheinen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnten diese Ergebnisse bestätigt werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass McbR ebenfalls an die Promotoren von cysK und das Sulfatoperon bindet (siehe Abb. 5). In beiden Studien konnte jedoch NCgl2640 nicht nachgewiesen werden, was darauf hindeutet, dass eine direkte DNA-Protein-Interaktion nicht an der durch NCgl2640 vermittelten Regulation beteiligt ist.

2.6 Erhöhte L-Methionin-Mengen in der NCgl2640-Mutante

Die Resistenz von C. glutanicum 14752::2640 gegenüber hohen Mengen an Ethionin scheint somit eine Folge einer erhöhten Biosynthese von L-Methionin zu sein. Um diese Hypothese zu bestätigen, wurde die Herstellung von L-Methionin im Wildtyp und in Mutanten in CGXII Minimalmedium "batch" -Kulturen überprüft.

Es konnte gezeigt werden, dass der mutierte Stamm in der Regel mindestens zweimal soviel Methionin wie der Wildtyp produzierte. In Gegenwart von Ethionin konnte die Methionin-Sekretion in der Mutante, aber nicht im Wildtyp stimuliert werden (siehe Abb. 6A). Intrazelluläre Methionin-Mengen waren in gleicher Weise in der Mutante verdoppelt, wohingegen durch Ethionin die intrazelluläre Methionin-Menge vermindert wurde, was vermutlich auf eine Stimulation der Methionin-Sekretion beruht (siehe Abb. 6B). Die gesamte Methionin-Menge war in der Mutante doppelt so hoch wie im Wildtyp.

Die oben dargestellten Experimente zeigen, dass Mikroorganismen, in denen die kodierenden Sequenzen für NCgl2640 deletiert sind und somit der Gehalt und/oder die Aktivität an durch diese Nukleinsäure kodiertem Protein im Vergleich zum Wildtyp vermindert sind, in der Lage sind, Methionin in erhöhten Mengen zu produzieren. Da durch NCgl2640, bei dem es sich wahrscheinlich um einen trans-agierenden Regulator handelt, die Gene des Schwefel-Stoffwechsels reguliert werden, können die erfindungsgemäßen Mikroorganismen auch zur Herstellung anderer schwefelhaltiger Verbindungen verwendet werden. Dies ist darin begründet, dass z.B. auch zur Herstellung von Cystein seitens der Mikroorganismen auf die Stoffwechselwege, die zur Reduktion des Schwefel führen, zurückgegriffen werden muss und weitere schwefelhaltige Verbindungen wie z.B. Glutathion oder S-Adenosylmethionin vom Vorhandensein von Cystein und/oder Methioin abhängen.

Sequenzdaten

SEQ ID No.1 (Genbank accession number NCgl2640): ATGGGCATTGAGTTTAAGCGTTCACCGCGACCCACCCTGGGCGTTGAGTG GGAAATTGCACTTGTTGATCCAGAAACACGTGATCTAGCCCCGCGCGCTG CAGAAATACTAGAGATTGTGGCCAAGAACCACCCTGAGGTGCACCTCGA GCGCGAATTCCTCCAAAACACCGTGGAGCTTGTCACCGGAGTGTGCGAC ACCGTCCCCGAAGCGGTGGCAGAGCTTTCCCACGATCTAGATGCGCTGAA AGAAGCAGCGGATTCTCTCGGGCTTCGGTTGTGGACCTCTGGATCCCACC CATTTTCGGATTTCCGCGAAAACCCAGTATCTGAAAAAGGCTCCTACGAC GAGATCATCGCGCGCACCCAATACTGGGGAAACCAGATGTTGATTTGGG GCATTCACGTCCACGTGGGCATCAGCCATGAAGATCGCGTGTGGCCGATC ATCAATGCGCTGCTGACAAATTACCCACATCTGTTGGCACTTTCTGCAAG CTCTCCAGCATGGGACGGACTTGATACCGGTTATGCCTCCAACCGGACGA TGCTCTACCAACAGCTGCCTACAGCCGGACTGCCATACCAATTCCAAAGC TGGGATGAATGGTGCAGCTACATGGCGGATCAAGATAAATCCGGTGTCA TCAACCACACCGGATCCATGCACTTTGATATCCGCCCCGCATCCAAATGG GGAACCATCGAAGTCCGCGTGGCCGATTCTACCTCCAACCTGCGGGAACT GTCTGCCATCGTGGCGTTGACCCACTGTCTCGTGGTGCACTACGACCGCA TGATCGACGCTGGCGAAGAGCTTCCCTCCCTGCAACAATGGCACGTTTCG GAAAATAAATGGCGCGCGGCTAGGTATGGTCTGGATGCCGAAATCATCA TTTCCAGAGACACCGATGAAGCGATGGTTCAAGACGAACTCCGCCGACT AGTAGCGCAATTGATGCCTCTAGCCAACGAACTCGGCTGCGCTCGTGAGC TTGAACTTGTGTTGGAAATCCTGGAACGTGGTGGTGGATACGAACGCCAA CGCAGAGTGTTTAAAGAAACTGGCAGTTGGAAAGCTGCAGTTGATTTAG CCTGCGACGAACTCAACGACCTCAAAGCACTGGACTAA

SEQ ID No.2 (Genbank accession number NP_601931): MGIEFKRSPRPTLGVEWEIALVDPETRDLAPRAAEILEIVAKNHPEVHLEREF LQNTVELVTGVCDTVPEAVAELSHDLDALKEAADSLGLRLWTSGSHPFSDF RENPVSEKGSYDEIIARTQYWGNQMLIWGIHVHVGISHEDRVWPIINALLTN YPHLLALSASSPAWDGLDTGYASNRTMLYQQLPTAGLPYQFQSWDEWCSY MADQDKSGVINHTGSMHFDIRPASKWGTIEVRVADSTSNLRELSAIVALTHC LVVHYDRMIDAGEELPSLQQWHVSENKWRAARYGLDAEIIISRDTDEAMVQ DELRRLVAQLMPLANELGCARELELVLEILERGGGYERQRRVFKETGSWKA AVDLACDELNDLKALD

SEQ ID No.3 (McbR): GTGGCTGCTAGCGCTTCAGGCAAGAGTAAAACAAGTGCCGGGGCAAACC GTCGTCGCAATCGACCAAGCCCCCGACAGCGTCTCCTCGATAGCGCAACC AACCTTTTCACCACAGAAGGTATTCGCGTCATCGGTATTGATCGTATCCT CCGTGAAGCTGACGTGGCGAAGGCGAGCCTCTATTCCCTTTTCGGATCGA AGGACGCCTTGGTTATTGCATACCTGGAGAACCTCGATCAGCTGTGGCGT GAAGCGTGGCGTGAGCGCACCGTCGGTATGAAGGATCCGGAAGATAAAA TCATCGCGTTCTTTGATCAGTGCATTGAGGAAGAACCAGAAAAAGATTTC CGCGGCTCGCACTTTCAGAATGCGGCTAGTGAGTACCCTCGCCCCGAAAC TGATAGCGAAAAGGGCATTGTTGCAGCAGTGTTAGAGCACCGCGAGTGG TGTCATAAGACTCTGACTGATTTGCTCACTGAGAAGAACGGCTACCCAGG CACCACCCAGGCGAATCAGCTGTTGGTGTTCCTTGATGGTGGACTTGCTG GATCTCGATTGGTCCACAACATCAGTCCTCTTGAGACGGCTCGCGATTTG GCTCGGCAGTTGTTGTCGGCTCCACCTGCGGACTACTCAATTTAG

SEQ ID No.4 (Genbank accession number NP_602128): MAASASGKSKTSAGANRRRNRPSPRQRLLDSATNLFTTEGIRVIGIDRILREA DVAKASLYSLFGSKDALVIAYLENLDQLWREAWRERTVGMKDPEDKIIAFF DQCIEEEPEKDFRGSHFQNAASEYPRPETDSEKGIVAAVLEHREWCHKTLTD LLTEKNGYPGTTQANQLLVFLDGGLAGSRLVHNISPLETARDLARQLLSAPP ADYSI

Abbildungslegenden

Abb. 1 Der getrennte Weg zur Inkorporation von Schwefel in der Methioninbiosynthese

Schwefel kann entweder über direkte Sulfhydrolation, die durch MetY (A) katalysiert wird, oder durch den Transsulfhydrolationsweg (B) inkorporiert werden. /αcZ-Fusionen wurden für Promotoren der markierten Genprodukte hergestellt. Der Promotor von NCgl2718 steuert die Expression von Genen, die im Sulfat-Cluster (NCgl2715-NCgl2720) organisiert sind.

Folgende Abkürzungen wurden verwendet: Ask, Aspartatkinase, AsDH, Aspartat- semialdehyd-Dehydrogenase, Hom, Homoserin-Dehydrogenase, MetA, Homoserin- Acetyltransferase, MetB, Cystathionin-γ-Synthase, MetC, Cystathionin-ß-Lyase, MetH, Methioninsynthase, MetY, O-Acetylhomoserin-Sulfhydrolase, MetK, S- Adenosylmethionin-Synthase, NCgl2715, Sulfat- Adenosyltransferase Untereinheit 1; NCgl2716, Sulfat-Adenosyltransferase Untereinheit 2; NCgl2717, PAPS-Reduktase; NCgl2718, Sulfidreduktase, die als putative Nitritreduktase annotiert ist; CysK, Cystein-Synthase.

Abb. 2 Der genomische Kontext von NCgl2640

Die Genbank-Annotationen, die für die ORFs erhältlich sind: NCgl2638, Ähnlichkeiten zu einem vierteiligen Na+/H+-Antiporter; NCgl2639, ähnlich zu vorhergesagten Hydrolasen oder Acyltransferasen, alpha/beta- Hydrolase-Superfamilie; NCgl2640, hypothetisches Protein (uncharakterisierter BCR); NCgl2641, hypothetisches Protein, keine Annotation; Tn5531, Transposon 5531 (ISl 207). Das gefüllte Dreieck stellt die Stelle der Insertion von Tn5531 in NCgl2640 dar.

Abb. 3 Wachstumskurven von C. glutamicum- Wildtyp und Mutanten, die in CGXII-Medium in Gegenwart oder Abwesenheit von Ethionin angezogen wurden

Die Glukosekonzentration betrug 3 g l"1; die D, L-Ethionin-Konzentrationen betrugen 3,5 g l"1 oder 7,5 g l"1 für den Wildtyp oder Mutantenstrang. Es muss beachtet werden, dass der Wildtyp nicht in Gegenwart von 7,5 g l"1 D, L-Ethionin wächst. Gefüllte Symbole: Ethionin vorhanden während der Kultivierung; offene Symbole: Kultivierung ohne Ethionin; ▲ Wildtyp; • mutanter Stamm. Abb. 4 Einfluss des NCgl2640 Knock-outs auf die Methionin-abhängige Expression von cysK, metYvxύ das Sulfatoperon

C. glutamicum-ATCC 14752 (Wildtyp; WT), der mutierte Stamm 14752::2640 und mutierte Stämme, die mit dem Plasmid-ständigen NCgl2640 (::2640-cpl) komplementiert waren, und die Reporterplasmide pClik-Pcy.su-, pClik-'PmetY oder pClik-Psulfat enthielten, wurden in CGXII (3 g 1-1 Glucose)-Medium in Gegenwart oder Abwesenheit von Methionin (10 mM) angezogen. Die Promotor- Aktivität wurde mittels LacZ- Aktivitätsreporter- Assays bestimmt und in Form von Miller- Einheiten quantifiziert. Dunkle Balken: kein Methionin im Wachstumsmedium; leere Balken: L-Methionin im Wachstumsmedium.

Abb. 5 SDS-PAGE für Proteine, die an putative Promotorregionen der C. glutamicum-GenQ für Cystein-Synthase (cysK), O-Acetylhomoserin-Sulfhydrolase (metY) und Gene des putativen Sulfatoperons binden

1 , TetR-ähnlicher Regulator McbR, der aus Rey et al. (vide suprä) bekannt war; 2, Exopoly-Phosphatase (Abbauprodukt); 3, Exopoly-Phosphatase; 4, ATP-Phosphoribosyl-Transferase; 5, DNA-Polymerase I.

Mit Ausnahme der Exopoly-Phosphatase und der DNA-Polymerase I band keines der identifizierten Proteine an das groES Kontroll-Promotorfragment. GAP-DH, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase wurde als Markerprotein (37 kDa) verwendet; M, Proteinmarker.

Abb. 6 Extra- (A) und intrazelluläre (B) L-Methionin-Mengen in C. glutamicum- Wildtyp und im NCgl2640 Knock-out Mutantenstamm (::2640) in Gegenwart oder Abwesenheit von Ethionin

Dunkle Balken: kein Ethionin während der Inkubation, weiße Balken: 3,5 g T1 (Wildtyp) oder 7,5 g T1 (: :2640) D, L-Ethionin. Tabelle 1 : Zusammenfassung der vorstehend genannten Stämme und Plasmide.

Literaturangaben in Tabelle 1 :

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