La présente invention concerne des microorganismes et leur utilisation pour la production de diacides carboxyliques.

Les acides dicarboxyliques (aussi appelés "diacides") sont utilisés comme matières premières par exemple dans la synthèse de polyamides et de polyesters, d'huiles lubrifiantes, d'agents plastifiants ou de parfums.

Les procédés de production des diacides varient suivant le nombre d'atomes de carbone du squelette carboné du diacide considéré. Par exemple, l'acide azélaïque (diacide en C9) est obtenu classiquement par oxydation chimique de l'acide oléique par l'ozone tandis que l'acide sébacique (diacide en C10) est produit par oxydation alcaline de l'acide ricinoléique. L'acide dodécanedioïque (diacide en C12) est un produit de la pétrochimie. La voie microbiologique est utilisée pour la production d'acide brassylique (diacide en C13) à partir de tridécane.

Compte tenu de la diversité des diacides qui sont utilisés dans les différentes applications, l'intérêt d'une voie de production applicable à la plus large gamme possible de diacides est souhaitable. Bien que se caractérisant par une vitesse de réaction plus lente que celle de la voie chimique, la voie biologique présente l'intérêt d'être applicable à une grande variété de substrats.

Bien que de nombreuses espèces microbiennes sauvages telles que Cryptococcus neoformans, Pseudomonas aeruginosa, Candida cloacae, etc. soient capables de biosynthétiser des diacides, les niveaux de production demeurent relativement peu élevés.

Aussi, pour obtenir des excrétions substantielles de diacides, il convient d'utiliser des mutants qui ont été bloqués au niveau de la β-oxydation..

Une autre technique plus contraignante, mettant en œuvre les techniques de mutagénèse dirigée, a été développée pour Candida tropicalis. À partir d'une souche sauvage appartenant à cette espèce, la disruption séquentiellement des quatre gènes codant les deux isoenzymes de acyl-CoA oxydase (Aox) qui catalysent la première étape de la β-oxydation a été réalisée (Détermination of Candida tropicalis Acylcoenzyme A Oxidase Isoenzyme Function by.Sequential Gène Disruption. Mol. Cell. Biol. 11 , 1991 , 4333-4339, et brevet US 5254466 A1 ). Cependant, les souches de Candida tropicalis produites ne semblent pas totalement stables et se prêtent à des réversions possibles. C'est pour cette raison que des améliorations ont dû être apportées à l'art antérieur.

D'autres exemples d'amélioration ont été rapportés. Notamment la demande WO 2014100461 concerne des procédés biologiques qui permettent d'obtenir des acides dicarboxyliques gras. Pour ce faire, certains gènes de la voie métabolique de Γω- oxydation ont été surexprimés, afin de permettre la formation de diacides.

Toutefois, de telles méthodes ne semblent pas permettre une production de diacides à longue chaîne de manière optimale.

Aussi, l'invention a pour but de remédier aux inconvénients de l'art antérieur.

Un des buts de l'invention est de fournir un procédé de synthèse de diacides qui permet une production accrue.

Un autre but de l'invention est de fournir des microorganismes modifiés permettant de mettre en œuvre ce procédé.

Encore un autre but de l'invention est d'utiliser de nouveaux outils génétiques permettant l'amélioration de la production de diacides par des microorganismes.

L'invention concerne l'utilisation d'une souche de levure incapable de dégrader les acides gras, notamment une souche de Yarrowia lipolytica, surexprimant au moins les gènes suivants :

- le gène ALK3, codant une cytochrome P450 mono oxygénase

- l'un au moins des gènes ADH2 et ADH5 codant chacun une déshydrogénase d'alcools, et

- l'un au moins des gènes FALDH3 et FALDH4, codant chacun une déshydrogénase d'aldéhydes gras ou le gène FA01 codant une oxydase d'alcool gras,

pour la préparation, par fermentation, d'au moins un diacide carboxylique, à partir d'acides gras ou d'hydrocarbures, notamment à partir d'acides gras issus d'huiles végétales.

L'invention repose sur la constatation surprenante faite par les inventeurs que la surexpression des gènes Alk3, d'au moins un gène choisi parmi ADH2 et ADH5 et d'au moins un gène choisi parmi FALDH3, FALDH4 et FA01 permet d'augmenter significativement la production de diacides, notamment à partir d'acides gras ou d'hydrocarbures (alcanes, alcènes ou alcynes).

De manière inattendue, les inventeurs ont mis en évidence une synergie des surexpressions des gènes susmentionnés sur la production de diacides, alors que la simple surexpression de chacun de ces gènes n'a pas ou peu d'effet ou à un effet inverse : la production de diacides est largement diminuée. Ce résultat est surprenant car il est connu de l'état de la technique que par exemple la surexpression de cytochrome P450 peut convertir des acides gras ou des hydrocarbures en diacides, sans faire intervenir d'autres enzymes de Γω-oxydation, i.e. les déshydrogénases d'aldéhydes gras et les déshydrogénase d'alcool gras.

Dans l'invention, on définit par diacides, ou acides dicarboxyliques, des composés organiques possédant deux fonctions carboxyle. La formule moléculaire de ces composés est généralement notée HOOC-R-COOH, où R peut être un groupe alkyle, alcényle, alcynyle ou aryle.

Les diacides obtenus par le procédé de l'invention sont issus d'hydocarbures saturés ou non, linéaires ou branchés, ou de leurs acides carboxyliques équivalents, et sont convertis par la voie de Γω-oxydation.

Par « surexpression », on entend dans l'invention le niveau d'expression d'un gène qui a été introduit artificiellement dans le génome d'une souche de levure, de manière ectopique ou non, (mesuré par la quantité d'ARN produit, ou par la quantité de protéine issue de cet ARN), qui est au moins deux fois supérieur au niveau d'expression du même gène endogène. Le gène est dit « surexprimé » si la somme des expressions du gène (exogène et éventuellement endogène) est au moins deux fois supérieure à l'expression du gène endogène lors que la souche de levure n'est pas transformée ou qu'elle est dite sauvage de référence.

En d'autre termes, pour l'exemple du gène ALK3, les souches de levures utilisées dans l'invention ont été préalablement transformées par une molécule d'acides nucléiques codant ledit gène ALK3, placé sous contrôle d'éléments régulant son expression qui ne correspondent pas aux éléments de régulation du gène dans son contexte naturel (par exemple un promoteur constitutif qui n'est pas le promoteur endogène du gène ALK3, présence de séquence(s) d'augmentation ou de facilitation de l'expression - enhancer..). Il y aura surexpression si la quantité totale de produit exprimé par la souche transformée est au moins deux fois supérieure à la quantité de produit exprimé par une souche de levure non transformée par le gène ALK3.

L'homme du métier, avec ses connaissances générales de biologie moléculaire sera en mesure de quantifier cette surexpression par des techniques de PCR quantitative pour mesurer le niveau d'expression des ARN, ou par des techniques immunologiques pour mesurer la quantité de protéines.

L'exemple ci-dessus concernant le gène ALK3 s'applique mutatis mutandis aux autres gènes surexprimés dans le cadre de l'invention.

Afin de favoriser la production de diacides, il est nécessaire que les souches de levures utilisées dans le cadre de l'invention pour mettre en œuvre le procédé de production soient incapables de dégrader les acides gras. En d'autres termes, il est nécessaire que les souches de levures utilisées ne puissent pas dégrader, ni les acides gras (les acides carboxyliques ayant une longue chaîne carbonée, saturée ou non, ramifiée ou non), ni les diacides obtenus par conversion lors des étapes de Ι'ω- oxydation.

Dans l'invention, les acides gras peuvent être considérés comme libres ou sous forme estérifiée avec du glycérol pour former des monoglycérides, des diglycérides ou des triglycérides.

Ainsi, en limitant la dégradation des acides gras, et par conséquent la dégradation des diacides, ces derniers vont s'accumuler, et leur production sera donc augmentée.

Dans l'invention, on utilise une souche de levure qui surexprime :

- le gène ALK3, codant pour une cytochrome P450 monooxygenase appartenant à la famille,

- l'un au moins des gènes ADH2 et ADH5 codant pour des déshydrogénases d'alcools, et

- l'un au moins des gènes FALDH3, FALDH4 codant pour des déshydrogénases d'aldéhydes gras et FA01, codant pour une oxydase d'alcools gras. FALDH3

YALI0B01298g est également nommé HFD4 (Iwama et al., 2014) chez Yarrowia lipolytica. FALDH4 YALI0A17875g est également nommé FALDH1 (Gatter et al., 2014) et HFD3 (Iwama et al., 2014) chez Yarrowia lipolytica.

Cela signifie donc que dans l'invention les 21 combinaisons de gènes suivantes sont envisagées

- ALK3, ADH2 et FALDH2,

- ALK3, ADH2 et FALDH4,

- ALK3, ADH2 et FA01 ,

- ALK3, ADH2, FALDH2 et FALDH4,

- ALK3, ADH2, FALDH2 et FA01 ,

- ALK3, ADH2, FALDH4 et FA01 ,

- ALK3, ADH2, FALDH2, FALDH4 et FA01 ,

- ALK3, ADH5 et FALDH2,

- ALK3, ADH5 et FALDH4,

- ALK3, ADH5 et FA01 ,

- ALK3, ADH5, FALDH2 et FALDH4,

- ALK3, ADH5, FALDH2 et FA01 ,

- ALK3, ADH5, FALDH4 et FA01 ,

- ALK3, ADH5, FALDH2, FALDH4 et FA01 ,

- ALK3, ADHA2, ADH5 et FALDH2,

- ALK3, ADHA2, ADH5 et FALDH4,

- ALK3, ADHA2, ADH5 et FA01 ,

- ALK3, ADHA2, ADH5, FALDH2 et FALDH4,

- ALK3, ADHA2, ADH5, FALDH2 et FA01 ,

- ALK3, ADHA2, ADH5, FALDH4 et FA01 , et

- ALK3, ADHA2, ADH5, FALDH2, FALDH4 et FA01

Les souches de levure avantageuses utilisées dans le cadre de l'invention sont les suivantes : les souches de levures Candida spp. (par exemple: C. tropicalis, C. viswanathii), les souches de levures Yarrowia spp. (en particulier Y. lipolytica), les souches de levures Pichia spp., les souches de levures Saccharomyces spp. et les souches de levures Kluyveromyces spp.

Les souches avantageuses selon l'invention sont des souches de Yarrowia lipolytica incapables de dégrader les acides gras, et qui surexpriment l'une au moins des 21 combinaisons de gènes de l'invention, listées ci-dessus.

Avantageusement, le gène ALK3 surexprimé dans l'invention comprend ou consiste essentiellement en la séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO : 1. ALK3 de l'invention peut également couvrir des gènes présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 sous réserve que ces séquences codent des protéines qui possèdent une activité cytochrome P450 mono oxygénase, et notamment les gènes de séquences suivantes : SEQ ID NO : 2 (YAAL0S03-16006g1_1 ), SEQ ID NO : 3 (YAGA0E09252g1_1 ) et SEQ ID NO : 4 (YAYA0S2-22892g1_1 ).

Avantageusement, le gène ADH2 surexprimé dans l'invention comprend ou consiste essentiellement en la séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO : 5. Le gène ADH2 de l'invention peut également couvrir des gènes présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 sous réserve que ces séquences codent des protéines qui possèdent une activité déshydrogénase d'alcools.

En outre, le gène ADH5 surexprimé dans l'invention comprend ou consiste essentiellement en la séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO : 6. Le gène ADH5 de l'invention peut également couvrir des gènes présentant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 sous réserve que ces séquences codent des protéines qui possèdent une activité déshydrogénase d'alcools.

Avantageusement, le gène FALDH3 surexprimé dans l'invention comprend ou consiste essentiellement en la séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO : 7. Le gène FADH3 de l'invention peut également couvrir des gènes présentant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 sous réserve que ces séquences codent des protéines qui possèdent une activité déshydrogénase d'aldéhydes gras.

Avantageusement, le gène FALDH4 surexprimé dans l'invention comprend ou consiste essentiellement en la séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO : 8. Le gène FADH4 de l'invention peut également couvrir des gènes présentant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 8 sous réserve que ces séquences codent des protéines qui possèdent une activité déshydrogénase d'aldéhydes gras.

Avantageusement, le gène FA01 surexprimé dans l'invention comprend ou consiste essentiellement en la séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO : 9. Le gène FADH4 de l'invention peut également couvrir des gènes présentant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 9 sous réserve que ces séquences codent des protéines qui possèdent une activité oxydase d'alcool gras, et notamment les séquences SEQ ID NO : 10 (YAYA0S1 -26698g), SEQ ID NO : 11 (YAGA0F17920g), SEQ ID NO : 12 (YAAL0S04-08768g) et SEQ ID NO : 13 (YAPH0S5-07338g).

L'activité cytochrome P450 monooxygenase peut être mesurée par spectre Spectre CO : Spectre différentiel entre du P450 réduit et présence de monoxyde de carbone et du P450 réduit, comme décrit dans Estabrook et Werringloer 1978. Methods Enzymol.52:212-220. Une autre méthode consiste à mettre les enzymes en présente de substat (7-ethoxyresorufine, 7-pentoxyresorufine) pour qu'ils soient métabolisés. Le produit de la réaction, la resorufine, est fluorescent et peut être quantifié par exemple à l'aide d'un lecteur de fluorescence.

L'activité déshydrogénase d'aldéhydes gras peut être par exemple mesurée en étudiant le métabolisme du pyrènedécanal par HPLC. En présence de pyrophosphate de sodium 20 mM à pH 8, de 1 mM NAD, de Triton X-100 à 1 % (v/v ; sous sa forme réduite) et de 50 μΜ de pyrènedécanal, la réaction est réalisée en présence de l'enzyme. Après réaction à 37°C pendant 20-30 min, la réaction est arrêtée avec du méthanol, et le mélange réactionnel est centrifugé à 16 000 g avant analyse par HPLC.

Une autre méthode peut être inspirée de Iwama et al., 2014, J.Biol. Cell. Dans une culture de cellules du n-décane est ajouté à une concentration finale de 1 % pendant 6h. Les cellules sont lavées, et reprises dans un tampon d'homogénéisation (25 mM HEPES-NaOH (pH 7.3), 100 mM KCI, 10% glycérol, 1 mM dithiothréitol, et 1 % d'inhibiteurs de protéases) et broyées avec des billes de diamètre de 0,45 à 0,5 mm de diamètre. L'homogénat est centrifugé deux fois à 1000g pendant 10 min à 4°C. 1 % v/v de Tween 80 est ajouté au surnageant, et le mélange est laissé 20 min à 4°C puis centrifugé à 13000g pendant 10 min. Le surnageant est alors analysé par spectrométrie de masse pour mesurer les produits de la conversion du n-décane.

L'activité déshydrogénase d'alcool peut être mesurée selon le protocole de Napora- Wijata et al. Biomolecules 2013, 3, 449-460. Brièvement, l'activité alcool déshydrogénase est déterminée en mesurant la réduction de NAD(P)+ at 340 nm. 20 L de solution (alcool ou sucre, 100 mM dans 50 mM potassium phosphate, 40 mM KCI, pH 8.5) sont ajoutés à 140 μί de potassium phosphate (50 mM, 40 mM KCI, pH 8.5), suivi par 20 μί d'enzyme (dans 10 mM sodium phosphate, pH 7.5). La réaction est initiée en ajoutant 20 μί de NAD+ (or NADP+; 10 mM dans l'eau) et la réaction est réalisée pendant 10 min. Des réactions sans substrats sont réalisées comme contrôles. L'activité est définie comme la quantité d'enzyme capable de produire 1 μηηοΙ de NADH par min.

La souche de levure susmentionnée peut être une souche de Yarrowia lipolytica transformée de sorte qu'elle surexprime l'une quelconque des combinaisons de gènes susmentionnés. Dans ce cas, il s'agit d'une surexpression « autologue ». Il est toutefois possible de transférer la voie métabolique dans un autre organisme, de sorte que la voie de biosynthèse des diacides est reproduite. Aussi, il est possible de faire surexprimer à une levure d'un autre genre que le genre Yarrowia, par exemple des levures des genres Candida, Pichia ou Saccharomyces (sans être limitatif) les gènes des combinaisons susmentionnées. Il s'agira alors d'une surexpression « hétérologue ou orthologue ».

Dans l'invention, les souches de levures utilisées sont incapables de dégrader les acides gras. En effet, le but de l'invention est d'augmenter la production de diacides en limitant autant que possible toute voie métabolique qui aurait pour but de dégrader les diacides biosynthétisés. Pour ce faire, il est possible,

- soit d'inactiver la voie de dégradation : la β-oxydation, par exemple en réalisant une délétion ou une disruption des gènes POX codant les iso-enzymes de l'acyl- CoA oxydase, impliqués dans la première étape de la β-oxydation péroxyisomale, notamment les gènes POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 et POX6, ce qui va inhiber la dégradation des acides gras au niveau des péroxysomes,

- soit de réaliser une délétion ou une disruption du gène MFE2, enzyme multifonctionnelle impliquée dans la deuxième et la troisième étapes de la β- oxydation péroxysomal,

- soit en réalisant une délétion ou une disruption des gènes FAA1 et/ou PXA 1 et/ou 2. Le gène FAA 1 code pour une fatty acid CoA synthétase cytoplasmique et les gènes PXA 1 et PXA2 codent pour un ABC transporteur impliqué dans le transport des acides gras dans les péroxysosomes.

Aussi, en résumé, lorsque l'on utilise la souche de levure modifiée telle que définie ci-dessus, il est possible de réaliser une production de diacides par fermentation. La source avantageuse de substrat de fermentation est un acide gras, un hydrocarbures ou un mélange d'acides gras et d'hydrocarbures.

Si la composition utilisée comme substrat comprend plusieurs acides gras ou hydrocarbures de nature différente (chaîne carbonée de taille différente, présence d'instaurations de substitutions, ...), le résultat de la fermentation conduira à l'obtention d'un mélange des diacides correspondants aux substrats. Par exemple, si les substrats comprennent un hydrocarbure en C5 et un hydrocarbure en C10, le résultat de la fermentation sera l'obtention d'un mélange de diacides en C5 et en C10. L'exemple ci- dessus s'applique également aux acides carboxyliques.

Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'une souche de Yarrowia lipolytica ou de Candida tropicalis incapable de dégrader les acides gras, surexprimant au moins les gènes suivants :

- le gène ALK3 comprenant ou consistant en la séquence suivante SEQ ID NO : 1 , codant une cytochrome P450 mono oxygénase, ou consistant en une séquence présentant au moins 75% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 ,

- l'un au moins des gènes ADH2 et ADH5 comprenant ou consistant respectivement en la séquence SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO : 6, codant chacun une déshydrogénase d'alcools, et

- l'un au moins des gènes FALDH3 et FALDH4 comprenant ou consistant respectivement en la séquence suivante SEQ ID NO : 7 ou SEQ ID NO : 8, codant chacun une déshydrogénase d'aldéhydes gras ou le gène FA01 comprenant ou consistant en la séquence suivante SEQ ID NO : 9 codant une déshydrogénase d'alcool gras,

pour la préparation, par fermentation, d'au moins un diacide carboxylique.

Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée, où ladite souche de levure surexprime en outre le gène CPR1 qui code pour une NADPH-cytochrome réductase.

Avantageusement, outre les combinaisons de gènes susmentionnées (ALK3, ADH2/5, FALDH3/4 et FA01 ), les inventeurs ont montré que la surexpression du gène CPR1 codant une cytochrome P450 réductase permettait d'augmenter la production de diacide.

Dans l'invention, le gène CPR1 est défini comme comprenant ou consistant en la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 14, ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 14 sous réserve que ces séquences codent un protéine possédant une activité cytochrome P450 réductase.

Lorsque le gène CPR1 est surexprimé, les souches possibles couvertes par l'invention sont les suivantes :

- CPR1 , ALK3, ADH2 et FALDH2,

- CPR1 , ALK3, ADH2 et FALDH4,

- CPR1 , ALK3, ADH2 et FA01 ,

- CPR1 , ALK3, ADH2, FALDH2 et FALDH4,

- CPR1 , ALK3, ADH2, FALDH2 et FA01 ,

- CPR1 , ALK3, ADH2, FALDH4 et FA01 ,

- CPR1 , ALK3, ADH2, FALDH2, FALDH4 et FA01 ,

- CPR1 , ALK3, ADH5 et FALDH2,

- CPR1 , ALK3, ADH5 et FALDH4,

- CPR1 , ALK3, ADH5 et FA01 , - CPR1 , ALK3, ADH5, FALDH2 et FALDH4,

- CPR1 , ALK3, ADH5, FALDH2 et FA01 ,

- CPR1 , ALK3, ADH5, FALDH4 et FA01 ,

- CPR1 , ALK3, ADH5, FALDH2, FALDH4 et FA01 ,

- CPR1 , ALK3, ADHA2, ADH5 et FALDH2,

- CPR1 , ALK3, ADHA2, ADH5 et FALDH4,

- CPR1 , ALK3, ADHA2, ADH5 et FA01 ,

- CPR1 , ALK3, ADHA2, ADH5, FALDH2 et FALDH4,

- CPR1 , ALK3, ADHA2, ADH5, FALDH2 et FA01 ,

- CPR1 , ALK3, ADHA2, ADH5, FALDH4 et FA01 , et

- CPR1 , ALK3, ADHA2, ADH5, FALDH2, FALDH4 et FA01 .

Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée, où ladite levure est en outre disruptée, ou présente une délétion pour les gènes codant les iso-enzymes de l'acyl-CoA oxydase POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 et POX6.

Comme mentionné ci-dessus, afin d'augmenter la production de diacides, il est avantageux de limiter la dégradation des acides gras, et notamment la dégradation par la β-oxydation. L'inactivation par délétion ou disruption (c'est-à-dire l'insertion d'un élément dans la séquence du gène qui conduit à une expression d'un produit du gène non fonctionnel ou à une absence d'expression) concomitante des gènes POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 et POX6 permet de limiter voire d'annuler cette dégradation.

La délétion ou la disruption susmentionnée des gènes POX peut être réalisée comme décrit dans la demande internationale WO/2006/064131 .

Il est également possible d'utiliser les souches MTLY66, MTLY81 , FT120 et FT 130 qui ont été déposées à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous les numéros d'enregistrement respectifs CNCM 1 -3319, CNCM I-3320, CNCM I-3527 et CNCM I-3528.

Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée, où ladite levure est en outre disruptée ou présente une délétion pour les gènes DGA 1, DGA2 et/ou LR01. En d'autres termes, dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée, où ladite levure est en outre disruptée ou présente une délétion pour l'un au moins des gènes DGA 1, DGA2 et LR01.

L'effet technique de cette disruption est de limiter le stockage des acides gras. En effet, une fois produits, les acides gras peuvent être stockés et échapper ainsi à la conversion en acides dicarboxyliques. Le pool d'acides gras stockés représente de 10 à 70% de la quantité totale d'acides gras produits ou assimilés par un microorganisme. Aussi, afin d'éviter l'échappement de la transformation en diacides, et augmenter la production de ces derniers, il est avantageux de limiter le stockage.

La disruption ou la délétion de l'un au moins des gènes DGA 1, DGA2 et/ou LR01 inhibe ledit stockage.

Par « DGA 1, DGA2 et/ou LR01 » on entend les combinaisons suivantes : DGA 1 seul, DGA2 seul, LR01 seul, la combinaison DGA 1 et DGA2, la combinaison DGA 1 et LR01, la combinaison DGA2 et LR01, et la combinaison DGA 1 et DGA2 et /.fîOr.

Le gène DGA2 code pour une diacylglycérol acyl transférase de type DGAT1 , le gène DGA 1 code pour une diacylglycérol acyl transférase de type DGAT2, le gène LR01 code pour une phospholipide :diacylglycérol acyl transférase impliquée dans la synthèse de triglycérol à partir de diacylglycérol par la voie aceltyl CoA indépendant.

Le gène DGA1 comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO : 15, le gène DGA2 comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO : 16 et le gène LR01 comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO : 17.

Dans encore un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée, où ladite souche de levure surexprimant lesdits gènes est dérivée de la souche de levure Yarrowia lipolytica OLEO-X.

La souche de levure OLEO-X est elle-même dérivée de la souche w29 déposée à l'ATCC (American Type Culture Collection) sous le numéro ATCC 20460, et présente le génotype suivant : MATA ura-3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dgalA IrolA dga2A fad2A.

Aussi, dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'une souche de Yarrowia lipolytica de génotype MATA ura-3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dgalA IrolA dga2A fad2A, surexprimant au moins les gènes suivants :

- le gène ALK3 comprenant ou consistant en la séquence suivante SEQ ID NO : 1 , codant une cytochrome P450 mono oxygénase, ou consistant en une séquence présentant au moins 75% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 ,

- l'un au moins des gènes ADH2 et ADH5 comprenant ou consistant respectivement en la séquence SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO : 6, codant chacun une déshydrogénase d'alcools, et

- l'un au moins des gènes FALDH3 et FALDH4 comprenant ou consistant respectivement en la séquence suivante SEQ ID NO : 7 ou SEQ ID NO : 8, codant chacun une déshydrogénase d'aldéhydes gras ou le gène FA01 comprenant ou consistant en la séquence suivante SEQ ID NO : 9 codant une oxydase d'alcool gras, éventuellement surexprimant en outre le gène CPR1 codant une NADPH-cytochrome réductase comprenant ou consistant en la séquence suivante SEQ ID NO : 14.

pour la préparation, par fermentation, d'au moins un diacide carboxylique, notamment à partir d'au moins un hydrocarbure ou au moins un acide gras.

Dans le cadre de l'utilisation susmentionnée, il est avantageux d'avoir comme source de bioconversion soit des hydrocarbures, soit des acides gras, à longue chaîne, c'est à dire présentant un squelette carboné de plus de 10 atomes de carbone.

II est notamment avantageux, afin de disposer de diacides présentant au moins une insaturation, d'utiliser des acides gras ou des hydrocarbures mono ou poly insaturés, c'est-à-dire présentant au moins une double liaison carbone-carbone sur ledit squelette carboné.

De manière avantageuse, l'invention concerne l'utilisation de l'une quelconque des souches suivantes :

- la souche Y4832, aussi appelée JMY4832 est caractérisée par le génotype MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2-URA3 FA01-LEU2 et a pour phénotype [Leu+ Ura+]. Cette souche a été déposée à la CNCM le 14 mars 2016 sous le numéro CNCM I-5072,

- la souche Y4833, aussi appelée JMY4833 est caractérisée par le génotype MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2-URA3 FA01-LEU2 et a pour phénotype [Leu+ Ura+]. Cette souche a été déposée à la CNCM le 14 mars 2016 sous le numéro CNCM I-5073, et

- la souche Y4834, aussi appelée JMY4834 est caractérisée par le génotype MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1

ADH2-URA3 FA01-LEU2 et a pour phénotype [Leu+ Ura+]. Cette souche a été déposée à la CNCM le 14 mars 2016 sous le numéro CNCM I-5074,

pour la préparation par fermentation d'au moins un diacide carboxylique telle que définie ci-dessus.

L'invention concerne également une méthode de production d'au moins un acide dicarboxylique comprenant les étapes suivantes :

a) une phase de croissance, dans laquelle on met en culture une souche de levure incapable de dégrader les acides gras surexprimant au moins les gènes suivants :

- le gène ALK3, codant une cytochrome P450 mono oxygénase

- l'un au moins des gènes ADH2 et ADH5 codant chacun des déshydrogénases d'alcools, et

- l'un au moins des gènes FALDH3 ou FALDH4, codant des déshydrogénases aldéhydes gras ou le gène FA01 codant une oxydase d'alcool gras,

dans un milieu de culture constitué essentiellement d'un substrat énergétique qui comprend au moins une source de carbone et une source d'azote, et

b) une phase de bioconversion, dans laquelle ladite souche de levure est mise en contact avec au moins un acide gras, de préférence en présence d'un substrat énergétique.

Toutes les définitions et descriptions relatives à l'utilisation définie ci-dessus sont applicables mutatis mutandis au procédé, ou la méthode, susmentionné.

Dans le procédé de production de diacides selon l'invention, on met la souche choisie en culture dans un milieu constitué essentiellement d'un substrat énergétique qui comprend au moins une source de carbone et une source d'azote afin de faire croître ladite souche. Il s'agit de la phase de croissance. Ceci peut être importnant dans la mesure ou l'incapacité à dégrader les acides gras peut interférer avec la croissance des levures.

On ajoute alors le substrat de bioconversion (alcane ou mélange d'alcanes, acide gras ou mélange d'acides gras, ester d'acide gras ou mélange d'esters d'acides gras ou huile naturelle ou mélange de ces différents substrats) de façon à initier la bioconversion en diacides. Lors de la phase de bioconversion, le milieu de culture peut comprendre un apport de substrat énergétique secondaire consistant en général en au moins un composé polyhydroxylé, tel que par exemple le glycérol ou un sucre, dont notamment le glucose.

L'obtention des souches mutantes utilisables dans le procédé de l'invention peut se faire à partir de la souche Po1 d, qui dérive de la souche sauvage Yarrowia lipolytica W29. La souche Po1 d est une souche auxotrophe pour la leucine (leu-) et l'uracyle (ura-). Elle est décrite dans la revue de G. Barth et al.: Yarrowia lipolytica in: Nonconventional Yeasts in Biotechnology A Handbook (Wolf, K., Ed.), Vol. 1 , 1996, pp. 313-388. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. Elle est répertoriée sous CLIB139 dans la CLIB.

Le principe du procédé selon l'invention est donc de bioconvertir les hydrocarbures en diacides, et les acides gras en diacides.

Par exemple l'octadécane C ₁₈ H ₃₈ sera converti en acide octadécanedioïque tout comme l'acide stéarique, l'acide oléique (acide cis-octadéc-9-énoïque) sera converti en acide cis-octadéc-9-éne dioïque... l'homme du métier est capable de connaître le diacide obtenu à partir de l'acide gras ou de l'hydrocarbure qui est ajouté lors de l'étape de bioconversion.

Avantageusement, l'invention concerne le procédé susmentionné, où ladite souche de levure surexprime en outre le gène CPR1 qui code pour une NADPH-cytochrome réductase.

Avantageusement, l'invention concerne une méthode telle que définie ci-dessus, comprenant en outre une étape de récupération, d'isolement ou de purification, dudit au moins un diacide carboxylique formé. Bien évidemment, il est avantageux, lorsque le procédé est mis en œuvre de récupérer les diacides formés par une technique connue de l'homme du métier, telle que la précipitation des sels de calcium.

Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode telle que définie ci-dessus, dans laquelle les acides gras sont sous forme d'un mélange, et notamment sous forme d'une huile ou d'un mélange d'alcanes, en particulier une huile choisie parmi :

- les huiles végétales telles que l'huile de colza, l'huile de colza oléique, l'huile de tournesol, l'huile de tournesol oléique, l'huile de coco, l'huile de palme, l'huile palmiste, l'huile d'olive, l'huile d'arachide, l'huile de soja, l'huile de mais, l'huile de moutarde, l'huile de ricin, l'oléine de palme, la stéarine de palme, l'huile de carthame, l'huile de sésame, l'huile de lin, l'huile de noix, l'huile de pépins de raison, l'huile de chanvre ou un sous-produit issus de l'extraction de celles-ci comprenant au moins 30% d'un mélange d'acides gras, comme les eaux d'estérifications, les fonds de bacs, les condensais de désodorisation, les eaux de lavages ou les pâtes de neutralisation,

- les huiles de poissons, notamment de poissons gras, et

- les huiles microbiennes issues de microorganismes dits oléagineux, c'est-à-dire capables de stocker des acides gras à plus de 20% de leur poids sec, issus de levures, bactéries, ou micro-algues

Ces exemples d'huiles sont donnés à titre indicatif et ne sauraient limiter la portée de l'invention.

Dans l'invention, on entend par huile végétale, un corps gras extrait d'une plante oléagineuse.

On entend par plante oléagineuse toutes plantes dont les graines, les noix ou les fruits contiennent des lipides.

Un corps gras est une substance composée de molécules ayant des propriétés hydrophobes. Les corps gras sont majoritairement composés d'acides gras et de triglycérides qui sont des esters constitués d'une molécule de glycérol et de trois acides gras. Les autres composants forment ce que l'on appelle l'insaponifiable.

L'extraction de l'huile végétale par des méthodes traditionnelles nécessite souvent diverses opérations préliminaires, telles que le décorticage. Après ces opérations, la culture est broyée en une pâte. La pâte, ou parfois le fruit entier, est bouillie en présence d'eau et sous agitation jusqu'à séparation de l'huile. Ces méthodes traditionnelles ont un faible taux d'efficacité.

Les méthodes modernes de récupération de l'huile comprennent des étapes de cassage et de pressage, ainsi que la dissolution dans un solvant, le plus souvent l'hexane. L'extraction de l'huile avec un solvant est une méthode plus efficace que le pressage. Le résidu laissé après l'extraction de l'huile (tourteaux ou farine) est utilisé comme aliment pour animaux.

Les huiles végétales brutes sont obtenues sans traitement supplémentaire autre que le dégommage ou la filtration. Pour les rendre propres à la consommation humaine, les huiles végétales comestibles sont raffinées pour éliminer les impuretés et substances toxiques, un processus impliquant le blanchiment, la désodorisation et le refroidissement. Les huiles envisagées dans l'invention végétales comprennent les huiles brutes, raffinées ou fractionnées ou les co-produits issus de l'extraction des huiles.

À quelques exceptions près, et contrairement aux graisses animales, les huiles végétales contiennent des acides gras majoritairement insaturés de deux sortes: monoinsaturés (acide palmitique, acide oléique, acide érucique) et polyinsaturées (acide linoléique).

Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode telle que définie ci-dessus, où ladite levure est en outre disruptée pour les gènes codant les iso-enzymes de l'acyl-CoA oxydase POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 et POX6.

Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode telle que définie ci-dessus, où ladite levure est en outre disruptée ou prrésente une délétion pour les gènes DGA1 , DGA2 et/ou LR01.

Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode telle que définie ci-dessus, où ladite souche de levure surexprimant lesdits gènes est dérivée de la souche OLEO-X.

Dans encore un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un procédé tel que défini précédemment, où lesdits diacides sont obtenus à partir d'acides gras ou d'hydrocarbures, qui sont présents sous la forme d'un mélange présentant en poids une quantité de plus de 30% d'acides gras ou d'hydrocarbures ayant plus de 10 atomes de carbone notamment des acides gras ou des alcanes en C14-C26.

Par au moins 30% d'acides gras ou d'hydrocarbures, on entend dans l'invention une quantité d'acides gras ou d'hydrocarbures de 30%, 31 %, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41 %, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% en poids par rapport au poids total de la composition. Par acide gras ou hydrocarbures ayant plus de 10 atomes, on définit des alcanes (CnH2n+2) linéaires ou ramifiés, des alcènes (CnH2n) linéaires ou ramifiés, des alcynes (CnH2n-2) linéaires ou ramifiés ayant au moins 10 atomes de carbone

Par acides gras ou hydrocrabures en C14-C26 on entend des acides gras ou des hydrocarbures en C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21 , C22, C23, C24, C25 ou C26.

Dans encore un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée, où lesdits acides gras ou hydrocarbures sont présents sous la forme d'un mélange présentant en poids une quantité de plus de 30% d'acides gras ayant plus de 10 atomes de carbone, notamment des acides gras ou des hydrocarbures en C14-C26, et présentant en poids notamment plus 30% d'acides gras ou d'hydrocarbures au moins mono insaturés.

Encore plus avantageusement, l'invention concerne la méthode susmentionnée, ledit au moins un acide gras est un mélange d'acide gras présentant en poids une quantité de plus de 30% d'acide oléique par rapport au poids total du mélange.

Il est avantageux, afin d'obtenir des diacides insaturés d'utiliser des acides gras issus d'huiles végétales, qui présentent un ou plusieurs acides gras insaturés.

En particulier, pour obtenir des diacides en C18 comprenant une insaturation (DC18 :1 ), il est avantageux d'utiliser une huile végétale ou une composition comprenant une quantité d'au moins 30% d'acide oléique de formule I suivante :

(formule I).

Les huiles végétales intéressantes sont les suivantes : l'huile de noisette qui comprend environ 77% en poids d'acide oléique, l'huile d'olive qui comprend environ 72% en poids d'acide oléique, l'huile d'avocat qui comprend environ 68% en poids d'acide oléique, l'huile de colza qui comprend environ 56% en poids d'acide oléique, l'huile de tournesol oléique qui comprend environ 80% en poids d'acide oléique, l'huile d'arachide qui comprend environ 35% en poids d'acide oléique, l'oléine de palme qui comprend environ 40% en poids d'acide oléique, l'huile de sésame qui comprend environ 39 % en poids d'acide oléique ou l'huile de palme qui comprend environ 36 % en poids d'acide oléique.

Par « environ X% en poids » on entend la valeur de X% plus ou moins 1 % en poids. Cette approximation est liée à la variabilité des méthodes de mesure de la quantité d'acide oléique contenu dans une huile, ainsi que la variabilité de production selon les plants utilisés. Avantageusement, l'invention concerne également une méthode de production d'au moins un acide dicarboxylique, notamment de l'acide cis-octadéc-9-éne dioïque, comprenant les étapes suivantes :

a) une phase de croissance, dans laquelle on met en culture une souche de levure de Yarrowia lipolytica, notamment de génotype MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dga lA Iro lA dga2A fad2A, incapable de dégrader les acides gras, et éventuellement de stocker les acides gras sous forme de triglycéride, surexprimant au moins les combinaisons de gènes choisies dans le groupe suivant :

- le gène ALK3, notamment comprenant ou consistant en la séquence suivante SEQ ID NO : 1 , ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 1 et présentant une activité cytochrome P450 mono oxygénase, le gène ADH2 comprenant ou consistant respectivement en la séquence SEQ ID NO : 5 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 5 et présentant une activité déshydrogénase d'alcools et le gène FALDH3 comprenant ou consistant respectivement en la séquence SEQ ID NO : 7 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 7 et présentant une activité déshydrogénase d'aldéhydes gras

- le gène ALK3, notamment comprenant ou consistant en la séquence suivante SEQ ID NO : 1 , ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 1 et présentant une activité cytochrome P450 mono oxygénase, le gène ADH2 comprenant ou consistant respectivement en la séquence SEQ ID NO : 5 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 5 et présentant une activité déshydrogénase d'alcools et le gène FALDH4 comprenant ou consistant respectivement en la séquence SEQ ID NO : 8 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 8 et présentant une activité déshydrogénase d'aldéhydes gras

- le gène ALK3, notamment comprenant ou consistant en la séquence suivante SEQ ID NO : 1 , ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 1 et présentant une activité cytochrome P450 mono oxygénase, le gène ADH2 comprenant ou consistant respectivement en la séquence SEQ ID NO : 5 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 5 et présentant une activité déshydrogénase d'alcools et le gène FA01 comprenant ou consistant respectivement en la séquence SEQ ID NO : 9 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 9 et présentant une activité oxydase d'alcools gras,

- le gène ALK3, notamment comprenant ou consistant en la séquence suivante

SEQ ID NO : 1 , ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 1 et présentant une activité cytochrome P450 mono oxygénase, le gène ADH5 comprenant ou consistant respectivement en la séquence SEQ ID NO : 6 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO:

6 et présentant une activité déshydrogénase d'alcools et le gène FALDH3 comprenant ou consistant respectivement en la séquence SEQ ID NO : 7 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 7 et présentant une activité déshydrogénase d'aldéhydes gras

- le gène ALK3, notamment comprenant ou consistant en la séquence suivante SEQ ID NO : 1 , ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 1 et présentant une activité cytochrome P450 mono oxygénase, le gène ADH5 comprenant ou consistant respectivement en la séquence SEQ ID NO : 6 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 6 et présentant une activité déshydrogénase d'alcools et le gène FALDH4 comprenant ou consistant respectivement en la séquence SEQ ID NO : 8 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 8 et présentant une activité déshydrogénase d'aldéhydes gras, et

- le gène ALK3, notamment comprenant ou consistant en la séquence suivante SEQ ID NO : 1 , ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 1 et présentant une activité cytochrome P450 mono oxygénase, le gène ADH5 comprenant ou consistant respectivement en la séquence SEQ ID NO : 6 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 6 et présentant une activité déshydrogénase d'alcools et le gène FA01 comprenant ou consistant respectivement en la séquence SEQ ID NO : 9 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 75 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 9 et présentant une activité oxydase d'alcools gras, éventuellement surexprimant en outre le gène CPR1 comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 14 ou comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 14 et présentant une activité NADPH-cytochrome réductase,

dans un milieu de culture constitué essentiellement d'un substrat énergétique qui comprend au moins une source de carbone et une source d'azote, et

b) une phase de bioconversion, dans laquelle ladite souche de levure est mise en contact avec une huile, notamment une huile végétale, comme les huiles susmentionnées, une huile de poisson ou de levures, bactéries ou micro-algues, de préférence en présence d'un substrat énergétique.

Avantageusement, l'invention concerne également une méthode de production d'au moins un acide dicarboxylique, notamment de l'acide cis-octadéc-9-éne dioïque, comprenant les étapes suivantes :

a) une phase de croissance, dans laquelle on met en culture une souche de levure de Yarrowia lipolytica choie parmi les souches suivantes :

- la souche Y4832, aussi appelée JMY4832 est caractérisée par le génotype MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dga IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2-URA3 FA01-LEU2 et a pour phénotype [Leu+ Ura+]. Cette souche a été déposée à la CNCM le 14 mars 2016 sous le numéro CNCM I-5072,

- la souche Y4833, aussi appelée JMY4833 est caractérisée par le génotype MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2-URA3 FA01-LEU2 et a pour phénotype [Leu+ Ura+]. Cette souche a été déposée à la CNCM le 14 mars 2016 sous le numéro CNCM I-5073, et

- la souche Y4834, aussi appelée JMY4834 est caractérisée par le génotype MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1

ADH2-URA3 FA01-LEU2 et a pour phénotype [Leu+ Ura+]. Cette souche a été déposée à la CNCM le 14 mars 2016 sous le numéro CNCM I-5074,

dans un milieu de culture constitué essentiellement d'un substrat énergétique qui comprend au moins une source de carbone et une source d'azote, et

b) une phase de bioconversion, dans laquelle ladite souche de levure est mise en contact avec une huile, notamment une huile végétale, comme les huiles susmentionnées, une huile de poisson ou de levures, bactéries ou micro-algues, de préférence en présence d'un substrat énergétique, et

c) éventuellement une étape de purification des diacides obtenus.

L'invention concerne en outre une composition comprenant un mélange de diacides carboxyliques susceptibles d'être obtenus par le procédé tel que défini ci-dessus. Les compositions de diacides obtenues selon le procédé susmentionné ne donneront pas directement en poids une conversion des alcanes et des acides gras qui seront fournis pour mettre en œuvre le procédé.

En effet, lors de la bioconversion des hydrocarbures et des acides gras par les souches de levure modifiées, telles que définies ci-dessus, outre la synthèse de diacides à partir de l'apport exogène vont être capables de synthétiser leurs propres acides gras pour la formation de leur membrane cellulaire. Ces acides gras ne seront pas stockés ni dégradés puisque les souches de levures de l'invention sont invalidées pour ces voies métaboliques.

Aussi, les acides gras synthétisés par les levures lors de leur croissance pourront également être bio-convertis en diacides.

Par conséquent, il n'existe pas de linéarité entre la quantité d'acide gras apporté par une huile déterminée, et la quantité de diacides obtenus. Toutefois, les compositions susceptibles d'être obtenues par le procédé de l'invention comportent une proportion de diacide élevé du fait de l'efficacité améliorée des souches de levure utilisées.

L'invention concerne par ailleurs une composition comprenant:

- une première molécule d'acide nucléique correspondant au gène ALK3, codant une cytochrome P450 mono oxygénase,

- au moins une deuxième molécule d'acide nucléique correspondant à l'un au moins des gènes ADH2 et ADH5 codant chacun des déshydrogénases d'alcools, et

- au moins une troisième molécule d'acide nucléique correspondant à l'un au moins des gènes FALDH3 ou FALDH4, codant des déshydrogénases aldéhydes gras ou correspondant au gène FA01 codant une oxygénase d'alcool gras,

lesdites première molécule d'acide nucléique, deuxième molécule d'acide nucléique et troisième molécule d'acide nucléique étant liées ou individualisées.

La composition susmentionnée doit être comprise de la manière suivante :

- soit elle comprend une première molécule d'acide nucléique correspondant au gène ALK3, une seconde molécule d'acide nucléique correspondant au gène ADH2, ou au gène ADH5 et une troisième molécule d'acide nucléique correspondant au gène FALDH3, ou au gène FALDH4, ou au gène FA01 ,

- soit une première une première molécule d'acide nucléique correspondant au gène ALK3 fusionnée ou liée à une seconde molécule d'acide nucléique correspondant au gène ADH2, ou au gène ADH5, et indépendante des deux premières une troisième molécule d'acide nucléique correspondant au gène FALDH3, ou au gène FALDH4, ou au gène FA01 ,

- soit une première une première molécule d'acide nucléique correspondant au gène ALK3 et indépendamment une seconde molécule d'acide nucléique correspondant au gène ADH2, ou au gène ADH5, fusionnée à une troisième molécule d'acide nucléique correspondant au gène FALDH3, ou au gène FALDH4, ou au gène FA01

- soit une première une première molécule d'acide nucléique correspondant au gène ALK3 fusionnée à une troisième molécule d'acide nucléique correspondant au gène FALDH3, ou au gène FALDH4, ou au gène FA01 et indépendamment une seconde molécule d'acide nucléique correspondant au gène ADH2, ou au gène ADH5,

- soit une première une première molécule d'acide nucléique correspondant au gène ALK3 fusionnée ou liée à une seconde molécule d'acide nucléique correspondant au gène ADH2, ou au gène ADH5, fusionnée à une troisième molécule d'acide nucléique correspondant au gène FALDH3, ou au gène FALDH4, ou au gène FA01 (soit une seule et même molécule),

éventuellement en association avec un autre molécule d'acide nucléique correspondant au gène CPR1 .

Sont également envisagés des vecteurs recombinants comprenant lesdites molécules d'acides nucléiques, et des moyens permettant l'expression desdits gènes.

Avantageusement, l'invention concerne une composition telle que définie précédemment, où

- la première molécule d'acide nucléique correspondant au gène ALK3, ladite première molécule d'acide nucléique comprenant, comprenant essentiellement ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 1 ,

- la seconde molécule d'acide nucléique correspondant au gène ADH2 comprenant, comprenant essentiellement ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 32 ou SEQ ID NO : 33, ou au gène ADH5 comprenant, comprenant essentiellement ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 34 ou SEQ ID NO : 35, et

- la troisième molécule d'acide nucléique correspondant au gène FALDH3 comprenant, comprenant essentiellement ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 36 ou SEQ ID NO : 37, ou au gène FALDH4 comprenant, comprenant essentiellement ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 38 ou SEQ ID NO : 39, ou au gène FA01 comprenant, comprenant essentiellement ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 40 ou SEQ ID NO : 41 ,

éventuellement en association avec une quatrième séquence molécule d'acide nucléique correspondant au gène CPR1 comprenant, comprenant essentiellement ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 42 ou SEQ ID NO : 43. Dans le cas d'une composition susmentionnée où chacune des molécules est clonée dans un vecteur, la composition comprend

- la première molécule d'acide nucléique comprend, comprend essentiellement ou consiste en la séquence SEQ ID NO : 18 ou SEQ ID NO : 19

- la seconde molécule d'acide nucléique comprend, comprend essentiellement ou consiste en la séquence SEQ ID NO : 20, SEQ IDNO : 21 , SEQ ID NO : 22 ou SEQ IDNO : 23 et

- la troisième molécule d'acide nucléique comprend, comprend essentiellement ou consiste en la séquence SEQ ID NO : 26, SEQ IDNO : 27, SEQ IDNO : 28, SEQ IDNO : 29, SEQ IDNO : 30 ou SEQ IDNO : 31 .

éventuellement en association avec une quatrième séquence molécule d'acide nucléique comprenant, comprenant essentiellement ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 24 ou SEQ ID NO : 25.

L'invention concerne en outre les différentes molécules d'acide nucléiques comprenant ou consistant en les séquences suivantes : SEQ ID NO : 18 à 31.

L'invention concerne de plus une souche de levure transformée par une composition comprenant au moins une molécule d'acide nucléique telle que définie ci-dessus.

Les différentes souches de levures envisagées sont celles décrites précédemment. Avantageusement, l'invention concerne une souche de levure susmentionnée, où, la dite levure étant une souche de Yarrowia lipolytica.

L'invention concerne par ailleurs une souche de Yarrowia lipolytica choisie parmi les souches suivantes :

- la souche Y3551 , de génotype MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dga U Iro U dga2A fad2A ALK3-LEU2 et de phénotype [Leu+ lira-],

- la souche JMY3950, dérivée de la souche Y3551 , de génotype MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dga U IroU dga2A fad2A ALK3-LEU2 CPR1-URA3 et de phénotype [Leu+ Ura+], déposée le 26 mars 2015 à la CNCM (Collection Nationale de Culture de microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15) sous le numéro CNCM I - 4963.

- la souche Y4428 dérivée de la souche JMY3950, de génotype MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dgaU IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 et de phénotype [Leu- Ura-],

- la souche Y4457 dérivée de la souche Y4428, de génotype MATA ura3-302 Ieu2- 270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2-URA3 et de phénotype [Leu- Ura+], et

- les souches Y4832, Y4833 et Y4834, déposées le 14 mars 2016 à la CNCM sous les numéros respectifs CNCM I - 5072, CNCM I - 5073 et CNCM I - 5074, ces souches étant dérivées de la souche Y4457, et ont pour génotype MATA ura3- 302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2- URA3 FA01-LEU2 et pour phénotype [Leu+ Ura+].

Plus précisément, la souche Y4832, aussi appelée JMY4832 est caractérisée par le génotype MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dgaU IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2-URA3 FA01-LEU2 et a pour phénotype [Leu+ Ura+]. Cette souche a été déposée à la CNCM le 14 mars 2016 sous le numéro CNCM I-5072.

La souche Y4833, aussi appelée JMY4833 est caractérisée par le génotype MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 ροχ1-6Δ dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2- URA3 FA01-LEU2 et a pour phénotype [Leu+ Ura+]. Cette souche a été déposée à la CNCM le 14 mars 2016 sous le numéro CNCM I-5073.

La souche Y4834, aussi appelée JMY4834 est caractérisée par le génotype MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 pox1-6A dga U IroU dga2A fad2A ALK3 CPR1 ADH2- URA3 FA01-LEU2 et a pour phénotype [Leu+ Ura+]. Cette souche a été déposée à la CNCM le 14 mars 2016 sous le numéro CNCM I-5074.

LEGENDE DES FIGURES

Les Figures 1A à 1 E représentent des chromatogrammes TLC obtenus pour la conversion de C12:0 avec des microsomes de levures transformées avec différentes constructions. P, P1 et P2 représentent les produits de la réaction, S représente le substrat. L'axe des abscisses représente la mobilité en mm, et l'axe des ordonnées représente la radioactivité en unités arbitraires.

La figure 1A représente l'histogramme TLC de microsomes de levures transformée avec un vecteur vide.

La figure 1 B représente l'histogramme TLC de microsomes de levures transformée avec un vecteur exprimant ALK2.

La figure 1 C représente l'histogramme TLC de microsomes de levures transformée avec un vecteur exprimant ALK 3.

La figure 1 D représente l'histogramme TLC de microsomes de levures transformée avec un vecteur exprimant ALK 5.

La figure 1 E représente l'histogramme TLC de microsomes de levures transformée avec un vecteur exprimant ALK 11 .

Les figures 2A à 2C montrent la conversion de l'acide oléique en présence de microsomes exprimant Alk3p.

La figure 2A représente des chromatogrammes TLC de microsomes de levures transformées avec un vecteur vide (panel du haut) ou avec Alk3p (panel du bas). L'axe des abscisses correspond au temps exprimé en minutes. 1 et 2 représentent les deux produits de conversion obtenus.

La figure 2B représente un spectre de masse du produit 1 observé à la figure 2A. La figure 2C représente un spectre de masse du produit 2 observé à la figure 2A. Les figures 3A et 3B montrent le taux de conversion des acides gras.

La figure 3A représente un histogramme montrant l'activité spécifique (en pg/min/mg) de conversion de 100μΜ acides gras indiqués en abscisse par des microsomes de levure exprimant Alk3p. Les barres en gris représentent les produits de Γω-oxydation et les barres en blanc les diacides.

La figure 3B représente un histogramme montrant l'activité spécifique (en pg/min/mg) de conversion de 100μΜ acides gras indiqués en abscisse par des microsomes de levure exprimant Alk5p. Les barres en gris représentent les produits de Γω-oxydation et les barres en blanc les diacides.

La figure 4 représente un graphique montrant la production au cours de diacide par deux souches (B et C) de levure OLEOX surexprimant le gène ALK3. La production est comparée à celle obtenue par une souche OLEOX non transformée avec ALK3 (A). L'axe des abscisses représente le temps de culture en heures et l'axe des ordonnées représente la quantité de DC18 1 en g/L.

La figure 5 représente un graphique montrant la production au cours du temps de diacide par deux souches (B et C) de levure OLEOX-CPR1 surexprimant le gène FALDH3 et FALDH4 respectivement. La production est comparée à celle obtenue par une souche OLEOX non transformée avec l'un quelconque des gènes FALDH3 ou 4 (A). L'axe des abscisses représente le temps de culture en heures et l'axe des ordonnées représente la quantité de DC18 1 en g/L.

La figure 6 représente un graphique montrant la production au cours du temps de diacide par deux souches de levure OLEOX surexprimant les gènes CPR1 +ALK3+ADH2+ FALDH3 (courbe avec des triangles) et CPR1 +ALK3+ADH2+ FALDH4 (courbe avec des carrés). La production est comparée à celle obtenue par une souche OLEOX surexprimant seulement CPR1 (courbe avec des carrés ouverts). L'axe des abscisses représente le temps de culture en heures et l'axe des ordonnées représente la quantité de DC18 1 en g/L.

La figure 7 représente un graphique montrant la production au cours du temps de diacide par trois souches de levure OLEOX surexprimant les gènes CPR1 +ALK3+ADH2+ FA01 (A,B et C). La production est comparée à celle obtenue par une souche OLEOX surexprimant seulement CPR1 (D). L'axe des abscisses représente le temps de culture en heures et l'axe des ordonnées représente la quantité de DC18 1 en g/L. La figure 8 représente un graphique montrant la productivité de trois souches de levure OLEOX surexprimant les gènes CPR1 +ALK3+ADH2+ FA01 (A, B et C). La production est comparée à celle obtenue par une souche OLEOX surexprimant seulement CPR1 (D). L'axe des abscisses représente le temps de culture en heures et l'axe des ordonnées représente la quantité de DC18 1 en g/L.

La figure 9 représente un graphique montrant la productivité de trois souches de levure surexprimant les gènes CPR1 + ADH2 (B) ou les gènes CPR1 + ADH5 (C). La production est comparée à celle obtenue par une souche seulement CPR1 (A). L'axe des abscisses représente le temps de culture en heures et l'axe des ordonnées représente la quantité de DC18 1 en g/L.

EXEMPLES

Exemple 1 - Procédé de production d'acides dicarboxyliques à partir d'huile de tournesol oléique avec une souche selon l'invention.

Une préculture de la souche, conservée sur milieu gélosé de composition: extrait de levure 10 g/L; peptone 10 g/L; glucose 10 g/L; Agar 20 g/L, est effectué grâce à un ensemencement qui fournit une absorbance initiale du milieu de préculture voisine de 0,30. La préculture est conduite sous agitation orbitale (200 rpm) pendant 24 h à 30°C dans une fiole à ailettes de 500 ml contenant 25 ml de milieu (10g/L d'extrait de levure; 10g/L de peptone; 20g/L de glucose).

Le milieu utilisé pour la culture est composé d'eau désionisée, d'extrait de levure à 10 g/L; de tryptone à 20 g/L; de glucose à 40 g/L et d'huile de tournesol oléique à 30 g/L.

L'ensemencement du fermenteur est effectué avec la totalité de la fiole de préculture.

La culture est conduite à 30°C dans un fermenteur de 4 L avec 2 L de milieu à un débit d'aération de 0,5 vvm et une vitesse d'agitation de 800 rpm assurée par une turbine centripète à double effet.

Après 17 heures de culture dès lors que le glucose du milieu est épuisé, on ajoute 60 mL d'huile de tournesol oléique dans le réacteur que l'on soumet à une alimentation continue de glycérol à raison de 1 mL/h. Le pH de la culture est alors maintenu dans une gamme de 7,5 à 8 par addition régulée de soude 4 M. La fermentation dure 130 h. En fin de culture, on élimine la biomasse cellulaire par centrifugation. Le surnageant est ensuite acidifié jusqu'à pH 2,5 par addition d'HCI 6M et les acides dicarboxyliques insolubles sont récupérés par centrifugation du moût acidifié puis séchés.

La composition en acides dicarboxyliques du mélange est déterminée par chromatographie en phase gazeuse sur une colonne DB1 après conversion des acides dicarboxyliques en diesters selon la méthode décrite par Uchio et al. Agr Biol Chem 36, No. 3, 1972, 426-433. La température du four du chromatographe est programmée de 150°C à 280°C à raison de 8°C par min.

Exemple 2 - Alk3p convertit in vitro les acides gras en diacides

Chez Yarrowia lipolytica, il existe 17 gènes codant des cytochromes P450, dont 12 appartiennent à la famille CYP52. Tous ces gènes CYP52 sont inductibles en présence d'alcanes.

Il a été montré que leur délétion affectait la croissance des levures en présence d'alcanes.

Les inventeurs ont ainsi testé la fonction de 7 de ces gènes de Yarrowia lipolytica afin de déterminer leur rôle biologique dans le métabolisme des molécules aliphatiques.

Résultats

Les études enzymologiques sur les membres de la famille CYP52 ont été menées en étudiant le métabolisme de l'acide laurique.

Afin de confirmer leurs hypothèses selon lesquelles ces enzymes catalysent les acides gras par réaction d'oxygénation, les inventeurs ont réalisé un criblage en utilisant des microsomes de levure S. cerevisiae WAT11 transformées avec 6 des gènes de la famille CYP52 clonés chez Yarrowia lipolytica : ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6 et ALK11 .

Les incubations ont été réalisées sur le substrat modèle que constitue l'acide laurique (C12.0), en présence de NADPH.

Les mélanges réactionnels ont été déposés sur des plaques TLC, puis développées et analysés.

Comme le montre les Figures 1A à 1 E, seules quatre des 6 préparations microsomales sont capables de convertir l'acide laurique en un produit hautement polaire. Aucun pic n'est observé pour le témoin (réaction sans NADPH) à l'exception du pic correspondant au substrat. Les résultats indiquent que les protéines Alk2p, Alk3p,

Alk5p et Alk11 p sont capables de métaboliser l'acide laurique.

Afin d'étudier la spécificité de substrat de ces enzymes, les inventeurs ont incubé chaque préparation microsomale avec des acides gras libres de taille différente et à différents niveaux d'insaturation (par exemple l'acide myristique - C14:0, l'acide palmitique - C16:0, l'acide stéarique - C18:0, l'acide oléique - C18:1 and l'acide linoléique - C18:2).

Les taux de conversion pour ces substrats incubés à une concentration de 100 μΜ montrent que la plupart des acides gras sont convertis :

Gene Taux de conversion (%)

Cl2:0 Cl4:0 Cl6:0 Cl8:0 Cl8:1 Cl8:2

ALK2 7,3 1 , 1 0,5 N.D. N.D. N.D. ALK3 65 68 20 3 27 35

ALK4 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 3

ALK5 24 27 12 2 13 11

ALK6 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D.

ALK11 Traces N.D. N.D. N.D. 2 4

ND : non détec table

Par exemple Alk2p semble être impliqué dans le métabolisme des acides gras à courtes chaînes, avec un taux de conversion qui diminue de l'acide laurique à l'acide palmitique. Aucune conversion significative de C18:0 n'est observée avec cette enzyme.

Alk4p, Alk6p et Alk11 p montrent quant à eux soit une absence d'activité soit une activité très faible.

Les microsomes contenant Alk3p and Alk5p convertissent quant à eux tous les substrats avec un fort taux de conversion. De plus, Alk3p montre deux produits de conversion pour tous les substrats sauf pour l'acide stéarique. Le premier pic a un profil attendu pour un acide gras ω-hydroxylé, tandis que le second semble correspondre à un diacide. Les exemples de la conversion de l'acide laurique sont montrés aux Figures 1A à 1 E.

Au vu de ces résultats, les inventeurs ont étudié plus avant Alk3p afin de caractériser les produits de la réaction.

Les préparations de microsomes frais de levure exprimant Alk3p ont été réalisées. Les inventeurs ont normalisé le contenu total en protéines et ont réalisé de nouvelles incubations avec de l'acide laurique et de l'acide palmitique ainsi que les trois acides gras en C18 susmentionnés (acide stéarique, acide oléique et acide linoléique). Toutes les réactions ont été réalisées en double en présence de NADPH pour une analyse par TLC et GC-MS. Les chromatogrammes TLC montrent clairement la capacité d'Alk3p à convertir chacun des substrats sauf l'acide stéarique en deux produits. Les deux produits ont un profil d'oo-oxydation et de diacide, comme attendu.

En ce qui concerne l'acide stéarique, seul un produit d'oo-oxydation est obtenu. Les analyses par GC-MS confirment une ω-oxydation de tous les substrats. Toutefois, dans les conditions utilisées par les inventeurs, aucun diacide n'est détectable pour les acides gras ayant moins de 18 carbones.

L'analyse des produits de réaction obtenus grâce à Alk3p sont :

- Pour une incubation avec l'acide laurique (C12:0) le spectre de masse obtenu pour le pic de produit montre des ions m/Z (intensité relative en %) à 73 (43%) (CH3)3Si+, 75 (50%) [(CH3)2Si+=0], 103 (20%) [CH2(OSi(CH3)3)], 146 (5%) [CH2=C+(OSi(CH3)3-OCH3], 159 (6%) [CH3-0+=C+(OSi(CH3)3)CH=CH2], 255 (100%) (M-47) [perte de méthanol pour le fragment (M-15)], 271 (5%) (M-31 ) (perte de OCH3 de l'ester de méthyle), et 287 (42%) (M-15) (perte de CH3 du groupe TMSi). Ce profil de fragmentation est caractéristique d'un dérivé d'acide 12-hydroxylaurique (M = 302g/mol),

- Pour une incubation avec l'acide palmitique (C16:0) le spectre de masse obtenu pour le pic de produit montre des ions m/Z (intensité relative en %) à 73 (28%) (CH ₃ ) ₃ Si ⁺ , 75 (39%) [(CH ₃ ) ₂ Si ⁺ =0], 103 (14%) [CH ₂ (OSi(CH ₃ ) ₃ )], 146 (7%) [CH ₂ =C+(OSi(CH ₃ ) ₃ -OCH ₃ ], 159 (6%) [CH ₃ -0 ⁺ =C ⁺ (OSi(CH ₃ ) ₃ )CH=CH ₂ ], 311 (100%) (M- 47) [perte de méthanol pour le fragment (M-15)], 327 (4%) (M-31 ) (perte de OCH3 de l'ester de méthyle), et 343 (32%) (M-15) (perte de CH3 du groupe TMSi). Ce profil de fragmentation est caractéristique d'un dérivé d'acide 16-hydroxypalmitique (M = 358g/mol).

- Pour une incubation avec l'acide stéarique (C18:0) le spectre de masse obtenu pour le pic de produit montre des ions m/Z (intensité relative en %) à 73 (51 %) (CH ₃ ) ₃ Si ⁺ , 75 (94%) [(CH ₃ ) ₂ Si ⁺ =0], 103 (15%) [CH ₂ (OSi(CH ₃ ) ₃ )], 146 (9%) [CH ₂ =C ⁺ (OSi(CH ₃ ) ₃ -OCH ₃ ], 159 (4%) [CH ₃ -0 ⁺ =C ⁺ (OSi(CH ₃ ) ₃ )CH=CH ₂ ], 339 (100%) (M- 47) [perte de méthanol pour le fragment (M-15)], 355 (3%) (M-31 ) (perte de OCH3 de l'ester de méthyle), 371 (35%) (M-15) (perte de CH3 du groupe TMSi), et 386 (2%) (M). Ce profil de fragmentation est caractéristique d'un dérivé d'acide 18- hydroxystéarique (M = 386 g/mol).

- Pour une incubation avec l'acide oléique (C18:1 ), deux produits ont été détectés par analyse GC-MS (Figures 2A à 2C). Le spectre de masse obtenu pour le premier pic de produit montre des ions m/Z (intensité relative en %) à 73 (86%) (CH ₃ ) ₃ Si ⁺ , 75 (100%) [(CH ₃ ) ₂ Si ⁺ =0], 103 (26%) [CH ₂ (OSi(CH ₃ ) ₃ )], 146 (14%) [CH ₂ =C ⁺ (OSi(CH ₃ ) ₃ -OCH ₃ ], 159 (18%) [CH ₃ -0 ⁺ =C ⁺ (OSi(CH ₃ ) ₃ )CH=CH ₂ ], 337 (60%) (M- 47) [perte de méthanol pour le fragment (M-15)], 353 (8%) (M-31 ) (perte de OCH3 de l'ester de méthyle), 369 (19%) (M-15) (perte de CH3 du groupe TMSi), et 384 (12%) (M). Ce profil de fragmentation est caractéristique d'un dérivé d'acide 18- hydroxyoléique (M = 384 g/mol) [30]. Le second pic montre des ions m/z (intensité relative en %) à 55 (100%), 276 (35%), 290 (8%), 309 (18%) (M-31 ) (perte de OCH ₃ de l'ester de méthyle) and 340 (3%) (M). Ce profil de fragmentation est caractéristique d'un dérivé authentique d'acide 1 , 18-octadeca-9-ènedioique (M=340 g/mol).

- Pour une incubation avec l'acide linoléique (C18:2) deux produits ont été détectés par analyse GC-MS. Le spectre de masse obtenu pour le premier pic de produit montre des ions m/Z (intensité relative en %) à 73 (100%) (CH ₃ ) ₃ Si ⁺ , 75 (91 %) [(CH ₃ ) ₂ Si ⁺ =0], 103 (15%) [CH ₂ (OSi(CH ₃ ) ₃ )], 146 (7%) [CH ₂ =C ⁺ (OSi(CH ₃ ) ₃ -OCH ₃ ], 159 (8%) [CH ₃ -0 ⁺ =C ⁺ (OSi(CH ₃ ) ₃ )CH=CH ₂ ], 335 (8%) (M-47) [perte de méthanol pour le fragment (M-15)], 351 (2%) (M-31 ) (perte de OCH3 de l'ester de méthyle), 367 (7%) (M- 15) (perte de CH3 du groupe TMSi), and 382 (2%) (M). Ce profil de fragmentation est caractéristique d'un dérivé d'acide 18-hydroxylinoléique (M = 382 g/mol). Le second pic montre des ions m/z (intensité relative en %) à 55 (60%), 274 (12%), 307 (10%) (M-31 ) (perte de OCH3 de l'ester de méthyle) and 338 (2%) (M). Ce profil de fragmentation pourrait être celui d'un dérivé 1 , 18-octadéca-9, 12-diènedioique (M=338 g/mol). Cette hypothèse est également supportée par le temps de rétention dans le système d'analyse GC-MS utilisé. En effet, ART entre les hydroxyl et les diacides pour l'acide oléique sont de 0,5 minutes. Le même ART entre l'hydroxy et le potentiel diacide est également observe pour l'acide linoléique (RT du potentiel acide 1 , 18-octadéca-9, 12- diènedioique est 45,002 min, RT pour l'acide 18-hydroxylinoléique est 45,511 min, min, RT de l'acide 1 ,18-octadéca-9-ènedioic est 45,299 min et RT de l'acide 18- hydroxyoléique est 45,853 min).

Les mêmes résultats sont obtenus avec la protéine Alk5p.

Les chromatogrammes TLC ont été utilisés pour calculer l'activité spécifique d'Alk3p et Alk5p pour les substrats testés. Les résultats pour Alk3p et Alk5p sont présentés aux Figures 3A et 3B.

Il n'existe pas de grande différence entre Alk3p et Alk5p pour les différents acides gras testés. Cependant, en regardant les profils des acides gras en C19, il apparaît que Alk3p est un meilleur candidat pour une oxydation des longues chaînes comparé à Alk5p. De plus, la conversion d'acide gras libre en diacide, catalysée par Alk3p est plus efficace qu'avec Alk5p.

Conclusion

Chez Yarrowia Iipolytica, l'expression des gènes ALK est connue pour être fortement régulée par les alcanes. Concernant leur activité in vitro sur les acides gras libres, une hypothèse est que Alk3p et/ou Alk5p pourraient être impliqués dans l'oxydation terminale successive des alcanes en les convertissant successivement en alcool gras, puis acides gras, puis hydroxyl alcools gras et finalement en diacides.

Une telle conversion pourrait conduire à des substrats utilisables comme sources de carbone et d'énergie par la voie de la β-oxydation.

Dans les expériences in vitro, les inventeurs ont démontré qu'Alk3p et Alk5p catalysaient effectivement Γω-oxydation des acides gras libres de C ₁₂ à Ci ₈ .

Ces travaux révèlent la grande diversité de produit et de substrat des protéines Alk de Y. Iipolytica. Grâce à ces résultats, les inventeurs ont désormais une indication sur quelle protéine est capable de produire un produit d'intérêt. Cette connaissance est importante pour créer de nouvelles souches capables de bioconversion de l'acide oléique en son diacide correspondant.

Matériel et méthodes Clonage des gènes ALK à partir Y. lipolytica

Les séquences codantes des gènes CYP52 ont été clonées par PCR en utilisant une préparation d'ADN de la souche W29 de Yarrowia lipolytica. Les amorces sens et antisens ont été préparées en incluant des sites de restrictions aux deux extrémités pour réaliser les clonages. L'amplification par PCR a été mis en œuvre en utilisant la Polymerase Pyrobest pour 30 cycles (15 secondes à 96°C, 30 secondes à 55°C, 1 minute 30 secondes à 72°C). Les fragments d'ADN résultant ont été purifiés par électrophorèse en utilisant le kit QIAquick Gèle Extraction. Les fragments purifiés ont été digérés par la combinaison appropriée d'enzymes de restriction et lié dans le vecteur navette pYeDP60 en utilisant l'ADN ligase de T4. Les produits de ligations ont été utilisés pour transformer E.coli Mach 1 T1 chimiquement rendu compétente. Les cellules E. coli transformées ont été sélectionnées sur milieu LB additionné de 100μg/ml d'ampicilline. Les plasmides d'une seule colonie ont été purifiés par miniprep. L'intégrité du plasmide et sa séquence ont été validés par analyse de restriction et séquençage d'ADN (GATC Biotech, Constance, Germany).

Expression hétéro logue dans S. cerevisiae

L'expression des protéines des 6 membres de la famille 6YP52 clonés a été réalisée en utilisant un système hétérologue spécifiquement conçu pour l'expression des enzymes cytochrome P450, basé sur le vecteur pYeDP60 et la souche WAT11 de Saccharomyces cerevisiae. La souche WAT11 a été transformée avec chacune des constructions pYeDP60 en utilisant la méthode de l'acétate de lithium LiAc. Les transformants ont été sélectionnés par étalement sur des boites YNB dépourvu d'uracile. Les levures sont laissées en culture et l'expression du cytochrome P450 a été induite comme décris dans POMPON et al., 1996. Pour chaque transformant les microsomes ont été préparés en brisant manuellement les cellules en utilisant des billes de verres (0,45mm de diamètre) dans 50mM d'un tampon Tris-HCI (pH 7,5) contenant 1 mM EDTA et 600mM de sorbitol. L'homogénat a été soumis à une centrifugation (10 000g-15min) et le surnageant résultant a été soumis à une ultracentrifugation (100 000g-1 h). Le culot de microsome a été resuspendu dans 50mM Tris-HCI (pH 7,4), mM EDTA et 30% (v/v) de glycérol avec un homogénéisateur Potter-Elvehjem. Le volume de tampon utilisé pour la resuspension des microsomes a été déterminé par la masse approximative du culot humide de levure obtenu après croissance (1 mL de tampon pour 2g de culot cellulaire). Les concentrations totales de protéine dans les microsomes ont été estimées en utilisant le test de Brasdford et homogénéisé à 15mg/mL en utilisant le volume approprié de tampon de resuspension. La préparation de microsomes a été stockés à -20°C. Toutes les expériences pour les préparations des microsomes ont été réalisées entre 0 et 4°C. Test enzymatique in vitro

L'activité des enzymes cytochrome P450 a été évaluée in-vitro en utilisant différents acide gras radio marqués. Le test standard (0, 1 mL) contenait 20mL sodium phosphate (pH 7,4), 1 mL NADPH) un substrat radiomarqué (100μΜ) et 0,15mg de protéine microsomale. Les réactions ont été mises en œuvre dans un bain-marie à 27°C sous agitation continu. La réaction est initiée par ajout de NADPH et stoppée après 20min en ajoutant 20μί d'acétonitrile contenant 0,2% d'acide acétique. Les réactions ont alors été révélées par application directe du milieu d'incubation sur les plaques TLC ou par analyse GC-MS réalisées par une extraction avec des solvants organiques et une étape de dérivation comme décrite ci-après.

Analyse TLC

Les mélanges réactionnels ont été déposés directement sur des plaques TLC recouvertes de silice pour séparer les produits d'incubation du substrat initial. Les plaques ont été développées en utilisant un mélange éther/éther de pétrole/acide formique (50:50 :1 ,v/v/v). Les plaques ont été scannées en utilisant un détecteur de radioactivité. Les chromatogrammes résultant de la TLC permettent la détermination des taux de conversion pour chaque combinaison cytochromes P450/acide gras, basée sur la radioactivité détectée par le lecteur. La mobilité des produits sur la plaque TLC est une bonne indication du type de réaction d'oxygénation qui a été réalisé sur le substrat (i.e. hydroxylation, époxydation, formation de diacides). Ces résultats ont été confirmés par GC/MS autant que possible.

Analyse GC-LS

Les métabolites ont été extraits du mélange réactionnel par des extractions liquides/liquide successives avec de l'éther diéthylique et de l'hexane comme solvants. Les solvants ont ensuite été évaporés sous un flux d'azote. Les lipides ont été méthylés par une réaction dans du méthanol acide (MeOH/H2S04,99 :1 ,v/v-1 h-100°C) et triméthylsilylates avec de la Ν,Ο-bistrimethylsilyltrifluoroacétamide contenant 1 % (v/v) de triméthylcholrosilane. Les analyses GC/MS ont été mises en œuvre sur un chromatographe à gaz équipé avec une colonne capillaire avec un diamètre interne de 0,25mm et une épaisseur de film de 0,25μηι. Le chromatographe à gaz a été combiné à un détecteur sélectif de la masse de type quadrupole. Le spectre de masse a été enregistré à 70eV et analysé comme dans Eglinton et al. 1996. Les acides gras hydroxylés tout comme les acides dicarboxyliques formés durant les réactions enzymatiques ont été identifiés par analyse de leur spectre de masse et comparés avec des contrôles quand cela était nécessaire.

Exemple 3 - Surexpression d'ALK3

Au vu des résultats obtenus à l'exemple 2, les inventeurs ont testé la surexpression du gène ALK3 chez Yarrowia lipolytica en vue d'augmenter la production de diacide à partir d'une source d'acide gras, et notamment d'acide oléique.

Il avait été décidé de réaliser ces modifications dans deux contextes génétique : 1 ) la souche de production Y2149 (souche performante mais qui contenant le gène CYP51A17 de Candida tropicalis et qui n'est pas complètement bloquée pour le stockage de lipide sous forme de TAG ) et la Y2159+CPR1 (dérivée de la souche OLEO-X qui produit un peu moins de diacides, est plus sensible aux lipides, mais qui avait l'avantage de ne plus stocker les acides gras sous formes de triacylglycérol).

La surexpression d'Alk3 et de Cyt B5 dans les deux contextes génétiques n'a pas permis une amélioration de la production d'acide cis-octadéc-9-éne dioïque (DC18 :1 ), au contraire, les inventeurs ont observé une diminution de la production de DC18 :1 (Figure 4).

Ces résultats sont à l'opposé de l'effet observé d'une activité hydroxylase spécifique pour l'acide oléique d'ALK3 in vitro à l'exemple 2.

D'après ces résultats décevant, les inventeurs ont cherché à savoir si d'autres enzymes telles que les enzymes FALDHs, qui sont impliquées dans la dernière étape de la voie de synthèse de diacides ou par d'autres enzymes de la voie de synthèse tels que les ADHs et la FAO pouvaient être intéressantes pour augmenter la production de diacides.

Exemple 4 - Surexpression des gènes FALDH3 ou FALDH4

En parallèle, les inventeurs ont identifié les gènes codant potentiellement pour une activité déshydrogénases d'aldéhydes gras (quatre gènes nommés FALDH1 -4). Ces gènes ayant montrés, au cours de l'analyse transcriptomiques durant une cinétique de production de DC18 :1 (fermentation DCA7) une forte expression au cours de la phase de production de diacide.

Les cassettes d'expression des quatre gènes codant les FALDH's ont été construits sous le contrôle du promoteur constitutif pTEF. Les inventeursont transformé les deux souches : Y2149 et Y2159 (souche de production et souche OLEO-X). Les souches obtenues ont étés vérifiés par PCR et mise en collection.

Afin de connaître si la dernière étape de la synthèse de DC18 :1 , qui implique les enzymes FALDH est cruciale, les inventeurs ont les ont transformé avec les vecteurs de surexpression dans la souche OLEO-X qui surexprime le gène CPR1 .

Les inventeurs n'ont obtenu que des souches qui surexpriment les gènes FALDH3 et FALDH4. Il est possible que la surexpression des gènes FALDH1 et FALDH2 soit toxique et létale pour les souches de production.

Après caractérisation des souches, les inventeurs ont testé la production de diacides en comparant les souches OLEOX surexprimant CPR1 et FALDH3 et OLEOX surexprimant CPR1 et FALDH4. En contrôle, la souche OLEOX ne surexprimant que CPR1 a été utilisée.

Les résultats sont présentés à la Figure 5.

Les résultats montrent que la surexpression de FALDH3 ou FALDH4 n'améliore pas la production de DC18:1 , bien au contraire il y a une diminution de la production de diacides. Ces résultats sont donc similaires à ceux observés pour la surexpression d'ALK3.

Exemple 5 - Surexpression des gènes ADH2 et ADH5

Les inventeurs ont également testé l'effet de la surexpression des gènes ADH2 et ADH5 sur la production de diacides. Des souches de Yarrowia lipolytica de génotype FT164, pox1-6A, dgalA, lro1 :: URA3, CPR1 ont été transformées avec les cassettes de surexpression des alcools déshydrogénases (ADHs) pPOX2-ADH2 et pPOX2- ADH5. Les souches obtenues ont étés vérifiés par PCR et mise en collection

Après caractérisation des souches, les inventeurs ont testé la production de diacides en comparant les souches surexprimant CPR1 et ADH2 et surexprimant CPR1 et ADH5. En contrôle, la souche ne surexprimant que CPR1 a été utilisée.

Les résultats sont présentés à la Figure 9.

Les résultats montrent que la surexpression d'ADH2 ou ADH5 n'améliore pas la production de DC18:1 , bien au contraire il y a une diminution de la productivité de diacides notamment lors de la surexpression d'ADH5. Ces résultats sont donc similaires à ceux observés pour la surexpression d'ALK3 ou la surexpression de FALDH3 ou FALDH4.

Exemple 6 - Surexpression des gènes ALK3 + ADH2 et/ou ADH5 + FALDH3 et/ou FALDH4 et/ou FAQ1

Malgré les résultats négatifs obtenus, qui les ont dissuadés d'utiliser les gènes ALK3 ou FALDH3 ou 4, les inventeurs ont tout de même testé toutes les souches qui surexpriment la voie de synthèse de diacide en entier.

Les souches étudiées dans une première expérience surexpriment l'une quelconque des combinaisons suivantes :

- ALK3 + CPR1 + ADH2 + FALDH3,

- ALK3 + CPR1 + ADH2 + FALDH4,

- ALK3 + CPR1 + ADH5 + FALDH3, et

- ALK3 + CPR1 + ADH5 + FALDH4.

Des cultures en fioles ont été réalisé et les meilleurs résultats ont été obtenus pour la combinaison suivantes ALK3+CPR1 +ADH2+FALDH3,

ALK3+CPR1 +ADH2+FALDH4 et ALK3+CPR1 +ADH5+FALDH3. Une deuxième cinétique de production a été réalisée pour confirmer les résultats précédents.

Les résultats obtenus pour les souches surexprimant ALK3+CPR1 +ADH2 + FALDH3 ou ALK3+CPR1 +ADH2 + FALDH4 sont présentés en Figure 6. La souche utilisée comme contrôle est OLEOX qui surexprime le gène CPR1 .

La cinétique de production de diacide a montré que la souche surexprimant ALK3+CPR1 +ADH2+FALDH3 présente une amélioration dans la production finale de DC18 :1 qui représente une augmentation de 20%.

La souche surexprimant ALK3+CPR1 +ADH2+FALDH4 ne présente pas une amélioration dans la production finale, mais il a une vitesse de production augmentée dans la phase de production de DCA. Ceci représente une amélioration intéressante en termes de productivité.

Au cours de la caractérisation des souches obtenues, un article a été publié par Gatter M et al. (Gatter et al., 2014 FEMS Yeast Res. 2014 Sep; 14(6):858), où ils sont identifiés une enzyme avec une activité oxydase d'alcool gras (FA01 ). Les inventeurs ont surexprimé ce gène sur le promoteur pTEF dans une souche qui surexprime les gènes CPR1 +ALK3 et ADH2.

Trois souches ont été testées pour leur capacité de production de diacide, en fiole. Une première expérience a montré une augmentation de 25%-60% de la production finale de DC18 :1 par rapport à la souche contrôle (OLEOX surexprimant CPR1 ). Les résultats sont représentés à la Figure 7.

Une deuxième expérience a permis aux inventeurs de suivre plus en détail la phase de production de diacide et les résultats précédents ont été confirmés. De plus, une forte amélioration de la productivité dans les 12-24h de la phase de production a été observée. Les résultats sont présentés à la Figure 8.

Ces résultats montrent l'obtention d'une souche capable d'augmenter la production et la productivité de DC18 :1 et en plus, que le gène FA01 joue un rôle très important pour la bioconversion d'acide oléique en DC18 :1.

L'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation présentés et d'autres modes de réalisation apparaîtront clairement à l'homme du métier.