MICROPARTf CULAS DE ALGINATO MODIFICADO CON RGD COMO SISTEMA DE LIBERACIóN DE FáRMACOS

CAMPO TéCNICO DE LA INVENCIóN

La presente invención se relaciona con sistemas de células encapsulados y, más concretamente, con microcápsulas formadas por un material polimérico que ha sido modificado por un péptido que es capaz de unirse a las proteínas de adhesión que se encuentran en la membrana celular de forma que las células que se encuentran en el interior de la microcápsula interaccionan con dicho péptido. La invención también contempla microcápsulas en las que las células han sido modificadas genéticamente para expresar una proteína de interés terapéutico así como a las aplicaciones terapéuticas de dichas microcápsulas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIóN

La tecnología de la microencapsulación celular se basa en la inmovilización de células dentro de una matriz polimérica rodeada por una membrana semipermeable. Dichas células encapsuladas están protegidas frente al rechazo del sistema inmune celular y dependiente de anticuerpos y tienen el potencial de producir un amplio abanico de sustancias terapéuticamente activas (Orive, G, et al. 2003, Nat. Med. 9:104-107, Orive,G. Trends Biotechnol. 2004, 22:87-92).

Estos sistemas "vivos" de liberación de fármacos resultan especialmente interesantes para la expresión de hormonas y factores de crecimientos de forma controlada y continuada, para la liberación local y dirigida de fármacos y para la mejora de la farmacocinética de péptidos y proteínas fácilmente degradables, los cuales, frecuentemente, tienen una vida media in vivo corta.

Debido a sus características, el alginato ha sido empleado frecuentemente como material de microencapsulación. Así, Orive, G. et al. (Mol.Therapy, 2005, 12:283-289) describen microcápsulas de alginato recubiertas de una membrana semipermeable de poli-L-lisina que contiene mioblastos genéticamente modificados y que expresan

eritropoietina (EPO). Las microcápsulas de alginato están estabilizadas por medio de cationes divalentes que, tras su implantación en el organismo, tienden a dirundir lo que resulta en una progresiva debilitación de la estructura de la microcápsula. Hasta la fecha, los intentos por mejorar la resistencia mecánica a largo plazo de estos sistemas se han basado en el reforzamiento de las microcápsulas con una membrana semipermeable (De Castro,M. et al. 2005, J Microencapsul. 22(3):303-15), mediante el uso de variantes del alginato modificadas mediante la condensación polielectrolítica con otro polímero, como el poli (metileno-co-guanidina (Orive,G. et al. 2003, Int.J.Pharm. 18:57-68) o mediante el entrelazado de las moléculas de alginato un monómero etilénico (WO03/094898). Sin embargo, este tipo de polímeros modificados no proporcionan un microambiente adecuado para la viabilidad celular. La solicitud de patente estadounidense US2006/0251630 describe microcápsulas de agarosa que contienen células encapsuladas en las que las microcápsulas se han preparado en presencia de fibrinógeno. Sin embargo, las microcápsulas están destinadas a la liberación rápida de las células, por lo que son cápsulas que no presentan una alta estabilidad. Markusen, J.F. et al. (Tissue Engeneering, 2006, 12:821-830) describen cápsulas de alginato modificadas con un péptido GRGDY y que contienen células mesenquimales adultas, así como su uso como sustituto de tejidos. Sin embargo, en este estudio no se demuestran que las células encapsuladas sobrevivan más de 15 días desde el momento de la implantación.

Por ello, existe una necesidad en la técnica de microcápsulas de alginato que presenten una mayor estabilidad y que, a la vez, garanticen durante largo tiempo la viabilidad de las células que se encuentran en su interior.

COMPENDIO DE LA INVENCIóN

En un primer aspecto, la invención se relaciona con una partícula de 1 mm de diámetro como máximo que comprende: a) un polímero X funcionalizado con, al menos, un péptido Y; b) al menos una célula que presenta en su superficie sitios de unión específicos para dicho péptido Y, en donde la célula se encuentra unida al

polímero X mediante la interacción entre el péptido Y y los sitios de unión específicos para dicho péptido Y en la superficie de la célula.

En un segundo aspecto, la invención se relaciona con una microcápsula que comprende una partícula de la invención rodeada por una membrana semipermeable.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una partícula o microcápsula de la invención para su uso en medicina.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de la partícula o microcápsula de la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento y prevención de enfermedades en las que se requiera una aportación del compuesto de naturaleza peptídica con actividad biológica que es expresado por las células que forman parte de las microcápsulas.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de la partícula o microcápsula de la invención como dispositivo para la liberación de un compuesto de naturaleza peptídica con actividad biológica.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la elaboración de una partícula de la invención que comprende las etapas de a) Poner en contacto una sustancia polimérica que está modificada con un péptido Y con al menos una célula que presenta en su superficie sitios de unión específicos para dicho péptido Y y b) aplicar condiciones que permitan la formación de partículas de material polimérico que tengan menos de 1 mm de diámetro.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para preparar una microcápsula de la invención que comprende las etapas de a) Poner en contacto una sustancia polimérica que está modificada con un péptido Y con unas células que tienen la capacidad de unirse a dicho péptido Y b) aplicar condiciones que permitan la formación de partículas de material polimérico que tengan menos de 1 mm de diámetro

c) recubrir la micropartícula formada en la etapa (b) con una membrana de un material distinto al polímero usado en la etapa (a).

BREVE DESCRIPCIóN DE LAS FIGURAS

Figura 1. a) viscosidad de la mezcla de alginatos-RGD y la solución de alginato LVG. b) Ilustración que describe el efecto de la bioactivación de las matrices de alginato con RGD, lo que facilita la adhesión de la células inmovilizadas a la matriz; c) Estudio de la estabilidad osmótica de las cápsulas LVG frente a las bioactivadas con RGD; d) Resistencia mecánica por compresión de ambas partículas mediante texturometría.

Figura 2. a) Seguimiento durante 300 días del hematocrito de los animales implantados con microcápsulas LVG y bioactivadas con RGD frente a animales control; b) Imagen al microscopio de cápsulas extraídas en el día 300 tras iniciarse el tratamiento; c) Producción de EPO de las cápsulas explantadas a día 300 de los animales; d) Histología de las microcápsulas a día 300.

Figura 3: Estudio dosis-respuesta: a) Imágenes iniciales de las microcápsulas RGD con diferentes densidades celulares; b) y c) viabilidad y producción de EPO de las células encapsuladas respectivamente; d) viabilidad de las dosis de cápsulas a diferentes densidades celulares durante 6 meses; e) ilustraciones correspondientes a los agregados de microcápsulas y la vascularización inducida a los 6 meses; f) Histología de las diferentes microcápsulas

DESCRIPCIóN DETALLADA DE LA INVENCIóN

Los autores de la presente invención han observado que, sorprendentemente, cuando micropartículas de alginato que contienen células se preparan con un alginato que ha sido modificado mediante conjugación con un péptido de bioadhesión celular, las micropartículas resultantes presentan una resistencia física muy superior a las microcápsulas que contienen alginato no modificado. Sin tener intención de estar vinculado por ninguna teoría, se piensa que este efecto es debido a la aparición de interacciones entre las moléculas de adhesión que están en la superficie de las células

microencapsuladas y los péptidos de adhesión acoplados al alginato, lo que resulta en que las células se incorporan a la matriz como agentes reticulantes, lo que resulta en una mejora de las propiedades mecánicas de las matrices. Por otro lado, los inventores han observado que la viablidad de las células en las partículas puede verse comprometida si las partículas tienen más de 1 mm de diámetro. Sin querer estar vinculado por ninguna teoría, se piensa que el pequeño diámetro de las partículas permite que las células se encuentren a una distancia máxima de 100 a 200 μm con respecto a la fuente de nutrientes (habitualmente un capilar), lo que garantiza un aporte óptimo de nutrientes.

Por ello, en un primer aspecto, la invención se relaciona con una partícula de 1 mm de diámetro como máximo que comprende: a) un polímero X funcionalizado con, al menos, un péptido Y y b) al menos una célula que presenta en su superficie sitios de unión específicos para dicho péptido Y, en donde la célula se encuentra unida al polímero X mediante la interacción entre el péptido Y y los sitios de unión específicos para dicho péptido Y en la superficie de la célula.

El diámetro exacto de las partículas no es limitante siempre que sea inferior a 1 mm. Así, en formas preferidas de realización, las partículas tienen, como máximo entre 1 y 0.9, entre 0.9 y 0.8, entre 0.8 y 0.7, entre 0.7 y 0.6, entre 0.6 y 0.5, entre 0.5 y 0.4, entre 0.4 y 0.3, entre 0.3 y 0.2, entre 0.2 y 0.1 o menos de 0.1 mm de diámetro.

Materiales de relleno adecuados para actuar como soporte de las células pueden ser cualquier tipo de material polimérico, en particular, los polímeros termoplásticos o los polímeros hidrogeles.

Entre los polímeros del tipo hidrogel se encuentran materiales naturales del tipo alginato, agarosa, colágeno, almidón, ácido hialurónico, albúmina de suero bovina, celulosa y sus derivados, pectina, condroitin sulfato, fibrina y fibroina, así como hidrogeles sintéticos como sefarosa y sefadex.

Entre los polímeros termoplásticos se encuentran ácido acrílico, acrilamida, 2-aminoetil metacrilato, poli(tetrafluoroetileno-cohexafluorpropileno), ácido metacrílico-(7-

cumaroxi) etil éster, N-isopropyl acrilamda, ácido poliacrílico, poliacrilamida, poliamidoamia, poli(amino)-p-xilileno, poli(cloroetilvonileter), policaprolactona, poli(caprlactona-co-trimethylene carboanto), poli(carbonato urea) uretano, poli(carbonato) uretano, polietileno, coplímero de polietileno y archilamida, polietilenglicol, polietilenglicol metacrilato, poli(etilene tereftalato), poli(4-hidroxibutil acrilato), poli(hidroxietil metacrilato), poli(N-2-hidroxipropil metacrilato), poli(ácido láctico-ácido glicólico), poli(ácido L láctico), poli(gamma-metil, L-glutamato), poli(metilmetacrilato), polipropileno fiαmarato), poli(propileno óxido), polipirrol, poliestirene, poli(tetrafuoro etileno), poliuretano, polivinil alcohol, polietileno de peso molecular ultraalto, 6-(p-vinilbenzamido)-ácido hexanoico y N-p-vinilbenzil-D- maltonamida y copolímeros que contienen más de uno de dichos polímeros.

En una forma de realización preferida, el polímero usado como soporte en la microcápsulas de la invención es alginato. En principio, cualquier tipo de alginato capaz de formar un hidrogel es adecuado para ser usado en las microcápsulas de la invención. Así, las microcápsulas de la invención pueden contener alginato formado mayoritariamente por regiones de ácido manurónico (bloques MM), por regiones de ácido gulurónico (bloques GG) y por regiones de secuencia mixta (bloques MG). El porcentaje y distribución de los ácidos urónicos difieren según el origen del alginato y contribuyen a las propiedades del alginato. El experto en la materia conoce los porcentajes de cada uno de los distintos bloques que aparecen en las distintas fuentes biológicas de los alginatos. Así, la invención contempla el uso de alginatos procedentes de Laminaria hyperborea, Letonia nigrescens, Lessonia trabeculata, Durvillaea antárctica, Laminaria digitata, Eclonia máxima, Macrocystis pyrifera, Ascophyllum nodosum y/o Laminaria japónica así como mezclas de alginatos de distintas especies hasta conseguir el contenido deseado en bloques GG, MM o GM. Los bloques GG contribuyen a la rigidez del hidrogel, mientras que los monómeros MM mantienen una gran resistencia a la fractura, de forma que mediante el uso de una combinación adecuada de polímeros de alginato, se puede obtener una mezcla cuyo módulo de elasticidad presenta una valor adecuado mientras que la viscosidad de la solución pre- gel se mantiene a niveles suficientemente bajos como para permitir una adecuada manipulación e inmovilización celular. Así, los alginatos que pueden usarse en la presente invención incluyen alginatos GG, alginatos MM o combinaciones de ambos en

una relación de 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 o 10:90. En una forma de realización preferida, se ha utilizado una mezcla de ambos tipos de polímeros para formar hidrogeles binarios que contienen un 50% de polímeros MVG irradiados y un 50% de polímeros de tipo MVG sustituidos con secuencias RGD.

Adicionalmente, la invención también contempla el uso de alginatos derivados del tratamiento de alginatos naturales con enzimas que son capaces de modificar los bloques integrantes para dar lugar a alginatos con propiedades mejoradas. Así, alginatos resultantes del tratar alginatos con C5-epimerasas, que convierten bloques M en bloques G, así como con la enzima AlgE4 de la bacteria Azotobacter vinelandii que es capaz de convertir los bloques M relativamente rígidos en bloques MG. Alternativamente, la invención contempla el uso de alginatos que han sido modificados por distintos tratamientos físicos, en particular, rayos gamma, irradiación con ultrasonidos o con luz ultravioleta según ha sido descrito por Wasikiewicz, J.M. et al. (Radiation Physics and Chemistry, 2005, 73:287-295). Así, en una forma de realización preferida, los alginatos han sido tratados con una fuente de rayos gamma, preferentemente Co ⁶⁰ , en una dosis de 10-500 kGy. El tratamiento con rayos gamma resulta en la degradación del alginato con lo que los bloques de alginatos GG, MM o GM que se incorporan en la partícula son de menor peso molecular.

El polímero que forma parte de las microcápsulas se encuentra funcionalizado con un péptido Y, que permite la unión de las células que se encuentran en las microcápsulas con el polímero a través de la interacción específica entre componentes de la membrana celular y el péptido Y. En principio, cualquier péptido que posea sitios de unión específicos en el exterior de la membrana celular puede ser usado en la presente invención. Así, el péptido Y puede proceder de moléculas de adhesión celular que interacciona con la matriz extracelular como la fibronectina, los distintos miembros de la familias de las selectinas, las caderinas, las lectinas, las integrinas, las inmunoglobulinas, las colectinas y las galectinas.

En una forma de realización preferida, el péptido Y es un péptido derivado de una región seleccionada de las regiones de las fibronectina que intervienen en la unión con las integrinas que se encuentran en la membrana celular. Preferentemente, dichos

péptidos derivan de la región de la décima repetición tipo III de fibronectina que contiene el péptido RGD, de la región de la decimocuarta repetición tipo III de la fibronectina que contiene el péptido IDAPS, de la región CSI de fibronectina que contiene el péptido LDV y la región CS5 de la fibrinectina que contiene el péptido REDV. Estos péptidos pueden consistir en fragmentos de las regiones correspndientes que conservan su capacidad adhesiva, como, por ejemplo, el péptido QAGDV del fibrinógeno, el péptido LDV de la fibronectina y el péptido IDSP de VCAM-I. En una forma de realización particular, dicho péptido de unión a integrinas es un péptido derivado de la décima repetición tipo HI de la fibronectina que comprende la secuencia RGD, como, por ejemplo, un péptido seleccionado del grupo de RGD, RGDS, , GRGD, RGDV, RGDT, GRGDG, GRGDS, GRGDY, GRGDF, YRGDS, YRGDDG, GRGDSP, GRGDSG, GRGDSY, GRGDVY, GRGDSPK, CGRGDSPK, CGRGDSPK, CGRGDSY, ciclo(RGDfK), YAVTGRGD, AcCGGNGEPRGDYRAY-NH2, AcGCGYGRGDSPG and RGDPASSKP, variantes cíclicas de dichos péptidos, variantes multivalentes tanto lineales como ramificadas (ver por ejemplo Dettin,M. et al. 2002, J.Biomed.Mater.res. 60:466-471, Monaghan;s. et al. 2001, Arkivoc, 2:U42-49, Thumshirn,G. et al. 2003, Chemistry 9:2717-25, Scott,E.S. et al, 2001, J.Gene Med. 3:125-134)) así como combinaciones de dos o más de dichos péptidos.

El péptido de adhesión celular puede estar unido al polímero que actúa como soporte a través del extremo N-terminal o del extremo C-terminal e, independientemente del punto de anclaje, puede estar unido directamente al polímero que actúa como soporte o, alternativamente, puede estar unido a través de un elemento espaciador. Prácticamente, cualquier péptido con flexibilidad estructural puede ser utilizado. A modo ilustrativo, dicho péptido flexible puede contener repeticiones de restos de aminoácidos, tales como (GIy) ₄ , Gly-Gly-Gly-Ser, (GIy) _n (Beer, J.H. et al., 1992, Blood, 79, 117-128), SPASSKGGGGSrL6-NH2 (Craig,W.S. et al. 1995, Biopolimers, 37:157-175) o cualquier otra repetición de restos de aminoácidos adecuada, o bien la región bisagra de un anticuerpo.

Así mismo, la invención contempla distintos grados de sustitución del alginato con el péptido bioadhesivo, de forma que durante el proceso de conjugación del polímero con el péptido de bioadhesión, las concentraciones de ambos componentes se pueden variar

de forma que el polímero modificado resultante tenga el número deseado de péptidos bioadhesivos acoplados. Así, la invención contempla alginatos que contienen entre 1 y

100, entre 100 y 200, entre 200 y 300, entre 300 y 400, entre 400 y 500, entre 500 y 600, entre 600 y 700, entre 700 y 800, entre 800 y 900 y entre 900 y 1000 moléculas de péptido bioadhesivo por cada molécula de polímero.

Las partículas de la invención pueden usarse tal cual. Sin embargo, el alginato es un polímero poco estable que tiende a perder calcio y por tanto, a perder su carácter de gel. Además, las partículas de alginato son relativamente porosas lo que resulta en que los anticuerpos pueden acceder a su interior y dañar las células. Por estos motivos, es conveniente que las micropartículas se rodeen de una membrana semipermeable que confiera estabilidad a las partículas y que forme una barrera impermeable a los anticuerpos. Por este motivo, en otro aspecto la invención se relaciona con microcápsulas que comprenden una partícula según la invención rodeadas de una membrana semipermeable.

Por membrana semipermeable se entiende una membrana que permite la entrada de todos aquellos solutos necesarios para la viabilidad celular y, en el caso de que se usen células que producen una proteína terapéutica, que permitan la salida de las proteínas terapéuticas producidas por las células, pero que es sustancialmente impermeable a los anticuerpos, de forma que las células quedan protegidas de la respuesta inmune producida por el organismo que alberga las microcápsulas.

Materiales adecuados para formar la membrana son materiales insolubles en fluidos biológicos, preferentemente poliamino ácidos, como por ejemplo poli-L-lisina, poli-L- ornitina, poli-L-arginina, poli-L-asparagina, poli-L-aspártico, poli benzil-L-aspartate, poli-S-benzil-L-cisteina, poli-gamma-bencil-L-glutamato, poli-S-CBZ-L-cisteina, poli- ε-CBZ-D-lisina, poli-δ-CBZ-DL-ornitina, poli-O-CBZ-L-serina, poli-O-CBZ-D- tirosine, poli(γ-etil-L-glutamate), poli-D-glutámico, poliglicine, poli-γ-N-hexil L- glutamato, poli-L-histidina, poli (α,β-[N-(2-hidroxyetil)-DL-aspartamida]), poli-L- hidroxiprolina, poli (α,β-[N-(3-hidroxipropil)-DL-aspartamide]), poli-L-isoleucina, poli- L-leucina, poli-D-lisina, poli-L-fenilalanina, poli-L-prolina, poli-L-serina, poli-L- threonina, poli-DL-triptófano, poli-D-tirosine o una combinación de los mismos. Más

prefereiblmente, los poli amino ácidos con poli amino ácidos policatiónicos. Aún más preferiblemente, los poli amino ácidos policatiónicos son poli-L-lisina, poli-L-ornitina y poli-D Usina.

La membrana que recubre la microcápsula es habitualmente de un material policatiónico, que da lugar a la formación de un complejo polianión-policatión que contribuye a la estabilización del alginato y a reducir la porosidad de la microcápsula y a formar una barrera inmunológica impermeable a los anticuerpos. Sin embargo, la carga positiva de dicha membrana favorece la adhesión celular a la superficie de la microcápsula lo que resulta en una menor biocompatibilidad de la microcápsula. Por ello, en una forma de realización particular, la membrana que rodea la microcápsula está rodeada, a su vez, de una segunda membrana formada mayoritariamente por un material que inhibe la adhesión celular. En una forma de realización, preferida, dicho material que forma la segunda membrana es un alginato.

Cualquier célula eucariota puede ser utilizada en la presente invención siempre que presente en su superficie sitios de unión para el péptido Y, pero las células de ratón, rata, primate y humanas son las preferidas. Así células adecuadas para llevar a cabo la invención son cardiomiocitos, células endoteliales, células epiteliales, linfocitos (células B y T), mastocitos, eosinófilos, células de la intima vascular, cultivos primarios de células aisladas de distintos órganos, preferentemente de células de aisladas de los islotes de Langerhans, hepatocitos, leucocitos, incluyendo leucocitos mononucleares, células madre de origen embrionario, mesenquimales, de cordón umbilical o adultas (de piel, pulmón, riñon e hígado), osteoclastos, condrocitos y otras células del tejido conectivo. También son adecuadas células de líneas establecidas tales como células T de Jurkat, células NIH-3T3, CHO, Cos, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, mioblastos C2C12 y células W138.

En principio, el número de células que deben formar parte de las microcápsulas no es esencial para la invención siempre que exista un número de células suficiente para que se contribuyan a la formación de la retícula y se obtenga el deseado efecto de aumento de la resistencia mecánica de las micropartículas. Así, en una forma preferida de realización, la cantidad de células por cada mL de solución de alginato es entre 1 y 10 x

10 ⁶ , preferiblemente entre 2 y 9 xlO ⁶ , más preferiblemente entre 3 y 8 x 10 ⁶ , todavía más preferiblemente entre 4 y 7 x 10 ⁶ y todavía más preferiblemente entre 5 y 6 x 10 ⁶ . Preferiblemente, el número de células en la mezcla inicial es de 5; 3,75; 2,5 ó l,25xlθ ⁶ por cada mL de solución de alginato.

En una forma de realización preferida, las células que forman parte de las microcápsulas han sido modificadas genéticamente de forma que producen proteínas terapéuticas. En este caso, las células deben ser capaces de modular la expresión de las secuencias insertadas y de modificar y procesar el producto de forma que la proteína adquiera su conformación nativa. Ejemplos de proteínas que pueden ser producidas por las células que forman parte de las microcápsulas objeto de la invención son eritropoietina (EPO), hormona liberadora de hormona adrenocorticotropa (CRH), hormona liberadora de hormona somatotropa (GHRH), hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH), hormona liberadora de tirotropina (TRH), hormona liberadora de prolactina (PRH), hormona liberadora de melatonina (MRH), hormona inhibidora de prolactina (PIH), somatostatina, hormona adrenocorticotropa (ACTH), hormona somatotropa o del crecimiento (GH), hormona luteinizante (LH), hormona foliculoestimulante (FSH), tirotropina (TSH u hormona estimulante del tiroides), prolactina, oxitocina, hormona antidiurética (ADH o vasopresina), melatonina, factor inhibidor Mülleriano, calcitonina, hormona paratifoidea, gastrina, colecistoquinina (CCK), secretina, factor de crecimiento de tipo insulina tipo I (IGF-I), factor de crecimiento de tipo insulina tipo II (IGF-II), péptido natriurético atrial (PNA), gonadotrofina coriónica humana (GCH), insulina, glucagón, somatostatina, polipéptido pancreático (PP), leptina, neuropéptido Y, renina, angiotensina I, angiotensina II, factor VIII, factor IX, factor tisular, factor VII, factor X, trombina, factor V, factor XI, factor XIII, interleukina 1 (IL-I), Factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNF-α), interleuquina 6 (IL-6), Interleukina 8 (IL-8 y chemoquinas), interleukina 12 (IL- 12), interleukina 16 (IL- 16), interferones alpha, beta, gamma, factor de crecimento neuronal (NGF), factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta), proteínas morfogenéticas del Hueso (BMPs), factores de crecimiento de los fibroblastos (FGF y KGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF y relacionados), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento glial, factor de crecimiento de queratinocitos, factor de crecimiento endotelial,

antitripsina 1 alfa, factor de necrosis tumoral, factor estimulante de colonias de granulocito y macrófagos (GM-CSF), ciclosporina, fibrinógeno, lactoferrina, activador de plasminógeno tipo tisular (tPA), quimotripsina, inmunoglobinas, hirudina, superoxide dismutasa, imiglucerasa.

Los polipéptidos que codifican para proteínas de interés terapéutico se encuentran asociados a secuencias que regulan la expresión de dichos polipéptidos. Estas secuencias pueden ser secuencias que regulan la transcripción, como promotores, constitutivos o inducibles, enhancers, terminadores transcripcionales y secuencias que regulan la traducción, como secuencias no traducidas localizadas 5' o 3' con respecto a la secuencia codificante.

Las proteínas expresadas por las células que forman parte de las microcápsulas de la invención pueden ser expresadas de forma transitoria o de forma estable. En caso de que las microcápsulas permanezcan un tiempo prolongado en el paciente, es preferible usar células que expresen la proteica terapéutica de forma estable. La expresión estable requiere la transformación del polinucleótido que codifica para la proteína de selección conjuntamente con un polinucleótido que codifica para una proteína que permite seleccionar frente a aquellas células que no han incorporado el marcador. Sistemas de selección adecuados son, sin limitación, la timidina quinasa del virus del herpes, la fosforribosiltransferase hipoxantina guanina, adenina fosforibosiltransferasa, genes que codifican para proteínas que confieren resistencia a un antimetabolito como la dihidrofolato reductase, la piruvato transaminasa, el gen de resistencia a la neomicina y a la higromicina.

Promotores adecuados para la expresión de las proteínas terapéuticas incluyen, sin estar necesariamente limitados, promotores constitutivos tales como los derivados de los genomas de virus eucariotas tales como el virus del polioma, adenovirus, SV40, CMV, virus del sarcoma aviar, virus de la hepatitis B, el promotor del gen de la metalotioneina, el promotor del gen de la timidina kinasa del virus del herpes simplex, regiones LTR de los retro virus, el promotor del gen de la inmunoglobuina, el promotor del gen de la actina, el promotor del gen EF-lalpha así como promotores inducibles en los que la expresión de la proteína depende de la adición de una molécula o de una señal

exógena exógena, tales como el sistema tetraciclina, el sistema NFkappaB/luz UV, el sistema Cre/Lox y el promotor de los genes de choque térmico.

En principio, la inserción del material genético exógeno en las células que van a ser encapsuladas puede ser llevado a cabo mediante cualquier método de los conocidos en la técnica. Así, el gen o el vector que contiene el gen pueden ser administrados mediante electroporación, transfección usando liposomas o proteínas policatiónicas o usando vectores virales, incluyendo vectores adeno virales y retro virales y también vectores no virales.

En una forma de realización particular, la proteína expresada por las células es la eritropoietina o una variante de la misma. En particular, eritropoietinas adecuadas son la eritropoietina humana así como variantes de la misma con una actividad y/o estabilidad mejorada, tales como las variantes descritas en la solicitud internacional de patente WO/2004/043382 o la variante conocida como nueva proteína estimulante de la eritropoiesis (NESP o darbepoietin alfa).

Las partículas y microcápsulas de la invención tienen la propiedad de secretar las proteínas producidas por las células que se encuentran en su interior, de forma que, si la proteína tiene interés terapéutico, pueden ser usadas para el tratamiento de aquellas enfermedades que requieran una aportación de la proteína terapéutica en cuestión. Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con composiciones farmacéuticas que contienen las partículas y microcápsulas de la invención así como a métodos para el tratamiento de distintas enfermedades utilizando las las partículas y microcápsulas de la invención y a métodos para la preparación de medicamentos que se pueden utilizar para el tratamiento de enfermedades que requieren la administración de las proteínas terapéuticas producidas por las partículas y microcápsulas.

No existe prácticamente limitación en lo que ser refiere al tipo de enfermedad que puede ser tratada usando las partículas y microcápsulas de la invención siempre que exista una proteína que tenga un efecto terapéutico sobre dicha enfermedad. Así la tabla 1 recoge un número de enfermedades que pueden ser tratadas con las microcápsulas de la invención con indicación de la proteína terapéutica necesaria para tal tratamiento.

Tabla 1 : Proteínas terapéuticas v enfermedades para las que se pueden utilizar

En una forma de realización particular, la proteína que es secretada por la proteína es la eritropietina, en cuyo caso las microcápsulas pueden ser utilizadas para el tratamiento y prevención de enfermedades caracterizadas por un bajo nivel de glóbulos rojos o una producción deficiente de glóbulos rojos. Ejemplos de tales enfermedades son anemia asociada al fallo renal crónico, anemia relacionada con la terapia con AZT in pacientes de SIDA, anemia en pacientes con enfermedades malignas de tipo no mieloide que reciben quimioterapia, anemia asociada al cáncer, anemia asociada con enfermedades inflamatorias crónicas (artritis reumatoide), anemia en pacientes que han sufrido algún tratamiento quirúrgico para eliminar la necesidad de transfusiones alogénicas, anemia falciforme, talasemia, anemia asociada a fibrosis quística, desordenes menstruales, pérdidas agudas de sangre, anemia resultante de la radioterapia, la reducción de la captación de oxígeno asociada a la altitud, esquizofrenia y enfermedades neurodegenerativas.

Las microcápsulas de la invención, tras su implantación en un sujeto, llegan a vascularizarse lo que garantiza su permanencia en el tejido durante un largo tiempo.

Además, debido a la existencia de interacciones entre la matriz polimérica y las células, éstas son funcionales durante más tiempo. Por ambos motivos, las microcápsulas son capaces de producir proteína terapéutica de manera estable durante tiempos prolongados, es decir, actúan como medicamentos de liberación sostenida. Por ello, las microcápsulas de la invención son especialmente útiles para la expresión de proteínas de vida media en suero corta, ya que la rápida eliminación de las proteínas se compensa con una secreción estable y continuada de las mismas por parte de las microcápsulas.

Esto permite evitar la administración continua y repetida de agente terapéutico en aquellos pacientes que requieran niveles básales de dicho agente durante un tiempo prolongado. Por este motivo, en una forma de realización preferida, las microcápsulas se usan para la expresión de proteínas terapéuticas de corta semivida de eliminación.

La semivida de eliminación de un fármaco es el tiempo necesario para que la cantidad de dicho fármaco o agente xenobiótico presente en el cuerpo (o en el plasma sanguíneo) se reduzca a la mitad, mediante diversos procesos de eliminación que incluyen

degradación y la excreción renal. El término "corto" referido a la semivida de eliminación indica que la pro teína terapéutica tiene una semivida menor de 24, 20, 15, 10, 7, 5, 3 o 1 hora(s).

Las microcápsulas de la invención pueden ser administradas al paciente de forma parenteral y no parenteral, incluyendo intravascular, intraperitoneal, subcutánea, intradérmica o por inhalación.

Debido a la capacidad de las microcápsulas de liberar las proteínas terapéuticas producidas por las células encapsuladas, las microcápsulas resultan de gran utilidad como dispositivo para la liberación de compuestos de naturaleza peptídica con actividad biológica. Así en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de las microcápsulas de la invención para la liberación de compuestos peptídicos con actividad biológica. En una forma de realización preferida, dicho compuesto tiene una corta vida media de eliminación en suero. En otra forma de realización preferida, la liberación se produce de forma controlada bajo la aplicación de un estímulo externo.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método de preparación de las partículas de la invención que comprende las etapas de

a. Poner en contacto una sustancia polimérica que está modificada con un péptido Y con al menos una célula que presenta en su superficie sitios de unión específicos para dicho péptido Y y b. aplicar condiciones que permitan la formación de partículas de material polimérico que tengan menos de 1 mm de diámetro.

Las condiciones necesarias en la segunda etapa para promover la agregación de los polímeros y dar lugar a partículas de menos de 1 mm de diámetro dependerán del tipo de polímero que se use. En el caso de los polímeros termoplásticos, la formación de las partículas requiere de calor. En el caso de que el polímero sea el alginato, la formación de partículas requiere la puesta en contacto de la mezcla polímero-células con un catión divalente. Preferentemente, el catión divalente es calcio y el paso de puesta en contacto de la solución alginato-células con la solución de catión divalente se hace mediante extrusión en fase gaseosa o líquida de la mezcla polímero-células sobre la solución de cationes divalentes o mediante aplicación de voltaje.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para la preparación de las microcápsulas de la invención que comprende las etapas de a. Poner en contacto una sustancia polimérica que está modificada con un péptido Y con al menos una célula que presenta en su superficie sitios de unión específicos para dicho péptido Y y b. aplicar condiciones que permitan la formación de partículas de material polimérico que tengan menos de 1 mm de diámetro. c. poner en contacto las partículas formadas en la etapa b con un material que forma una membrana en torno a la microcápsula.

en donde las etapas (a) y (b) se corresponden esencialmente con las etapas del método de preparación de las partículas de la invención.

En la tercera etapa, las partículas de polímero-células se recubren de una membrana que confiere resistencia mecánica a las partículas e actúan como barrera inmunológica. El proceso de recubrimiento se lleva a cabo mediante la puesta en contacto de la micropartícula con el material de recubrimiento. En una forma de realización preferida, en el caso de que las partículas sean de alginato y el material que forma la membrana externa sea un material policatiónico, la simple puesta en contacto de las partículas con poli-L-lisina permite que se forme la membrana de recubrimiento, debido a la interacción directa que se produce entre la carga positiva de la poli-L-lisina y la carga negativa de los alginatos.

En otra forma de realización preferida de la invención, en caso de que las partículas contengan una capa externa adicional, el método de preparación incluye una etapa adicional en la que las microcápsulas se recubren de dicha capa adicional. Preferentemente, cuando las microcápsulas están rodeadas de una membrana de un material policatiónico y la capa adicional es alginato, la etapa adicional requiere simplemente la puesta en contacto de las microcápsulas con la solución de alginato, ya que los alginatos, a través de su carga negativa, son capaces de interaccionar con la membrana de material policatiónico.

La invención se ilustra a continuación en base a los siguientes ejemplos que se proporcionan a modo ilustrativo y no limitativo del alcance de la invención.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Se ajustó el peso molecular de las moléculas de alginato ricos en restos de ácido gulurónico (Protanal LF240 D , FMC Technologies) mediante irradiación con una fuente de cobalto 60. Se variaron la dosis de irradiación de 2 a 5 Mrads. El peso molecular final de las moléculas de alginato se analizó mediante cromatografía de filtración en gel (Viscotek).

Tras la irradiación, se modificaron las moléculas de alginato con oligopéptidos sintéticos que contenían la secuencia (glicina) ₄ -arginina-glicina-ácido áspartico-tirosina (GGGGRGDY, Commonwealth Biotechnology Inc.) utilizando para ello reacciones de carbodiimida acuosa [I]. De forma resumida, se prepararon soluciones de alginato en un tampón de hidrato del ácido 2-[N-moφholino]ethanesulfonico (MES, Sigma) que fueron posteriormente mezcladas con N-hydroxysulfosuccinimida (sulfo-NHS, Pierce Chemical), and l-etil-3-[3-(dimetilamino)propil] carbodiimida (EDC, Sigma) y los oligopéptidos. Tras dejar proceder la reacción durante 24 horas, las moléculas de alginato modificadas se purificaron usando filtros (Fisher) para eliminar las moléculas más pequeñas de 3,500 g/mol. Tras la filtración, esterilización y liofilización, el alginato modificado se reconstituyó hasta la concentración deseada en el medio de cultivo celular.

Se comprobó la viscosidad de ambos geles binarios, la solución con alginato-RGD y la solución con alginato sin modificar y se observó que ambos exhibían unos valores similares de viscosidad (Figura la).

Ejemplo 2 Efectos adhesivos y biomiméticos de los alginatos-RGD

Para evaluar los efectos adhesivos y biomiméticos de los alginatos-RGD, se seleccionaron como células candidatas mioblastos C2C12 esqueléticos de ratón

modificados por ingeniería genética que secretan eritropoietina (EPO) y se mezclaron con la solución de polímero binario. Se observó que tanto la concentración de RGD como de la composición de alginato podían controlar el fenotipo de los mioblastos. Estas células son fácilmente manipulables y una vez encapsuladas e implantadas en el hospedador, salen de forma irreversible del ciclo celular y se fusionan en miofibrillas multinucleadas. Lo último es esencial para controlar la dosis terapéutica y para evitar posibles riesgos de bioseguridad. Se seleccionó EPO como fármaco modelo debido a sus efectos terapéuticos emergentes y porque es fácil de monitorizar su expresión y bioactividad in vivo siguiendo su nivel hematocrito. Además, debido a su farmacocinética débil, se espera que la tecnología de la encapsulación celular pueda evitar la continua y repetida inyección de EPO que actualmente se practica.

Se fabricaron microcápsulas tridimensionales con soluciones de alginato-RGD y de alginato sin modificar (Figura Ib). Para asegurar una biocompatibilidad óptima, una funcionalidad a largo periodo de tiempo y una cinética de liberación de EPO de orden cero, se produjeron microcápsulas uniformes y de pequeño diámetro (450 μm).

Para evaluar y comparar la integridad mecánica de las microcásulas de alginato-RGD y de alginato sin modificar, se estudió el comportamiento de expansión y la resistencia mecánica de las cápsulas frente a compresión. La expansión de las microcápsulas de alginato-RGD (1,12 ± 0,01) fue significativamente menor que la de los sistemas de alginato no modificado (1,16 ± 0,01) (n=20, P<0,05) (Figura Ic), mientras que la resistencia de las cápsulas a la compresión fue significativamente mayor (49,6 ± 6,7 vs. 39,1 ± 4,7; n= 20, P < 0,01) (Figura Id). Estos resultados apoyan la idea de la interacción de mioblastos a los ligados de adhesión lo que proporciona una integridad mecánica adicional a los andamios actuando las células como agentes reticulantes.

Ejemplo 3

Viabilidad y funcionalidad de los mioblastos en las matrices de alginato RGD

Para caracterizar la viabilidad y funcionalidad de los mioblastos en las matrices, se estudió in vitro la actividad metabólica celular y la liberación de EPO durante un periodo de tres semanas. Estos estudios a corto plazo no mostraron mayores diferencias

entre los dos tipos de microcápsulas en viabilidad celular ni en liberación de EPO. Tras 21 días en cultivo, la secreción de EPO de microcápsulas de alginato-RGD cargadas con 100 células medida fue 71 ±9 IU de EPO/24 h, mientras que la producción en matrices de alginato no modificado fue de 72±5 IU EPO/24 h. Estos resultados sugieren que las células se adaptaron satisfactoriamente a los nuevos microambientes. Sin embargo, con el fin de evaluar el posible impacto de matrices bioactivadas con RGD en la supervivencia y funcionalidad a largo tiempo de las células encapsuladas, se implantaron 0,2 mL de ambos tipos de microcápsulas (alginato-RGD, 5x106 células/mL alginato) en tejido subcutáneo de ratones inmunocompetentes Balb/c (n=5) sin implementación de protocolos de inmunosupresión (Figura 2c). Los resultados indican que el hematocrito de todos los animales implantados (tanto con microcápsulas-RGD o sin RGD) aumentó significativamente (P<0,01) comparado con los ratones control, los cuales mostraron un nivel basal constante durante el estudio. Los ratones en los que se implantaron los sistemas con alginato-RGD aumentaron su nivel hematocrito hasta el día 28 (88,2%) y después mantuvieron un nivel asintótico cercano al 80% hasta el final del estudio. Los recipientes con microcápsulas sin modificar mostraron un comportamiento similar hasta el día 120. De ahí en adelante, se detectó un progresivo descenso en el hematocrito de los animales. Más aún, en los últimos 100 días del estudio el nivel hematocrito de los recipientes con matrices de alginato-RGD fue significativamente mayor que los sistemas de alginato sin modificar (P<0,01) (Figura 2a). Estos resultados indican que las matrices bioactivadas con RGD muestran una funcionalidad más sostenida, manteniendo el nivel hematocrito próximo al 80% durante 10 meses tras la administración de una sola dosis. Por el contrario, las partículas de alginato no modificado con RGD fueron capaces únicamente de mantener el nivel hematocrito durante 100 días (Orive, G. et al. 2005, Mol.Therapy, 12:283-289).

Ejemplo 4

Estudio histológicos y de funcionalidad ex vivo de las microcápsulas

Se explantaron las microcápsulas de todos los receptores a los 330 días del comienzo del estudio. En el momento de la explantación, tanto las cápsulas con RGD como sin RGD aparecieron formando una estructura neovascularizada e irregular que se encontraba totalmente adherida al tejido subcutáneo. Las microcápsulas se separaron de

manera sencilla de los agregados y aún mantenían la forma esférica y la membrana semipermeable definida (Figura 2d). Para determinar la funcionalidad de las células incluidas en dichas microcápsulas, se midió la cantidad de EPO liberada de ambos sistemas (Figura 2e). Los resultados confirman que los sistemas con RGD liberaron más EPO que las cápsulas sin alginato modificado (P<0,05).

Los análisis histológicos de las cápsulas revelaron una reacción inflamatoria mínima basada en una fina capa de fibroblastos rodeando ambos tipos de cápsulas (Figura 2f) a pesar de que se emplearon alginatos purificados comerciales para los experimentos. Se ha visto que el propio proceso de implante atrae y activa a las células del sistema inmune y estimula la liberación de citoquinas. Sin embargo, la mínima reacción inmune observada no altera la funcionalidad de las cápsulas. Es interesante el hecho de que EPO inhibe a algunas citoquinas pro-inflamatorias incluyendo la IL-6, TNF-alfa y MCP-I, que ejerce efectos deletéreos y desencadena fallo en el transplante.

Otra importante observación histológica fue la presencia de un elevado número de capilares rodeando los agregados de microcápsulas RGD (Figura 2f). La formación de una red capilar alrededor de las cápsulas reduce la distancia entre las células y la vasculatura al mínimo, asegurando un mejor aporte nutricional y de oxígeno y así mejorando la funcionalidad a largo plazo de los sistemas.

Ejemplo 5

5.1 Efecto de la densidad celular en la actividad de las microcápsulas

Se realizó un estudio de dosis-respuesta para evaluar la potencial versatilidad de las cápsulas RGD para la liberación controlado de fármacos. Se fabricaron matrices RGD con diferentes densidades celulares (5; 3,75; 2,5 y l,25xlθ ⁶ células/mL alginato) y por tanto, con diferentes dosificaciones de EPO (Figura 3a). Los estudios de actividad metabólica in vitro y de producción de EPO claramente mostraron una relación dosis- dependiente (Figura 3b, 3 c). Para evaluar el potencial terapéutico de la invención, se implantaron subcutáneamente 0,2 mL de diferentes matrices RGD en ratones Balb/c. Los resultados indican que el hematocrito de todos los receptores implantados con las microcápsulas RGD, independientemente de la dosis, eran significativamente mayores

que en ratones control para todos los periodos de tiempo (P<0,05). El nivel hematocrito de todos los ratones transplantados con las microcápsulas RGD alcanzaron un pico al día 28 (Figura 3d) a partir de un valor basal (46 ± 7). A ese punto, el hematocrito fue de 87 ± 3; 88 ± 4; 86,4 ± 1,5; 81 ± 8 % para las densidades celulares de 5; 3,75; 2,5 y 1,25x10 ⁶ .

Sólo se observó un efecto dosis-dependiente en los 14 días iniciales. A partir del día 28 hasta el día 60, el valor hematocrito obtenido con todas las formulaciones no fue significativamente diferente, indicando que se obtiene efecto hematopoyético máximo con todas las formulaciones. En el resto de los periodos de tiempo, los ratones recibieron una dosis mayor mostrando unos valores hematocrito significativamente superiores que los receptores que recibieron una dosis menor (P<0,05). Desde ese día hasta el final del estudio, el hematocrito de los ratones con la menor dosis-respuesta disminuyó progresivamente mientras que las otras 3 formulaciones mantuvieron su hematocrito. A pesar de que para el tratamiento de la anemia sería recomendable una menor dosis de EPO, para el tratamiento de esquizofrenia o para neuroprotección se emplearían dosis más elevadas.

5.2 Anάlsis histológicos de las microcápsulas ex vivo.

Se explantaron todas las microcápsulas RGD 200 días tras la implantación. Las microcápsulas formaron de nuevo agregados irregulares rodeados por redes vasculares (Figura 3e). Interesantemente, la vascularización de los agregados parece ser también dosis-dependiente, con una formación de capilares menor o incluso sin formación alguna en el caso de las cápsulas RGD con menor densidad celular (l,25xlθ ⁶ ).

Los resultados aquí mostrados indican que una dosis mínima de EPO sería necesaria para estimular la formación capilar alrededor de los agregados de cápsulas.

El análisis histológico de las matrices de RGD mostraron una menor respuesta inflamatoria y una red capilar alrededor de los agregados de cápsulas (Figura 3f). Las microcápsulas presentes en los agregados permanecieron intactas con una membrana semipermeable definida y uniforme. Tras el aislamiento de las matrices de los

agregados, se ha observado que todas las células encapsuladas permanecieron viables y liberaban cantidades detectables de EPO.