Campo de la invención

La presente invención se refiere a una microplaca para ensayos biológicos, especialmente para ensayos celulares o inmunoensayos (tipo ELISA) .

Más concretamente, la microplaca de la invención es del tipo que comprenden una pluralidad de pequeños receptáculos, denominados pocilios, que van abiertos por su cara superior y disponen de un orificio de salida en la parte inferior que desemboca en una cámara de vacío .

Antecedentes, de la invención

Hay un gran número de operaciones de laboratorio que requieren el manejo de múltiples muestras de pequeño volumen. Por ejemplo, tanto técnicas inmunológicas como ensayos basados en células, requieren la continua adición y eliminación de líquidos. Con el fin de manejar esta complejidad muestral, se usan unos tipos de recipientes conocidos comúnmente como placas de pocilios o microplacas, donde tienen lugar reacciones biológicas y químicas con los agentes inmovilizados al sustrato de la placa. Dichas placas están fabricadas típicamente en plástico (como polipropileno, poliestireno o similar) y tienen una serie de pocilios de base plana dispuestos en un patrón geométrico que simplifica la organización y realización de operaciones. Una placa de uso general extendido es la que contiene 96 pocilios en un patrón rectangular de 8 x 12 pocilios. Hay otras microplacas disponibles con diferentes números de pocilios y de capacidades volumétricas inferiores, como por ejemplo placas de 384, 1536 o incluso 3456 pocilios, donde el acceso para el manejo y evacuación de líquidos de los pocilios se hace cada vez más angosto y dificultoso.

En todas las técnicas experimentales y de screening llevadas a cabo en microplacas, se emplean varios pasos en donde los reactivos, nutrientes o soluciones de lavado se añaden a cada pocilio y luego son retirados. Con el fin de obtener una mayor flabilidad y exactitud de los resultados, a menudo es necesario vaciar los pocilios entre estos pasos y aclararlos con una solución de lavado varias veces para eliminar los restos inespecífieos de reactivo. En el curso de un ensayo de screeníng, se puede llegar a trabajar con un elevado número de microplacas, haciéndose necesaria la evacuación de cada uno de los pocilios en un número elevado de veces. En los ensayos inmunológicos por ejemplo, el reactivo es un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno. Comúnmente, se forma una reacción de color en aquellos pocilios donde el antígeno estaba presente. Los reactivos de todos los pocilios deben lavarse con el fin de prevenir la formación de color en los pocilios donde el antígeno estaba ausente. Otro ejemplo donde hay que evacuar el líquido de los pocilios de una microplaca es en ensayos basados en cultivos celulares. Las células usadas en procesos experimentales son sembradas en microplacas y necesitan de varios lavados entre diferentes reacciones y tratamientos. Todas estas operaciones de lavado pueden realizarse manualmente o de forma automatizada. En las operaciones manuales, el lavado se lleva a cabo mediante la aspiración individual del líquido de cada pocilio con una pipeta Pasteur conectada a un sistema de vacío o en el mejor de los casos, toda una columna o fila de pocilios a la vez. Este método manual además de ser laborioso, tiene otros inconvenientes como son el riesgo de contacto de la pipeta de aspiración con las muestras, la probabilidad de contaminación líquida entre pocilios adyacentes o la falta de homogeneidad en el rendimiento de ensayo a ensayo. Por lo tanto, este proceso se ha automatizado y actualmente hay varios equipos comerciales disponibles que agregan automáticamente los reactivos, evacuan el líquido de los pocilios, y diluyen las muestras en serie. Todos estos equipos operan de manera similar. Por lo general, las microplacas se encuentran en posición horizontal y una serie de colectores en forma de aguja añaden por la parte superior de la placa una solución de lavado a cada pocilio, seguido de una retirada rápida del líquido de lavado por otro set de agujas de aspiración, empleando un dispositivo de succión de vacío. Las pipetas de aspiración deben de eliminar la mayor cantidad de líquido posible para que el lavado sea eficaz y minimice la cantidad residual de reactivos presente en la base de los pocilios. Este paso requiere una tecnología precisa y sofisticada que consiste a menudo en tecnologías de sensor de líquidos. Las tecnologías que usan sensores de líquidos imponen una sofisticación y un coste extra al equipo. Otro hecho que contribuye de nuevo al aumento del precio de las operaciones de lavado es que en ocasiones se deben utilizar nuevos sets de pipetas para cada lavado con el fin de evitar la contaminación entre sucesivos lavados, dado que las agujas de lavado tocan físicamente el líquido contenido en los pocilios.

Otra de las limitaciones impuestas por la tecnología actual es la dificultad de realizar lavados por rebosamiento en pocilios que poseen un muy reducido diámetro, debido a limitaciones espaciales donde deben coexistir tanto las agujas de dispensación como las de succión. La técnica de lavado por rebose consiste en añadir y eliminar el líquido de los pocilios de forma simultánea para así conseguir un lavado más vigoroso de los pocilios. La eliminación de los líquidos residuales es de vital importancia especialmente cuando se trabaja con cantidades muy pequeñas de líquidos. Los robots están programados para bajar a una ubicación exacta fija en el espacio, pero muy sutiles variaciones en las alineaciones entre pocilios o las variaciones en la profundidad de éstos entre distintos fabricantes, pueden dar lugar a lavados inconsistentes. Por último, las agujas muy delgadas pueden aumentar el riesgo de obstrucción durante la evacuación del líquido. Diversos sistemas en el mercado tratan de evitar este problema mediante el uso de ultrasonidos, cosa que de nuevo encarece la tecnología actual . A la vista de estos antecedentes, un método de lavado que prescinda del uso de agujas contribuiría a una disminución en el mantenimiento del equipo, evitaría contaminaciones residuales entre lavados, evitaría el problema de obstrucción de las agujas de aspiración, aumentaría la velocidad de procesado y en su conjunto permitiría abaratar las operaciones de lavado de las microplacas convencionales. Por lo tanto, se necesitaría un método de evacuación sin agujas sencillo, rápido y de bajo coste que supere todos los inconvenientes antes mencionados .

En el estado del arte, la evacuación de los pocilios por su base inferior mediante el uso de vacío viene ya descrita en numerosos sistemas de evacuación de líquidos. Por una parte, patentes como PCT/US02/00594, GB2422795 A, EP1366818 A1, EP1262759 Al, US2002098125 Al, US6133045 A, W09811989 A1, US4927604 A, EP0359249 A o E04021018 nos enseñan el uso de una fuente de vacío con el fin de extraer una fase sólida por medio de filtros que pueden retener bacterias o moléculas tales como ácidos nucleicos o proteínas. Otra patente como WO2004113874 A2, nos enseña la evacuación de líquidos por la parte inferior de los pocilios de base redondeada o cóncava mientras los analitos quedan retenidos mediante una fuerza magnética a las paredes del pocilio. Finalmente, patentes como WO9102073 A o US4090850 A emplean sistemas de succión por vacío en conjunto con membranas permeables que retienen los analitos presentes en inmunoensayos . En concreto, la patente US4090850 A muestra un método de lavado para radioinmunoensayos por el cual la base plana de los pocilios posee un orificio central por donde se evacua el líquido por succión mientras los radio- ligandos sometidos a estudio se encuentran atrapados en un disco de papel de celulosa.

Para facilitar la salida de líquidos mediante una diferencia de presión provocada por el vacío, todas las patentes descritas anteriormente poseen algún tipo de abertura en la misma base de los pocilios. Ninguna de las patentes citadas por lo tanto puede reivindicar su uso para sustratos fijados a la base de los pocilios, como es el caso de inmunoensayos y de ensayos celulares . Esto es debido a que en todas las patentes descritas, el área destinada al sustrato biológico y la abertura destinada a la evacuación de líquidos coexisten en el mismo plano, viéndose de esta manera comprometido el reducido espacio destinado al sustrato biológico de los pocilios de una microplaca. Es por ello que ninguna de estas patentes puede dar respuesta al problema de lavado de microplacas de pocilios planos donde se encuentran adheridos sustratos biológicos tales como antígenos o células.

Descripción de la invención

La presente invención tiene por objeto una microplaca para ensayos biológicos, constituida de modo que resuelva el problema expuesto y permita el lavado de placas o microplacas utilizadas en la realización de ensayos celulares o inmunoensayos en los que los sustratos biológicos se encuentran inmovilizados o adheridos al fondo o base de los pocilios y cuyo lavado requería hasta ahora el uso de un elevado número de sets de pipetas, con el consiguiente gasto económico y de tiempo.

La microplaca de la invención es del tipo inicialmente indicado, constituida por una pluralidad de pocilios en forma de receptáculos abiertos por su cara superior y dotados de un orificio de salida en la parte inferior que desemboca en una cámara de vacío.

De acuerdo con la invención cada pocilio está constituido por un receptáculo cuyo fondo es plano y está cerrado en toda su superficie, disponiendo en la pared de un orificio que va situado en posición adyacente al fondo plano.

El fondo plano permite que sobre el mismo puedan inmovilizarse o adherirse sustratos biológicos, no comprometiendo la posición del orificio el área de estudio donde se encuentra fijado dicho sustrato.

La especial disposición del orificio de salida permite que los pocilios sean utilizables no solo para analitos que estén en suspensión, sino también para ensayos en los que se usen sustratos biológicos anclados o adheridos al fondo plano o base del pocilio. El orificio de evacuación se encuentra en la parte más inferior de la pared del pocilio con el fin de minimizar cualquier resto residual de líquido durante el proceso de evacuación por succión.

La disposición vertical de los orificios ofrece además una ventaja con respecto a la posición horizontal de la técnica conocida. Esta ventaja viene dada por una mayor capacidad de retención de líquido en el pocilio por fuerzas de tensión superficial, debido a que el orificio está en un plano vertical y por lo tanto perpendicular al plano horizontal donde la fuerza gravitacional terrestre es máxima.

Los orificios serán de un diámetro lo suficientemente pequeño para retener el volumen de los pocilios de las microplacas por efectos de la tensión superficial de orificio, y a su vez con un diámetro suficientemente grande como para permitir la evacuación del líquido de los pocilios al aplicarse una presión negativa.

El diámetro de los orificios será lo suficientemente amplio como para evitar problemas de obstrucción en la salida del líquido.

La invención, por tanto, resuelve el problema del lavado de placas con sustratos biológicos inmovilizados o adheridos al fondo plano de los pocilios, tales como ensayos celulares e inmunoensayos , permitiendo la completa evacuación de líquidos sin necesidad de alterar o levantar los sustratos biológicos por una aspiración cercana a ellos y evitando al mismo tiempo problemas como la obstrucción de las agujas y la potencial contaminación de las muestras transmitida por las agujas de aspiración en los procesos automatizados. Por lo demás, el lavado de los micropocillos se realizará por succión a través de una cámara de vacío situada debajo de los pocilios, conectada a una fuente de aspiración. La superficie inferior del interior de esta cámara podrá estar dotada de unas propiedades hidrofóbicas con el fin de facilitar la máxima evacuación de líquido de los pocilios.

La presente invención contempla esta cámara como parte integrada en la microplaca, mediante su cerramiento inferior con una base de plástico, en cuyo caso respetará las medidas estándares establecidas para las microplacas. En la base de esta cámara inferior se encuentra un conector de salida al que se le aplica un vacío determinado, y el líquido es recogido en un contenedor de deshechos.

Alternativamente, la microplaca puede estar abierta por su parte inferior, como es el caso de las microplacas convencionales, en cuyo caso el vacío vendría hecho al posicionarse la microplaca sobre una plataforma que cierre herméticamente la base de la microplaca. Esta plataforma conectada a vacío está ya disponible en el mercado.

Las velocidades de evacuación de líquidos de los pocilios podrán ser controladas mediante distintos niveles de succión por vacío dependiendo de los requerimientos del lavado.

La presente invención ofrece una solución de bajo coste que puede ser aplicada tanto en el lavado manual de microplacas como en su lavado automatizado.

Breve descripción de los dibujos

En los dibujos adjuntos se muestra una microplaca para ensayos biológicos constituida de acuerdo con la invención y dada a título de ejemplo no limitativo. En los dibujos:

La figura 1 es una perspectiva de una microplaca para ensayos celulares o inmunoensayos (tipo ELISA) .

La figura 2 es una sección transversal de la microplaca, tomada según la línea de corte II -II de la figura 1.

La figura 3 es una perspectiva de uno de los pocilios que entran a formar parte de la microplaca de la figura 1. Descripción detallada de un modo de realización

En la figura 1 se muestra una microplaca constituida de acuerdo con la invención, la cual incluye una estructura que define un soporte 1 en el que van montados los pocilios 2, alineados en filas y columnas. La microplaca representada en la figura 1 es de 96 pocilios en los que se llevarán a cabo los diferentes ensayos, seguidos de los correspondientes lavados .

Los pocilios 2, según se muestra en la figura 3 están constituidos por un receptáculo de configuración cilindrica, con fondo plano y dotados en la parte inferior de su pared de un orifico de salida 3. Los pocilios con la constitución descrita van montados, según se muestra en la figura 2, con el orificio 3 situado dentro de una cámara de vacío 4 que se conecta, a través de la correspondiente boquilla 5, a una fuente de aspiración o vacío. El orificio 3 va situado en posición adyacente al fondo del pocilio.

Esta disposición permite evacuar toda la placa simultáneamente mediante una cámara inferior común a todos los pocilios. También podría efectuarse la evacuación selectivamente por filas o columnas, mediante cámaras inferiores independientes, coincidentes con dichas filas o columnas .

Puede contemplarse un diseño de microplaca con base cerrada, que forma la cámara de succión, o alternativamente una microplaca sin cerrar, necesitándose en este caso una plataforma extra sobre la cual la microplaca encajaría herméticamente para practicarse así el vacío sobre dicha plataforma .

También puede usarse una base hidrofóbica en el fondo de la cámara inferior, con objeto de facilitar la retirada de líquidos por succión, así como diversas velocidades de succión que se adecuen a lavados suaves o mas energéticos y adecuar la fuerza de succión de modo que permita una evacuación continua en el caso de lavado por rebose. El orificio 3 de los pocilios 2 será suficientemente pequeño como para contener el líquido dentro del pocilio, debido a las fuerzas de tensión superficial impuestas por cada orificio, permitiendo sin embargo le evacuación del líquido por efecto de la succión producida en la cámara de vacío 4.

Si el orificio 3 estuviese situado en la base o fondo de los pocilios 2, el área de estudio donde se encuentra la muestra biológica se vería comprometida e invalidaría el proceso. Dado que el campo de la invención es el de microplacas con un número elevado de pocilios, el área del orificio de evacuación adquiere un carácter muy relevante comparado con el área objeto de análisis. Por el contrario, al estar el orificio 3 situado en la pared lateral, se dispone de un fondo plano, continuo y cerrado en toda su superficie, que permite llevar a cabo cualquier ensayo biológico sin que el área de estudio donde se encuentra la muestra biológica se vea comprometida .

La posición del orificio 3 en los pocilios 2 de la microplaca de la invención permite llevar a cabo el lavado de los pocilios, incluso con agentes biológicos adheridos a un sustrato que forma la base o fondo del pocilio de la microplaca .

La invención es de especial aplicación en microplacas con un elevado número de pocilios, por ejemplo a microplacas con 1356 pocilios y más, donde las agujas actuales de lavado tienen dificultad de entrada y donde el área de experimentación es tan pequeña que no hacen posible situar el orificio de evacuación 3 en la base o fondo del pocilio.

Otra ventaja de la invención es que al estar el orificio 3 en posición vertical, la capacidad de retención del líquido por tensiones superficiales es aún mayor que si el orificio estuviera situado en el fondo y ocupara una posición horizontal. Esto es debido a que en la descomposición de fuerzas, la fuerza gravitacional hacia abajo está bloqueada por la propia base del pocilio. La invención está dirigida a microplacas con pocilios de fondo plano, no solo porque físicamente es donde mayor evacuación de líquidos se puede conseguir mediante este diseño de microplaca, sino también porque éste es el formato que se usa mayoritariamente para ensayos celulares y ELISAS.