Die Erfindung betrifft ein Mikroskop zur Abbildung eines Objekts, das ein Objektiv zur Abbildung des Objekts durch einen Abbildungsstrahlgang, eine Lichtquelle zur Erzeugung von

Beleuchtungsstrahlung und eine Überwachungseinrichtung zur Überwachung eines

Energieparameters der Beleuchtungsstrahlung umfasst, wobei die Überwachungseinrichtung einen Energieparameter einer auf sie eintreffenden Strahlung bestimmt.

Bei Mikroskopen, Laser-basierten Verfahren, wie Laser-Scanning-Mikroskopie, und optischen Manipulationstechniken, z.B. optischen Pinzetten, ist es oftmals wünschenswert, die Intensität der Beleuchtungsstrahlung zu überwachen. Dies unterstützt die Reproduzierbarkeit von Messungen. Es ist bekannt, die Intensität der Lichtquelle dadurch zu bestimmen, dass ein Strahlungsdetektor anstelle der Probe angeordnet wird und auf diese Weise die in dem Objekt auftreffende Intensität der Beleuchtungsstrahlung bestimmt werden kann. Solche Verfahren sind beispielsweise in der EP 2458420 B1 oder der US 8619252 B2 offenbart. Da die Messung der Intensität ausschließlich vor oder nach der Messung in der Probe erfolgen kann, schlagen die EP 1260848 B1 oder die EP 1353210 B1 vor, einen Intensitätsdetektor im

Beleuchtungsstrahlengang nahe an der Lichtquelle vorzusehen. Auf diese Weise kann die Intensität der von der Lichtquelle ausgesandten Beleuchtungsstrahlung auch während der Messung der Probe bestimmt werden.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Mikroskop bereitzustellen, das eine verbesserte Überwachung des Energieparameters der Beleuchtungsstrahlung bereitstellt. Die Erfindung ist im Anspruch 1 definiert. Bevorzugte Ausführungsformen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.

Die Erfindung schafft ein Auflicht-Mikroskop zur Abbildung eines Objekts, das ein Objektiv zur Abbildung eine Objekts durch einen Abbildungsstrahlengang, eine Lichtquelle zur Erzeugung von Beleuchtungsstrahlung , eine Überwachungseinrichtung zur Überwachung eines

Energieparameters der Beleuchtungsstrahlung und eine Strahlteilereinrichtung umfasst. Die Überwachungseinrichtung bestimmt einen Energieparameter einer auf sie eintreffenden Strahlung. Die Strahlteilereinrichtung ist in Beleuchtungsrichtung dem Objektiv vorgeordnet und koppelt eine von der Beleuchtungsstrahlung Messstrahlung auf die Überwachungseinrichtung aus. Bevorzugt weist das Mikroskop ferner mindestens ein optisches Element zur Einkopplung der Beleuchtungsstrahlung in den Abbildungsstrahlengang auf. Der Abbildungsstrahlengang ist zwischen der die Messstrahlung auskoppelnden Strahlteileinrichtung und dem Objekt frei von optischen Abbildungselementen. Da es sich beim Mikroskop um ein Auflichtmikroskop handelt, wird die Beleuchtungsstrahlung der Abbildungsstrahlung entgegenlaufend in den Abbildungsstrahlengang eingekoppelt und dann über das Objektiv in das Objekt (üblicherweise eine Probe) geführt. Zwischen diesem Ort der Einkopplung und dem Objekt enthält der Abbildungsstrahlengang folglich den

Beleuchtungsstrahlengang. Dort läuft die Beleuchtungsstrahlung zum Objekt hin und die Abbildungsstrahlung vom Objekt weg. Dieser Abschnitt wird üblicherweise auch als

gemeinsamer Strahlengang bezeichnet. Diese Terminologie wird auch in der nachfolgenden Beschreibung verwendet.

Die Strahlteilereinrichtung zur Auskopplung der Messstrahlung auf die

Überwachungseinrichtung ist im gemeinsamen Strahlengang nah an dem Objektiv angeordnet, so dass die durch die Strahlteilereinrichtung ausgekoppelte Messstrahlung sehr exakt proportional zum Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung ist, welche durch das Objektiv auf das Objekt fokussiert wird. Insbesondere werden somit durch die Überwachungseinrichtung all jene Veränderungen des Energieparameters der Beleuchtungsstrahlung, welche durch zuvor durchlaufene Filter, optische Elemente oder sonstige Effekte hervorgerufen werden, von der Überwachungseinrichtung erfasst. Auf diese Weise erfasst aufgrund der Strahlteilereinrichtung am Objektiv die Überwachungseinrichtung ein Signal, das besonders präzise mit dem

Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung im Objekt selbst übereinstimmt. Insbesondere ist es nicht nötig, durch Rechnungen oder anderweitige Überlegungen die Auswirkungen von eingeschobenen Filtern, Linsen oder Strahlteilern zu berücksichtigen, da die Messstrahlung von der Beleuchtungsstrahlung erst ausgekoppelt wird, wenn die Beleuchtungsstrahlung diese Elemente etc. durchlief. Gleichzeitig ist es möglich, den Energieparameter der

Beleuchtungsstrahlung auch während der Untersuchung des Objekts zu bestimmen. Dies erlaubt insbesondere eine Regelung der Lichtquelle auf einen konstanten Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung im Objekt hin. Dies reduziert die Nutzer-Interaktion, wodurch

Experimente vereinfacht werden. Die gewonnenen Messdaten hinsichtlich der Beleuchtung des Objekts können mit den aufgenommenen Bildern verknüpft werden, so dass eine besonders präzise Dokumentation hinsichtlich der Beleuchtungsbedingungen erhaltbar ist. Der Energieparameter kann die Intensität oder die Leistung oder Fluence sein.

Das Mikroskop kann sowohl für Fluoreszenz-Mikroskopie als auch für Laser-basierte Techniken verwendet werden, insbesondere im Weitfeld. Ferner ist es möglich, das Mikroskop bei Beleuchtungsstrahlung, die optische Manipulationstechniken, wie FRAP (Fluorescence Recovery after Photobleaching) oder FLIP (Fluorescence Loss in Photobleaching) bewirkt, anzuwenden. Außerdem kann das Mikroskop mit verschiedenen Wellenlängen das Objekt beleuchten und/oder abbilden und/oder bearbeiten, z. B. mittels Laserablation. Das Mikroskop kann ein konfokales Mikroskop oder ein Mikroskop zur Abbildung des Objekts im Weitfeld sein. Bevorzugt ist das Mikroskop ausgebildet, Emission von Fluoreszenzlicht in dem Objekt zu stimulieren und das von dem Objekt emittierte Fluoreszenzlicht zu detektieren. Dazu kann das Objekt beispielsweise mit Fluoreszenzfarbstoffen versehen sein. Das Objekt kann als jede Probe, Körper oder Struktur aufgefasst werden, welche mit Hilfe des Mikroskops abgebildet werden soll. Insbesondere kann das Objekt eine biologische Probe umfassen.

Das Objektiv fokussiert die Beleuchtungsstrahlung in das Objekt und dient gleichzeitig zur Abbildung des Objekts, d.h. zur Erfassung der vom/am Objekt erzeugten oder reflektierten Strahlung. Ein Bild des Objekts wird mit Hilfe des Abbildungsstrahlengangs erzeugt, an dessen Ende ein Bilddetektor zur Umwandlung der von dem Abbildungsstrahlengang geführten Strahlung in elektrische Signale steht. Eine Steuereinrichtung kann beispielsweise die elektrischen Signale in ein elektronisches Bild des Objektes umwandeln, das z. B. auf einer Anzeigeeinrichtung dargestellt und/oder abgespeichert wird. Die Lichtquelle kann einen Laser, eine Weißlichtquelle, wie beispielsweise eine Halogen- oder Quecksilberlampe, oder eine Light-Emitting-Diode (LED) oder eine Kombination daraus umfassen. Insbesondere kann die Lichtquelle Beleuchtungsstrahlung in einem breiten

Wellenlängenbereich oder Beleuchtungsstrahlung mit einzelnen diskreten Wellenlängen oder Wellenlängenbereichen erzeugen; bevorzugt umfasst die Lichtquelle mehrere

Einzellichtquellen, die jeweils Strahlung in verschiedenen, z. B. diskreten

Wellenlängenbereichen erzeugen. Vorzugsweise ist die Lichtquelle mit der Steuereinrichtung verbunden, welche die Intensität oder die Leistung der Beleuchtungsstrahlung steuert. Die Lichtquelle kann parallelisierte Beleuchtungsstrahlung bereitstellen oder der Lichtquelle ist eine Linse oder Linsensystem, beispielsweise ein Mikrolinsenarray, vorgeordnet, mittels welchem die von der Lichtquelle bereitgestellte Strahlung parallelisiert werden kann. Alternativ kann die

Beleuchtungsstrahlung im Beleuchtungsstrahlengang nicht parallelisiert geführt werden. Ob die Beleuchtungsstrahlung parallelisiert verläuft, hängt nicht zuletzt von dem mit dem Mikroskop durchgeführten Abbildungsverfahren ab. Bei Laser-Scanning-Mikroskopen und bei optischen Manipulationstechniken wird in der Regel die Beleuchtungsstrahlung parallelisiert verlaufen; bei Weitfeldabbildungen oder TIRF-Experimenten (Total Internal Reflection Fluorescence) verläuft die Beleuchtungsstrahlung hingegen meist konvergent durch den Beleuchtungsstrahlengang. Das optische Element dient zur Einkopplung der Beleuchtungsstrahlung in den

Abbildungsstrahlengang. Das optische Element kann beispielsweise ein dichroitischer Spiegel sein, der Strahlung im Wellenlängenbereich der Beleuchtungsstrahlung reflektiert und Strahlung im Wellenlängenbereich der Abbildung, z. B. vom Objekt erzeugte Fluoreszenzstrahlung, transmittiert. Es ist auch möglich, das Reflexions- und Transmissionsverhalten des optischen Elements zu vertauschen. Der Beleuchtungsstrahlengang zum Führen der

Beleuchtungsstrahlung von der Lichtquelle zum Objekt und der Abbildungsstrahlengang verlaufen in diesem Fall von dem optischen Element bis zum Objektiv/Objekt identisch. Die Überwachungseinrichtung bestimmt den Energieparameter der auf sie einfallenden Strahlung, z. B. die Intensität oder die Leistung der Messstrahlung. Die

Überwachungseinrichtung kann als Fotodetektor, CCD-Sensor oder ähnliches ausgestaltet sein und ist insbesondere ausgebildet, Strahlung in einem Wellenlängenbereich von 355 nm bis 700 nm zu detektieren ; sie hat ferner beispielsweise einen dynam ischen Bereich von 10 ⁵ . Wird das Mikroskop auch für optische Manipulationstechniken, wie optische Pinzetten, verwendet, ist die Überwachungseinrichtung in der Lage, die dabei verwendete(n) Wellenlänge(n) zu detektieren, z.B. 1064 nm oder 800 nm . Vorzugsweise ist die Überwachungseinrichtung mit der

Steuereinrichtung verbunden, so dass die Überwachungseinrichtung der Steuereinrichtung ein Signal bereitstellt, das dem Energieparameter der Messstrahlung, welche auf die

Überwachungseinrichtung trifft, entspricht.

Die Strahlteilereinrichtung kann als Strahlteiler m it einem vorgegebenen Transmissions- und Reflexionsverhalten ausgebildet sein. Ferner ist es möglich, dass die Strahlteilereinrichtung eine in dem Abbildungsstrahlengang angeordnete Glasplatte ist. Insbesondere ist die

Strahlteilereinrichtung derart ausgestaltet, dass die Messstrahlung, die auf die

Überwachungseinrichtung ausgekoppelt ist, klein im Vergleich zum Anteil der

Beleuchtungsstrahlung ist, welcher weiter zu dem Objektiv/Objekt läuft. Beispielsweise werden nur 15%, 10%, 5% oder 1 % der Beleuchtungsstrahlung als Messstrahlung auf die

Überwachungseinrichtung ausgekoppelt. Die Strahlteilereinrichtung ist optional in einem Unendlichkeitsraum angeordnet, welcher sich im Abbildungsstrahlengang zwischen dem

Objektiv und einer Tubuslinse befindet. Der Unendlichkeitsraum ist der Raum zwischen Objektiv und Tubuslinse.

Im gemeinsamen Strahlengang, also dem Bereich zwischen Strahlteilereinrichtung und Objektiv, sind vorzugsweise keine optischen Abbildungselemente angeordnet, welche den

Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung, wie sie im Objekt eintrifft, verändern können. So sind beispielsweise keine Filter, Linsen, Blenden, Pinholes oder Optiken im

Abbildungsstrahlengang zwischen der Strahlteilereinrichtung und dem Objektiv vorgesehen. Optische Abbildungselemente hätten nämlich den Effekt, dass der Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung im Objekt verändert wäre und diese Veränderung nicht durch die Überwachungseinrichtung erfasst wäre. Somit könnte die Überwachungseinrichtung nicht den im Objekt vorhandenen Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung direkt erfassen.

Bevorzugt ist die Strahlteilereinrichtung im gemeinsamen Strahlengang unmittelbar benachbart dem Objektiv angeordnet. Ausgenommen davon ist ein Shutter, welcher im geschlossenen Zustand die Beleuchtungsstrahlung blockiert und beim Mikroskopieren offen steht. Er wirkt beim Mikroskopieren ja nicht. Die Steuereinrichtung weist optional einen Speicher auf, in welchem ein Zusammenhang zwischen dem Energieparameter der Messstrahlung und dem Energieparameter der

Beleuchtungsstrahlung auf dem Objekt hinterlegt ist. Der Zusammenhang dient dazu, dem gemessenen Ist-Wert des Energieparameters der Messstrahlung den zugehörigen

momentanen Wert des Energieparameters auf dem Objekt zu bestimmen. Die Verwendung des Zusammenhangs ist also ein Konvertierungsschritt von Messstrahlung auf die Beleuchtung des Objektes. Die umgekehrte Konvertierung ist optional möglich, da der Zusammenhang mathematisch in der Regel invertierbar ist (bei Verwendung einer Gleichung) oder

entsprechende inverse Tabellen leicht erstellt werden können. Die Steuereinrichtung kann die Lichtquelle dazu derart steuern, dass der Energieparameter der von der Lichtquelle erzeugten Beleuchtungsstrahlung innerhalb eines Toleranzbereichs einen vorgegebenen Soll- Energieparameter hat. In dem Zusammenhang kann ferner der von dem Objektiv absorbierte oder reflektierte Anteil der Beleuchtungsstrahlung und/oder der von dem Objektiv transmittierte Anteil der Beleuchtungsstrahlung als Parameter, z. B. in Form eines Transmissionsgrades, eingehen. Dieser Wert kann für das jeweilige Objektiv bekannt sein oder vor der eigentlichen Messung des Objektes bestimmt werden. Insbesondere ist dieser Wert wellenlängenabhängig im Speicher hinterlegt; der Zusammenhang kann wellenlängenabhängig sein. Ferner ist im Speicher der Steuereinrichtung hinterlegt, wie in welchem Verhältnis die Messstrahlung zur verbliebenen Beleuchtungsstrahlung steht. Auch dieses kann vorbekannt oder vor der eigentlichen Messung durch Kalibration bestimmt werden. Aufgrund der Angaben zum Objektiv und zur Strahlteileinrichtung kann die Steuereinrichtung vorzugsweise aus dem von der Überwachungseinrichtung erfassten Energieparameter der Messstrahlung die im Objekt vorhandene Leistung der Beleuchtungsstrahlung berechnen. Beispielsweise hängen die im Objekt vorhandene Leistung LO, die mit der Überwachungseinrichtung bestimmten Leistung L, der Anteil der von der Strahlteilereinrichtung ausgekoppelten Strahlung A und der

Transmissionsgrad des Objektivs T über folgende Gleichung zusammen: Soll die Intensität anstelle der Leistung als Energieparameter herangezogen werden, wird die Leistung noch durch die Fläche der Strahlung auf Überwachungseinrichtung dividiert. Die Fläche kann bekannt sein, oder die Überwachungseinrichtung ist ortsauflösend und erlaubt somit zugleich eine Flächenmessung des Stahlquerschnitts der Messstrahlung.

Die Steuereinrichtung steuert optional die Lichtquelle derart, dass der Energieparameter der von der Lichtquelle erzeugten Beleuchtungsstrahlung unter Berücksichtigung des

Zusammenhangs mit einem vorgegebenen Soll-Energieparameter innerhalb eines

Toleranzbereichs übereinstimmt. Der Soll-Energieparameter kann der gewünschte Wert sein, mit dem das Objekt beleuchtet werden soll. Die Steuereinrichtung kann demnach den Wert des Energieparameters im Objekt konstant halten.

Da bevorzugt zwischen Strahlteilereinrichtung und Objektiv keine weiteren optischen

Abbildungselemente vorgesehen sind, müssen weitere Parameter wie Filter, Pinholes oder

Linsen und deren Transmissions- bzw. Reflexionseigenschaften nicht betrachtet werden. Ferner kann die Steuereinrichtung eine Erfassungseinrichtung aufweisen, mittels welcher der Typ oder die Art des Objektivs, das im Abbildungsstrahlengang angeordnet ist, ermittelt werden, und kennt Angaben über das Transmissionsverhalten der jeweiligen im Abbildungsstrahlengang angeordneten Objektive.

Vorzugsweise weist das Mikroskop ferner eine Schnittstelle für eine Autofokuseinrichtung zur Bestimmung des Fokus des Objektivs in dem Objekt auf, wobei die Schnittstelle einen

Autofokusstrahlengang zum Führen von Autofokusstrahlung zum Objekt aufweist. Die

Strahlteilereinrichtung hat dann eine Doppelfunktion, indem sie einerseits objektivseitig

Autofokusstrahlung in den gemeinsamen Strahlengang ein- und/oder daraus auskoppelt und andererseits lichtquellenseitig die Messstrahlung zur Überwachungseinrichtung auskoppelt. In einer Ausgestaltung hat das Auflicht-Mikroskop deshalb eine Autofokuseinrichtung zur

Bestimmung des Fokus des Objektivs für das Objekt. Die Autofokuseinrichtung weist einen Autofokusstrahlengang zum Führen von Autofokusstrahlung zum Objektiv auf. Die

Strahlteilereinrichtung hat eine Doppelfunktion, indem sie einerseits objektivseitig

Autofokusstrahlung in den gemeinsamen Strahlengang ein- und/oder daraus auskoppelt und andererseits lichtquellenseitig die Messstrahlung zur Überwachungseinrichtung auskoppelt. Bei bekannten Auflicht-Mikroskopen besteht Platzmangel im gemeinsamen Strahlengang, um sämtliche optische Elemente darin passend anzuordnen. Insbesondere im Abschnitt des Strahlengangs zwischen Objektiv und Tubuslinse, also im Unendlichkeitsraum , ist bei herkömmlichen Mikroskopen wenig Platz. Durch die Doppelfunktion der Strahlteilereinrichtung können dennoch sowohl eine Autofokuseinrichtung und die Überwachungseinrichtung in dem platzbeschränkten Bereich verschoben werden und es ist möglich, trotz Bauraum knappheit sowohl eine Überwachungseinrichtung als auch eine Autofokuseinrichtung vorzusehen.

Hinsichtlich des Objektivs, der Lichtquelle, des optischen Elements und/oder der

Überwachungseinrichtung gelten für diese Weiterbildung die oben angeführten Überlegungen analog. Darüber hinaus ist es bevorzugt, dass der gemeinsame Strahlengang zwischen der die Messstrahlung auskoppelnden Strahlteilereinrichtung und dem Objektiv frei von optischen Abbildungselementen ist. Die Schnittstelle ist derart ausgebildet, dass daran die

Autofokuseinrichtung angeschlossen werden kann und gleichzeitig die für die

Autofokuseinrichtung relevante Strahlung durch die Schnittstelle geführt werden kann. Natürlich kann die Autofokuseinrichtung eine optionale Schnittstelle für die Überwachungseinrichtung aufweisen. Auch ist es möglich, dass die Autofokuseinrichtung ein Modul aus

Autofokuseinrichtung und Überwachungseinrichtung ist. Die Schnittstelle ist beispielsweise ein Gewinde, und der Autofokusstrahlengang kann einen Querschnitt umfassen, durch welchen die Autofokusstrahlung geleitet wird. Die Autofokuseinrichtung kann ein vom Mikroskop separates Element sein und wie in der WO 2007/144197 A1 , der DE 102008018952 A1 oder der DE 102008018864 A1 beschrieben ausgebildet sein. Die Autofokuseinrichtung weist eine

Autofokuslichtquelle auf, die zur Erzeugung der Autofokusstrahlung dient. Die

Autofokusstrahlung wird m ittels des Autofokusstrahlengangs über die Strahlteilereinrichtung zu dem Objektiv und damit auf das Objekt geführt. Von dem Objekt wird die Autofokusstrahlung reflektiert oder gestreut, durch das Objektiv gesam melt und über die Strahlteilereinrichtung mittels des Autofokusstrahlengangs einem Autofokusdetektor zugeführt. Dazu kann in der Autofokuseinrichtung ein Strahlteiler vorgesehen sein, m ittels welchem das Einkoppeln der von der Autofokuslichtquelle erzeugten Autofokusstrahlung und/oder das Auskoppeln der von dem Objekt stammenden Autofokusstrahlung zum Autofokusdetektor erfolgen. Die

Autofokusbeleuchtungsstrahlung, die von der Autofokuslichtquelle erzeugt wird , und die

Autofokusmessstrahlung, die zu dem Autofokusdetektor geführt wird, werden hier unter dem Begriff „Autofokusstrahlung" zusammengefasst. Sie werden über die Strahlteilereinrichtung gemeinsam ein- bzw. ausgekoppelt. Es ist aber auch möglich, dass ein weiterer Strahlteiler im Abbildungsstrahlengang vorgesehen ist, m ittels welchem Autofokusstrahlung in den gemeinsamen Strahlengang ein- oder daraus ausgekoppelt wird. Bei dieser Ausführungsform ist es somit möglich, dass die Autofokuslichtquelle und der Autofokusdetektor an

verschiedenen, weit entfernten Orten im Mikroskop angeordnet sind.

Im Autofokusstrahlengang kann beispielsweise ein schräg gestelltes Gitter platziert sein, das in das Objekt abgebildet wird, so dass die Rückstreuung am Objekt mit Hilfe des

Autofokusdetektors überwacht wird und som it die Lage des Fokus bestimmt wird. In einer anderen Ausführungsform kann die Autofokuslichtquelle im Objekt einen punktförmigen Lichtpunkt erzeugen, dessen Schärfe oder Ausdehnung m it Hilfe des Autofokusdetektors gemessen wird und somit Rückschlüsse auf die Lage des Fokus geschlossen werden.

Insbesondere ist die Autofokuseinrichtung mit der Steuereinrichtung verbunden, wobei die Steuereinrichtung auf Grundlage der von der Autofokuseinrichtung ermittelten Werten der Lage des Fokus einstellen bzw. nachkorrigieren kann. Somit lässt sich mit Hilfe der

Autofokuseinrichtung ein Drift in der Lage des Fokus ausgleichen. Die Autofokusstrahlung liegt vorzugsweise in einem Wellenlängenbereich, der nicht zur Abbildung des Objekts

herangezogen wird. Beispielsweise ist die Autofokusstrahlung im infraroten

Wellenlängenbereich und die Beleuchtungsstrahlung im sichtbaren Wellenlängenbereich. Die Strahlteilereinrichtung ist insbesondere einstückig oder einteilig ausgebildet, so dass die objektivseitige Fläche der Strahlteilereinrichtung und die lichtquellenseitige Fläche der

Strahlteilereinrichtung nah beieinander liegen. Objektivseitig kann die Strahlteilereinrichtung als dichroitischer Spiegel ausgebildet sein, der beispielsweise Licht im Wellenlängenbereich der Beleuchtungsstrahlung und der Fluoreszenzstrahlung des Objekts transmittiert und Strahlung im Wellenlängenbereich der Autofokusstrahlung reflektiert.

Bei Beleuchtung des Objekts mit hoher Intensität oder Leistung ist es manchmal

wünschenswert, das Ausbleichen von Fluoreszenzquellen im Objekt zu vermeiden, indem das Objekt nur zeitweise beleuchtet wird. Daher ist es bevorzugt, dass im Abbildungsstrahlengang zwischen der Strahlteilereinrichtung und dem Objekt der bereits erwähnte Shutter vorgesehen ist, der in einem Betriebszustand den gemeinsamen Strahlengang blockiert, so dass keine Beleuchtungsstrahlung auf das Objekt gelangt. Der Shutter ist in der Regel mit der

Steuereinrichtung verbunden. Auch bei blockierendem Shutter kann weiterhin der

Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung erfasst werden. Bei einem Shutter vor der Strahlteilereinrichtung wäre das nicht möglich. Bei offenem Shutter kann die

Beleuchtungsstrahlung ungehindert passieren. Der Shutter findet optional auch bei optischen Manipulationsexperimenten wie FRAP und/oder Laser-Ablation und/oder FLIP Anwendung. Hier wird die Beleuchtungseinrichtung zum Manipulieren des Objekts verwendet. Bei optischen Manipulationsexperimenten hat die Beleuchtungsstrahlung eine wesentlich höhere Leistung. Dies bedeutet, dass z. B. mit der Beleuchtungseinrichtung geblichen oder ablatiert wird, und das Objekt abgebildet wird, um die Fluoreszenz zu dokumentieren. In manchen Varianten laufen diese Experimente mit zwei unterschiedlichen Wellenlängen ab, die dann gleichzeitig genutzt werden; der eine Wellenlängenbereich zum Bleichen oder ablatieren und der andere Wellenlängenbereich zum Abbilden. Um ungewünschtes Bleichen zu vermeiden, ehe der Energieparameter den korrekten Wert hat oder diesen konstant einnimmt, kann der Shutter optional dichroitisch, d. h. zum Blockieren (nur) der Beleuchtungsstrahlung, ausgebildet sein und andere Wellenlängen können ihn transmittieren. Die Ausdehnung der Beleuchtungsstrahlung im Objekt kann mit Hilfe einer Leuchtfeldblende eingestellt werden, welche in einer zu der Objektebene konjugierten Zwischenbildebene angeordnet ist. Die Leuchtfeldblende ist der Lichtquelle nachgeordnet und insbesondere in Beleuchtungsrichtung vor der Strahlteilereinrichtung angeordnet, z. B. außerhalb des gemeinsamen Strahlengangs im Beleuchtungsstrahlengang, z. B. zwischen dem optischen Element und der Lichtquelle. Vorzugsweise weist die Leuchtfeldblende einen Antrieb auf, der mit der Steuereinrichtung verbunden ist. Die Steuereinrichtung kann ferner ausgebildet sein, einen Grad der Öffnung der Leuchtfeldblende zu erfassen, beispielsweise um eine manuelle Verstellung der Leuchtfeldblende zu detektieren.

Die Auskopplung der Messstrahlung von der Beleuchtungsstrahlung bzw. die Ein- oder Auskopplung der Autofokusstrahlung gelingt dann besonders einfach, wenn die

Beleuchtungsstrahlung bzw. die Autofokusstrahlung parallelisiert verläuft. Daher ist es bevorzugt, dass die Strahlteilereinrichtung in einem Abschnitt, in welchem der gemeinsame Strahlengang parallelisiert verläuft, zwischen dem optischen Element und dem Objektiv angeordnet ist. Die Strahlteilereinrichtung kann somit im Unendlichkeitsraum angeordnet sein. Der erwähnte Shutter ist in der Regel in dem Abschnitt des gemeinsamen Strahlengangs vorgesehen, der im Unendlichkeitsraum ist. Um den im Objekt vorhandenen Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung besser bestimmen zu können, weist das Mikroskop eine Überwachungsblende, welche zwischen der Strahlteilereinrichtung und der Überwachungseinrichtung angeordnet ist und deren Öffnung verstellbar ist, sowie eine Steuereinrichtung auf, welche die Öffnung der Überwachungsblende je nach wirksamer Apertur des Objektivs einstellt. Die wirksame Apertur entspricht insbesondere der Ausdehnung der Beleuchtungsstrahlung, wie sie in Beleuchtungsrichtung in das Objektiv eintritt. Ist die Ausdehnung der Beleuchtungsstrahlung größer als die Apertur des Objektivs, entspricht die wirksame Apertur der Apertur des Objektivs. Ist die Ausdehnung der Beleuchtungsstrahlung an dem Objektiv kleiner als die Apertur des Objektivs, beispielsweise indem dieser durch die Leuchtfeldblende begrenzt wird, entspricht die wirksame Apertur dem Durchmesser der Leuchtfeldblende.

Ferner kann die Überwachungsblende mit anderer Öffnung ausgetauscht werden, z. B. indem die gewünschte Überwachungsblende mittels eines Schiebers in die Messstrahlung geschoben wird.

Entspricht die wirksame Apertur nicht dem Durchmesser der Messstrahlung, so kann mit Hilfe der Überwachungsblende der Durchmesser der Messstrahlung an die wirksame Apertur angepasst werden. Dazu kann die Überwachungsblende mit der Steuereinrichtung verbunden sein, welche die Öffnung der Überwachungsblende an die wirksame Apertur anpasst. Die wirksame Apertur kann beispielsweise auf die Apertur des Objektivs, insbesondere wenn der Durchmesser der Beleuchtungsstrahlung größer als der des Objektivs ist, oder durch Erfassen der Öffnung der Leuchtfeldblende, bestimmt werden. Auf diese Weise lässt sich der

Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung im Objekt genauer überwachen, da die

Ausdehnung der das Objektiv transmittierenden Beleuchtungsstrahlung und der Messstrahlung gleich sind. Insbesondere wird der Querschnitt der Messstrahlung derart angepasst, dass der gleiche Anteil der Beleuchtungsstrahlung das Objektiv und die Überwachungsblende passieren kann. Auf diese Weise lassen sich Abweichungen zwischen dem gemessenen und dem in dem Objekt vorhandenen Energieparameter aufgrund eines nicht gleichförmigen Intensitätsprofils oder Leistungsprofils der Beleuchtungsstrahlung, wie beispielsweise ein Gaußprofil, minimieren.

Um den Aufbau zu verkleinern und den Bauaufwand für das Mikroskop zu reduzieren, ist es bevorzugt, dass dem Strahlteiler eine Überwachungsoptik nachgeordnet ist, welche die Messstrahlung auf die Überwachungseinrichtung fokussiert, wobei vorzugsweise die

Überwachungseinrichtung einen nicht ortsauflösenden Detektor, wie beispielsweise eine Fotodiode, aufweist. Zusammen mit der Überwachungsblende ist es dann möglich, einen nicht ortsauflösenden Detektor zu verwenden und dennoch den Durchmesser der

Beleuchtungsstrahlung oder die wirksame Apertur zu berücksichtigen. Da nicht-ortsauflösende Detektoren meist kleiner als ortsauflösende Detektoren und darüber hinaus einfacher aufgebaut sind, kann somit Bauraum als auch Aufwand eingespart werden.

Die Erfassung der wirksamen Apertur kann jedoch auch dadurch erfolgen, dass die

Überwachungseinrichtung einen ortsauflösenden Detektor hat, z. B. einen CCD-(charge- coupled device)-Sensor. Mit Hilfe des ortsauflösenden Detektors kann man den

Strahlquerschnitt der Messstrahlung bestimmen. Insbesondere kann eine Intensitätsverteilung und/oder die Form und Größe des Spots der Beleuchtungsstrahlung bestimmt werden. Mit Hilfe dieser Ergebnisse lässt sich der im Objekt vorhandene Energieparameter der

Beleuchtungsstrahlung genauer angeben.

Es ist ferner bevorzugt, dass das Mikroskop mindestens einen Filter zur Abschwächung und/oder Absorption wenigstens eines Wellenlängenbereichs der Beleuchtungsstrahlung aufweist, der zwischen der Strahlteilereinrichtung und Überwachungseinrichtung angeordnet ist. Der Filter kann zur Abschwächung des gesamten Wellenlängenbereichs der

Beleuchtungsstrahlung dienen. Durch ihn kann man mit der Überwachungseinrichtung

Beleuchtungsstrahlung mit hohem Energieparameter detektieren, ohne die

Überwachungseinrichtung zu beschädigen. Der Filter erlaubt es, einen größeren

Energieparameterbereich mit Hilfe der Überwachungseinrichtung zu erfassen. Darüber hinaus kann der Filter auch als Bandpassfilter ausgebildet sein, der nur Strahlung eines bestimmten Wellenlängenbereichs passieren lässt. Insbesondere wenn die Überwachungseinrichtung zur Detektion von Strahlung in einem vorgegebenen Wellenlängenbereich ausgebildet ist, kann ein solcher Filter Messfehler aufgrund von Strahlung aus anderen Wellenlängenbereichen vermeiden. Ferner kann der Filter als Langpass oder Kurzpass vorgesehen sein, um unerwünschte Strahlung vor der Überwachungseinrichtung zu blocken, z. B. Autofokusstrahlung oder Strahlung des Fluoreszenzlichtes. Vorzugsweise sind einer oder mehrere Filter in der oben beschriebenen Art zwischen der Strahlteilereinrichtung und der Überwachungseinrichtung vorgesehen.

Insbesondere ist es von Vorteil, wenn der Filter in den als Messstrahlung ausgekoppelten Teil der Beleuchtungsstrahlung ein- und herausgeführt werden kann. Auf diese Weise lässt sich die Erfassung der Messstrahlung je nach Wellenlängenbereich der Beleuchtungsstrahlung optimieren. Es ist insbesondere bevorzugt, dass das Mikroskop einen Filterantrieb zum

Bewegen mindestens eines Filters aus oder in die Messstrahlung vorweist. Der Filterantrieb kann beispielsweise ein Elektromotor oder ein Linearantrieb umfassen. Der Filterantrieb ist insbesondere mit der Steuereinrichtung verbunden, so dass mit Hilfe der Steuereinrichtung die Position des mindestens einen Filters gesteuert werden kann. Die Steuereinrichtung kann beispielsweise automatisch den entsprechenden Filter je nach Wellenlängenbereich der Beleuchtungsstrahlung und des Energieparameters der Beleuchtungsstrahlung zwischen die Strahlteilereinrichtung und die Überwachungseinrichtung bewegen. Alternativ kann dies auch manuell erfolgen.

Darüber hinaus ist es bevorzugt, dass die Strahlteilereinrichtung in den gemeinsamen

Strahlengang hinein oder daraus heraus bewegbar ist. Dazu kann die Strahlteilereinrichtung einen Antrieb aufweisen, der vorzugweise mit der Steuereinrichtung verbunden ist. Ohne Strahlteilereinrichtung im gemeinsamen Strahlengang wird die Beleuchtungsstrahlung mit maximal möglichem Energieparameter ins Objekt eingekoppelt, da dann keine Messstrahlung abgetrennt wird. Außerdem kann die Strahlteilereinrichtung nur dann in den gemeinsamen Strahlengang gestellt werden, wenn die Überwachung der Lichtquelle tatsächlich gewünscht ist. In dieser Ausführungsform wird der Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung rechnerisch korrigiert, nämlich bezüglich der Messstrahlung, wenn die Strahlteilereinrichtung im/nicht im gemeinsamen Strahlengang steht. Die Überwachungseinrichtung kann Detektoren zur Erfassung der Beleuchtungsstrahlung in einem breitbandigen Wellenlängenbereich aufweisen. Darüber hinaus ist es möglich, dass die Überwachungseinrichtung einen oder mehrere Detektoren aufweist, die Strahlung nur eines bestimmten Wellenlängenbereichs detektieren. Um dennoch mehrere Wellenlängenbereiche zu erfassen, kann eine Einrichtung zur Aufspaltung der Beleuchtungsstrahlen nach

Wellenlängenbereichen vorgesehen sein, wie beispielsweise ein Prisma und/oder ein Gitter. Diese sind dann in Beleuchtungsrichtung den Detektoren der Überwachungseinrichtung vorgeordnet. Darüber hinaus ist es möglich, dass die Überwachungseinrichtung ein

Spektrometer umfasst. Durch die Möglichkeit, mehrere Wellenlängenbereiche zu erfassen, kann mit Hilfe der Überwachungseinrichtung detektiert werden , welche von mehreren

Lichtquellen gerade zur Beleuchtung des Objekts verwendet wird. Dies ist insbesondere dann hilfreich, wenn das Objekt mit Beleuchtungsstrahlung in unterschiedlichen

Wellenlängenbereichen nacheinander oder sim ultan beleuchtet wird.

Es ist in einer Weiterbildung vorgesehen, dass der eingangs genannte, in der Steuereinrichtung hinterlegte Zusammenhang wellenlängenabhängig ist, und dass die Steuereinrichtung eine Wellenlänge der Beleuchtungsstrahlung und/oder einen in der Beleuchtungsstrahlung angeordneten Anregungsfilter ermittelt. Die Wellenlänge oder der Wellenlängenbereich der Beleuchtungsstrahlung kann durch Detektion der momentan aktivierten Lichtquelle erm ittelt werden, wobei in der Steuereinrichtung der Spektralbereich der Lichtquelle hinterlegt ist. Der Wellenlängenbereich der Beleuchtungsstrahlung kann über einen Anregungsfilter modifiziert werden. Beispielsweise wird ein Anregungsfilter als Bandpass m it einem Transm issionsbereich von 510 nm bis 550 nm verwendet. Zur Ermittlung des Anregungsfilters kann dessen

Transmissionsspektrum beispielsweise manuell eingegeben werden. Darüber hinaus kann die Steuereinrichtung die Position eines Revolvers erfassen, auf welchem mehrere Anregungsfilter angeordnet sind. Zur Ermittlung der Eigenschaften des Anregungsfilters kann es vorgesehen sein, dass die Steuereinrichtung eine Datenbank, in welcher die Transm issionsspektren der verwendeten Anregungsfilter hinterlegt sind, heranzieht.

Mittels der Kenntnis der Wellenlänge oder der Wellenlängen der Beleuchtungsstrahlung und/oder des verwendeten Anregungsfilters weiß man somit, welcher Wellenlängenbereich die Beleuchtungsstrahlung abdeckt. Wenn zugleich Zusammenhang wellenlängenabhängig vorliegt, kann der Energieparameter, mittels welchem das Objekt beleuchtet wird, hinsichtlich des Wellenlängenbereichs der Beleuchtungsstrahlung angepasst werden.

Es ist optional vorgesehen, dass der Zusammenhang von Parametern des Objektivs abhängt. Parameter des Objektivs können die numerische Apertur, das momentane Sehfeld, die Vergrößerung, die Apertur und/oder das Objektfeld sein. Wie zuvor beschrieben kann ein Parameter die Transmissionseigenschaft und/oder Reflexionseigenschaft - auch

wellenlängenabhängig - sein. Die Parameter des Objektivs können manuell eingegeben werden, in der Steuereinrichtung hinterlegt sein oder von der Steuereinrichtung ermittelt werden. Beispielsweise sind mehrere Objektive auf einem Revolver angeordnet und die Steuereinrichtung kann die Position des Revolvers erfassen und somit ermitteln, welches Objektiv im Beleuchtungsstrahlengang angeordnet ist. Dazu kann die Steuereinrichtung mit einem Sensor verbunden sein, der die Position des Revolvers erfassen kann. Darüber hinaus ist es auch möglich, dass die Objektive mit einer Markierung, beispielsweise einem RFID-Chip, versehen sind, und ein mit der Steuereinrichtung verbundene Sensor aufgrund der Markierung das jeweilige Objektiv ermittelt. Durch das Ermitteln des Objektivs kann der Zusammenhang an die unterschiedlichen Transmissions- bzw. Reflexionseigenschaften des Objektivs angepasst werden. Dadurch ergibt sich eine genauere Bestimmung des Energieparameters der

Beleuchtungsstrahlung.

Es ist optional vorgesehen, dass der Zusammenhang von einem Durchmesser der

Beleuchtungsstrahlung, einem Profil der Beleuchtungsstrahlung, einer Konvergenz der Beleuchtungsstrahlung und/oder einem zwischen dem Objekt und dem Objektiv vorhandenen Immersionsmedium abhängt. Der Durchmesser der Beleuchtungsstrahlung kann beispielsweise mittels einer Leuchtfeldblende eingestellt werden. Dazu kann die Steuereinrichtung mit einem Sensor verbunden sein, der die Größe der Öffnung der Leuchtfeldblende erfassen kann. Ferner ist es möglich, den Durchmesser der Beleuchtungsstrahlung manuell einzugeben,

beispielsweise nachdem die Leuchtfeldblende entsprechend eingestellt wird. Darüber hinaus kann der Durchmesser der Beleuchtungsstrahlung auch dadurch eingestellt werden, dass der Durchmesser der Beleuchtungsstrahlung für die jeweilige Lichtquelle bekannt ist. Ähnlich kann das Profil der Beleuchtungsstrahlung ermittelt werden, beispielsweise indem für jede der verwendeten Lichtquellen das Profil der Beleuchtungsstrahlung bekannt ist. Die Konvergenz der Beleuchtungsstrahlung kann von der jeweiligen Art des Mikroskops oder der vorzunehmenden Messung abhängen. Beispielsweise ist die Strahlung für Weitfeldabbildungen oder bei Total Internal Reflection Microscopy (TIRF) konvergent. Bei Laserscanningmikroskopen, optischen Pinzetten oder bei optischen Manipulationen können die Beleuchtungsstrahlen parallel verlaufen. Dies kann beispielsweise über eine Eingabeschnittstelle der Steuereinrichtung mitgeteilt sein. Alle genannten Parameter sowie das zwischen dem Objektiv und dem Objekt vorhandene Immersionsmedium haben Einfluss auf den Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung im Objekt. Durch Kenntnis einer, mehrerer oder aller dieser Parameter kann der Zusammenhang so modifiziert werden, dass er eine genauere Verknüpfung zwischen dem Energieparameter der Messstrahlung und dem Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung im Objekt bereitstellt. Die genannten Parameter können daher als Variablen in dem Zusammenhang eingehen.

In einer Weiterbildung ist es vorgesehen, dass die Lichtquelle ausgebildet ist,

Beleuchtungsstrahlung mit mindestens zwei verschiedenen Wellenlängen gleichzeitig zu erzeugen und/oder dass die Überwachungseinrichtung ausgebildet ist, den Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung für mindestens zwei unterschiedliche Wellenlängen zu bestimmen. Bei dieser bevorzugten Weiterbildung ist es auch möglich, den Energieparameter der

Beleuchtungsstrahlung im Objekt gleichzeitig für zwei verschiedene Wellenbereiche zu steuern. Vorzugsweise kann dies auch für drei oder mehrere verschiedene Wellenlängenbereiche durchgeführt werden. Dazu ist vorgesehen, dass für jeden Wellenlängenbereich ein entsprechender Zusammenhang in der Steuereinrichtung hinterlegt ist.

Zwischen dem Strahlteiler zur Auskopplung der Messstrahlung von der Beleuchtungsstrahlung und dem Objektiv kann man optional ein Element vorsehen . Gerade in Verbindung m it der

Laserscanningmikroskopie wird oftmals ein„differential interference contrast" verwendet, wobei in die Objektivpupille direkt in Abbildungsrichtung nach dem Objektiv ein Prisma, z. B. ein Wollaston-Prisma eingeführt wird. Auch dieses kann wellenlängenabhängig sein , was dann bevorzugt in dieser Ausführungsform mit berücksichtigt werden kann.

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen , sondern auch in anderen

Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen :

Fig. 1 eine schematische Darstellung einer ersten Ausführungsform des Mikroskops;

Fig. 2 eine schematische Darstellung einer zweiten Ausführungsform des Mikroskops; und

Fig. 3 eine schematische Darstellung einer dritten Ausführungsform des Mikroskops. Ein Auflicht-Mikroskop 10 gemäß der in Fig. 1 gezeigten Ausführungsform dient zur Abbildung eines Objekts 12, insbesondere im Weitfeld. Das Mikroskop 10 kann auch als konfokales Mikroskop ausgebildet sein ; in diesem Fall steht in der Regel ein Pinhole im Strahlengang. Das Objekt 12 kann Fluoreszenzfarbstoffe oder Substanzen enthalten, die nach Stimulation Fluoreszenzstrahlung aussenden. Das Mikroskop 10 umfasst ein Objektiv 14, eine Lichtquelle 16, ein optisches Element 18, eine Überwachungseinrichtung 20, eine Strahlteilereinrichtung 22, eine Schnittstelle 23 für eine Autofokuseinrichtung 24, einen Abbildungsdetektor 26 und eine Steuereinrichtung 28. Das Objektiv 14, die Strahlteilereinrichtung 22, das optische Element 18 und ein Linsenelement 30 sowie der Abbildungsdetektor 26 bilden einen Abbildungsstrahlengang 32. Die Lichtquelle 16, das optische Element 18, die Strahlteilereinrichtung 22, und das Objektiv 14 bilden einen Beleuchtungsstrahlengang 34. Der Abbildungsstrahlengang 32 und der

Beleuchtungsstrahlengang 34 verlaufen zwischen dem Objektiv 14 und dem optischen Element 18 in einem gemeinsamen Strahlengang.

Das Objektiv 14 dient deshalb sowohl zur Fokussierung der Beleuchtungsstrahlung des Beleuchtungsstrahlengangs 34 auf das Objekt 12 als auch zur Abbildung des Objekts 12 durch den Abbildungsstrahlengang 32. Das Objekt 12 wird mit dem Objektiv 14 und dem

Linsenelement 30 auf den Abbildungsdetektor 26 abgebildet; das Linsenelement 30 kann als Tubuslinse aufgefasst werden. Der Abbildungsdetektor 26 wandelt die auf ihn eintreffende Strahlung in elektrische Signale um , die z. B. mittels einer Leitung an die Steuereinrichtung 28 übermittelt werden. Die Steuereinrichtung 28 erzeugt aus den elektrischen Signalen ein Bild des Objekts 12, das auf einer nicht dargestellten Anzeigeeinrichtung dargestellt werden kann. Das Bild des Objekts 12 kann beispielsweise ein Fluoreszenzbild sein.

Die Lichtquelle 16 kann als Laser, Light Emitting Diode (LED) oder als Weißlichtquelle ausgebildet sein. Die Lichtquelle 16 erzeugt vorzugsweise parallelisierte

Beleuchtungsstrahlung; dazu kann die Lichtquelle 16 eine in der Figur nicht dargestellte Linse oder Linsensystem aufweisen, welche/welches die Beleuchtungsstrahlung parallelisiert. Über das optische Element 18, welches beispielsweise als dichroitischer Spiegel ausgebildet ist, wird die Beleuchtungsstrahlung in den Abbildungsstrahlengang 32 eingekoppelt. Die

Beleuchtungsstrahlung umfasst z. B. einen Wellenlängenbereich, der zur Stimulation von Fluoreszenzstrahlung in dem Objekt 12 dient. Die vom Objekt 12 emittierte Strahlung hat in der Regel vorzugsweise einen anderen Wellenlängenbereich als der Wellenlängenbereich der Beleuchtungsstrahlung, so dass das optische Element 18 in der Regel dichroitisch ist und nur auf die Beleuchtungsstrahlung wirkt. Mit Hilfe der Strahlteilereinrichtung 22, welche z. B. als Strahlteiler ausgebildet sein kann, wird ein Anteil der Beleuchtungsstrahlung als Messstrahlung aus dem gemeinsamen Strahlengang, insbesondere wellenlängenunabhängig, abgetrennt und der Überwachungseinrichtung 20 zugeführt. Der ausgekoppelte Anteil der Beleuchtungsstrahlung kann beispielsweise 10%, 5% oder 1 % der Intensität oder der Leistung der Beleuchtungsstrahlung vor der Abtrennung betragen. Die Überwachungseinrichtung 20 ist in der in Figur 1 geführten Ausführungsform des Mikroskops 10 als ortsauflösender Detektor, wie z. B. als CCD-Sensor (charge-coupled device), ausgebildet, welcher ortsauflösend die auf ihn eintreffende Strahlung in elektrische Signale umwandelt. Die von der Überwachungseinrichtung 20 erzeugten elektrischen Signale werden über eine Leitung an die Steuereinrichtung 28 geleitet. Die von der Überwachungseinrichtung 20 erzeugten elektrischen Signale sind insbesondere proportional zu der Intensität oder Leistung der auf die Überwachungseinrichtung 20 eintreffenden Strahlung, so dass die

Steuereinrichtung 28 aus den Signalen die auf die Überwachungseinrichtung 20 eintreffende Intensität der Messstrahlung bestimmen kann.

Vorzugsweise weist die Steuereinrichtung 28 einen Speicher 36 auf, in dem ein, optional wellenlängenabhängiger Zusammenhang hinterlegt ist, welcher beschreibt, welchen

Prozentsatz der Beleuchtungsstrahlung die Strahlteilereinrichtung 22 als Messstrahlung aus dem gemeinsamen Strahlengang zur Überwachungseinrichtung 20 abtrennt. Der Speicher 36 kann beispielsweise ein beschreibbares oder nicht beschreibbares Speichermedium wie ein RAM oder ROM sein. Anhand des von der Überwachungseinrichtung 20 erfassten

Energieparameters der Messstrahlung kann die Steuereinrichtung 28 den Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung ermitteln, welcher von der Lichtquelle 16 zur Verfügung gestellt wird. Weit bedeutender ist es jedoch, dass die Steuereinrichtung 28 über den Zusammenhang den Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung im Objekt 12 ermittelt. Der Zusam menhang verknüpft den Energieparameter der Messstrahlung mit dem Energieparameter der

Beleuchtungsstrahlung am Objekt 12. Die Steuereinrichtung 28 steuert nun optional die Lichtquelle 16 derart, dass der Energieparameter der von der Lichtquelle 1 6 erzeugten

Beleuchtungsstrahlung innerhalb eines Toleranzbereichs mit einem vorgegebenen Soll- Energieparameter übereinstimmt.

Der Zusammenhang kann von Parametern des Objektivs 14 abhängen. Parameter des Objektivs 14 können die numerische Apertur, das momentane Sehfeld, die Vergrößerung, die Apertur oder das Objektfeld sein. Ein Parameter des Objektivs 14 ist optional das

Transmissions- und/oder Reflexionsverhalten des Objektivs 14. Hierzu kann die

Steuereinrichtung 28 mit dem Objektiv 14 verbunden sein, um beispielsweise zu ermitteln, welche Art oder Typ von Objektiv momentan im gemeinsamen Strahlengang 32 vorgesehen ist. Beispielsweise können mehrere Objektive 14 auf einem Revolver angeordnet sein und die Steuereinrichtung 28 kann erfassen, welches der Objektive 14 sich momentan im gemeinsamen Strahlengang befindet. Vorzugsweise ist im Speicher 36 ein Zusammenhang hinterlegt, welcher wellenlängenabhängig das Transmissions- und/oder Reflexionsverhalten des Objektivs 14 angibt. Darüber hinaus kann auch die Apertur der im Mikroskop 10 zu verwendenden Objektive 14 hinterlegt sein. Anhand der Transm issions- und/oder Reflexionseigenschaften des Objektivs 14 und der Kenntnis der Intensität der Beleuchtungsstrahlung kann die Steuereinrichtung 28 insbesondere präzise den in dem Objekt 12 vorhandenen Energieparameter der

Beleuchtungsstrahlung erm itteln. Beispielsweise hängen die im Objekt 12 vorhandene Leistung LO, die mit der Überwachungseinrichtung 20 bestimmten Leistung L, der Anteil der von der Strahlteilereinrichtung 22 ausgekoppelten Strahlung A und der Transmissionsgrad des Objektivs 14 T über folgende Gleichung zusammen:

Da die Überwachungseinrichtung 20 einen ortsauflösenden Detektor hat, bestimmt die Steuereinrichtung 28 auch einen Strahlquerschnitt der Messstrahlung. Ist die Ausdehnung der Beleuchtungsstrahlung größer als die Apertur des Objektivs 14, passiert nicht sämtliche Beleuchtung das Objektiv 14, und nicht die sämtliche zur Verfügung stehende

Beleuchtungsstrahlung wird auf das Objekt 12 fokussiert. Mit Hilfe der ortsauflösenden Überwachungseinrichtung 20 kann somit bei der Ermittlung des Energieparameters der Beleuchtungsstrahlung im Objekt der Anteil der nicht ausgenutzten Beleuchtungsstrahlung berücksichtigt werden, wenn der Zusammenhang als Parameter die Apertur des Objektivs 14 aufweist.

Ferner kann der hinterlegte Zusammenhang von einem Durchmesser der

Beleuchtungsstrahlung, einem Profil der Beleuchtungsstrahlung, einer Konvergenz der Beleuchtungsstrahlung und/oder einem zwischen dem Objekt 12 und dem Objektiv 14 vorhandenen Immersionsmedium abhängen. Der Durchmesser der Beleuchtungsstrahlung kann beispielsweise mittels einer Leuchtfeldblende 41 eingestellt werden. Dazu kann die Steuereinrichtung 28 mit einem Sensor verbunden sein, der die Größe der Öffnung der Leuchtfeldblende 41 erfasst. Ferner ist es möglich, den Durchmesser der

Beleuchtungsstrahlung manuell einzugeben, beispielsweise nachdem die Leuchtfeldblende 41 entsprechend eingestellt wurde. Darüber hinaus kann der Durchmesser der

Beleuchtungsstrahlung auch dadurch ermittelt werden, dass er für die jeweilige Lichtquelle 16 bekannt ist. Ähnlich kann das Profil der Beleuchtungsstrahlung ermittelt werden, beispielsweise indem für jede verwendete Lichtquelle 16 deren Profil der Beleuchtungsstrahlung bekannt ist. Die Konvergenz der Beleuchtungsstrahlung kann von der jeweiligen Art des Mikroskops oder der vorzunehmenden Messung abhängen. Beispielsweise ist die Strahlung für

Weitfeldabbildungen oder bei total internal reflection microscopy (TIRF) konvergent sein. Bei Laserscanningmikroskopen, optischen Pinzetten oder bei optischen Manipulationen können die Beleuchtungsstrahlungen parallel sein. Diese Angabe kann beispielsweise der

Steuereinrichtung 28 über eine Eingabeschnittstelle zur Verfügung gestellt werden.

Alle genannten Parameter sowie das zwischen dem Objektiv 14 und dem Objekt 12 vorhandene Immersionsmedium haben Einfluss auf den Energieparameter der

Beleuchtungsstrahlung in dem Objekt 12. Durch Kenntnis einer oder mehrerer oder aller dieser Energieparameter kann der Zusammenhang so modifiziert werden, dass er eine genauere Angabe des Energieparameters der Beleuchtungsstrahlung im Objekt aus dem

Energieparameter der Messstrahlung bereitstellt. Der Zusammenhang kann daher die genannten Parameter als Variablen haben.

Die Lichtquelle 16 kann ausgebildet sein, Beleuchtungsstrahlung m it m indestens zwei verschiedenen Wellenlängen gleichzeitig zu erzeugen . Ferner kann die

Überwachungseinrichtung 20 ausgebildet sein, die Energieparameter der

Beleuchtungsstrahlung bei mindestens zwei unterschiedlichen Wellenlängen zu bestimmen. Bei dieser Weiterbildung ist es möglich, den Energieparameter der Beleuchtungsstrahlung im Objekt 12 für zwei, drei oder mehrere verschiedene Wellenbereiche zu steuern. Dazu ist vorgesehen, dass für jeden Wellenlängenbereich ein entsprechender Zusammenhang in der Steuereinrichtung 28 hinterlegt ist. Das Mikroskop weist eine für eine Autofokuseinrichtung 24 auf, deren Strahlung durch die Schnittstelle 23 geführt werden kann. Die Schnittstelle 23 ist beispielsweise ein Gewinde und der Autofokusstrahlengang kann eine Öffnung umfassen, durch welchen die Autofokusstrahlung geleitet wird. Die Autofokuseinrichtung 24 dient zur Erfassung der Lage des Fokus des

Objektivs 14. Eine geeignete Autofokuseinrichtung 24 ist beispielsweise in WO 2007/144197 A1 beschrieben. Die Autofokuseinrichtung 24 kann ein gegenüber dem Mikroskop 10 separates Element sein und erzeugt Autofokusbeleuchtungsstrahlung, deren Wellenlängenbereich vorzugsweise nicht m it dem Wellenlängenbereich der Beleuchtungsstrahlung oder mit dem Wellenlängenbereich der von dem Objekt 12 erzeugten Fluoreszenzstrahlung übereinstimmt. Die Überwachungseinrichtung 20 erfasst die Lage des Fokus des Objektivs 14 aus vom Objekt erhaltener Autofokusmessstrahlung und übermittelt diese Angabe an die Steuereinrichtung 28. Die Steuereinrichtung 28 kann dann den Fokus des Objektivs 14 konstant halten. Dies kann aber auch durch eine separate Steuerung erreicht werden. Somit können durch Ansteuerung des Objektivs 14 beispielsweise Drift und andere Effekte ausgeglichen werden. Objektivseitig ist die Strahlteilereinrichtung 22 m it einem dichroitischen Spiegel versehen, der die Autofokusstrahlung reflektiert und die Beleuchtungsstrahlung sowie die

Fluoreszenzstrahlung transmittiert. Lichtquellenseitig weist die Strahlteilereinrichtung 22 den Strahlteiler zur Auskopplung der Messstrahlung aus dem Beleuchtungsstrahlengang aus.

Optional können die Eigenschaften des dichroitischen Spiegels und des Strahlteilers in einer einzigen optischen Strahlteilerschicht realisiert sein. Die Strahlteilereinrichtung 22 ist vorzugsweise ein einstückiges Element mit Beschichtungen, welche dessen Reflexions- oder Transmissionsverhalten beeinflussen. Der gemeinsame Strahlengang ist zwischen dem Objektiv 14 und der Strahlteilereinrichtung 22 frei von optischen Abbildungselementen ; in der in Figur 1 gezeigten Ausführungsform sind keine Elemente in diesem Bereich vorgesehen. Dort verläuft die Strahlung näherungsweise parallelisiert; dies entspricht dem Unendlichkeitsraum .

Die in Figur 2 gezeigte Ausführungsform des Mikroskops 10 stimmt mit der in Figur 1 gezeigten Ausführungsform im grundsätzlichen Aufbau überein. Auch wenn in Figur 2 die

Autofokuseinrichtung 24 nicht gezeigt ist, kann sie in Figur 2 ebenfalls vorgesehen sein. Im Folgenden wird nur auf die sonstigen Unterschiede zwischen den beiden Ausführungsformen gemäß Figur 1 und 2 eingegangen :

Im gemeinsamen Strahlengang ist zwischen dem Objektiv 14 und der Strahlteilereinrichtung 22 ein Shutter 38 vorgesehen. Der Shutter 38 ist über eine Leitung m it der Steuereinrichtung 28 verbunden und von der Steuereinrichtung 28 in zwei Betriebszustände schaltbar. In einem Betriebszustand blockiert der Shutter 38 den gemeinsamen Strahlengang, so dass keine

Beleuchtungsstrahlung das Objekt 12 erreichen kann. In einem anderen Betriebszustand ist der Shutter 38 geöffnet, so dass der gemeinsame Strahlengang frei ist.

Als vom Shutter unabhängige Option ist der Lichtquelle 16 eine Leuchtfeldblende 41 nachgeordnet angeordnet, mittels welcher sich die Feldgröße der Beleuchtungsstrahlung verändern lässt. Die Leuchtfeldblende 41 ist über eine Leitung m it der Steuereinrichtung 28 verbunden, wobei die Steuereinrichtung 28 Lage und/oder Größe der Öffnung der

Leuchtfeldblende 41 steuern und/oder erm itteln kann. Auf diese Weise ist es möglich, den Querschnitt der Beleuchtungsstrahlung vor dem gemeinsamen Strahlengang zu verändern.

Als weitere eigenständige Option ist die Überwachungseinrichtung 20 in der in Figur 2 gezeigten Ausführungsform als ein nicht-ortsauflösender Detektor, beispielsweise eine

Fotodiode, ausgebildet. Diese nimmt im Vergleich zu dem ortsauflösenden Detektor gemäß Figur 1 weniger Raum ein und ist einfacher im Aufbau. Um die Messstrahlung auf die

Überwachungseinrichtung 20 zu fokussieren, ist eine Überwachungsoptik 42 zwischen der Strahlteilereinrichtung 22 und der Überwachungseinrichtung 20 angeordnet. Die

Überwachungsoptik 42 kann eine oder mehrere Linsen umfassen. Die Überwachungsoptik 42 fokussiert die Messstrahlung, die aus dem parallelisierten Beleuchtungsstrahlengang 34 ausgekoppelt wurde, auf die Überwachungseinrichtung 20.

Ferner sind zwischen der Strahlteilereinrichtung 22 und der Überwachungseinrichtung 20 eine optionale Irisblende 44 und ein optionaler Filter 46 angeordnet. Die Irisblende 44 ist m it der Steuereinrichtung 28 verbunden, wodurch die Steuereinrichtung 28 eine Öffnung der Irisblende in der Größe verändern und/oder ermitteln kann. Insbesondere steuert die Steuereinrichtung 28 die Irisblende 44 derart an, dass deren Öffnung mit der wirksamen Apertur des Objektivs 14 übereinstimmt. Auf diese Weise haben der Querschnitt der Messstrahlung und der Querschnitt der Beleuchtungsstrahlung im Beleuchtungsstrahlengang 34, welche das Objektiv 14 passiert, die gleiche Größe. Somit lässt sich die Intensität der in dem Objekt 12 vorhandenen

Beleuchtungsstrahlung besser ermitteln. Die wirksame Apertur des Objektivs 14 wird wie oben beschrieben aus Typ oder Art des Objektivs 14 sowie Größe der Öffnung der Leuchtfeldblende 41 ermittelt. Der Filter 46 kann einerseits zum Abschwächen, insbesondere wellenlängenunabhängig, der Messstrahlung vorgesehen sein, z. B. um Beschädigungen an der Überwachungseinrichtung 20 zu vermeiden oder um den Messbereich der Überwachungseinrichtung 20 hinsichtlich der Intensität zu vergrößern. Zum anderen kann der Filter 46 derart ausgestaltet sein, dass er nicht gewünschte Strahlung, welche das Ergebnis der Messung der Intensität der

Beleuchtungsstrahlung verfälschen könnte, blockt. Beispielsweise wird Strahlung im

Wellenlängenbereich der Autofokusstrahlung oder des Fluoreszenzlichts blockiert. Darüber hinaus kann der Filter 46 als Bandpass ausgebildet sein, so dass auf die

Überwachungseinrichtung 20 nur Strahlung in demjenigen Wellenlängenbereich eintrifft, die vor der Überwachungseinrichtung 20 erfasst werden kann. Das Mikroskop 10 kann einen oder mehrere Filter 46, wie oben beschrieben, umfassen. Insbesondere weist das Mikroskop 10 einen Filterantrieb 48 auf, mittels welchem der Filter 46 zwischen die Strahlteilereinrichtung 22 und die Überwachungseinrichtung 20 gewechselt oder herausgenommen werden kann.

Insbesondere steuert die Steuereinrichtung 28 den Filterantrieb 48 derart, dass der für die jeweilige Messung gewünschte Filter 46 zwischen die Strahlteilereinrichtung 22 und die Überwachungseinrichtung 20 eingeschaltet wird.

Die Strahlteilereinrichtung 22 kann aus dem gemeinsamen Strahlgengang ausgebildet sein. Dazu kann ein Antrieb 49, z. B. ein Elektromotor oder ein Linearantrieb, vorgesehen sein. Der Antrieb 49 ist datentechnisch mit der Steuereinrichtung 28 über eine in den Figuren nicht eingezeichnete Leitung oder per Funk verbunden. Durch Entfernen der Strahlteilereinrichtung 22 aus dem gemeinsamen Strahlengang oder dem Beleuchtungsstrahlengang 34 wird die maximale von der Lichtquelle 16 erzeugte Intensität am Objekt 12 erreicht, da in diesem Fall keine Messstrahlung ausgekoppelt wird. Die in Figur 3 gezeigte Ausführungsform des Mikroskops stimmt mit der in Figur 2 gezeigten Ausführungsform des Mikroskops 10 überein, bis auf das Vorsehen eines spektralen Elements 50 anstatt des Filters 46. Es ist jedoch auch möglich, dass sowohl der Filter 46 als auch das spektrale Element 50 zwischen der Überwachungseinrichtung 20 und der Strahlteilereinrichtung 22 vorgesehen sind. Das spektrale Element 50 lenkt die Messstrahlung wellenlängenabhängig ab. Beispielsweise umfasst das spektrale Element 50 ein Beugungsgitter oder ein Prisma. Darüber hinaus hat die Überwachungseinrichtung 20 mehrere, insbesondere nicht- ortsauflösende, Detektoren, die jeweils einfallende Strahlung in einem Wellenlängenbereich detektieren. Die von dem spektralen Element 50 wellenlängenabhängig abgelenkte Strahlung wird mit Hilfe der Überwachungsoptik 42 auf die jeweiligen Detektoren der

Überwachungseinrichtung 20 fokussiert. Die Überwachungseinrichtung 20 ist auf diese Weise spektrometrisch analysierend ausgebildet. Dies könnte auch anders, z. B. mit einem

Spektrometer, geschehen.

Die Steuereinrichtung 28 ist ausgebildet, die erfasste Intensität der

Beleuchtungsstrahlungsstrahlung kontinuierlich oder an ausgewählten Zeitpunkten im Speicher 36 so abzulegen, dass für die mit dem Mikroskop 10 aufgenommenen Bilder des Objekts 12 die Intensität der Beleuchtungsstrahlung angegeben ist. Auf diese Weise lassen sich Messungen besser dokumentieren und ggf. reproduzieren.

In der in Figuren 2 und 3 gezeigten Ausführungsform kann ein im Beleuchtungsstrahlengang angeordneter Anregungsfilter 33 vorgesehen sein. Der Anregungsfilter 33 ist z. B. der Leuchtfeldblende 41 nachgeordnet. Der Wellenlängenbereich der Beleuchtungsstrahlung wird über den Anregungsfilter 33 modifiziert, beispielsweise durch ein Anregungsfilter 33 mit einem Transmissionsbereich von 510 nm bis 550 nm. Zur Berücksichtigung des Anregungsfilters 33 kann dessen Transmissionsspektrum beispielsweise manuell eingegeben werden, so dass der Steuereinrichtung 28 diese Information zur Verfügung steht. Darüber hinaus ist es möglich, dass die Steuereinrichtung 28 ausgebildet ist, die Position eines nicht dargestellten Revolvers zu erfassen, auf welchem mehrere Anregungsfilter 33 angeordnet sind. Zur Ermittlung des Anregungsfilters 33 kann es außerdem vorgesehen sein, dass die Steuereinrichtung 28 eine Datenbank, in welcher Transmissionsspektren der verfügbaren Anregungsfilter 33 hinterlegt sind, heranzieht. Kennt die Steuereinrichtung den verwendeten Anregungsfilters 33, weiß sie, welchen Wellenlängenbereich die Beleuchtungsstrahlung abdeckt. Ist der Zusammenhang wellenlängenabhängig, kann der Energieparameter, mittels welchem das Objekt 12 beleuchtet wird, hinsichtlich des Wellenlängenbereichs der Beleuchtungsstrahlung angepasst werden.