Die Erfindung betrifft ein Mikroskopsystem, das eine lichtblattmikroskopische Funktionseinheit, deren Beleuchtungsobjektiv durch ein erstes Objektiv und deren Detektionsobjektiv durch ein separates zweites Objektiv gebildet ist, und mindestens eine weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit umfasst.

In jüngerer Vergangenheit kommen insbesondere in der Fluoreszenzmikroskopie sogenannte Lichtblatt- oder Lichtscheibenmikroskope zur Anwendung, bei denen nur eine dünne Schicht in der Probe beleuchtet wird. Verglichen mit herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopen ermöglichen Lichtblattmikroskope so eine höhere Auflösung und eine geringere Lichtbelastung, wodurch unerwünschte Effekte durch Bleichen oder lichtinduzierten Stress in biologischen Proben vermieden werden. Lichtblattmikroskope sind deshalb besonders gewinnbringend für Fluoreszenzuntersuchungen an lebenden Organismen einsetzbar.

Aus dem Stand der Technik sind verschiedenartige optische Anordnungen zur Realisierung eines Lichtblattmikroskops bekannt. Im Kontext der vorliegenden Erfindung sind hierbei insbesondere Anordnungen zu nennen, bei denen Beleuchtung und Detektion über zwei separate Objektive erfolgen. Dabei sind das Beleuchtungsobjektiv und das Detektionsobjektiv üblicherweise senkrecht zueinander angeordnet. Diese senkrechte Anordnung der Objektive hat jedoch insbesondere den Nachteil, dass sie sich nur schwer in schon bestehende Mikroskopsysteme, z.B. Konfokalsysteme, integrieren lässt.

Aus dem Stand der Technik sind Lichtblattmikroskope bekannt, bei denen sich das Beleuchtungsobjektiv und das Detektionsobjektiv in Abkehr von der vorgenannten rechtwinkligen Anordnung längs der vertikalen Achse des Mikroskopstativs gegenüberstehen. Ein Beispiel hierfür ist in dem Dokument DE 10 2011 054 914 AI offenbart. Um auch in einer solchen Anordnung ein senkrecht zur Detektionsachse liegendes Lichtblatt erzeugen zu können, wird das längs der vertikalen Stativachse durch das Beleuchtungsobjektiv tretende Beleuchtungslichtbündel auf ein Spiegelsystem gerichtet, welches das Beleuchtungslichtbündel in einem rechten Winkel ablenkt, um die Probe in der horizontal liegenden Fokusebene des Detektionsobjektivs mit einem Lichtblatt zu beleuchten. Der in der Fokusebene liegende Zielbereich der Probe wird dann durch das Detektionsobjektiv auf einen Kamerasensor abgebildet. Aus dem Dokument US 9 057 879 B2 ist ein Mikroskopsystem bekannt, das eine lichtblattmikroskopische Funktionseinheit mit einer konfokalmikroskopischen Funktionseinheit kombiniert. Bei diesem System erfolgen die Lichtblattbeleuchtung sowie die konfokale Beleuchtung und Detektion über ein- und dasselbe Mikroskopobjektiv. Für die Lichtblattdetektion ist dagegen ein separates Objektiv vorgesehen.

Da in dem vorgenannten Mikroskopsystem die lichtblattmikroskopische Funktionseinheit und die konfokalmikroskopische Funktionseinheit mit verschiedenen Detektionsobjektiven arbeiten, ist es nicht ohne weiteres möglich, dass die nach den beiden unterschiedlichen Mikroskopieanwendungen gewonnenen Bilddaten in Bezug zueinander, d.h. miteinander korreliert werden können.

Ausgehend von diesem Stand der Technik ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein aus einer lichtblattmikroskopischen Funktionseinheit und einer weiteren lichtmikroskopischen Funktionseinheit gebildetes Mikroskopsystem so weiterzubilden, dass eine einfache und präzise Auswertung der mit den beiden Funktionseinheiten gewonnenen Bilddaten möglich wird.

Die Erfindung löst diese Aufgabe durch ein Mikroskopsystem, umfassend eine lichtblattmikroskopische Funktionseinheit, deren Beleuchtungsobjektiv durch ein erstes Objektiv und deren Detektionsobjektiv durch ein separates zweites Objektiv gebildet ist, und mindestens eine weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit, wobei diese weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit ein Detektionsobjektiv aufweist, das durch das zweite Objektiv gebildet ist.

Die Erfindung sieht also ein Mikroskopsystem vor, durch das eine lichtblattmikroskopische Funktionseinheit und eine weitere lichtmikroskopische, z.B. konfokalmikroskopische Funktionseinheit derart miteinander kombiniert sind, dass beide Funktionseinheiten das aus der abzubildenden Probe stammende Detektionslicht mit ein- und demselben Detektionsobjektiv empfangen. Die Verwendung eines einzigen Detektionsobjektivs ermöglicht es, die Probe unter Anwendung unterschiedlicher Mikroskopiemethoden abzubilden, ohne dass bei einem Wechsel von der einen zu der anderen Methode ein Probentransfer erforderlich ist. Dies erleichtert die Handhabung des Mikroskopsystems erheblich. Es wird durch ein erfindungsgemäßes Mikroskopsystem also ermöglicht, korrelative Mikroskopie für Lichtblattmikroskopie und ein weiteres lichtmikroskopisches Verfahren auf eine besonders einfache und fehlerminimierende Weise durchzuführen.

Das erfindungsgemäße Mikroskopsystem kann insbesondere in der Weise eingesetzt werden, dass die Probe zunächst schonend und schnell lichtblattmikroskopisch untersucht und anschließend zur Gewinnung zusätzlicher Bilddaten durch die weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit abgebildet wird. Hier ist denkbar, dass eine solche weitere Aufnahme der Probe beispielsweise eine höhere Auflösung interessierender Probenregionen ermöglicht.

In einer bevorzugten Ausführung hat das Mikroskopsystem eine Auswerteeinheit zur korrelierten Bildauswertung auf Grundlage von Detektionslicht, das die lichtblattmikroskopische Funktionseinheit und die weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit jeweils über das durch das zweite Objektiv gebildete, gemeinsam genutzte Detektionsobjektiv empfangen. Diese vorteilhafte korrelierte Bildauswertung wird dadurch ermöglicht, dass die beiden mikroskopischen Funktionseinheiten das Detektionslicht jeweils aus ein- und derselben Probenebene empfangen, die durch die Fokusebene des den beiden Funktionseinheiten gemeinsam zugeordneten Detektionsobjektivs definiert ist. Unter einer korrelierten Bildauswertung im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Auswertung der Bilddaten zu verstehen, bei der sowohl Bilddaten benutzt werden, die mittels der lichtblattmikroskopischen Funktionseinheit gewonnen worden sind, als auch Bilddaten, die mittels der weiteren lichtmikroskopischen Funktionseinheit gewonnen worden sind. Insbesondere kann eine korrelierte Bildauswertung eine Verrechnung von zwei oder mehr Bildern oder Teilbildern der beiden Funktionseinheiten miteinander zu mindestens einem resultierenden Bild beinhalten, beispielsweise durch Addition (Überlagern) oder Subtraktion oder andere mathematische Operationen. Vorzugsweise weist die weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit ein Beleuchtungsobjektiv auf, das durch das zweite Objektiv gebildet ist. In dieser Ausführungsform stellt also das von beiden mikroskopischen Funktionseinheiten gemeinsam genutzte Detektionsobjektiv zugleich das Beleuchtungsobjektiv der weiteren lichtmikroskopischen Funktionseinheit dar. Das andere (erste) Objektiv ist dann allein der lichtblattmikroskopischen Funktionseinheit zugeordnet, nämlich als Beleuchtungsobjektiv.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform hat das Mikroskopsystem ein Mikroskopstativ, das aus einem ersten Stativteil, an dem das erste Objektiv gehalten ist, und einem zweiten Stativteil, an dem das zweite Objektiv dem ersten Objektiv gegenüberliegend gehalten ist, zusammengesetzt ist. Unter dem vorgenannten Mikroskopstativ ist dabei ein Mikroskopkörper zu verstehen, der eine Reihe von Anschlüssen (Ports) aufweist, die mechanische Schnittstellen insbesondere zum Zwecke der Lichtzufuhr und Lichtabfuhr bereitstellen. Über diese Schnittstellen lassen sich beispielsweise Kameras, Okulare, Scanner und Manipulatoren an dem Mikroskopstativ anbringen. Dementsprechend sind die vorgenannten Stativteile als Mikroskopteilkörper aufzufassen, aus denen das Mikroskopstativ bzw. der Mikroskopkörper zusammengesetzt ist. Im Kontext der vorliegenden Erfindung sind die beiden Stativteile in funktionaler Hinsicht durch einen Mikroskoptisch, der eine Probenkammer zur Aufnahme der abzubildenden Probe aufweist, voneinander separiert. Nimmt man beispielhaft an, dass einer der beiden Stativteile in Gebrauchslage des Mikroskopsystems ein unterer Stativteil und der andere ein oberer Stativteil ist, so bedeutet die vorgenannte funktionale Separierung der Stativteile, dass die dem unteren Stativteil zugeordneten Beleuchtungs- und Detektionskomponenten von unterhalb des Mikroskoptisches her wirksam werden, während die dem oberen Stativteil zugeordneten Beleuchtungs- und Detektionskomponenten von oberhalb des Mikroskoptisches her wirksam werden. In diesem Zusammenhang ist darauf hinzuweisen, dass das erfindungsgemäße Mikroskopsystem sowohl als aufrechtes Mikroskop als auch als inverses Mikroskop ausgeführt sein kann. Dabei wird vorliegend unter einem aufrechten Mikroskop eine Anordnung verstanden, bei der das gemeinsame Detektionsobjektiv oberhalb des Mikroskoptisches angeordnet ist. Demgegenüber befindet sich das gemeinsame Detektionsobjektiv bei einer inversen Mikroskopausführung unterhalb des Probentisches.

Vorzugsweise weist das Mikroskopsystem eine Lichtumlenkvorrichtung auf, die einen von der lichtblattmikroskopischen Funktionseinheit durch das erste Objektiv erzeugten Beleuchtungsfokus in eine Fokusebene des zweiten Objektivs umlenkt. Eine solche Lichtumlenkvorrichtung ermöglicht es, dass auch in einer Anordnung, in der die beiden Objektive des Mikroskopsystems einander gegenüberstehen, das Lichtblatt koplanar zur Fokusebene des Detektionsobjektivs erzeugt werden kann. Vorzugsweise weist die Lichtumlenkvorrichtung mindestens ein Spiegelelement auf, das den Beleuchtungsfokus senkrecht zur optischen Achse des zweiten Objektivs umlenkt. Dieses Spiegelelement ist vorzugsweise an dem ersten Objektiv oder an dem zweiten Objektiv angebracht, denkbar ist aber auch eine Anbringung an anderen Elementen des Mikroskopsystems, beispielsweise dem Deckglas oder einem der beiden Stativteile. In einer bevorzugten Ausführung sind beiderseits der optischen Achse zwei Spiegelelemente vorgesehen.

In einer speziellen Ausgestaltung weist die lichtblattmikroskopische Funktionseinheit einen in dem zweiten Stativteil angeordneten Flächensensor zur Detektion des durch das zweite Objektiv empfangenen Detektionslichtes auf. Der Flächensensor ist beispielsweise als CCD- oder CMOS-Kamera ausgeführt.

In einer weiteren Ausführungsform umfasst die weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit ein dem zweiten Stativteil zugeordnetes Beleuchtungsmodul zur punktweise abtastenden Probenbeleuchtung und/oder zur Weitfeld- Probenbeleuchtung. Dabei soll durch die Formulierung„zugeordnet" zum Ausdruck gebracht werden, dass das vorgenannte Beleuchtungsmodul sowohl innerhalb des zweiten Stativteils angeordnet als auch über eine geeignete Schnittstelle an dem zweiten Stativteil angekoppelt werden kann.

In einer beispielhaften Ausführung enthält das Beleuchtungsmodul einen Scanner zur punktweise abtastenden Probenbeleuchtung. Ein solcher Scanner kann beispielsweise in Form eines an sich bekannten Spiegelscanners ausgeführt sein, wie er bei einem herkömmlichen Konfokalmikroskop eingesetzt wird.

Im vorgenannten Fall weist das Beleuchtungsmodul in einer speziellen Ausführung einen Punktsensor auf, der einen sogenannten Descanned-Detektor für das durch das zweite Objektiv empfangene Detektionslicht bildet. Als Descanned-Detektor empfängt der Punktsensor des Detektionslicht nach dessen Rückführung auf den Scanner als ortsfestes Lichtbündel.

Eine Lichtquelle, die Licht für das Beleuchtungsmodul zur Verfügung stellt, kann in das Beleuchtungsmodul integriert oder aber auch, beispielweise über eine Lichtleitfaser, angekoppelt sein. Hierbei kann die Lichtquelle selbst mehrere einzelne Lichtquellen, beispielsweise mehrere Laser und/oder Laserdioden (insbesondere unterschiedlicher Wellenlängen), umfassen. Zusätzlich oder alternativ kann der Flächensensor der lichtblattmikroskopischen Funktionseinheit zugleich einen der weiteren lichtmikroskopischen Funktionseinheit zugeordneten Non-Descanned-Detektor für das durch das zweite Objektiv empfangene Detektionslicht bilden. In diesem Fall wird das von der weiteren lichtmikroskopischen Funktionseinheit empfangene Detektionslicht nicht (bzw. nicht ausschließlich) auf den punktweise abtastenden Scanner zurückgeführt, sondern direkt auf den Flächensensor geleitet, was einen direkten Vergleich der von den beiden mikroskopischen Funktionseinheiten erfassten Bilddaten ermöglicht.

In einer Ausführungsform umfasst der erste Stativteil ebenfalls einen Detektor, vorzugsweise einen Non-Descanned-Detektor, der eine zusätzliche oder alternative Detektion über den ersten Stativteil ermöglicht.

In einer bevorzugten Ausführung umfasst die lichtblattmikroskopische Funktionseinheit einen Lichtblattgenerator, der dem ersten Stativteil zugeordnet ist. Ein solcher Lichtblattgenerator enthält beispielsweise eine Lichtquelle und einen der Lichtquelle nachgeordneten Scanner, durch den der Beleuchtungsfokus so bewegt wird, dass ein quasi-statisches Lichtblatt aufgebaut wird. In einer alternativen Ausführungsform kann anstelle des Scanners auch eine lichtblatterzeugende Optik, z.B. eine Zylinderlinse vorgesehen sein. Die Lichtquelle (beispielsweise ein oder mehrere Laser) muss allerdings nicht Teil des Lichtblattgenerators sein, sondern kann mit diesem auch nur verbunden sein, beispielsweise über eine Lichtleitfaser. Hierbei ist es denkbar, dass die Lichtquellen des Lichtblattgenerators (der lichtblattmikroskopischen Funktionseinheit) und das Beleuchtungsmodul (der weiteren lichtmikroskopischen Funktionseinheit) in demselben Gehäuse untergebracht sind oder sogar zumindest teilweise identisch sind, also beispielsweise ein Laser für beide Lichtquellen Verwendung findet.

In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung hat das Mikroskopsystem eine Versteilvorrichtung zum Verstellen des zweiten Stativteils oder zumindest Teilen (Untereinheiten) des zweiten Stativteils relativ zu dem ersten Stativteil oder relativ zu zumindest Teilen (Untereinheiten) des ersten Stativteils. Denkbar ist folglich, dass eine solche Versteilvorrichtung nur ein oder mehrere Untereinheiten, wie beispielsweise einen Objektivhalter (Objektivanschluss), des zweiten Stativteils relativ zu dem ersten Stativteil (oder zumindest Untereinheiten desselben) verstellt, aber auch, dass die Versteilvorrichtung den zweiten Stativteil relativ zu dem ersten Stativteil (oder zu zumindest einer Untereinheit desselben) als Ganzes verstellt. Unter einem Verstellen ist insbesondere ein Bewegen zu verstehen, dass ein Verschieben und/oder ein Schwenken und/oder ein Rotieren beinhalten kann. Eine Antriebseinheit oder Mechanik könnte für ein Verstellen des zweiten Stativteils relativ zum ersten Stativteil („relatives Verstellen") beispielsweise den ersten Stativteil relativ zum Bezugssystem des Raumes, in dem sich das Mikroskop befindet, bewegen, aber alternativ oder zusätzlich auch den zweiten Stativteil. Äquivalentes gilt für die Untereinheiten der Stativteile. Eine solche Versteilvorrichtung kann folglich insbesondere eine Schiebeeinheit umfassen, die ausgebildet ist, den zweiten Stativteil und/oder zumindest eine Untereinheit des zweiten Stativteils (wie beispielsweise einen Objektivhalter) in einer Verschiebeebene, die senkrecht zur optischen Achse des zweiten Objektivs liegt, zumindest in eine Richtung relativ zu dem ersten Stativteil (oder zumindest Untereinheiten desselben) zu verschieben. Durch diese laterale Verschiebbarkeit ergibt sich eine Reihe von Vorteilen, wie z.B. eine Vergrößerung des detektierbaren Probenraums. Insbesondere wenn zur Lichtblatterzeugung beiderseits der optischen Achse zwei Spiegelelemente in einem vergleichsweise großen Abstand voneinander angeordnet sind und das Beleuchtungsbildfeld so klein ist, dass die Spiegelelemente durch das Beleuchtungsobjektiv nicht mehr ausreichend beleuchtet werden können (also diese das Beleuchtungsfokus nicht mehr ausreichend umlenken), kann durch laterales Verschieben einer der beiden Stativteile nach Bedarf eines der Spiegelelemente angefahren, d.h. beleuchtet werden. Außerdem ist es möglich, während der Bildaufnahme das Beleuchtungsobjektiv im Zentralbereich und nicht am Rand des Beleuchtungsbildfeldes einzusetzen (also das Spiegelelement im Zentralbereich des Beleuchtungsobjektives zu positionieren), was zu einer Steigerung der optischen Leistung (Abbildungsleistung), insbesondere zu einer Verringerung der Farbquerfehler, führt. Auch kann ein Beleuchtungsobjektiv mit höherer Vergrößerung und damit (bei gleichem Durchmesser der Eintrittspupille) höherer numerischer Apertur eingesetzt werden. Die Möglichkeit, das Beleuchtungsobjektiv im Zentralbereich des Beleuchtungsbildfeldes einzusetzen, vereinfacht zudem das in speziellen Lichtblattanwendungen vorgesehene Schieben des Beleuchtungsfokus längs der optischen Achse. Eine Schiebeinheit kann auch so ausgebildet sein, dass alternativ oder zusätzlich zu der oben beschriebenen Funktionalität eine Verschiebung des zweiten Stativteils und/oder zumindest einer Untereinheit des zweiten Stativteils parallel zur optischen Achse des ersten und/oder zweiten Objektivs ermöglicht wird. Beispielsweise ist eine Verschiebung des Objektivanschlusses des zweiten Stativteils parallel zur optischen Achse des zweiten Objektivs denkbar. Alternativ oder zusätzlich kann die Versteilvorrichtung auch eine gegebenenfalls weitere Schiebeeinheit umfassen, die eine Verschiebung des ersten Stativteils und/oder zumindest einer Untereinheit des ersten Stativteils parallel zur optischen Achse des ersten und/oder zweiten Objektivs ermöglicht. In einer weiteren vorteilhaften Ausführung umfasst die Versteilvorrichtung eine Schwenkeinheit, die ausgebildet ist, den zweiten Stativteil und/oder zumindest eine Untereinheit des zweiten Stativteils um eine Schwenkachse, die senkrecht zur optischen Achse des ersten Objektivs und/oder senkrecht zur optischen Achse des zweiten Objektivs liegt, relativ zu dem ersten Stativteil (oder zumindest Untereinheiten desselben) zu verschwenken.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführung umfasst die Versteilvorrichtung eine Rotationseinheit, die ausgebildet ist, den zweiten Stativteil und/oder zumindest eine Untereinheit des zweiten Stativteils um eine Rotationsachse, die parallel zur optischen Achse des ersten Objektivs und/oder parallel zur optischen Achse des zweiten Objektivs liegt, relativ zu dem ersten Stativteil (oder zumindest Untereinheiten desselben) zu rotieren. In einer weiteren Ausführung ist die Schiebeeinheit ausgebildet, eine Untereinheit des zweiten Stativteils in der parallel zu einer Fokusebene des zweiten Objektivs liegenden Verschiebeebene relativ zu dem ersten Stativteil zu verschieben. Ferner ist die Schwenkeinheit ausgebildet, den zweiten Stativteil in seiner Gesamtheit um die Schwenkachse relativ zu dem ersten Stativteil zu verschwenken. Diese Möglichkeit einer gekoppelten Schiebe-/Schwenkbewegung bietet eine Vielzahl von Einstellmöglichkeiten, die sich je nach Anwendung frei wählen lassen.

Vorzugsweise ist die weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit in ihrer Gesamtheit dem zweiten Stativteil zugeordnet. Dies ermöglicht einen besonders kompakten Aufbau des Mikroskopsystems.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung bildet die weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit ein punktweise abbildendes Mikroskop, insbesondere ein Rastermikroskop. Das vorgenannte Rastermikroskop ist beispielsweise ein Konfokalmikroskop. Durch die Kombination eines Lichtblattmikroskops und eines Konfokalmikroskops, die als Schnittstelle das gemeinsame Detektionsobjektiv aufweisen, können unter Anwendung unterschiedlicher Mikroskopiemethoden Bilddaten aus ein- und demselben Probenbereich gewonnen und miteinander korreliert werden. Beispielsweise wird zunächst mit Hilfe des Lichtblattmikroskops ein Übersichtsbild eines Probenbereichs aufgenommen. Findet man innerhalb dieses Übersichtsbilds eine Stelle, die beispielsweise mit höherer Auflösung abgebildet werden soll, so wird von dem Lichtblattmikroskop auf das Konfokalmikroskop umgeschaltet.

Das Rastermikroskop kann in einer weiteren Ausführungsform ein Multiphotonenmikroskop sein. Hierzu verfügt das Mikroskopsystem über ein Beleuchtungsmodul, das einen Multiphotonenlaser und einen Scanner umfasst. Die Detektion der in dem beleuchteten Probenbereich angeregten Photonen kann im Descanned-Modus erfolgen, indem das Detektionslicht auf den Scanner zurückgeführt und dann auf einen Punktsensor geleitet wird. Eine Detektion über einen Non- Descanned-Modus ist auch denkbar, hierbei wird das Detektionslicht beispielsweise vor dem Scanner ausgekoppelt und einem Detektor zugeführt. In weiteren Ausführungsformen kann das Rastermikroskop auch ein STED-Mikroskop (STED: stimulated emission depletion) oder ein RESOLFT-Mikroskop (RESOLFT: revesible saturable optical fluorescence depletion) sein.

In einer anderen Ausführung kann das Rastermikroskop auch als ein CARS/SRS- Mikroskop ausgeführt sein (CARS: coherent anti-Stokes Raman scattering; SRS: stimulated Raman scattering).

In weiteren anderen Ausführungen kann das Rastermikroskop auch ein Mikroskop zur Durchführung von Fluoreszenzlebensdauer-Messungen (FLIM : fluorescence lifetime imaging microscopy; FLIM-Mikroskop) oder zur Durchführung von Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS: fluorescence correlation spectroscopy; FCS-Mikroskop) oder ein spektrales Mikroskop sein. Unter einenn spektralen Mikroskop versteht man ein Mikroskop, das die Möglichkeit bietet, mehrere spektrale Bereiche aus dem Emissionspektrum der verwendeten Fluoreszenzmarker gleichzeitig oder sequentiell zu detektieren. Grundsätzlich ist ein spektrales Mikroskop geeignet, das Spektrum des detektierten Lichts zu messen.

Im Fall eines Rastermikroskops (beispielsweise Konfokalmikroskop, Multiphotonenmikroskop, STED-Mikroskop, CARS/SRS-Mikroskop, FLIM-Mikroskop, FCS-Mikroskop, spektrales Mikroskop) als lichtmikroskopische Funktionseinheit kann alternativ das Detektionslicht im Non-Descanned-Modus auch direkt auf einen Flächensensor geleitet werden, der zugleich den Detektor des Lichtblattmikroskops bildet. In diesem Fall führt das Detektionslicht auf dem Flächensensor eine Abtastbewegung aus, die der durch den Scanner verursachten Abtastbewegung des Beleuchtungslichts auf der Probe entspricht.

Die neben der lichtblattmikroskopischen Funktionseinheit vorgesehene weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit kann auch ein Weitfeldmikroskop bilden, insbesondere ein Lokalisationsmikroskop.

Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur mikroskopischen Abbildung einer Probe unter Verwendung eines Mikroskopsystems vorgesehen, das eine lichtblattmikroskopische Funktionseinheit, deren Beleuchtungsobjektiv durch ein erstes Objektiv und deren Detektionsobjektiv durch ein separates zweites Objektiv gebildet ist, und mindestens eine weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit umfasst, wobei das zweite Objektiv sowohl für die Abbildung der Probe mittels der lichtmikroskopischen Funktionseinheit als auch für die Abbildung der Probe unter Verwendung der weiteren lichtmikroskopischen Funktionseinheit als gemeinsames Detektionsobjektiv genutzt wird. Die Erfindung wird im Folgenden an Hand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert. Darin zeigen :

Fig. 1 den schematischen Aufbau eines Mikroskopsystems als

Ausführungsbeispiel;

Fig. 2 eine Darstellung der beiden in dem Mikroskopsystem nach Fig. 1 vorgesehenen Objektive; Fig. 3 eine Abwandlung des Mikroskopsystems;

Fig. 4 eine weitere Abwandlung des Mikroskopsystems;

Fig. 5 eine weitere Abwandlung des Mikroskopsystems;

Fig. 6 eine Darstellung der beiden in dem Mikroskopsystem nach Fig. 5 vorgesehenen Objektive;

Fig. 7 eine weitere Abwandlung des Mikroskopsystems;

Fig. 8 eine weitere Abwandlung des Mikroskopsystems;

Fig. 9 eine weitere Abwandlung des Mikroskopsystems; und Fig. 10 ein Blockdiagramm des Mikroskopsystems.

Fig. 1 zeigt in schematischer Darstellung ein Mikroskopsystem 10, das ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung darstellt. Das Mikroskopsystem 10 hat ein allgemein mit 12 bezeichnetes Mikroskopstativ, das aus einem unteren Stativteil 14 und einem darauf aufgesetzten oberen Stativteil 16 gebildet ist. An dem unteren Stativteil 14 ist über einen Objektivanschluss 18 ein erstes Objektiv 20 angebracht. Entsprechend ist an dem oberen Stativteil 16 über einen Objektivanschluss 22 ein zweites Objektiv 24 angebracht. Die beiden Objektive 20 und 24, die in Figur 2 noch einmal in Alleinstellung gezeigt sind, liegen einander längs einer optischen Achse 0 gegenüber, die unter Bezugnahme auf das xyz-Koordinatensystem gemäß Figur 1 parallel zur z-Achse verläuft. Die Objektive 20 und 24 sind somit beiderseits eines Mikroskoptisches 26 angeordnet, der eine in den Figuren 1 und 2 nicht explizit gezeigte Probenkammer aufweist, die beispielsweise in Form einer mit einem Glasboden versehenen Petrischale ausgebildet ist.

An dem unteren Stativteil 14 ist über einen Anschluss 28 ein Lichtblattgenerator 30 angekoppelt. Der Lichtblattgenerator 30 dient der Erzeugung einer lichtblattartigen Beleuchtungslichtverteilung, die beispielsweise über einen Spiegel oder einen dichroitischen Strahlteiler 32 in das erste Objektiv 20 eingekoppelt wird. Hierzu verfügt der Lichtblattgenerator 30 über an sich bekannte, in Figur 1 nicht gezeigte lichtblatterzeugende Komponenten wie eine Lichtquelle und einen Scanner, der das von der Lichtquelle emittierte Beleuchtungslicht in eine abtastende Bewegung versetzt. Infolge dieser abtastenden Bewegung generiert ein durch das erste Objektiv 20 erzeugter Beleuchtungsfokus, der in Figur 2 mit 34 bezeichnet ist, das der Probenbeleuchtung dienende Lichtblatt.

Wie ferner in Figur 2 gezeigt, sind an dem dem ersten Objektiv 20 zugewandten zweiten Objektiv 24 zwei beiderseits der optischen Achse O angeordnete Spiegelelemente 36, 38 angebracht, die den parallel zur optischen Achse O aus dem ersten Objektiv 20 austretenden Beleuchtungsfokus 34 senkrecht zur optischen Achse O in eine Fokusebene des zweiten Objektivs 24 umlenken. Das durch den umgelenkten Beleuchtungsfokus 34 generierte Lichtblatt ist somit koplanar zur Fokusebene des zweiten Objektivs 24 angeordnet. Wie aus vorstehender Erläuterung deutlich wird, dient das an dem unteren Stativteil 14 angeordnete erste Objektiv 20 in dem Ausführungsbeispiel nach Figur 1 als Beleuchtungsobjektiv, das die abzubildende Probe in der Fokusebene des zweiten Objektivs 24 mit dem Lichtblatt beleuchtet. Das erste Objektiv 20 wird deshalb im Weiteren auch als Lichtblatt-Beleuchtungsobjektiv bezeichnet.

An dem unteren Stativteil 14 befinden sich ferner weitere Anschlüsse, die Schnittstellen zur Ankopplung von Mikroskopkomponenten bilden, die insbesondere der Zufuhr von Licht in den unteren Stativteil 14 oder der Abfuhr von Licht aus dem unteren Stativteil 14 dienen. Beispielhaft ist in Figur 1 ein Anschluss 40 gezeigt, der der Ankopplung einer weiteren Lichtquelle dient, die Beleuchtungslicht in Richtung des dichroitischen Strahlteilers 32 emittiert. Ferner sind an dem unteren Stativteil 14 Okulare 42 angebracht.

Das dem Lichtblatt-Beleuchtungsobjektiv 20 gegenüberliegende Objektiv 24 dient in dem Ausführungsbeispiel nach Figur 1 zum einen der Erfassung des Detektionslichtes, das aus der mit dem Lichtblatt beleuchteten Probe stammt. Hierzu leitet das zweite Objektiv 24 das Detektionslicht über eine Tubusoptik 44 auf einen Flächensensor 46, der beispielsweise als CCD- oder CMOS-Kamera ausgeführt ist. Zum anderen ist das Objektiv 24 funktionsmäßig einem konfokalen Beleuchtungsmodul 48 zugeordnet, das über einen Anschluss 50 an dem oberen Stativteil 16 angekoppelt ist. In dieser Funktion dient das Objektiv 24 sowohl als Beleuchtungsobjektiv, in dem es Beleuchtungslicht, das von einer in dem konfokalen Beleuchtungsmodul 48 enthaltenen, nicht eingezeichneten Lichtquelle erzeugt und über einen ebenfalls im konfokalen Beleuchtungsmodul 48 enthaltenen Konfokal-Scanner 52 geleitet wird, auf die abzubildende Probe leitet, als auch als Detektionsobjektiv, in dem es durch die konfokale Probenbeleuchtung generiertes Detektionslicht zurück in den oberen Stativteil 16 in das konfokale Beleuchtungsmodul 48 leitet, worin das Detektionslicht von einem Punktsensor 54 erfasst wird. Da das Detektionslicht in den Konfokal- Scanner 52 zurückgeführt wird, arbeitet der Punktsensor 54 in an sich bekannter Weise als sogenannter Descanned-Sensor. Wegen der vorstehend erläuterten Doppelfunktion des zweiten Objektivs 24 wird dieses im Weiteren auch als gemeinsames Beleuchtungs-/Detektionsobjektiv bezeichnet.

Wie der untere Stativteil 14 ist auch der obere Stativteil 16 mit einer Reihe von Anschlüssen versehen, die Schnittstellen zur Ankopplung externer Komponenten an den Stativteil 16 definieren. Neben dem schon genannten Anschluss 50, an dem das konfokale Beleuchtungsmodul 48 angebracht wird, weist der Stativteil 16 einen Anschluss 56 zur Ankopplung des Flächensensors 46 und einen Anschluss 58 zur Ankopplung einer LED-Lampe 62 auf. Dabei definieren die beiden Anschlüsse 50 und 58 zwei parallele Schnittstellenebenen Ei, E ₂ , die eine wohldefinierte (insbesondere konjugierte) Lage relativ zur bildseitigen Fokusebene und/oder zur objektseitigen Fokusebene des gemeinsamen Beleuchtungs-/Detektionsobjektivs 24 aufweisen. Vorteilhafterweise weisen auch die Anschlüsse 50 und 58 selbst eine wohldefinierte (insbesondere bekannte) Lage auf, beispielsweise in Bezug auf das gemeinsame Beleuchtungs-/Detektionsobjektiv 24 und/oder relativ zur bildseitigen und/oder zur objektseitigen Fokusebene. Die Schnittstellenebene E ₂ definiert in dem Ausführungsbeispiel nach Figur 1 eine sogenannte Auflichtachse, längs der Licht, das von der LED-Lampe 62 emittiert wird, auf das gemeinsame Beleuchtungs- /Detektionsobjektiv 24 geleitet wird. An dem oberen Stativteil 16 sind ferner Okulare 60 angeordnet.

Der obere Stativteil 16 enthält neben der zuvor schon zuvor erwähnten, dem Flächensensor 46 vorgeordneten Tubusoptik 44 einen in der ersten Schnittstellenebene Ei angeordneten Strahlteilerspiegel 64 (hierbei kann es sich je nach Anwendung beispielsweise um einen (gegebenenfalls flexibel in den Strahlengang einbringbaren) Strahlteiler oder Spiegel handeln, der auch durch weitere Filter ergänzt werden kann) sowie einen Filterwürfel 66 und einen dichroitischen Strahlteiler 68, die in der zweiten Schnittstellenebene E ₂ und damit auf der Auflichtachse angeordnet sind. Die vorgenannten optischen Konnponenten 64, 66 und 68 werden in an sich bekannter Weise je nach Anwendung auf der optischen Achse 0 des gemeinsamen Beleuchtungs-/Detektionsobjektivs 24 positioniert, um das Beleuchtungslicht und das Detektionslicht innerhalb des oberen Stativteils 16 in der gewünschten Weise zu beeinflussen. Insbesondere kann durch einen entsprechend gewählten Strahlteiler als Strahlteilerspiegel 64 (bei Einsatz von passenden Farbstoffen) eine Aufspaltung entsprechend der Art des Beleuchtung (konfokale Beleuchtung oder Beleuchtung durch ein Lichtblatt) und damit eine parallele Detektion des Detektionslichts beider Arten der Beleuchtung erreicht werden. Auch eine Aufspaltung nach Polarisationsrichtungen bei Einsatz eines entsprechenden Strahlteilers (oder bei Kombination mit Polarisationsfiltern) ist denkbar.

Das Mikroskopsystem 10 nach Figur 1 stellt eine modulare Anordnung verschiedener Funktionseinheiten dar, die einzeln, aber auch gemeinsam zur Bildgebung eingesetzt werden können. Insbesondere enthält das Mikroskopsystem 10 eine lichtblattmikroskopische Funktionseinheit, deren wesentliche Funktionskomponenten im Hinblick auf die Beleuchtung durch den Lichtblattgenerator 30 und das Lichtblatt- Beleuchtungsobjektiv 20 und im Hinblick auf die Detektion durch das gemeinsame Beleuchtungs-/Detektionsobjektiv 24 und den Flächensensor 46 gegeben sind. Ferner umfasst das Mikroskopsystem 10 eine weitere, konfokalmikroskopische Funktionseinheit, deren wesentliche Komponenten sowohl im Hinblick auf die Beleuchtung als auch im Hinblick auf die Detektion durch das konfokale Beleuchtungsmodul 48 und das gemeinsame Beleuchtungs-/Detektionsobjektiv 24 gegeben sind.

In dem vorstehend erläuterten Ausführungsbeispiel nach Figur 1 erfasst die konfokalmikroskopische Funktionseinheit das aus der Probe stammende Detektionslicht nach dessen Rückführung auf den Konfokal-Scanner 52 mittels des Punktsensors 54 im sogenannten Descanned-Modus. Es ist jedoch ebenso möglich, das Detektionslicht im sogenannten Non-Descanned-Modus direkt auf den Flächensensor 46 zu leiten. In diesem Fall führt das Detektionslicht auf dem Flächensensor 46 eine Abtastbewegung aus, die der durch den Konfokal-Scanner 52 verursachten Abtastbewegung des Beleuchtungslichts auf der Probe entspricht. Das Mikroskopsystem 10 nach Figur 1 weist ferner eine Schiebeeinheit 70 auf, die es ermöglicht, den oberen Stativteil 16 in der x-y-Ebene, d.h. senkrecht zur optischen Achse 0, relativ zu dem unteren Stativteil 14 zu bewegen. Diese Möglichkeit einer lateralen Verschiebung erlaubt es insbesondere, das Lichtblatt-Beleuchtungsobjektiv 20 im Zentralbereich des Bildfeldes und nicht an dessen Rand zu nutzen, was unter anderem eine höhere optische Abbildungsleistung (insbesondere geringere Farbquerfehler) ermöglicht.

Die Figuren 3 bis 9 zeigen eine Reihe von Abwandlungen des erfindungsgemäßen Mikroskopsystems 10 nach Figur 1, wobei zur Vereinfachung der Beschreibung diejenigen Komponenten dieser Abwandlungen, die jedenfalls in ihrer grundlegenden Funktion den in Figur 1 gezeigten Komponenten entsprechen, mit den in Figur 1 verwendeten Bezugszeichen versehen sind.

Die abgewandelte Ausführungsform nach Figur 3 unterscheidet sich von dem Ausführungsbeispiel nach Figur 1 im Wesentlichen dadurch, dass die erste Schnittstellenebene Ei weggelassen und das konfokale Beleuchtungsmodul 48 in der zweiten Schnittstellenebene E ₂ , d.h. in der Auflichtachse angekoppelt ist.

Die abgewandelte Ausführungsfigur nach Figur 4 unterscheidet sich von der Ausführungsform nach Figur 3 durch das Weglassen der Okulare 60.

Figur 5 zeigt eine Ausführungsform, die sich von dem Ausführungsbeispiel nach Figur 1 dadurch unterscheidet, dass die Lichtblatterzeugung über den oberen Stativteil 16 erfolgt, während die Lichtblattdetektion sowie die konfokale Beleuchtung und Detektion in dem unteren Stativteil 14 realisiert sind. Dementsprechend ist der Lichtblattgenerator 30 bei der Ausführungsform nach Figur 5 in der ersten Schnittstellenebene Ei an dem oberen Stativteil 16 angekoppelt. Ferner ist das konfokale Beleuchtungsmodul 48 an dem unteren Stativteil 14 angebracht. Zudem weist die in Figur 5 gezeigte Ausführungsform einen weiteren Flächendetektor 72, z.B. in Form einer CCD- oder CMOS-Kamera, in dem unteren Stativteil 14 auf. Der weitere Flächendetektor 72 erfasst das Detektionslicht, das aus der mit dem Lichtblatt beleuchteten Probe stammt.

Gegenüber der Ausführungsform nach Figur 1 ist in der in Figur 5 dargestellten Ausführungsform die Anordnung des Lichtblatt-Beleuchtungsobjektivs 20 und des gemeinsamen Beleuchtungs-/Detektionsobjektivs 24 vertauscht, d.h. das Lichtblatt- /Beleuchtungsobjektiv 20 befindet sich an dem oberen Stativteil 16, während das gemeinsame Beleuchtungs-/Detektionsobjektiv 24 an dem unteren Stativteil 14 angeordnet ist. Dementsprechend befinden sich, wie in Figur 6 gezeigt, die beiden an dem Lichtblatt-Beleuchtungsobjektiv 20 angebrachten Spiegelelemente 36, 38 unterhalb des Mikroskoptisches 26.

Die in Figur 7 dargestellte Ausführungsform entspricht, soweit für die vorliegende Erfindung von Belang, im Wesentlichen dem Ausführungsbeispiel nach Figur 3, abgesehen davon, dass der Lichtblattgenerator 30 über eine Lichtleitfaser 102 an eine Mehrfarben-Lichtquelle 74 gekoppelt ist. Die Mehrfarben-Lichtquelle 74 enthält mehrere monochrome Lichtquellen 76, 78, 80, 82, die dem Lichtblattgenerator 30 über mehrere dichroitische Spiegel 84, 86, 88, 90 Beleuchtungslicht unterschiedlicher Farben zuführen. Die Mehrfarben-Lichtquelle 74 kann alternativ auch aus einem Weißlichtlaser bestehen, der ein kontinuierliches breites Spektrum an Wellenlängen liefert, oder einen solchen umfassen. Insbesondere ist auch eine Kombination aus Weißlichtlaser und monochromen Lichtquellen denkbar. Gleichzeitig ist die Mehrfarben-Lichtquelle 74 auch über eine weitere Lichtleitfaser 102 mit dem konfokalen Beleuchtungsmodul 48 verbunden und dient auch dem oberen Stativteil 16 als Lichtquelle. Im Gegensatz zu den vorherigen Ausführungsformen wurde das untere Stativteil 14 des Weiteren auf den Objektivanschluss 18 und den Lichtblattgenerator 30 reduziert und insbesondere auf Okulare 42 für den unteren Stativteil 14 verzichtet. Hierbei kann der Objektivanschluss 18 (der Objektivanschluss 18 ist eine Untereinheit des unteren Stativteils 14) mittels der Schiebeeinheit 70 sowohl parallel zur optischen Achse des Lichtblatt-/Beleuchtungsobjektivs 20 als auch in einer Ebene senkrecht zur optischen Achse des Lichtblatt-/Beleuchtungsobjektivs 20 verschoben werden. Des Weiteren kann durch eine weitere Schiebeeinheit 98 auch der Objektivanschluss 22 (der Objektivanschluss 22 bildet eine Untereinheit des oberen Stativteils 16) parallel zur optischen Achse des Beleuchtungs- /Detektionsobjektivs 24 bewegt werden. Die Versteilvorrichtung unnfasst in diesenn Fall also zwei Schiebeeinheiten 70, 98.

Die Mehrfarben-Lichtquelle 74 kann hierbei über eine optische Weiche 104 mit den Lichtleitfasern 102, die der Ankopplung an den Lichtblattgenerator 30 und dem konfokalen Beleuchtungsmodul 48 dienen, verbunden sein. Die optische Weiche 104 kann hierbei ein optisches Bauteil mit der Funktion eines Schalters sein, der das Licht entweder jeweils vollständig dem Lichtblattgenerator 30 oder dem konfokalen Beleuchtungsmodul 48 zuführt, so dass die beiden Funktionseinheiten (die lichtblattmikroskopische und die lichtmikroskopische) die Probe sequentiell beleuchten. Alternativ kann die optische Weiche 104 auch ein optisches Bauteil mit der Funktion eines Teilers sein, der einen ersten Anteil des Lichts der lichtblattmikroskopischen Funktionseinheit und einen zweiten Anteil des Lichts der konfokalmikroskopischen Funktionseinheit zuführt, so dass diese zeitgleich die Probe beleuchten. Die optische Weiche 104 kann hierbei beispielsweise einen schaltbaren Spiegel, ein akustooptisches Bauelement, wie zum Beispiel einen akustooptischen Modulator (AOM) oder einen akustooptischen Deflektor (AOD), oder einen elektro- optischen Modulator (EOM) umfassen.

Die Ausführungsform nach Figur 8 entspricht im Wesentlichen der in Figur 7 gezeigten Anordnung, abgesehen davon, dass das konfokale Beleuchtungsmodul 48 nicht wie in Figur 7 in der Schnittstellenebene Ei, sondern in der Schnittstellenebene E ₂ , d.h. in der Auflichtachse angeordnet ist.

Figur 9 zeigt eine Ausführungsform des Mikroskopsystems 10, die auf dem Ausführungsbeispiel nach Figur 3 basiert. Im Unterschied zu der in Figur 3 dargestellten Ausführungsform hat bei der Anordnung nach Figur 9 die Schiebeeinheit 70 die Funktion, nicht den oberen Stativteil 16 als Ganzes, sondern nur eine in Figur 9 mit 94 bezeichnete Untereinheit des oberen Stativteils 18, an der das gemeinsame Beleuchtungs-/Detektionsobjektiv 24 gehalten ist, lateral in der x-y-Ebene zu verschieben. Zusätzlich hat das Mikroskopsystem 10 nach Figur 9 eine Schwenkeinheit 96, mit der sich der obere Stativteil 16 als Ganzes um eine zur x-Achse parallele Schwenkachse S verschwenken lässt. Auf diese Weise lässt sich das Objektiv 24 in einer gekoppelten Schiebe-/Schwenkbewegung relativ zu dem Objektiv 20 verstellen. In dem Blockdiagramm nach Figur 10 ist schließlich rein schematisch noch einmal veranschaulicht, wie die beiden Objektive 20 und 24, der Lichtblattgenerator 30 und das konfokale Beleuchtungsmodul 48 zum einen funktional den beiden das Lichtblattmikroskop und das Konfokalmikroskop bildenden Funktionseinheit und zum anderen räumlich den beiden Stativteilen 14, 16 zugeordnet sind. Die vorgenannten Funktionseinheiten sind in Figur 10 gestrichelt dargestellt.

Ferner zeigt Figur 10 eine Steuer-/Auswerteinheit 100, die den Gesamtbetrieb des Mikroskopsystems 10 steuert. Dabei ist die Steuereinheit-/Auswerteinheit 100 insbesondere ausgebildet, Bilddaten in einer Weise auszuwerten, dass diejenigen Daten, die durch das Konfokalmikroskop gewonnen werden, in Korrelation zu von dem Lichtblattmikroskop generierten Bilddaten gesetzt werden.

Die vorstehend erläuterten Ausführungsformen sind lediglich beispielhaft zu verstehen. So ist insbesondere darauf hinzuweisen, dass sich einzelne Aspekte verschiedener Ausführungsformen ohne Weiteres miteinander kombinieren lassen. In den beschriebenen Ausführungsformen bildet die erfindungsgennäße weitere lichtmikroskopische Funktionseinheit ein Konfokalmikroskop. Es versteht sich von selbst, dass diese Funktionseinheit auch ein punktweise abbildendes Mikroskop anderer Art darstellen kann, z.B. ein Multiphotonenmikroskop, ein STED-Mikroskop, ein RESOLFT-Mikroskop oder ein CARS/SRS-Mikroskop. Ferner kann die Funktionseinheit auch als Weitfeld-Mikroskop, insbesondere als Lokalisationsmikroskop ausgeführt sein.

Bezugszeichenliste

Mikroskopsystem

Mikroskopstativ

unterer Stativteil

oberer Stativteil

Objektivanschluss

Objektiv

Objektivanschluss

Objektiv

Mikroskoptisch

Anschluss

Lichtblattgenerator

dichroitischer Strahlteiler

Beleuchtungsfokus

Spiegelelemente

Anschluss

Okular

Tubusoptik

Flächensensor

konfokales Beleuchtungsmodul

Anschluss

Konfokal-Scanner

Punktsensor

Anschluss

Anschluss

Okular

LED-Lampe

Strahlteilerspiegel

Fluoreszenzwürfel dichroitischer Strahlteiler

Schiebeeinheit weiterer Flächendetektor

Mehrfarben-Lichtquelle-82 Lichtquellen

-90 dichroitische Spiegel

Untereinheit

Schwenkeinheit weitere Schiebeeinheit0 Steuer-/Auswerteeinheit2 Lichtleitfaser

4 optische Weiche