Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen BO/de 660205

Templergraben 55 17.08.2006

52062 Aachen

MIKROSKOP MIT INTERFEROMETERANORDNUNG ZUR DURCHLICHTUNTERSUCHUNG TRANSPARENTER OBJEKTE MITTELS INTERFERENZKONTRAST UND POLARISATIONSKONTRAST

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop zur Durchlichtuntersuchung von Objekten mit einem Strahlengang zwischen einer Beleuchtungsvorrichtung und einer Vorrichtung zur Betrachtung/Erfassung eines Objektbildes, insbesondere einer Kamera. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Durchlichtmikroskopie von Objekten, insbesondere mit einer vorgenannten Vorrichtung.

Mikroskope zur Durchlichtuntersuchung von Objekten sind im Stand der Technik allgemein bekannt. Die Wirkungsweise eines Mikroskops beruht dabei im Wesentlichen darauf, dass das Licht einer Beleuchtungsvorrichtung auf ein zu betrachtendes Objekt gerichtet wird, wobei üblicherweise zur Erhöhung der Lichtintensität das einfallende Licht mittels eines sogenannten Kondensors, üblicherweise einer Linse oder Linsenanordnung, in Richtung des Objekts gebündelt wird. Mittels eines Objektivs, welches üblicherweise ebenso aus einer Linse oder Linsenanordnung besteht, wird aus der Ebene des Objektes ein Abbild des Objektes projeziert, welches ein reelles Bild darstellt und entweder unmittelbar oder nach einer weiteren Vergrößerung betrachtet werden kann.

Hierbei steht für eine weitere Vergrößerung ein Okkular zur Verfügung, mittels dem das reelle Bild weiter vergrößert wird, um anschließend mit dem Auge des Betrachters oder mittels einer Kamera erfasst zu werden. Wesentlich für eine gute Abbildungsqualität ist es, dass ein Objekt einen ausreichenden Kontrast in dieser Durchiichtuntersuchung erzeugt. Hierbei wird als Kontrast das Verhältnis der Intensitäten des Lichtes, welches das Objekt durchleuchtet und des Umgebungslichtes verstanden.

üblicherweise wird dabei in Mikroskopen eine Amplitudenänderung des Lichtes aufgrund der durch das Objekt reduzierten Transmission durch das Objekt ausgewertet. Hierbei ergibt sich jedoch das Problem, dass gerade kleine transparente Strukturen, wie sie z.B. bei lebenden Zellen auftreten, nur mit großer Schwierigkeit mikroskopisch beobachtet und untersucht werden können, da derartige lebende Zellen aufgrund ihrer hohen Transparenz oftmals nur einen ungenügenden Amplitudenkontrast erzeugen.

Es ist daher im Stand der Technik weiterhin bekannt, zu untersuchende Objekte, also beispielsweise lebende Zellen, mittels Farbstoffen, insbesondere Fluoreszenzfarbstoffen, zu präparieren und sodann die Farbstoffe mittels daran angepassten Lichtwellenlängen anzuregen und das Fluoreszenzlicht auszuwerten. Dies führt jedoch gerade bei lebenden Zellen zu der Problematik, dass eine Fluoreszenzfärbung biochemische Abläufe in den Zellen empfindlich stören kann und oftmals die untersuchten Zellen frühzeitig absterben. Auch ist der Informationsgehalt in den so erhaltenen Bildern begrenzt, da die Färbung oftmals nur gezielte einzelne Strukturen sichtbar machen kann. Wegen der Lebensdauer des Farbstoffes zum einen und der mitunter begrenzten Lebensdauer der präparierten lebenden Zellen sind darüber hinaus Langzeitbeobachtungen derart präparierter Zellen kaum möglich.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Mikroskop für Durchlichtuntersuchungen sowie auch ein Verfahren zur Mikroskopie zur Verfügung zu stellen, mittels dem die vorgenannten Nachteile überwunden werden und welches die Grenzen bei der Beobachtung hochtransparenter Objekte, insbesondere von lebenden Zellen, verbessert. Es ist dabei weiterhin Aufgabe der Erfindung, mittels eines möglichst geringen Aufwandes ein Maximum an Informationen aus einem untersuchten Objekt herauszuholen, lebende Zellen direkt zu untersuchen, ohne einen Einfluss auf die Lebensprozesse der Zellen zu nehmen und insbesondere auch Langzeituntersuchungen zu ermöglichen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein Mikroskop zur Durchlichtuntersuchung gelöst, welches einen Strahlengang zwischen einer Beleuchtungsvorrichtung und einer Vorrichtung zur Betrachtung/Erfassung eines Objektbildes, insbesondere eine Kamera aufweist, wobei im Strahlengang ein Interferometer angeordnet ist, welches Mittel zur Veränderung der Polarisation und davon unabhängige Mittel zur Veränderung der relativen Phase in wenigstens einem der Teilstrahlen des Interferometers aufweist.

Die Aufgabe wird weiterhin durch ein Verfahren zur Durchlichtmikroskopie von Objekten gelöst, bei dem der Strahlengang zwischen einer Beleuchtungsvorrichtung und einer Vorrichtung zur Betrachtung/Erfassung eines Objektbildes durch ein Interferometer führt und wobei wenigstens ein Abbild eines Objektes, insbesondere eine Serie von Abbildern, mittels einer Kamera aufgenommen wird, insbesondere in Abhängigkeit von einer Lage der Polarisation und/oder der Phase des Lichtes in wenigstens einem der Teilstrahlen des Interferometers.

Hierbei können für die Erfindung im Wesentlichen jegliche Art von Interferometer zum Einsatz kommen. Unter einem Interferometer wird dabei eine Vorrichtung verstanden, die ein von einer Beleuchtungsvorrichtung stammendes Lichtstrahlenbündel, gegebenenfalls nach einer vorherigen Raumfilterung, aufspaltet in zwei Teilstrahlen, die nach Durchlaufen einer vorbestimmten Wegstrecke in zwei unabhängigen Armen des Interferometers und gegebenenfalls nach einer Beeinflussung von Phase und Polarisation wieder in einer Vorrichtung zur Strahlenzusammenführung zu einem Lichtstrahlenbündel zusammengeführt wird, in welchem aufgrund der überlagerung Interferenzeffekte und Polarisationseffekte sichtbar gemacht werden können, die auf einer unterschiedlichen Beeinflussung der Lichtstrahlen in den beiden Teilstrahlengängen resultieren.

Hierbei können Beeinflussungen insbesondere durch änderungen der Polarisation und der relativen Phasenlage vorgenommen werden. Beispielsweise kann

erfindungsgemäß der Aufbau eines sogenannten Mach-Zehnder-Interferometers verwendet werden. Die Erfindung ist jedoch nicht auf den Einsatz einer derartigen Interferometeranordnung beschränkt und es kann grundsätzlich jegliche Interferometeranordnung verwendet werden, die nach einer Aufspaltung eines Lichtbündels zu zwei Teilstrahlen und der Möglichkeit der unabhängigen Manipulierung von Phase und Polarisation die Teilstrahlen wieder zu einem Bündel zusammenführen.

Wesentlicher Kerngedanke der Erfindung ist es dabei, dass mittels eines erfindungsgemäßen Mikroskops bzw. Verfahrens neben der Auswertung von Amplitudenkontrastbildern auch die Möglichkeit besteht, Abbilder von Objekten aufzunehmen, die abhängig sind von einerseits der Polarisation des eingestellten Lichtes, welches zur Beleuchtung des Objektes dient sowie auch von der Phase. Hierbei ist es wesentlich für die Erfindung, dass sowohl die Polarisation als auch die Phase unabhängig voneinander mittels derselben Vorrichtung verändert werden können, ohne dass zwischenzeitlich ein Einfluss auf die zu untersuchende Probe bzw. das zu untersuchende Objekt genommen werden muss. Es besteht somit die Möglichkeit, neben dem vorgenannten Amplitudenkontrast auch den Interferenzkontrast sowie den Polarisationskontrast auszuwerten und insbesondere diese beiden Kontrastarten in den Bildern zu unterscheiden.

Dies kann einerseits dadurch erfolgen, dass ein Betrachter die entstandenen Bilder unmittelbar mit dem Auge wahrnimmt und auswertet oder aber bevorzugterweise, dass die Bilder mittels eines Detektors, z.B. einer Kamera erfasst und anschließend weiter ausgewertet werden. Die Möglichkeit, unterschiedliche Kontrastinformationen auszuwerten, ist insbesondere vorteilhaft bei transparenten lebenden Zellen, da bei diesen oftmals eine optische Aktivität vorliegt, was bedeutet, dass derartige Objekte sowohl Polarisation als auch phasenschiebende Wirkungen aufweisen können. Hierbei können phasenschiebende Wirkungen z.B. durch unterschiedliche optische Dichten oder unterschiedliche Dicken eines untersuchten Objektes entstehen, wobei

beispielsweise Veränderungen in der Polarisation durch doppelbrechende Wirkungen von Zellstrukturen entstehen können.

Derartige optisch aktive Wirkungen von Objekten können mittels üblicher Amplitudenkontrastmikroskopie nicht ausgewertet werden, hingegen mittels des erfindungsgemäßen Mikroskops bzw. eines Verfahrens zur Durchführung mikroskopischer Untersuchungen, da hierbei mittels ein- und derselben Interferometeranordnung sowohl die Polarisation als auch die relative Phase bei den Teilstrahlen im Interferometer unabhängig voneinander geändert werden können, so dass aufgrund der unabhängigen änderbarkeit Rückschlüsse darauf gezogen werden können, ob ein auftretender Kontrast in einem beobachteten Objekt auf eine Polarisationsdrehung oder eine Phasenverschiebung zurückgeht.

Hierbei wird es als besonders vorteilhaft für die Erfindung empfunden, dass sowohl das Mikroskop als auch das erfindungsgemäße Verfahren ohne jegliche weitere Einflussnahme auf die zu untersuchende Probe bzw. das zu beobachtende Objekt auskommt, so dass unbeeinflusste Untersuchungen und insbesondere auch Langzeituntersuchungen möglich sind, ohne die untersuchte Probe in irgendeiner Art und Weise zu stören und hierdurch gegebenenfalls sogar ein Untersuchungsergebnis zu verfälschen.

Mittels einer Interferometeranordnung in einem erfindungsgemäßen Mikroskop, beispielsweise mittels eines Mach-Zehnder-Interferometers, besteht die Möglichkeit, deutlich höhere Kontraste zu erwirken, als dies mit einer üblichen Amplitudenmikroskopie möglich ist. Dies beruht auf der Möglichkeit, dass mittels eines Interferometeraufbaus und einer entsprechenden Justage das erfasste Abbild derart eingestellt werden kann, dass zunächst durch Interferenzeffekte und/oder Polarisationseffekte das durch das Objekt unverfälschte beleuchtende Licht in der Bildebene einen dunklen Hintergrund ergibt und lediglich durch phasen- oder polarisationsschiebende Effekte des beobachteten Objektes hellere Strukturen im Abbild erscheinen, insbesondere wobei die Helligkeit über die Stärke des Effektes gibt. Ebenso ist eine hierzu inverse Justage möglich.

Hierfür kann es in einer Ausführung vorgesehen sein, den lnterferometeraufbau durch Auswahl von Polarisation und relativer Phasenverschiebung der Teilstrahlen im Interferometer derart zu justieren, dass in der Bildebene im Wesentlichen eine ebene Wellenfront senkrecht zur Ausbreitungsrichtung der Lichtstrahlen vorliegt, und bei den beiden überlagerten Teilstrahlen aus den jeweiligen Interferometerarmen eine sich gegenseitig auslöschende Interferenz gegeben ist.

Hierfür können die Teilstrahlen im Interferometer bevorzugt unpolarisiert oder gleich polarisiert eingestellt werden, z.B. durch Auswahl einer geeigneten Beleuchtungsvorrichtung und/oder durch Auswahl polarisierend wirkender Strahlteiler und/oder polarisationsändernder Elemente. Die effektiven optischen Längen der beiden Interferometerarme sind aneinander anzupassen, zumindest bis zu einer Genauigkeit unterhalb der Kohärenzlänge der verwendeten Beleuchtungsvorrichtung. Feineinstellungen der Phasenlage können durch wenigstens ein phasenverschiebendes Element in wenigsten einem der Interferometerarme realisiert werden, z.B. mittels sogenannter Keilkompensatoren. änderungen der Interferenz durch ein Objekt lassen sodann Rückschlüsse zu auf phasenverschiebende Wirkungen des Objektes bzw. von Objektbereichen.

Es kann weiterhin vorgesehen sein, dass das Licht nach dem Interferometer durch entsprechende Einstellung des Interferometers, d.h. durch Beeinflussung der Polarisation und der relativen Phase des Lichtes in den beiden Teilstrahlengängen derart eingestellt wird, dass die Polarisation eine definierte gewünschte Lage einnimmt, z.B. zirkulär oder linear ist. Es kann sodann vor einer beobachtenden Kamera oder vor dem Auge des Betrachters eine Anordnung positioniert werden, die dieses Licht filtert, d.h. vollständig abblockt, so dass ohne die Einfügung eines Objektes in das Mikroskop ein vollständig dunkles Abbild entsteht.

Erst durch die Einführung eines Objektes erfolgt aufgrund polarisations- und/oder phasenverschiebender Effekte eine über den Querschnitt des Objektes abhängige unterschiedliche änderung der zirkulären Polarisation in eine von der eingestellten Polarisation abweichende Polarisation, z.B. also von der rein zirkulären in eine

elliptische Polarisation, so dass die Anordnung, welche durch das Objekt ungestörtes Licht ausfiltert, für derartige geänderte, z.B. elliptische Polarisationsanteile zumindest teilweise durchlässig wird und somit im Abbild, welches von einem Detektor, z.B. einer Kamera erfassbar ist oder auch von dem Auge eines Betrachters, derartige polarisations- oder phasenverschiebende Objektanteile heller erscheinen.

Durch Vergleich der Ergebnisse, die aus diese Arten und Weisen der Bildaufnahme erstellt wurden, können Rückschlüsse darauf gezogen werden, ob ein Objekt, bzw. ein Objektbereiche polarisationsdrehend ist oder phasenverschiebend. Dabei kann die Analysatoranordnung, die für die Polarisations-Kontrast-Messung nötig ist entfallen, z.B. aus dem Strahlengang geschoben werden, wenn eine Messung zum Interferenzkontrast vorgenommen wird. Ggfs kann sie auch so eingestellt werden, dass sie das Licht der verwendeten Polarisation durchlässt und somit ein Messung nicht verfälscht.

Neben dieser vorgenannten Art und Weise, eine Mikroskopie durchzuführen, ergeben sich beliebige viele andere Möglichkeiten, aufgrund der unabhängigen Einstellung von Polarisation und Phase in wenigstens einem der Teilstrahlengänge des Interferometers, wobei es bevorzugt sein kann, dass polarisationsändernde Mittel auch in beiden Teilstrahlengängen des Interferometers vorgesehen sind.

Ein erfindungsgemäßes Mikroskop kann in einer bevorzugten ersten Alternative beispielsweise derart aufgebaut sein, dass eine Mikroskopoptik zur Erzeugung eines Abbildes eines Objektes außerhalb des Interferometers nach einer Anordnung zur Strahlenzusammenführung angeordnet ist. Hierdurch ergibt sich die Möglichkeit, z.B. mittels einer Beleuchtungsvorrichtung polarisiertes oder auch unpolarisiertes Licht zu erzeugen und mittels eines polarisierend wirkenden Strahlteilers den erzeugten Lichtstrahl aufzuspalten in zwei Teilstrahlen mit zueinander senkrecht stehender Polarisationsrichtung. Vor der Zusammenführung der beiden Teilstrahlen können diese derart manipuliert werden, dass eine relative

Phase der beiden Strahlen zueinander eingestellt wird, dass das wieder zusammengeführte Strahlenbündel aufgrund der vektoriellen Addition mit der eingestellten Phasenverschiebung und den senkrechten Polarisationen zirkulär polarisiertes Licht erzeugt, beispielsweise rechts- oder linkszirkulares Licht je nach eingestellter Phase. Durch Polarisationseinstellung und Phasenverschiebung in den Interferometerarmen kann auch jegliche andere gewünschte Polarisation eingestellt werden. Wichtig, ist dass ein gewünschte Polarisation zur Auswahl kommt, z.B. zirkulär.

Die Phasenverschiebung kann durch entsprechende phasenschiebende Mittel in wenigstens einem der beiden Teilstrahlengänge des Interferometers erfolgen, beispielsweise durch eine Anordnung mit einem Keilprisma / Keilkompensator, welches mehr oder weniger weit in den Strahlengang eingeschoben wird. Zur Kompensation des eingeschobenen Glasweges kann es dabei vorgesehen sein, in dem anderen Interferometerarm einen entsprechenden transparenten Körper, beispielsweise einen Glasblock aus dem gleichen oder einem ähnlichen Material einzufügen, um die effektive Längenänderung der Interferometerarme durch den Einsatz dieses phasenverschiebenden Elementes auszugleichen.

Es besteht bei dieser Ausführung so wie eingangs genannt die Möglichkeit, durch Vorschaltung eines Analysators vor einer beobachtenden Kamera oder dem Auge eines Betrachters, das z.B. rein zirkulär polarisierte Licht bzw. die gewählte Polarisation des Licht, welches zur Beleuchtung eines Objektes in einer Mikroskopanordnung dient, vollständig zu blockieren bzw. auszufiltern.

Unter einer Mikroskopanordnung wird hierbei und bei allen anderen Ausführungen im Wesentlichen verstanden, dass ein Kondensor, insbesondere eine Linse oder Linsenanordnung, zur Beleuchtung eines Objektes vorgesehen ist sowie ein Objektiv, um eine Abbildung des beleuchteten Objektes zu projezieren, gegebenenfalls unter Erstellung eines Zwischenbildes, welches weiterhin vergrößert durch ein Okular betrachtet wird. Bei einer derartigen Anordnung ist demnach die Mikroskopoptik zur Erzeugung eines Abbildes sowie die innerhalb

der Mikroskopoptik angeordnete Probe bzw. das Objekt außerhalb des Interferometers angeordnet.

Wird demnach die Analysatoranordnung vor dem Auge des Betrachters oder des Detektors / der Kamera derart einjustiert, dass die gewählte Polarisation z.B. rein zirkuläres Licht ausgefiltert wird und somit zu einem vollständig dunklen Abbild führt, so ist es ersichtlich, dass helle Strukturen in einem Abbild des Objektes darauf zurückzuführen sind, dass das betrachtete Objekt entweder phasenschiebend oder aber polarisationsdrehend wirkt, so dass es über den Querschnitt des betrachteten Objektes zu unterschiedlichen änderungen des Lichtes aus der gewählten, z.B. reinen zirkulären Polarisation heraus kommt, z.B. wobei diese änderungen dazu führen, dass sich die reine zirkuläre Polarisation in eine elliptische Polarisation ändert, so dass entsprechend elliptisch polarisierte Lichtanteile die Analysatoranordnung wenigstens teilweise passieren können und zu einem hellen Abbild führen.

Es wird somit deutlich, dass neben der reinen Mikroskopie des Amplitudenkontrastes mittels einer derartigen Vorrichtung auch Phasen- bzw. Interferenz- und Polarisationskontraste aufgenommen werden können. Um eine Unterscheidung zwischen einer polarisationsdrehenden oder phasenschiebenden Wirkung des Objektes bzw. von Objektbereichen unterscheiden zu können.

Die Phasenkontrast-Mikroskopie wird mit dieser Vorrichtung sodann ebenso, wie zuvor beschrieben durchgeführt.

Es kann verfahrensgemäß vorgesehen sein, eine erste Serie von Abbildern eines Objektes aufzunehmen, bei der zwischen der Aufnahme zweier Abbilder die Polarisation in wenigstens einem der Teilstrahlen geändert wird und eine zweite Serie, bei der zwischen der Aufnahme zweier Abbilder die relative Phase in wenigstens einem der Teilstrahlen geändert wird. Hierbei kann die Einstellung der relativen Phase wie vorgenannt z.B. durch ein phasenverschiebendes Element wie ein Keilprisma bewirkt werden, wobei es vorgesehen sein kann, die

Polarisation durch ein entsprechendes Mittel zur Polarisationsänderung, wie beispielsweise eine Lambda-Halbe Platte vorzunehmen oder durch ähnlich wirkende Elemente.

Es besteht so nachträglich durch Auswertung der aufgenommenen Abbildungen die Möglichkeit, Rückschlüsse dahingehend zu ziehen, welche Bereiche eines Objektes phasenschiebend bzw. polarisationsdrehend wirken. Dies lässt somit Rückschlüsse dahingehend zu, ob Objektbereiche gegebenenfalls doppelbrechend sind, beispielsweise wenn sie polarisationsdrehend wirken oder aber unterschiedliche Brechungsindices bzw. unterschiedliche Dicken bei dem Objekt vorliegen, wenn diese Objektbereiche als phasenschiebend erkannt werden.

Hierbei kann es vorgesehen sein, dass die vorgenannte zweite Serie von Abbildern aufgenommen wird, wenn die Teilstrahlen in dem Interferometer unpolarisiert oder gleich polarisiert sind gegenüber einer Aufnahme der ersten Serie, wo die Teilstrahlen im Interferometer linear polarisiert sind, insbesondere wobei beide Teilstrahlen senkrecht zueinander polarisiert sind. Dies schließt bei der Aufnahme der zweiten Serie aus, dass sich Effekte ergeben, die gegebenenfalls auf polarisiertes Licht zurückzuführen sind.

Eine änderung von polarisiertem Licht in den Teilstrahlen des Interferometers zu unpolarisiertem Licht in den Teilstrahlen des Interferometers kann beispielsweise durch entsprechende Auswahl der Vorrichtung zur Strahlteilung erreicht werden. Beispielsweise können Strahlteilerwürfel eingesetzt werden, die polarisierend bzw. nicht polarisierend wirken. Derartige Strahlteilerwürfel können sodann mittels eines Verschiebemechanismus ausgetauscht werden, um das Interferometer auf polarisierten bzw. unpolarisierten Betrieb umzustellen.

In dieser vorgenannten Anordnung kann es beispielsweise auch vorgesehen sein, dass die Teilstrahlen gegenüber einer Justage, bei der diese exakt parallel zueinander verlaufen, derart justiert werden, dass die Teilstrahlen aus den

Interferometerarmen in der Vorrichtung zur Strahlzusammenführung unter einem Winkel ungleich 0 überlagert sind. Hierdurch kann sich in der Ebene des zu beobachtenden Objektes, welches sich außerhalb des Interferometers befindet, ein Strahlversatz ergeben, wobei es sodann vorgesehen sein kann, dass im Strahlengang nach dem zu beobachtenden Objekt eine Vorrichtung zur Kompensation dieses Strahlversatzes angeordnet ist, um die beiden versetzten Strahlen wieder aufeinanderzuführen. Es besteht so die Möglichkeit, eine sogenannte differentielle Interferenzmikroskopie durchzuführen, da beide Teilstrahlen das Objekt an unterschiedlichen Orten durchleuchten und anschließend wieder überlagert werden, so dass insbesondere Brechungsindexänderungen oder Dickenänderungen, mithin große Gradienten dieser Parameter in dem erzeugten Abbild dargestellt werden können.

Hierbei kann es insbesondere für eine Vereinfachung der Justage vorgesehen sein, dass nach der Beleuchtungsvorrichtung und vor dem Interferometer ein zumindest temporär angeordnetes Maskenelement vorgesehen ist, welches einen von der Beleuchtungsvorrichtung emitierten Lichtstrahl über dessen Querschnitt räumlich in der Intensität moduliert. Beispielsweise kann es sich bei einem solchen Maskenelement um ein optisches Gitter oder Lochblenden oder eine ähnliche Maske handeln. Eine derartige Maske bewirkt, dass in der Abbildung des Objektes ebenso die Maskenstruktur sichtbar wird, wobei sich bei ungenügender Justage zwei Abbildungen der Masken bezogen auf die beiden unvollständig überlagerten Teilstrahlen ergeben, so dass für eine optimale Justage und Anpassung der Verkippung der beiden Teilstrahlen und der Vorrichtung zur Kompensation der Verkippung die beiden Teilstrahlen auf einfache Weise aufeinander justiert werden können, nämlich dadurch, dass die beiden separaten Maskenbilder zur Deckung gebracht werden. Für die sodann eigentliche Untersuchung kann es vorgesehen sein, dass das Maskenelement aus dem Strahlengang herausgekippt wird, so dass dieses die Mikroskopieuntersuchung nicht weiter stört.

Bei dieser vorbeschriebenen Anordnung ist wie eingangs genannt das beleuchtete Objekt sowie die Mikroskopanordnung, d.h. Kondensor und Objektiv, im Strahlengang nachgeschaltet zum Interferometer angeordnet.

Die Anordnung aus Beleuchtungsvorrichtung und Interferometer kann somit als eine spezielle erfindungsgemäße Beleuchtungsvorrichtung verstanden werden, die gegebenenfalls auch mit üblichen klassischen Durchlichtmikroskopen zum Einsatz kommen kann. Es kann demnach eine Vorrichtung, umfassend eine Beleuchtungsvorrichtung und ein Interferometer, verwendet werden, um den Objektträger eines üblichen Mikroskops zu beleuchten, wobei hier insbesondere durch die Interferometeranordnung und die darin vorgesehenen Mittel zur Phasenschiebung und Polarisationsdrehung auf einfache Art und Weise die Einstellung einer gewünschten, z.B. der zirkulären Polarisation bei dem beleuchteten Licht ermöglichen.

In einer anderen bevorzugten und alternativen Anordnung eines erfindungsgemäßen Mikroskops kann es vorgesehen sein, dass in beiden Teilstrahlengängen des Interferometers vor einer Strahlzusammenführung jeweils eine Mikroskopoptik angeordnet ist, wobei in einer Mikroskopoptik ein zu beobachtendes Objekt und in die andere Mikroskopoptik ein Referenzobjekt einsetzbar ist. Es erfolgt hier demnach eine Strahlenzusammenführung der beiden Teilstrahlen des Interferometers erst, nachdem die beiden Teilstrahlen jeweils eine zugehörige Mikroskopoptik durchlaufen haben. Es erfolgt somit eine Interferenz dieser Teilstrahlen in einem Bereich nach dem Interferometer, so dass eine änderung der Interferenz unmittelbar beeinflusst werden kann durch ein Objekt, welches sich in einer der Mikroskopoptiken des einen Teilstrahles des Interferometers befindet.

Hierbei wird, wie vorgenannt unter der Mikroskopoptik im Wesentlichen wiederum Kondensor und Objektiv sowie ein Objektträger zur Aufnahme eines Objektes verstanden. Erfindungsgemäß ist es dabei vorgesehen, dass nur einer der Objektträger in den beiden Mikroskopoptiken der beiden Teilstrahlen ein Objekt

trägt, so dass der jeweils andere Objektträger lediglich als Referenzobjekt dient, so dass grundsätzlich beide Teilstrahlen, abgesehen von dem Objekt, identisch beeinflusst werden hinsichtlich Polarisation, Phasenschiebung und Amplitudenänderung und somit klar ist, dass eine änderung in der Interferenz / der Polarisation auf das Objekt selbst zurückzuführenist.

Alternativ kann hier auch nur eine Mikroskopoptik in einem der Interferometerarme zum Einsatz kommen, d.h. die Mikroskopoptik mit dem Refrenzobjekt kommt in Entfall. Um hier einen Einfluß der Mikroskopoptik bei der Auswertung auszuschließen, kann es vorgesehen sein, zunächst wenigsten ein Nullbild aufzunehmen, dass ein Bild ohne Objekt. Diese Nullbild kann dann von späteren Aufnahmen mit Objekt abgezogen / subtrahiert werden, um den Einfluss der Mikroskopoptik in den Bildern zu eliminieren.

Diese Anordnungen können beispielsweise so justiert werden, dass sich nach der Strahlenzusammenführung durch entsprechende Auswahl der Polarisation in den beiden Teilstrahlen und Einflussnahme auf die relative Phase der Teilstrahlen zueinander am Ausgang des Interferometers ein definiert polarisiertes, z.B. zirkuläres Licht ergibt, welches wiederum, wie auch bei der ersten Ausführung, mittels einer Analysatoranordnung, beispielsweise aus Lambdaviertelplatte und Linearpolarisator, vollständig gefiltert bzw. geblockt werden kann, so dass sich außerhalb des Interferometers eine dunkle Abbildung bei der Beobachtung durch das Auge des Betrachters oder eine Kamera ergibt.

ändert nun ein Objekt in der Objektebene einer der beiden Mikroskopanordnungen in dem einen Teilstrahl durch eine optisch aktive Wirkung, d.h. entweder durch eine Polarisationsdrehung oder eine Phasenschiebung diese ausgewählte, z.B. zirkuläre Polarisation außerhalb des Interferometers nach der überlagerung der Teilstrahlen in eine geänderte, z.B. elliptische Polarisation, so können derart polarisierte Anteile den vorbeschriebenen Analysator passieren und zu einem Abbild des Objektes in der Kamera oder im Auge des Betrachters führen, da über den Querschnitt betrachtet, unterschiedliche Bereiche des

Objektes zu unterschiedlich starken Abweichungen von der gewählten, z.B. Zirkularen Polarisation führen. Es ergibt sich somit auch bei dieser Anordnung eine überlagerung von Interferenz und Polarisationskontrastbildern, so dass äquivalent mit dem vorbeschriebenen Verfahren auch bei dieser Anordnung durch verschiedene Messserien, bei denen zum einen die Polarisation zwischen verschiedenen Aufnahmen geändert wird und zum anderen die Phasenverschiebung zwischen verschiedenen Aufnahmen geändert wird, Rückschlüsse darauf zulässt, ob die untersuchten Strukturen phasenschiebend oder polarisationsdrehend sind.

Insbesondere bei einer optischen Aktivität, die auf eine Doppelbrechung von Objektbereichen zurückzuführen ist, ist es bekannt, dass die Stärke der Doppelbrechung abhängig davon ist, wie eine lineare Polarisation bei einem beleuchtenden Licht relativ zu der doppelbrechenden Struktur orientiert ist. Die Stärke der polarisationsdrehenden Wirkung eines derartigen doppelbrechenden Bereichs ist somit abhängig von der Richtung der linearen Polarisation bei der Beleuchtung.

Um einen derartigen Effekt ausmessen zu können, kann es verfahrensmäßig vorgesehen sein, dass in beiden Interferometerarmen, d.h. beiden Teilstrahlen des Interferometers jeweils Mittel zur änderung der Polarisation des jeweils linear polarisierten Lichtes vorgesehen ist, insbesondere wobei es vorgesehen sein kann, dass in den beiden Teilstrahlen die linearen Polarisationen senkrecht zueinander ausgerichtet sind. Verfahrensgemäß können dann z.B. durch eine Wirkverbindung von zwei Mitteln zur Polarisationsbeeinflussung in den beiden jeweiligen Teilstrahlen betragsmäßig die gleichen Beträge einer Polarisationsänderung eingestellt werden, wobei jeweils immer die Polarisationen in den Teilstrahlen nach den polarisationsändernden Mitteln, wie z.B. Lambdahalbeplatten, bevorzugt weiterhin senkrecht zueinander stehen, bzw. die bei einer änderung die relative Lager der Polarisationen in den Teilstrahlen erhalten bleibt und durch eine entsprechende Phasenschiebereinstellung unabhängig von der eingestellten Polarisationsrichtung eines Teilstrahles am

Ausgang des Interferometers immer wieder das gewünscht polarisierte , z.B. zirkulär polarisiertes Licht erhalten wird.

Dies bedeutet, dass unabhängig von der Einstellung der polarisationsändernden Mittel in den Teilstrahlen bei einer erfassenden Kamera bzw. bei dem Auge des Betrachters ohne Berücksichtigung eines beobachteten Objektes immer ein dunkles Bild aufgrund der filternden Wirkung des vorbeschriebenen Analysators entsteht, welcher die gewünschte Polarisation, z.B. rein zirkulär polarisiertes Licht blockiert. Durch die änderung der linearen Polarisation in den beiden Interferometerarmen wird dabei jedoch die Ausrichtung der linearen Polarisation relativ zu einem betrachteten Objekt geändert, so dass in Abhängigkeit von der änderung der linearen Polarisation desjenigen Lichtes, welches das Objekt in einem der Interferometerarme beleuchtet, eine Serie von Abbildungen des Objektes, z.B. mittels einer Kamera aufgenommen werden kann, um die Stärke der doppelbrechenden Wirkung in Abhängigkeit des Winkels der linearen Polarisation relativ zum Objekt auszumessen. So können doppelbrechende Strukturen, insbesondere hinsichtlich ihrer Ausrichtung in der Probe, näher untersucht werden, ohne dass die Probe selbst bewegt werden muss.

Hierfür ist es wie vorbeschrieben bevorzugt vorgesehen, dass die Mittel zur Polarisationsbeeinflussung untereinander wirkverbunden sind, beispielsweise derart, dass eine Drehung eines polarisationsändernden Elementes in einem der Interferometerarme automatisch zu einer Drehung des anderen polarisationsändernden Elementes um den gleichen Betrag in dem anderen Interferometerarm führt. Eine solche Wirkverbindung kann z.B. durch ein Getriebe mit einer 1 zu1 übersetzung realisiert sein.

Auch bei dieser Anordnung kann es vorgesehen sein, vergleichende Aufnahmen von Abbildungen durchzuführen, um Abbildaufnahmen mit einer polarisierten Beleuchtung eines Objektes gegenüber Abbildungen mit einer unpolarisierten Beleuchtung eines Objektes gegenüberstellen zu können. Auch hier kann es vorgesehen sein, einen Strahlteiler am Eingang eines Interferometers entweder

polarisierend bzw. nicht polarisierend auszubilden und derartige Strahlteiler, beispielsweise als Strahlteilerwürfel auszubilden und mittels eines Verschiebemechanismus gegeneinander zu ersetzen. Neben den vorgenannten Ausführungen kann es grundsätzlich vorgesehen sein, hier nicht nur zirkuläre Polarisation bei den überlagerten Strahlen außerhalb des Interferometers zu analysieren, sondern gegebenenfalls jede beliebige Art der Polarisation durch entsprechende Auswahl bzw. Einstellung einer Analysatoranordnung, wie beispielsweise einer Lamdaviertelplatte und eines Linearpolarisators.

Ein derartiges Mikroskop der vorgenannten Art gemäß der ersten oder auch der zweiten Alternative oder jeder anderen erfindungsgemäßen Anordnung kann sich bevorzugt dadurch auszeichnen, dass die optischen Elemente zur Beeinflussung des Strahlenganges oder die Mittel zur änderung der Polarisation und/oder die Mittel zur änderung der relativen Phase mittels jeweils wenigstens eines Aktuators justierbar sind. Es ergibt sich so die Möglichkeit, beispielsweise bei umlenkenden Spiegeln, Aktuatoren vorzusehen bezüglich wenigstens zweier Achsen, um eine automatische Justierbarkeit zu ermöglichen. Ebenso kann es vorgesehen sein, dass die Mittel zur änderung der Polarisation, wie beispielsweise Lamda-halbe- Platten, mittels Aktuatoren gezielt drehbar sind und dass Mittel zur relativen Phasenschiebung, wie beispielsweise Keilprismen, mittels Aktuatoren in den Strahlgang hinein- oder herausfahrbar sind.

Hierbei wird es als besonders vorteilhaft empfunden, wenn das Mikroskop eine Steuerung aufweist, insbesondere eine Softwaresteuerung, die auf einer Datenverarbeitungsanlage realisiert ist, mittels der der gewünschte Parameter, wie z. B. Polarisation, Phasen oder Justierung automatisch einstellbar sind. So kann durch einen Benutzer einfacherweise, beispielsweise mittels einer Bedienoberfläche eines Programms, eine Auswahl von Parametern vorgenommen werden, die sodann durch die übergeordnete Steuerung und die Aktuatoren automatisch eingestellt werden. Insbesondere kann eine derartige Steuerung behilflich sein, um das Interferometer hinsichtlich der gewünschten Art der Interferenz zu justieren, welches erfahrungsgemäß manuell aufwendig ist. Hierbei

kann gerade eine Auswertung der bei der Justage bewirkten Interferenzmuster durch die Aufnahme mittels einer nachgeschalteten Kamera ausgewertet werden, um so zu einer optimalen Justage zu kommen.

Es besteht so auch weiterhin die Möglichkeit, mittels einer vorgenannten Steuerung einer Kamera, die bei Mikroskopanordnung vorgesehen sein kann, automatisch eine Folge von einzelnen Aufnahmen eines Objektes zu erfassen, insbesondere wobei zwischen zwei Aufnahmen eine automatische, insbesondere vorprogrammierte änderung wenigstens eines Parameters, wie z. B. eine änderung der Phase und eine änderung der Polarisation vorgenommen wird. Der gesamte Messvorgang bzw. die Durchführung einer Messserie kann somit voll automatisch, insbesondere nach einer vorherigen Programmierung erfolgen, ohne dass ein Nutzer bei der Durchführung der mikroskopischen Untersuchung manuell eingreifen muss.

In einer bevorzugten Anwendung der vorgenannten Mikroskopanordnungen kann es vorgesehen sein, dass eine Justage des Interferometers derart erfolgt, dass die überlagerten Teilstrahlen außerhalb des Interferometers ein Interferenzstreifenmuster ausbilden. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass die beiden Teilstrahlen aus den Interferometerarmen unter einem leichten Winkel zueinander justiert werden, so dass sich winkelabhängig mehr oder weniger eng beieinanderliegende Interferenzstreifen ergeben.

Insbesondere bei einer Mikroskopanordnung, bei der ein Mikroskobjektiv mit einem zu betrachtenden Objekt innerhalb eines Interferometerarmes, d.h. eines Teilstrahlenweges angeordnet ist, wird es sodann zu einer lateralen Verzerrung des Interferenzstreifenmusters kommen, wenn ein Objekt in der Objektebene der Mikroskopanordnung vorhanden ist. Ist kein Objekt vorhanden, so ergeben sich bei idealer Justage der Anordnung lediglich gerade ausgerichtete Interferenzstreifen. Eine laterale Verzerrung der Interferenzstreifen kann also dahingehend ausgewertet werden, dass ein Objekt in der Objektebene vorhanden ist, wobei hier zu berücksichtigen ist, dass in idem zweiten Interferometerarm ein

Referenzobjekt vorhanden ist, welches beispielsweise lediglich aus einem leeren Objektträger besteht, oder - wie vorgenannt - ein Nullbild berücksichtigt wird.

Dies überprüfung kann auch bei einer exakt parallelen Justage der Teilstrahlen bei der überlagerung erfolgt, wenn diese so justiert werden, dass z.B. negative Interferenz über die ganze Bildebene auftritt, wenn kein Objekt vorhanden ist. . Stört ein Objekt die Interferenz, so kommt es zu helleren Bildanteilen, was Rückschlüsse zulässt auf die Existenz eines Objektes im Objektträger. Diese Verfahren ist ebenso analog und äquivalent möglich, wenn maximal positive Interferenz einjustiert wird.

Es kann somit auf Grund dieser Erkenntnis ein Verfahren realisiert werden, bei dem beispielsweise automatisiert nacheinander Objektträger, beispielsweise mittels eines Scanverfahrens in die Objektebene eingefahren werden, um zu untersuchen, ob auf bzw. in einem Objektträger ein zu untersuchendes Objekt vorhanden ist oder ob es sich um einen leeren Objektträger handelt. So können beispielsweise automatisiert Scans durchgeführt werden, um die Belegung von Objektträgern, wie beispielsweise Mikrotiterplatten, festzustellen. Hierbei können eine Vielzahl von Objektträger z.B. auf einem Tisch angeordnet sein, der verfahrbar ist und so die Möglichkeit bietet nacheinander verschiedene Objektträger in die Objektebene des Mikroskopes zu fahren, z.B. mittels einer x-y- Schrittsteuerung.

Wird somit beispielsweise mit einer Kamera ein ungestörtes lnterferenz-(streifen) muster festgestellt, so lässt dies auf eine Nichtbelegung des Objektträgers schließen, wohingegen ein gestörtes lnterferenz-(streifen)-muster eine Belegung des Objektträgers mit einem Objekt anzeigt.

Hierbei wird es als besonders vorteilhaft empfunden, dass eine Veränderung der Interferenz selbst dann vorkommt, wenn sich ein beobachtetes Objekt nicht exakt in der Brennebene des Objektives einer Mikroskopanordnung befindet und somit keine scharfe Abbildung des Objektes bei dieser überprüfung erfolgt. Es kann

sodann ergänzend auch vorgesehen sein, dass bei der Feststellung, dass ein Objekt im Objektträger vorhanden ist, die Mikroskopanordnung hinsichtlich der Lage des Objektives durchgefahren wird, um unterschiedliche Ebenen im Objektträger, wie beispielsweise bei Mikrotiterplatten, durchzufahren und so verschiedene Ebenen des Objektträger mikroskopisch zu untersuchen, wenn eine Belegung des Objektträgers zuvor festgestellt wurde. Es können so beispielsweise automatisierte Mikroskopieuntersuchungen an beliebigen Anzahlen von Objektträgern durchgeführt werden.

Durch dieses Verfahren besteht auch die Möglichkeit, bewegte Objekte, auf oder in einem Objektträger zu verfolgen. Hierfür kann eine Rückkopplung vorgesehen sein, von einem Detektor bzw. einer Kamera zu einer Translationsvorrichtung für den Objektträger wenigstens in X-Y, bevorzugt in X-Y-Z-Ebene, um das bewegte Objekt im Sehfeld oder Fokus zu halten.

Anwendungsgebiet der erfindungsgemäßen Mikroskopanordnung bzw. des Verfahrens sind beispielsweise im Bereich der Krebsforschung, Stammzellenforschung oder auch der Immunologie zu sehen. Insbesondere Proteine, die in Stammzellen oder Viren vorkommen, können mittels Interferenzeffekten und der erfindungsgemäßen Anordnung mit hohen Kontrasten nachgewiesen werden.

Ausführungsbeispiele der Erfindung sind den Figuren dargestellt. Es zeigen:

Fig. 1 : Eine Ausführung mit Mikroskopanordnungen in jedem

Interferometerarm

Fig. 2: Eine Ausführung wie in Figur 1 , aber nur mit einer

Mikroskopanordnung in einem der Interferometerarme

Fig. 3: Eine Ausführung mit einer Mikroskopoptik ausserhalb des

Interferometers;

Fig. 4: Eine Ausführung wie in Fig. 2, aber mit zueinander verkippten

Teilstrahlengängen des Interferometers;

Fig. 5: Bilddarstellung eines Mausfibroplast

Die Figur 1 zeigt einen Mikroskopaufbau, bei dem in jedem Arm des Interferometers eine Mikroskopanordnung vorgesehen ist. Hierbei dient eine Mikroskopanordnung zur Beobachtung eines Objektes und die andere zur Berücksichtigung eines Referenzobjekts, damit die Strahlengänge in beiden Interferometerarmen bis auf das beobachtete Objekt identisch sind.

Durch die Lichtquelle 1 wird Licht erzeugt, z.B. mittels einem thermischen Leuchtmittel, wie Halogen-, Quecksilberdampf-, Xenondampf-, Natriumdampf- Leuchte oder mittels eines Lasers, wie z.B. Diodenlaser, Gaslaser, Festköperlaser, durchstimmbarer Diodenlaser, Optisch parametrischer Oszillator. Die Anwendung eines Laser hat dabei den Vorteil einer höheren Kohärenzlänge, so dass die Längenanpassung in den Interferometerarmen unkritischer ist als z.B. bei Thermischen Leuchtmitteln. Insbesondere bei letzteren wird die Länge der beiden Interferometerarme exakt identisch eingestellt, zumindest innerhalb der jeweils zu berücksichtigenden Kohärenzlänge.

Nach der Lichtquelle 1 kann im Strahlengang eine Aufweitungs- oder Kollimationsoptik 2 vorgesehen sein, z.B. ein Teleskop zum Aufweiten des Lichtbündels, z.B. der Laserstrahlung. Hierbei kann ein Raumfilter im Teleskop angeordnet sein, z.B. durch ein Pinhole im Fokus des Teleskops. Alternativ kann ein Kollektor zum Bündeln von Licht thermischer Quellen vorgesehen sein.

Im Strahlengang folgt sodann am Eingang zum Interferometeraufbau ein Strahlteiler 3, der als Strahlteilerwürfel ausgebildet sein kann mit a) polarisierender Wirkung für polarisationsoptische Messungen (Doppelbrechung und optische Aktivität im Objekt, Erzeugung des Polarisationskontrastes)) oder b) nicht polarisierender Wirkung für interferometrische Messungen (Brechungsindex, Dicke, optische Dichte, Gangunterschiede, Phasengrenzen, Erzeugung des Interferenzkontrastes und eines Interferenzstreifenmusters), insbesondere bei

denen Polarisationseffekte ausgeschlossen werden sollen. Das gleiche Bauteil 3 kann am Ausgang des Interferometers zu Zusammenführung der beiden Teilstrahlen des Interferometers dienen.

Durch den Strahlteiler 3 wird der Lichtstrahl I aufgespalten in die beiden Teilstrahlen Il und III, die z.B. senkrecht zueinander polarisiert sein können, oder bei nicht polarisierenden Strahlteilern 3 keine Polarisation aufweisen. Beide Teilstrahlen Il und III durchlaufen in den Interferometerarmen bis zur Zusammenführung im In der Vorrichtung zur Strahlzusammenführung 3 am Ausgang des Interferometers dieselbe Weglänge, zumindest bis auf die Kohärenzlänge genau.

Nach der Strahlaufteilung folgt in jedem der Interferometerarme ein polarisationsoptisches Element 4, z.B. ein rotierbares, insbesondere automatisch rotierbares polarisationsoptisches Element 4 um linear oder zirkulär zu polarisieren oder um die eingestrahlte Polarisation zu drehen. Es kann sich z.B. um ein Polaroid, Polarisationsprisma (Rochon, Glen-Thomson, Wollaston,...), ein Gitter, eine Lambda-Halbe Platte, Lambda-Viertel Platte, Flüssigkristallfilter für die Messung von statistisch in der Probeverteilten doppelbrechenden oder gerichteten oder optisch aktiven Strukturen oder ähnliches handeln. Zur richtungsunabhängigen Untersuchung können die beiden Elemente 4 in den beiden Interferometerarmen Armen gekoppelt sein, z.B. um sie simultan durchstimmen zu können.

Zur Umlenkung, um die spätere Zusammenführung der Teilstrahlen Il und III zu ermöglichen sind im Strahlengang Umlenkelemente 5 vorgesehen, z.B. 90° Umlenkspiegel, Prismen oder Oberflächenspiegel, jeweils mit Justagemöglichkeiten und/oder mit motorisierter Justagemöglichkeit (angetriebene Feingewindeschrauben). Durch die Umlenkelemente 5 lassen sich die Wellenfronten aus den beiden Interferometerarmen zueinander ausrichten, insbesondere zur Erzeugung eines Interferenzstreifenmusters.

Im unteren Interferometerarm ist ein optisches Element 6 zur Einstellung der relativen Phasen zwischen den Teilstrahlen Il und III vorgesehen. Es kann sich in einer Ausführung z.B. um einen Keilkompensator aus Glaskeilen (Quarz) handeln. Mit diesem Phasenschiebenden Element 6 kann z.B. der Interferenzkontrast durch den Gangunterschied bei unpolarisierten Teilstrahlen Il und III verändert werden oder bei polarisierten Teilstrahlen Il und III der Gangunterschied, um bei der überlagerung der Teilstrahlen Il und III am Ausgang des Interferometers eine gewünschte Polarisation einzustellen, insbesondere eine zirkuläre Polarisation. Hierzu können bei einem Keilkompensator die Keile senkrecht zur optischen Achse auseinander gezogen oder ineinander geschoben werden, damit der der Glasweg kürzer oder länger wird. Alternativ können für das Element 6 z.B. auch Pockelszellen oder , Kerrzellen eingesetzt werden.

Im oberen Arm ist ein optisches Element 7 zur Kompensation der Wegverlängerung durch das Element 6 angeordnet. Hierdurch kann z.B. der Glasweg eines Keilkompensators kompensiert werden, so dass beide Interferometerarme dieselbe effektive optische Länge haben. Das Kompensationselement 7 ist bevorzugt aus demselben Material wie das phasenschiebende Element 6 zum Erhalt der Phasenbeziehung und der Kohärenz der Teilstrahlen. Z.B. kann es aus Quarzglas sein, wenn z.B. ein Keilkompensator aus Quarzglas beim Element 6 eingesetzt wird.

In beiden Teilstrahlengängen des Interferometers folgt noch vor dem Element 3 zur Strahlzusammenführung je eine Mikroskopanordnung, umfassend einen Kondensor 10, z.B. eine Sammellinse oder Linsenanordnung zur Bündelung des Beleuchtungslichtes auf die Probe bzw. das zu beobachtende Objekt und ein Objektiv 11 , z.B. ebenfalls eine Linse oder Linsenanordnung, z.B. ein Trockenobjektiv, Wasserimmersions-, ölimmersionsobjektiv). Diese Objektiv erzeugt ein reelles Zwischenbild hinter der Strahlzusammenführung 3, z.B. im Tubus der Mikroskopanordnung.

Zwischen Kondensor und Objektiv befindet sich im unteren Interferometerarm mit dem Teilstrahl Il ein Objektträger 8 mit einem zu beobachtenden Objekt und im

oberen Teilstrahl III ein Referenzobjekt 9, welches z.B. lediglich denselben Objektträger umfassen kann, jedoch ohne Objekt. So ist sichergestellt, dass beide Teilstrahlengänge bis auf das zu untersuchende Objekt identisch sind.

Beide Teilstrahlen Il und III werden in der Anordnung zur Strahlzusammenführung 3 wieder überlagert und anschließend durch eine Optik 12, z.B. eine Linse für ein unendlich korrigiertes Mikroskop, auf einen Detektor 14 abgebildet. Der Detektor kann z.B. als Kamera mit CCD oder CMOS- Chip oder als Photomultiplier, Photodiode, Videokamera, Digitalkamera ausgebildet sein.

Vor dem Detektor 14 oder alternativ dem Okular für das Auge eines Betrachters kann eine Anordnung zur Polarisationsfilterung angeordnet sein, die z.B. eine gewünschte Polarisation filtert, d.h. blockt, z.B. kann die Anordnung so eingestellt sein, dass zirkulär oder linear polarisiertes Licht nicht passieren kann. Hierfür kann eine Kombination aus einer Lambda-Viertel-Platte 13 und eines Linear- Polarisators 4 eingesetzt werden. Ebenso kann es sich um ein Flüssigkristallfilter, insbesondere ein elektronisch programmierbares Flüssigkristallfilter oder ein Prisma handeln.

Im Strahlengang beider Teilstrahlen Il und III können je noch zwei Glasplatten 16 eingesetzt sein, um ein Wellenfrontonverkippung zu ermöglichen. Hierfür sind die Rotationsachsen bevorzugt parallel versetzt zur optischen Achse. Die Platten können zur Einstellung eines Interferenzstreifenmusters oder zur parallelen Ausrichtung der Wellenfronten dienen, und ebenso wie alle andere optischen Element motorisiert sein für eine automatische Justage und automatisierte Messung.

Die beschriebene Anordnung der Figur 1 kann wie folgt eingesetzt werden:

Die bevorzugt kohärenten, jedoch durch Auswahl des Strahlteilers 3 unpolarisierten Objekt- und Referenzwelle Il und III überlagern sich und erzeugen durch Interferenz ein Interferenzmuster, insbesondere welches bei ebener Wellenfront so eingestellt werden kann durch Phasenschiebung am Element 6,

dass das Hintergrundlicht sich auslöscht. So kann ein hoher Interferenzkontrast erzeugt werden.

Phasenretardierungen in der Objektwelle II, hervorgerufen durch die Verteilung der optischen Dichte in dem zu beobachtenden Objekt 8 der Probe, erzeugen im Interferenzbild Helligkeitsunterschiede bzw. bei thermischer nicht oder weniger kohärenter Beleuchtung, insbesondere mit höherer Bandbreite charakteristische Interferenzfarben. Ein Objekt unterschiedlicher optischer Dichte (Phasenobjekt) kann auf diese Weise starken Kontrast erzeugen durch ein helles Bild vor dunklem Hintergrund. Hierbei ist vorteilhaft, dass das Objekt nicht einmal vollständig fokussiert sein muss, da die Interferenz auch ohne scharfe Objektabbildung in der Bildebene des Detektors entsteht.

Durch Polarisation von Objektwelle Il und Referenzwelle III kann bei der überlagerung nach der Strahlzusammenführung 3 z.B. zirkulär, (bzw. linear) polarisiertes Licht erzeugt werden, welches durch die Analysatoranorndung 13/4 geblock werden kann, so dass kein Signal am Detektor bzw. nur ein dunkeles Bild an der Kamera entsteht. Alle Strukturen in der Objekt-Probe, die die Polarisation des Objektstrahles Il drehen oder die entsprechende E-Feldkomponente verkleinern, sorgen für eine Abweichung aus der ungestörten zirkulären (oder linearen) Polarisation nach der überlagerung der Teilstrahlen. Diese gestörten Anteile der Welle können den Analysator 13/4 passieren und erzeugen ein Signal auf dem Detektor oder der Kamera.

Um alle Strukturen, deren Ausrichtungen statistisch in der Objekt-Probe verteilt sein können, polarisationsoptisch zu erfassen, ist es bevorzugt vorgesehen die Rotation der Polarisation der eingestrahlten Objektwelle Il stufenweise oder kontinuierlich zwischen 0° und 90° zu drehen. Unabhängig von der Lage der Struktur wird es somit eine Einstellung geben, in der diese Struktur ein Signal erzeugt, sofern sie polarisationsdrehend wirkt. Hierbei kann es vorgesehen sein, dass simultan mit einer änderung der Polarisation in der Objektwelle Il auch die Polarisation in der Referenzwelle III gedreht wird, um zu gewährleisten, dass diese Polarisationen immer senkrecht zueinander stehen und immer nach der

überlagerung zirkulär polarisiertes Licht entsteht. Hierzu können die Elemente 4 zur Polarisationsdrehung in den Interferometerarmen wirkverbunden sein, z.B. durch ein 1 :1 Getriebe.

Um den Kontrast der durch die änderung der Polarisation entsteht von dem Kontrast der durch Phasenretardierung entsteht, unterscheiden zu können, ist die Aufnahme einer Bilderserie erforderlich, bei der in jedem Bild eine andere Einstellung der relativen Phase und der relativen Polarisation vorgenommen wird. Durch Vergleich können die Kontrastarten unter Kenntnis der eingestellten Parameter unterschieden und insbesondere unterschiedlich im Bild eingezeichnet werden. Sind alle polarisierenden Strukturen und Brechungsindizes und Phasengrenzen mit einer Bilderserie erfasst, kann ein vollständiges Bild zusammengestellt werden, in welchem Brechungsindizes, Grenzen von Bereichen unterschiedlicher Dichte, gerichtete Strukturen, und Konzentrationen von optisch aktiven Substanzen deutlich und kontrastreich zu erkennen sind.

So liefert eine erfindungsgemäße Anordnung der beschriebenen Art die Möglichkeit ohne vorherige Manipulation an der Objektprobe verschiedenste Kontrast-Arten aufzunehmen, voneinander zu unterscheiden und in aufgenommenen Bilderserien unterschiedlich darzustellen, da mit ein und demselben Aufbau sowohl Polarisationseffekte als auch Phaseneffekte ausgemessen werden können.

Bei einer Ausfilterung der zirkulären Polarisation kann es auch vorgesehen sein, die Polarisation der Objektwelle Il und Referenzwelle III so einzustellen, dass die überlagerung eine bestimmte bekannte elliptische Polarisation bildet. Bereiche im Objekt, die eine eingestellte elliptische Polarisation exakt in die zirkuläre Polarisation zurückdrehen, erzeugen dann ein Minimum im Signal. So kann auf einfache Weise festgestellt werden, um welchen Betrag der untersuchte Objektbereich die Polarisation dreht.

Z.B. mit der zu Figur 1 beschriebenen Anordnung kann auch eine Automatische Detektion von Objekten aufgrund des Interferenzkontrast erfolgen. Bei paralleler

Ausrichtung der unpolarisierten Wellen Il und III nach der überlagerung, ist der Helligkeitsunterschied im Bild, zwischen Probe und deren Umgebung so groß, daß er für eine automatische Erkennung genutzt werden kann. Mit einem Videosystem können so z.B. in der Objektprobe mobile Zellen erfasst und durch Rückkoppelung mit einem motorisierten Objektträger, bzw. Objektmanipulator oder Probenteller im Sehfeld behalten werden.

Es kann ebenso das Probenvolumen z.B. von Mikrotiterplatten automatisch daraufhin untersucht werden, ob ein Objekt im Probenvolumen enthalten ist oder nicht. Z.B. Zellen können automatisch gefunden werden, da der erzeugte Gangunterschied das Interferenzstreifenmuster auslenkt. So kann die Probe in der x-y-Ebene gefunden werden. Durch Verfahren der z-Achse bei parallelen Wellenfronten der Teilstrahlen Il und III kann die Fokusebene gefunden werden, indem nach dem größten Kontrast gesucht wird. Also der größten hellen Fläche vor einem dunklen Hintergrund, oder umgekehrt. Oder es wird die Grenze zwischen hellem und dunklem Gebiet mit dem steilsten Intensitätsanstieg gesucht, was automatisch erfolgen kann, z.B. durch eine Bildverarbeitung, beispielsweise softwaretechnisch.

Bei kohärenter Beleuchtung kann nach Aufnehmen einer Bilderserie und einem Durchstimmen der Phase durch Bildanalyse und eine mathematische Rücktransformation des Beugungsbildes aus dem Fourier- in den Realraum die relative Lage und Größe der beugenden Strukturen in drei Richtungen rekonstruiert werden.

Alle Freiheitsgrade zur Ausrichtung der Wellenfronten zueinander, zum Durchstimmen der relativen Phase der Teilstrahlen und zur Rotation der Polarisationsrichtung können bevorzugt motorisiert sein. Das Interferometer kann so mechanische und thermische Einflüsse ggfs. automatisch kompensieren und eine Justage beibehalten. Zur Aufnahme von Bilderserien werden die optischen Komponenten zur Phasenanpassung, z.B. ein Keilkompensator und zur Polarisationsdrehung beispielsweise softwaremäßig in definierte Positionen gedreht und es kann dann von jeder entsprechenden Position ein Bild erzeugt

werden. Die Software enthält darüber hinaus den Algorithmus zur Aufschlüsselung der Bildinformation in Phasen und Polarisationskontrast, wobei es vorgesehen sein kann, dass die Software die Bilder optimiert zusammensetzt.

Die Figur 2 zeigt eine Alternative, bei der die Referenzmikroskopanordnung im Teilstrahl III in Entfall gekommen ist. Um hier Einflüsse in den Bildserien durch die Mikroskopoptik auszuschließen kann es vorgesehen sein, zunächst von einer Einfügung eines Objektes in das Mikroskop wenigstens ein Nullbild aufzunehmen und diese später von den aufgenommenen Bildern zu subtrahieren.

Die Figur 3 zeigt eine alternative Anordnung eines erfindungsgemäßen Mikroskops, bei dem die Mikroskopoptik ausserhalb des Interferometers angeordnet ist. Ansonsten sind oder können alle anderen Komponenten und deren Ausgestaltung, die zur Figur 1 beschrieben wurden, auch bei dieser Ausführung vorgesehen sein. Die zur Durchführung mikroskopischer Untersuchungen genannten Verfahrensmöglichkeiten, d.h. insbesondere die Interferenz-Kontrast-Mikroskopie mit unpolarisiertem Licht im Interferometer und die Polarisations-Kontrast-Mikroskopie mit polarisiertem Licht können hier genauso durchgeführt werden.

Die Figur 4 zeigt eine Abwandlung der Ausführung nach Figur 2. Auch hier sind oder können. alle zu den Figuren 1 oder 2 genannten Merkmale realisiert sein. Die Ausführung nach Figur 3 unterscheide sich von der Figur 2 dadurch, dass der Teilstrahl Il bei der Zusammenführung mit dem Teilstrahl III im Element 3 nicht parallel zueinander, sondern unter einem Winkel zueinander verlaufen.

Hierdurch ergibt sich in der Ebene des zu beobachtenden Objektes 8 ein Strahlversatz zwischen den Teilstrahlen Il und III, so dass diese unterschiedliche nebeneinanderliegende Bereich des Objektes 8 durchleuchten. Beide Teilstrahlen werden also in dem Objekt unterschiedlich hinsichtlich Phasenschiebung oder Polarisationsdrehung beeinflusst. Zwischen der Mikroskopoptik 10,11 und der Kameraoptik 12,14 kann sodann ein optisches Element 18 vorgesehen sein, mit

dem der einjustierte Strahlversatz, bzw. der eingestellte Winkel zwischen den Teilstrahlen Il und III kompensiert wird, so dass die Teilstrahlen nach dem Element 18 parallel zueinander verlaufen und übereinander liegen.

Bei dem Element 18 kann es sich z.B. um ein Wollaston- oder Nomarski-Prisma handeln, welche die lateral versetzten Teilstrahlen zusammenführen können und/oder die Polarisationsrichtungen gleich zueinander ausrichten.

Mit dieser Anordnung kann ein Differential-Interferenz-Kontrast-Mikroskop realisiert werden, bei welchem wiederum ohne Manipulation an der Objektprobe gleichzeitig Messungen zu unterschiedlichen Phasen und Polarisationen durchgeführt werden können, wie auch bei den anderen möglichen Ausführungen, insbesondere so, wie es dort bereits beschrieben wurde. Auch hier wird ein Keilkompensator oder ein anderes Element 6 zur Phasenschiebung eingesetzt, um Polarisationskontrast vom Phasenkontrast in den aufgenommenen Bilder oder gemessenen Daten unterscheiden zu können.

Um bei der Justage zugehörige Wellenanteile miteinander zu überlagern, insbesondere die Winkeleinstellung zwischen den Teilstrahlen Il und III an den Versatz anzupassen, der durch das Element 18 erzeugt wird, kann es vorgesehen sein, ein Maske 17, z.B. ein optisches Gitter 17 vor dem Eingang in das Interferometer vorzusehen. So werden beide Teilstrahlen mit dem Muster der Maske über den Querschnitt intensitätsmoduliert und es besteht die Möglichkeit die Teilstrahlen exakt zu justieren, z.B. durch Verkippung des Element 5 im unteren Interferometerarm, wenn die Muster der beiden Teilstrahlen nach dem Element 18 exakt zur Deckung kommen.

Die Figur 5 zeigt zur Verdeutlichung die Unterschiede zwischen üblicher Amplituden-Kontrast-Mikroskopie und der Interferenz-Mikroskopie nach der Erfindung.

Erkennbar ist in der linken oberen Darstellung der Figur 4 ein Mausfibroblast in normaler Durchlicht-Amplitudenmikroskopie. Die Darstellung zeigt wenig Kontrast und die Zellstrukturen sind somit nur ungenau zu erkennen. Aufnahmen mit der

erfindungsgemäßen Anordnung und dem erfindungsgemäßen Verfahren zeigen die Bilder mittig und rechts in nullter Interferenzordnung, in der Phase zwischen den beiden Bildern um Pi verschoben.

Deutlich ist im mittleren Bild ein heller Zellbereich und im rechten Bild derselbe Zellbereich in dunkler Darstellung zu erkennen, der einen optisch aktiven Bereich kennzeichnet, der also entweder polarisationsdrehend oder phasenschiebend wirkt, so dass weitere Rückschlüsse auf diesen Bereich gezogen werden können, die sich aus der reinen Amplituden-Kontrast-Mikroskopie nicht ergeben.