Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mikroskop, insbesondere zur evaneszenten Beleuchtung einer Probe, mit einer Lichtquelle, einem im Beleuchtungsstrahlengang angeordneten x-y-Scanner und einem Objektiv, wobei sowohl Beleuchtungslicht als auch Detektionslicht durch das Objektiv geführt werden, wobei das einfallende Beleuchtungslicht in der Ebene der Objektivpupille einen Fokus aufweist, wobei die Objektivpupille im Verlauf des Scannens durch Aneinanderreihung einzelner Beleuchtungspunkte zweidimensional, vorzugsweise ringförmig, beleuchtet wird, und wobei an der Probe oder an einer Probenabdeckung vorzugsweise total reflektiertes Beleuchtungslicht (Reflexionslicht) in den Beleuchtungsstrahlengang zurückkehrt.

Bei der Totalinternen-Reflexions-Mikroskopie wird das Brechungsverhalten von Licht beim Übergang von einem optisch dichteren in ein optisch dünneres Medium genutzt. So ergibt sich beispielsweise für den Übergang von Deckglas (n1=1 ,518) zu Wasser (n2=1 ,33) ein kritischer Winkel von 61 °, der Winkel der Total-Reflexion. Unter den Bedingungen der Total-Reflexion (Winkel >61 °) bildet sich im Medium mit geringerem Brechungsindex eine stehende evaneszente Welle. Die Intensität dieser Well fällt exponentiell mit dem Abstand zur Grenzfläche ab. Aufgrund dessen werden von der Grenzfläche weiter entfernte Fluorophore nicht angeregt. Die Hintergrundfluoreszenz wird erheblich reduziert. Der Bildkontrast wird dabei verbessert und die Auflösung wird gleichzeitig deutlich gesteigert. Voraussetzung für die Nutzung des voranstehend geschilderten Phänomens ist ein ausreichend großer Unterschied der Brechungsindizes von Deckglas und Medium.

Aus der US 2002/0097489 A1 ist bereits ein Mikroskop mit evaneszenter Beleuchtung einer Probe bekannt. Das Mikroskop beinhaltet eine Weißlichtquelle, deren Licht über eine Schlitzblende durch das Mikroskopobjektiv hindurch in den eine Probe tragenden Objektträger zur evaneszenten Beleuchtung eingekoppelt wird. Das Beleuchtungslicht pflanzt sich in dem Objektträger durch totalinterne Reflektion fort, wobei die Beleuchtung der Probe nur im Bereich des aus dem Objektträger herausragenden evaneszenten Feldes erfolgt. Mikroskope dieser Art sind unter dem Begriff TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescent Microscope) bekannt. Die z-Auflösung

von TIRF-Mikroskopen ist aufgrund des nur ca. 100 nm in die Probe ragenden evaneszenten Feldes außerordentlich gut.

Aus der DE 101 08 796 A1 ist ein hochaperturiges Objektiv, insbesondere für TIRF- Anwendungen, bekannt. Das Objektiv besteht aus einer ersten Linse mit einer positiven Brechkraft, einer zweiten Linse mit negativer Brechkraft, wobei das Brennweitenverhältnis zwischen den beiden Linsen im Bereich von - 0,4 und - 0,1 liegt und die Gesamtbrech kraft größer Null ist. Ferner beinhaltet das Objektiv zwei positive Linsen, deren Verhältnisdurchmesser zur Brennweite größer 0,3 und kleiner 0,6 ist. Ferner beinhaltet das Objektiv eine Negativlinse und einer Sammellinse, wobei die Negativlinse der Frontgruppe zugewandt ist und das Brennweitenverhältnis der Negativlinse und der Sammellinse zwischen - 0,5 und - 2 liegt.

Aus der DE 102 17 098 A1 ist eine Auflichtbeleuchtungsanordnung für die TIRF- Mikroskopie bekannt. Die Auflichtbeleuchtungsanordnung beinhaltet eine Beleuchtungsquelle, die im Betrieb ein polarisiertes Beleuchtungsstrahlenbündel abgibt, das unter einem Winkel zur optischen Achse propagiert und eine Umlenkeinrichtung, die das Beleuchtungsstrahlenbündel umlenkt und parallel zur optischen Achse in das Objektiv einkoppelt. Es ist bei dieser Auflichtbeleuchtungsanordnung vorgesehen, dass das von der Beleuchtungsquelle abgegebene Beleuchtungsstrahlenbündel s- und p-Polarisationsrichtungen mit einer Phasendifferenz aufweist und die Umlenkeinrichtung das Beleuchtungsstrahlenbündel x-mal reflektiert, wobei x = (n x 180 ° - d)/60 °.

Aus der DE 101 43 481 A1 ist ein Mikroskop zur TIRM (Total Internal Reflection Microscopy) bekannt. Das Mikroskop weist ein Mikroskopgehäuse und ein Objektiv auf. Das von einer Beleuchtungseinrichtung ausgehende Beleuchtungslicht kann über einen in das Mikroskopgehäuse einschiebbaren Adapter eingekoppelt werden.

Aus der US 2004/0001253 A1 ist ein Mikroskop mit einem optischen Beleuchtungssystem, das ein einfaches Umschalten zwischen evaneszenter Beleuchtung und Reflektionsbeleuchtung ermöglicht. Das Beleuchtungssystem beinhaltet eine Laserlichtquelle, deren Licht in eine optische Faser eingekoppelt wird. Ferner ist eine Auskoppeloptik vorgesehen, die das aus der Faser austretende Licht in einen

hinteren Brennpunkt des Mikroskopobjektivs fokussiert. Die optische Faser ist in einer Ebene senkrecht zur optischen Achse des Mikroskopobjektivs verschiebbar.

Aus der DE 102 29 935 A1 ist eine Einrichtung zur Einkopplung von Licht in einem Mikroskop bekannt. Dort wird in der Leuchtfeldblendenebene durch eine als Schieber ausgeführte Lichtleitfaser-Einkopplung Laserlicht auf das Präparat gerichtet. Die Erfindung ist insbesondere für das TIRF-Verfahren geeignet.

In der Rastermikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Detektionslicht, als Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus eines Beleuchtungslichtstrahlenbündels wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Probenebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Detektionslichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet. Speziell in der konfokalen Rastermikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahls in drei Dimensionen abgetastet.

Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende - die sog. Anregungsblende - fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Diese Detektionsanordnung wird Descan- Anordnung genannt. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts mit dem

Fokus des Beleuchtungslichtstrahlenbündels zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt.

Wie bereits zuvor erwähnt, geht es hier um Mikroskope, die sich für TIRF-Unter- suchungen eignen. Dabei wir eine Probe unter sehr flachem Winkel beleuchtet, nämlich zur Erzeugung von Total-Reflexion an der Probenoberfläche, an einem Deckglas oder dergleichen. Im Stand der Technik verwendet man dazu Objektive mit sehr großer Apertur, um große Beleuchtungsaperturen zu ermöglichen. Die Fluoreszenz-Anregung erfolgt über eine Laserlichtquelle, wobei der Laser regelmäßig auf einen Punkt am Pupillenrand des Objektivs abgebildet wird. Aus dem Stand der Technik ist es auch bereits bekannt, zur Fluoreszenz-Anregung Gasentladungs-Lampen zu verwenden. In der Aperturebene des Beleuchtungsstrahlengangs wird dabei eine Ringblende eingebracht, so dass nur der Pupillenrand des Objektivs beleuchtet wird.

Bei der Totalinternen-Reflexions-Mikroskopie ist das total reflektierte Beleuchtungslicht problematisch, da es in den Beleuchtungsstrahlengang zurückkehrt und ohne besondere Maßnahmen in den Detektionsstrahlengang gelangt. Zur Vermeidung von Falschlicht muss es daher ausgekoppelt und absorbiert werden.

Aus der DE 102 58 945 A1 ist für sich gesehen ein TIRF-Mikroskop bekannt, bei dem gemäß dortiger Figur 3 eine Lichtfallenanordnung vorgesehen ist, der das durch Totalreflexion an der Grenzfläche reflektierte Anregungslicht zugeführt wird. Dabei wird reflektiertes Beleuchtungslicht eindimensional beleuchteter Punkte der Objektivaustrittspupille über eine Spiegelanordnung ausgeblendet. Handelt es sich bei dem reflektierten Beleuchtungslicht um ein zweidimensionales Beleuchtungsmuster, ist eine wirksame Ausblendung mit der bekannten Anordnung nicht möglich.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mikroskop der gattungsbildenden Art derart auszugestalten und weiterzubilden, dass bei zweidimensionalem Beleuchtungsmuster Falschlicht im Detektionsstrahlengang weitestgehend vermieden wird.

Das erfindungsgemäße Mikroskop löst die voranstehende Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 1. Danach ist das gattungsbildende Mikroskop dadurch gekennzeichnet, dass im Beleuchtungsstrahlengang der Ausprägung des Reflexionslichts angepasste Mittel zum räumlichen Trennen des Reflexionslichts vom Beleuchtungslicht und zum Ableiten des Reflexionslichts in eine Lichtfalle vorgesehen sind.

In erfindungsgemäßer Weise ist erkannt worden, dass man auch bei zweidimensionalen Beleuchtungsmustern eine Ausblendung des total reflektierten Beleuchtungslichts zur Vermeidung von Fehllicht im Detektionsstrahlengang mit einfachen Mitteln realisieren kann, nämlich dadurch, dass im Beleuchtungsstrahlengang besondere Mittel zum räumlichen Trennen des Reflexionslichts vom Beleuchtungslicht vorgesehen sind. Diese besonderen Mittel sind der Ausprägung des Reflexionslichts angepasst. Mit anderen Worten handelt es sich hier um Mittel, die entsprechend der zweidimensionalen Ausprägung des Reflexionslichts konstruiert sind, so dass die Ausblendung ausschließlich in Bezug auf das konkret ausgebildete Reflexionslicht stattfinden kann. So ist in Bezug auf die die Ausblendung bewerkstelligenden Mittel nicht nur deren exakte Positionierung sondern auch die Form der in Bezug auf die Ausblendung wirksamen Fläche von besonderer Bedeutung.

Wie bereits zuvor ausgeführt, dienen die Mittel zum räumlichen Trennen des Reflexionslichts vom Beleuchtungslicht. Des Weiteren ist eine Lichtfalle vorgesehen, in die das vom Beleuchtungslicht räumlich getrennte Reflexionslicht zur Absorption hineingeleitet wird. So lässt sich wirksam verhindern, dass das Reflexionslicht im Umfange seiner zweidimensionalen Ausprägung als Falschlicht in den Detektionsstrahlengang gelangt und somit die Abbildung bzw. Messung verfälscht.

An dieser Stelle sei angemerkt, dass es sich bei dem erfindungsgemäßen Mikroskop um ein Mikroskop jedweder Bauart handeln kann, wobei es sich dabei insbesondere um ein Mikroskop zur evaneszenten Beleuchtung einer Probe handelt. Dabei wird ein Mikroskopobjektiv evaneszent beleuchtet, nämlich durch eine punktförmige Beleuchtung der Objektivaustrittspupille. Durch einen zweidimensionalen Scanner lassen sich beliebige Punkte in der Objektivpupille ausleuchten. Aufgrund der bei der TIRF-Mikroskopie auftretenden Totalreflexion des Beleuchtungslichts muss das

Reflexionslicht aus dem Beleuchtungsstrahlengang ausgekoppelt und absorbiert werden, damit kein Falschlicht in den Detektionsstrahlengang gelangen kann. Mit bisher bekannten Mitteln war dies äußerst aufwendig oder unmöglich, da nämlich die evaneszente Beleuchtung ein meist ringförmiges Beleuchtungsmuster in der Objektivaustrittspupille aufweist. So geht es hier in erster Linie um das Ausblenden und um die Absorption zweidimensionaler Beleuchtungsmuster, insbesondere bei der TIRF-Mikroskopie.

In konstruktiver Hinsicht ist es von Vorteil, wenn die Mittel zum räumlichen Trennen des Reflexionslichts vom Beleuchtungslicht bereits vorhandene Bauteile umfassen, nämlich den x-y-Scanner. Dieser x-y-Scanner dient nämlich über seine eigentliche Scanfunktion hinaus dazu, das an der optischen Achse gespiegelte Reflexionslicht mit einem Winkelversatz gegenüber dem Beleuchtungslicht in einen Reflexionsstrahlengang abzulenken, so dass das Reflexionslicht vom einfallenden Beleuchtungslicht getrennt ist.

Zur Funktionsweise des Mikroskops sei an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass als Lichtquelle meist eine Laserlichtquelle dient, wobei das Licht mittels Lichtleitfaser in das Mikroskop eingekoppelt wird. Der an der Faser austretende Strahl hat typischerweise eine sehr kleine numerische Apertur, so in etwa im Bereich von 0,08. Üblicherweise wird das divergente Licht kollimiert und trifft als Parallelstrahl auf den Scanner, der üblicherweise in einer konjugierten Ebene zum Objekt angeordnet ist. Im weiteren Verlauf gelangt das Licht in das Objektiv und beleuchtet die Objektivpupille punktförmig, und zwar je nach Stellung des Scanners. Im Bewegungsablauf des Scanners entsteht ein zweidimensionales Beleuchtungsmuster in der Objektivpupille, und zwar entsprechend den Bedürfnissen der TIRF-Mikroskopie. Von dort aus gelangt das Beleuchtungslicht zur Probenoberfläche bzw. zu deren Abdeckung. Nach Totalreflexion an der Probe bzw. an der Objektabdeckung läuft der Strahl an der optischen Achse gespiegelt in den Beleuchtungsstrahlengang zurück. Aufgrund der Ablenkung durch den x-y-Scanner erhält der Reflexionslichtstrahl bzw. der daraus gebildete Reflexionsstrahlengang einen Winkelversatz gegenüber dem einfallenden Beleuchtungslicht, so dass der x-y-Scanner als Bestandteil der zum räumlichen Trennen des Reflexionslichts vom Beleuchtungslicht dienenden Mittel betrachtet werden kann.

Des Weiteren ist es von Vorteil, wenn in dem vom Beleuchtungsstrahlengang abgewinkelten Reflexionsstrahlengang eine der zweidimensionalen Ausprägung des Reflexionslichts angepassten Ablenkeinrichtung für das Reflexionslicht vorgesehen ist. Bei der Ablenkeinrichtung kann es sich um einen Spiegel handeln. Sofern das Reflexionslicht - entsprechend der Prägung des Beleuchtungslichts - eine ringförmige Anordnung der einzelnen Beleuchtungspunkte aufweist, könnte die Ablenkeinrichtung entsprechend als Ringspiegel ausgeführt sein, nämlich exakt im Reflexionsstrahlengang angeordnet und auf die Ausprägung des Reflexionslichts abgestimmt.

Zur Realisierung einer hinreichend großen Ablenkeinrichtung, die zur weiterreichenden Ablenkung des Reflexionslichts geeignet ist, ist es von weiterem Vorteil, wenn die Ablenkeinrichtung möglichst weit von dem x-y-Scanner entfernt angeordnet ist, damit nämlich das Reflexionslicht hinreichend weit vom Beleuchtungsstrahlengang entfernt ist, nämlich unter Zugrundelegung des durch den x-y-Scanner erzielten Winkelversatzes des Reflexionslichts in Bezug auf das Beleuchtungslicht.

Zuvor ist bereit erwähnt worden, dass sich als Lichtquelle ganz besonders eine Laserlichtquelle eignet, deren Licht über eine Lichtleitfaser in den Beleuchtungsstrahlengang eingekoppelt wird. Das aus der Lichtleitfaser austretende Licht ist divergent, so dass der Lichtleitfaser ein Kollimator zur Parallelisierung des Lichts nachgeschaltet ist. Insoweit ist es von Vorteil, wenn die Ablenkeinrichtung nahe des der Lichteinkopplung folgenden Kollimators, nämlich zwischen dem Kollimator und dem x-y-Scanner, angeordnet ist, und zwar möglichst weit vom x-y-Scanner entfernt.

In Bezug auf die Anordnung der Ablenkeinrichtung, so beispielsweise des Spiegels bzw. des Ringspiegels, ist es denkbar, diesen im Rahmen einer alternativen Ausgestaltung nahe der Lichteinkopplung vorzusehen, so beispielsweise nahe dem Faserende einer Lichtleitfaser, die zum Einkoppeln in das Beleuchtungslicht dient. Insoweit ist es möglich, die Ablenkeinrichtung im Bereich des Fokus des Reflexionslichts, d.h. neben der Faser, anzuordnen, wobei an dieser Stelle darauf hingewiesen sei, dass eine solche Anordnung aufgrund der Nähe zur Faser und der erforderlichen Rotationssymmetrie schwierig in der Realisierung ist.

Dennoch ist es möglich, die Ablenkeinrichtung nahe der Lichteinkopplung vorzusehen, und zwar insbesondere in einer konjugierten Ebene zur Lichteinkopplung. Im Konkreten kann die Ablenkeinrichtung unmittelbar neben der Lichteinkopplung bzw. dem Faserende angeordnet sein, wobei die Ablenkeinrichtung selbst wiederum an die Faser gekoppelt sein kann oder mit der Faser eine bauliche Einheit bildet. Wesentlich ist dabei, dass die Ablenkeinrichtung möglichst nahe am Austrittsende der Lichtleitfaser zur Wirkung kommt.

In Bezug auf die erfindungsgemäße Lehre ist von Bedeutung, dass das Reflexionslicht eine Prägung wie das Beleuchtungslicht in Bezug auf die räumliche Verteilung der Beleuchtungspunkte aufweist. Entsprechend sind die Ablenkeinrichtung und die Lichtfalle auszubilden, wobei die zuvor erörterte Ablenkeinrichtung selbst als Lichtfalle zur Absorption des Lichts dienen kann. Ebenso ist es möglich, dass der Ablenkeinrichtung die eigentliche Lichtfalle nachgeordnet ist, wobei auch die Lichtfalle eine der Ausprägung des Reflexionslichts angepasste Wirkfläche haben kann. Diese Wirkfläche kann entsprechend der Ausgestaltung der Ablenkeinrichtung ringförmig ausgebildet sein, wobei eine solche Vorkehrung nicht zwingend erforderlich ist, sofern eine hinreichend gute Ausblendung des Reflexionslichts aus dem Beleuchtungsstrahlengang mittels der Ablenkeinrichtung bereits stattgefunden hat.

Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die dem Patentanspruch 1 nachgeordneten Patentansprüche und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung eines bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung des bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigt

die einzige Fig. in einer schematischen Ansicht den prinzipiellen Verlauf des Beleuchtungslichts und des Reflexionslichts bis hin zu einer Lichtfalle.

Die einzige Figur zeigt den Beleuchtungsstrahlengang 1 und den Reflexionsstrahlengang 2 in einem Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops.

Im Konkreten wird das Beleuchtungslicht 7 über eine Laserlichtquelle 3 zur Verfügung gestellt, wobei das Licht über eine Lichtleitfaser 4 in den Beleuchtungsstrahlengang 1 eingekoppelt wird. Das Beleuchtungslicht 7 tritt am Lichtaustritt 5 der Lichtleitfaser 4 in zunächst divergenter Form aus und wird mittels Kollimator 6 kollimiert bzw. parallelisiert. Das Beleuchtungslicht 7 gelangt parallel zu einem x-y-Scanner 8, der in einer konjugierten Ebene zu einem in der Figur nicht gezeigten Objekt angeordnet ist.

Im weiteren Verlauf wird die in der Figur nicht gezeigte Objektivpupille punktförmig beleuchtet, wobei sich aufgrund der Scannbewegung des x-y-Scanners 8 ein zweidimensionales Beleuchtungsmuster zur TIRF-Beleuchtung ergibt.

Nach Totalreflexion am Objekt bzw. an der Objektabdeckung läuft das totalreflektierte Reflexionslicht 9 zurück in den Beleuchtungsstahlengang 1 bis hin zum x- y-Scanner 8, wobei das Reflexionslicht 9 an der optischen Achse gespiegelt ist.

Das Reflexionslicht 9 kehrt somit in den Beleuchtungsstrahlengang 1 zurück. Aufgrund der Ablenkung durch den x-y-Scanner 8 erfährt das Reflexionslicht 9 einen durch den Pfeil 10 angedeuteten Winkelversatz gegenüber dem einfallenden Beleuchtungslicht 7.

Nahe dem Kollimator 6 ist ein Ringspiegel 11 angeordnet, der derart dimensioniert und positioniert ist, dass er jeden reflektierten Beleuchtungspunkt des Reflexionslichts 9 aufnimmt und ihn über den Reflexionsstrahlengang 2 zu einer Lichtfalle 12 leitet. Dort wird das Reflexionslicht 9 absorbiert, nachdem es von dem Beleuchtungsstrahlengang 1 abgelenkt worden ist.

In Bezug auf weitere vorteilhafte Ausgestaltungen, die sich der einzigen Figur nicht entnehmen lassen, sei zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil der Beschreibung verwiesen.

Schließlich sei angemerkt, dass das voranstehend beschriebene Ausführungsbeispiel der Erörterung der erfindungsgemäßen Lehre dient, diese jedoch nicht auf das Ausführungsbeispiel einschränkt.