Die Erfindung betrifft ein Mikroskopierverfahren zur Ermittlung eines Kontrastbildes gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 sowie ein Mikroskop gemäß dem

Oberbegriff des Anspruchs 8.

Um insbesondere in der Lichtmikroskopie kontrastarme Objekte abbilden zu können, werden beispielsweise das Phasenkontrastverfahren oder das Verfahren des Differentiellen Interferenzkontrasts (DIC) verwendet. Diese erfordern die Anordnung zweier kostenintensiver Wollaston- oder Nomarski-Prismen sowie zweier

Polarisatoren im Strahlengang. Zudem müssen mehrere optische Elemente sowohl in den Beleuchtungs- als auch in den Abbildungsstrahlengang eingebracht werden, wodurch eine flexible Verwendbarkeit eines solchen Mikroskops in Kombination mit anderen Verfahren wie der Fluoreszenzmikroskopie erschwert ist.

Aus der EP 2 645 146 B1 ist ein Verfahren zur Bildaufnahme mit einem

Lichtmikroskop bekannt, bei dem Beleuchtungslicht auf eine Probe geleitet und eine Blende zum Beschneiden des Beleuchtungslichts in einen Strahlengang des

Beleuchtungslichts gebracht wird. In einer ersten Blendeneinstellung wird ein Anteil der Querschnittsfläche des Strahlengangs abgedeckt, in einer zweiten

Blendeneinstellung ein zweiter Anteil. Mit jeder der Blendeneinstellungen wird ein Bild aufgenommen und die Bilder zur Erstellung eines Kontrastbildes miteinander verrechnet. Dabei dient das Verfahren dazu, durch Wände eines die Probe beinhaltenden Probengefäßes bedingte Einschränkungen eines

Querschnittsbereichs des Beleuchtungslichts auszugleichen. Die Blenden sind in den Strahlengang mittels eines Blendenmotors einschwenkbar. In der EP 2 645 146 B1 ist zudem ein Lichtmikroskop offenbart, das zur Durchführung des Verfahrens ausgebildet ist und in den Strahlengang einschwenkbare Blenden aufweist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde ein gegenüber dem Stand der Technik verbessertes Mikroskopierverfahren vorzuschlagen. Der Erfindung liegt ferner die Aufgabe zugrunde ein gegenüber dem Stand der Technik verbessertes Mikroskop vorzuschlagen. Die Aufgabe wird hinsichtlich des Mikroskopierverfahrens durch die Merkmale des unabhängigen Anspruchs 1 gelöst. Hinsichtlich des Mikroskops wird die Aufgabe durch die Merkmale des unabhängigen Anspruchs 8 gelöst.

Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche. Bei dem Mikroskopierverfahren wird eine Beleuchtungsstrahlung auf ein in einer Objektebene eines Mikroskops angeordnetes Objekt gerichtet, um das Objekt mittels einer aus der Objektebene erhaltenen Objektstrahlung abzubilden. Dabei werden mit einer ersten Konfiguration des Mikroskops Bilddaten eines ersten Bildes des

Objektes und mit einer zweiten Konfiguration des Mikroskops Bilddaten eines zweiten Bildes des Objektes erfasst und Unterschiede zwischen den Bilddaten des ersten und des zweiten Bildes ermittelt. In Abhängigkeit der ermittelten Unterschiede, beispielsweise von Differenzen, werden Bilddaten eines Kontrastbilds des Objekts bereitgestellt.

Gekennzeichnet ist ein erfindungsgemäßes Mikroskopierverfahren dadurch, dass in der ersten Konfiguration in einer Pupille des Mikroskops eine Phasenmaske angeordnet ist, die einen optischen Gradienten quer zur optischen Achse des

Mikroskops aufweist. Durch Wirkung der Phasenmaske ist ein Phasengradient der Objektstrahlung erzeugt oder erzeugbar. In der zweiten Konfiguration ist die

Phasenmaske aus der Pupille entfernt. Das erfindungsgemäße

Mikroskopierverfahren wird also mit der ersten und der zweiten Konfiguration des Mikroskops durchgeführt.

Die Objektstrahlung kann durch Wirkung der Phasenmaske hinsichtlich ihrer Phase und/oder ihrer Amplitude verändert werden oder verändert sein, was vereinfachend unter dem Begriff des Phasengradienten zusammengefasst wird.

Unter der Objektstrahlung werden sowohl ein durch das Objekt getretener Anteil der Beleuchtungsstrahlung, der mit dem Objekt interagiert hat und durch das Objekt gegebenenfalls verändert wurde, als auch ein nicht durch das Objekt getretener, aber aus der Objektebene erhaltener, Anteil der Beleuchtungsstrahlung verstanden. Die Objektstrahlung ist aus der Objektebene erhaltene, beispielsweise erfasste und/oder gesammelte, Beleuchtungsstrahlung. Das Mikroskopierverfahren ist insbesondere ein Durchhchtmikroskopierverfahren, bei dem wenigstens ein Anteil der Beleuchtungsstrahlung durch das Objekt tritt und als Objektstrahlung erfasst wird.

Das Objekt ist beispielsweise eine Probe in Form eines biologischen Präparats, beispielsweise eines Gewebes, einer Zelle und/oder eines Zellorganells.

Die Objektstrahlung kann einen Phasengradienten aufweisen, wenn das Objekt selbst einen optischen Gradienten aufweist beziehungsweise durch dessen

Abmessungen, lokale Phasenunterschiede, Brechungsindexänderungen und/oder stoffliche Zusammensetzung ein optischer Gradient des Objekts bewirkt ist. Die Bilddaten werden vorzugsweise ortsaufgelöst erfasst, indem diese jeweils einem Punkt und/oder einem Bereich der Objektebene zugeordnet oder zuordenbar sind. Die einzelnen Bilddaten können als Bildelemente (Pixel, picture elements) eines Bildes beispielsweise auf einer Anzeige dargestellt werden.

In der Pupille des Mikroskops liegt eine Fourier-Transformierte eines Bildes der Objektebene vor.

Die Phasenmaske ist ein optisches Element, durch dessen Wirkung die Phase und/oder die Amplitude der durch die Phasenmaske hindurchtretenden Strahlung, insbesondere der Objektstrahlung, verändert wird beziehungsweise veränderbar ist.

Der optische Gradient der Phasenmaske ist beispielsweise dadurch ausgebildet, dass die Phasenmaske insbesondere quer zur optischen Achse eine sich

verändernde Dicke und/oder einen sich verändernden Brechungsindex aufweist. Die Dicke kann sich dabei tatsächlich ändern, beispielsweise zu- oder abnehmen. Sie kann sich in weiteren Ausführungen auch im Sinne beispielsweise einer zu- oder abnehmenden optischen Dicke verändern. Durch Wirkung der Phasenmaske, insbesondere durch Wirkung des optischen

Gradienten der Phasenmaske, ist ein Phasengradient der die Phasenmaske durchlaufenden Objektstrahlung erzeugt oder erzeugbar. Die durch die

Phasenmaske im Bereich des optischen Gradienten durchgetretene Objektstrahlung weist mindestens in einer Richtung quer zur optischen Achse einen Gradienten seiner Phase und/oder Amplitude (Phasengradienten) auf. ln der zweiten Konfiguration des Mikroskops ist die Phasenmaske aus der Pupille entfernt. Dabei kann die Phasenmaske tatsächlich, physisch entfernt sein oder die optische Wirkung der Phasenmaske ist, zumindest bezüglich der Objektstrahlung, aufgehoben. Mit der zweiten Konfiguration des Mikroskops werden Bilddaten eines Weitfeldbilds erfasst. Diese Bilddaten können mit den Bilddaten, die den durch die Phasenmaske bedingten Phasengradienten beinhalten, verglichen und die Unterschiede ermittelt werden. Das Weitfeldbild wird dabei als Referenz für ein unbeeinflusstes Bild beziehungsweise für unbeeinflusste Bilddaten verwendet. Die Unterschiede zwischen den Bilddaten können als Differenzen ermittelt werden. Sie können in weiteren Ausgestaltungen auch als relative Unterschiede in Form von Verhältnissen oder Prozenten ermittelt werden. Weiterhin ist es möglich, dass die Unterschiede in einer anderen für die Anwendung des erfindungsgemäßen

Mikroskopierverfahrens geeigneten Form ermittelt werden. Um Absorptionsverluste auszugleichen, werden in einer weiteren Ausgestaltung des Mikroskopierverfahrens die Bilddaten der ersten und zweiten Bilder normiert und/oder skaliert. Dabei werden beispielsweise in der Phasenmaske auftretende Absorptionsverluste ausgegl ichen .

In einer weiteren Ausgestaltung des Mikroskopierverfahrens wird in Abhängigkeit der ermittelten Differenzen der Bilddaten ein inverses Kontrastbild erzeugt, insbesondere berechnet. Bei einem inversen Kontrastbild sind die Hell-Dunkel-Verteilungen gegenüber einem Kontrastbild umgekehrt dargestellt.

Der optische Gradient der Phasenmaske wird vorteilhaft in Abhängigkeit optischer Eigenschaften des Objekts und/oder des optischen Systems ausgewählt, wodurch eine der vorgesehenen Anwendung entsprechende Qualität des Kontrastbildes erreicht werden kann.

Es ist in weiteren Ausgestaltungen des Mikroskopierverfahrens möglich, dass Bilddaten mehrerer erster und/oder zweiter Bilder erfasst werden. Zur Ermittlung der Unterschiede können ausgewählte erste und zweite Bilder verwendet werden. Es ist auch möglich, die ersten und/oder zweiten Bilder vor der Ermittlung der Unterschiede zu korrigieren, beispielsweise Intensitätsüberhöhungen zu dämpfen oder Bilder zu verwerfen.

Das erfindungsgemäße Mikroskopierverfahren kann vorteilhaft mit weiteren

Abbildungsverfahren, insbesondere mit weiteren Mikroskopierverfahren, kombiniert werden. In einer vorteilhaften Ausgestaltung erfolgen die Erfassungen der Bilddaten mittels der ersten und der zweiten Konfiguration im Wechsel mit einer Anzahl von Erfassungsvorgängen, die mit einer dritten Konfiguration des Mikroskops

durchgeführt werden. Eine solche dritte Konfiguration des Mikroskops ist

beispielsweise eine Fluoreszenzerfassung und/oder ein Erfassungsvorgang, bei dem kein Durchlicht erfasst wird.

Das Mikroskopierverfahren kann in einer möglichen Ausgestaltung dazu verwendet werden, um in Abhängigkeit der Bilddaten des Kontrastbilds eine Zustandsanalyse des Objekts durchzuführen. Dazu wird mindestens eine Teilmenge der Bilddaten des Kontrastbilds mit Soll-Daten verglichen. Der Vorgang des Vergleichens wird vorzugsweise automatisch ausgeführt und kann beispielsweise durch ein

Einblenden, ein Überblenden und/oder ein Anzeigen der Soll-Daten auf einer Anzeige, vorzugsweise zusammen mit erfassten Ist-Daten, erfolgen. Ein Vergleich der Soll- mit den Ist-Daten ist visuell möglich, kann aber auch durch Vergleich und die Bewertung der Abweichungen der Soll-Daten und der Ist-Daten automatisiert unter Verwendung eines geeigneten Algorithmus erfolgen.

Eine solche Zustandsanalyse kann vorteilhaft mit der Durchführung des weiteren Abbildungsverfahrens kombiniert werden. Beispielsweise kann nach einer Anzahl von Erfassungsvorgängen mittels der dritten Konfiguration der Zustand des Objekts überprüft werden, indem Bilddaten mittels der ersten und der zweiten Konfiguration erfasst und Bilddaten mindestens eines Kontrastbilds ermittelt werden und das mindestens eine Kontrastbild ausgewertet wird.

Wird bei einer solchen Zustandsanalyse beispielsweise eine ungewollte oder zu weit fortgeschrittene Degeneration des Objekts festgestellt, können die nachfolgend mittels der dritten Konfiguration durchzuführenden Erfassungsvorgänge

entsprechend modifiziert oder weitere Erfassungsvorgänge unterbunden werden, um beispielsweise Zeit und Kosten zu sparen. Die Aufgabe wird ferner durch ein Mikroskop gelöst. Das Mikroskop umfasst eine Lichtquelle zur Bereitstellung einer Beleuchtungsstrahlung, einen Kondensor zur Fokussierung der Beleuchtungsstrahlung in einer Objektebene, eine Objektiveinheit zum Sammeln und Abbilden von aus der Objektebene erhaltener Objektstrahlung in Richtung einer optischen Achse des Mikroskops in einer bildseitigen Pupille; eine Abbildungseinheit zur Abbildung der Objektstrahlung in einer Bildebene und einer Erfassungseinheit zur ortsaufgelösten Erfassung von Bilddaten in der Bildebene.

Ein erfindungsgemäßes Mikroskop ist dadurch gekennzeichnet, dass in der Pupille eine Phasenmaske angeordnet ist oder eine zum Zustellen der Phasenmaske in und aus der Pupille ausgebildete Zustellvorrichtung vorhanden ist, wobei die

Phasenmaske mindestens einen optischen Gradienten aufweist, der quer zur optischen Achse ausgebildet ist und durch dessen Wirkung ein Phasengradient der Objektstrahlung erzeugt oder erzeugbar ist.

Die Objektiveinheit und die Abbildungseinheit bestehen jeweils aus mindestens einer optischen Linse.

In einer weiteren möglichen Ausführung des Mikroskops sind mindestens zwei Phasenmasken in einer Wechselvorrichtung gehalten, einzeln auswählbar und mittels der Zustellvorrichtung in die Pupille ein- und ausführbar. Eine solche

Wechselvorrichtung ermöglicht die Auswahl und flexible Nutzung von Phasenmasken unterschiedlich starker optischer Gradienten und/oder unterschiedlicher Richtung(- en) der optischen Gradienten.

Die Phasenmaske ist in weiteren Ausführungen in Teilbereiche geteilt und

mindestens einer der Teilbereiche weist einen gegenüber den anderen Teilbereichen abweichenden Gradienten auf. Die Teilung der Phasenmaske ist vorteilhaft symmetrisch erfolgt. Eine solche Ausführung reduziert die Betonung des

Phasengradienten in einer bestimmten Richtung, wie dies beispielsweise bei dem Verfahren des Differentiellen Interferenzkontrasts, dort auch als„Seher-Richtung" bezeichnet, auftritt.

Die Phasenmaske kann um eine parallel zur optischen Achse verlaufende

Drehachse drehbar sein, wodurch ebenfalls die oben genannten

Richtungsbetonungen des Phasengradienten reduziert oder gar vermieden wird. Eine Halterung der in der Pupille befindlichen Phasenmaske ist dann zur, vorzugsweise gesteuerten, Rotation der Phasenmaske ausgebildet.

Die Phasenmaske ist beispielsweise als ein für die Objektstrahlung transparentes Element wie ein Keil, ein Doppelkeil oder ein anders geformtes Element ausgebildet. In weiteren möglichen Ausführungen des Mikroskops ist die Phasenmaske durch verkippte Spiegelflächen mindestens zweier Spiegel und/oder einen deformierbaren Spiegel gebildet. Sie kann außerdem als ein Flüssigkristallelement oder ein räumlicher Lichtmodulator (spatial light modulator) ausgebildet sein. Der

deformierbare Spiegel, das Flüssigkristallelement beziehungsweise der räumliche Lichtmodulator sind vorteilhaft einstellbar, um unterschiedliche optische Gradienten zu bewirken sowie um ggf. einen gewünschten optischen Gradienten einzustellen oder zu justieren.

Das Mikroskop weist in einer weiteren Ausführung eine Auswerteeinheit zur

Auswertung der durch die Erfassungseinheit erfassten Bilddaten auf, wobei die Auswerteeinheit zur Ermittlung von Unterschieden von Strahlungswerten zwischen mindestens einem mit der in der Pupille angeordneten Phasenmaske erfassten Datensatz und einem ohne der in der Pupille angeordneten Phasenmaske erfassten Referenzdatensatz ausgebildet, insbesondere konfiguriert, ist.

Das erfindungsgemäße Mikroskopierverfahren ist mit wenig Aufwand ausführbar. Zudem ist geräteseitig das Mikroskop nur geringfügig zu modifizieren, da in den

Strahlengang lediglich ein optisches Element, nämlich die Phasenmaske eingebracht beziehungsweise einzubringen ist.

Das Verfahren ist kantenselektiv und ermöglicht eine gegenüber dem Stand der Technik verbesserte Auflösung des Kontrastbildes. Außerdem wird das optische Schneiden (Sectioning) hinsichtlich der erreichbaren Auflösung verbessert.

Die konkrete Positionierung der Phasenmaske relativ zur Pupille kann

toleranzbehaftet sein, ohne die Funktion des Mikroskops und die Ausführbarkeit des Verfahrens merklich zu beeinflussen.

Infolge der Anordnung der Phasenmaske in der Pupille tritt kein Signalverlust auf, wie dies in den Lösungen gemäß dem Stand der Technik nachteilig der Fall ist. So werden bei dem in der der EP 2 645 146 B1 beschriebenen Halbpupillen-Ansatz Anteile des Durchlichts, also der Objektstrahlung, unterdrückt.

Bei der Ausführung des erfindungsgemäßen Mikroskopierverfahrens wird für die Erzeugung der Bilddaten jedes Bildes die gesamte Numerische Apertur genutzt, während bei dem Halbpupillen-Ansatz gemäß dem Stand der Technik lediglich die halbe Numerische Apertur nutzbar ist. Die Auflösung und der Kontrast sind infolge der Nutzung der gesamten Numerischen Apertur besser als mit dem Halbpupillen- Ansatz.

Das erfindungsgemäße Mikroskopierverfahren ermöglicht eine vereinfachte

Visualisierung kontrastarmer Objekte in der Mikroskopie, beispielsweise ergänzend zur Bildgebung mittels eines Fluoreszenzverfahrens. Beispielsweise wird im

Durchlicht das Objekt, z. B. Zellen oder Gewebeschnitte, in seiner Gesamtheit abgebildet und auch dessen Zustand analysiert, da die eigentliche

Fluoreszenzmikroskopie aufgrund der Spezifizität der Färbbarkeit beispielsweise bestimmter Proteine oder Proteinkomplexe hierüber keine Informationen liefert.

Im Gegensatz zum klassischen DIC ist das vorgeschlagene Kontrastverfahren nicht interferenzbasiert. Daraus ergibt sich ein höheres Potential zum optischen

Schneiden, also der Kontrastdarstellung nur aus dem Schärfentiefenbereich des Objektivs. Beim klassischen DIC wird die Phasendifferenz der in Polarisation getrennten Teilstrahlengänge während des gesamten Durchgangs der

Beleuchtungsstrahlung durch das Objekt akkumuliert, wodurch unerwünschte dunkle oder helle Bereiche im Kontrastbild entstehen können.

Beim dem erfindungsgemäßen Mikroskopierverfahren stammt die generierte

Bildinformation im Wesentlichen aus dem Schärfentiefenbereich des verwendeten Objektivs, da die in den ersten Bildern und in den zweiten Bildern enthaltenen

Bilddaten im stark defokussierten Fall nahezu identisch sind.

Das erfindungsgemäße Mikroskopierverfahren, das auch als Phasenmasken- Kontrast-Methode bezeichnet werden kann, eignet sich vor allem zum Abbilden hochfrequenter Phasenänderungen auf kurzen Längenskalen, beispielsweise von Kanten, Umrissen und/oder Filamenten. Dabei werden kurze Längenskalen in der

Objektebene, beispielsweise im Objekt, oder im Zwischenbild infolge der Fourier- Transformation in der Pupille zu hohen Ortsfrequenzen. Die Längenskala, auf der Phasenänderungen überhöht dargestellt werden, hängt bei gegebenem optischen System, beispielsweise der Vergrößerung und der Numerischen Apertur, dabei hauptsächlich vom optischen Gradienten in der Objektivpupille ab und lässt sich damit auch an unterschiedliche Gegebenheiten anpassen.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und Abbildungen näher erläutert. Es zeigen:

eine schematische Darstellung eines zur Erzeugung eines Kontrastbildes geeigneten Mikroskops gemäß dem Stand der Technik, eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops, eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops in einer ersten Konfiguration, eine schematische Darstellung des zweiten Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Mikroskops in einer zweiten Konfiguration, eine schematische Darstellung eines dritten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops, eine schematische Darstellung eines vierten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops, eine schematische Darstellung eines fünften Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops, Fig. 7a eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels

Phasenmaske in der Draufsicht, Fig. 7b eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels einer Phasenmaske in der Draufsicht

Fig. 7c eine schematische Darstellung eines dritten Ausführungsbeispiels einer

Phasenmaske in der Draufsicht

Fig. 7d eine schematische Darstellung eines vierten Ausführungsbeispiels

Phasenmaske in der Draufsicht

Fig. 8a ein mittels eines erfindungsgemäßen Mikroskopierverfahrens

erhaltenen Kontrastbildes von Stärkekörnern einer Kartoffelzelle und

Fig. 8b ein mittels eines Mikroskopierverfahrens gemäß dem Stand der Technik erhaltenen Kontrastbildes der Stärkekörnern. In den Figuren sind gleiche Elemente mit gleichen Bezugszeichen versehen.

Ein gemäß dem Stand der Technik zur Erzeugung eines Kontrastbildes

ausgebildetes Mikroskop 1 ist in der Fig. 1 dargestellt und weist eine Lichtquelle 2 zur Bereitstellung einer Beleuchtungsstrahlung 3, einen Kondensor 4 zur

Fokussierung der Beleuchtungsstrahlung 3 in einer Objektebene 5, eine

Objektiveinheit 6 zum Sammeln und Abbilden von aus der Objektebene 5 erhaltener Objektstrahlung 30 in Richtung einer optischen Achse 7 des Mikroskops 1 in einer bildseitigen Pupille 8; eine Abbildungseinheit 9 zur Abbildung der Objektstrahlung 30 in einer Bildebene 10 und einer Erfassungseinheit 1 1 zur ortsaufgelösten Erfassung von Bilddaten in der Bildebene 10 auf. Die Bilddaten sind durch die

Objektstrahlung 30 infolge des Durchtritts der Beleuchtungsstrahlung 3 durch ein optional in der Objektebene 5 vorhandenes Objekt 12 sowie infolge ihres

Durchgangs durch den Strahlengang des Mikroskops 1 in der Bildebene 10 als Intensitäten bewirkt.

Ein in der Fig. 2 dargestelltes erstes Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops 1 weist die zu Fig. 1 angegebenen technischen Elemente auf. Zusätzlich ist in der Pupille 8 eine Phasenmaske 13 angeordnet. Die Phasenmaske 13 ist als ein Keil aus einem für die Beleuchtungsstrahlung 3 transparenten Material wie zum Beispiel Glas ausgebildet und weist einen optischen Gradienten OG (durch einen Pfeil symbolisiert) auf, der quer zur optischen Achse 7 verläuft und durch die Änderung der Dicke der Phasenmaske 13 bewirkt ist. Die Beleuchtungsstrahlung 3 hat je nach Auftreffort auf der Phasenmaske 13

unterschiedlich lange Wege durch die Phasenmaske 13 zu durchlaufen. Durch Wirkung des optischen Gradienten OG ist ein Phasengradient PG (ebenfalls durch einen Pfeil symbolisiert) der durch die Phasenmaske 13 hindurchgetretenen

Beleuchtungsstrahlung 3 (Objektstrahlung 30) erzeugt oder erzeugbar. Das Mikroskop 1 mit der Phasenmaske 13 in der Pupille 8 stellt eine erste

Konfiguration I des Mikroskops 1 dar.

Die Phasenmaske 13 ist aus dem Strahlengang entfernbar, so dass bei entfernter Phasenmaske 13 eine zweite Konfiguration I I des Mikroskops 1 vorliegt (nicht dargestellt). Um die Phasenmaske 13 in der Pupille 8 in den Strahlengang des Mikroskops 1 einzubringen beziehungsweise aus dem Strahlengang zu entfernen ist in einem zweiten Ausführungsbeispiel des Mikroskops 1 eine Zustellvorrichtung 14 vorhanden, wie dies in den Fig. 3a und 3b dargestellt ist.

Ferner ist eine Wechselvorrichtung 19 vorhanden, in der eine Anzahl von nicht näher dargestellten Phasenmasken 13 gehalten sind beziehungsweise gehalten sein können. Die Phasenmasken 13 sind einzeln auswählbar und eine jeweils

ausgewählte Phasenmaske 13 ist mittels der Zustellvorrichtung 14 in und aus der Pupille 8 bewegbar.

Die Zustellvorrichtung 14 und die Wechselvorrichtung 19 stehen mit einer

Auswerteeinheit 15 in Verbindung und sind durch diese steuerbar.

Die Auswerteeinheit 15 steht zudem mit der Erfassungseinheit 1 1 in Verbindung, um von der Erfassungseinheit 1 1 erfasste Bilddaten Erfassungszeitpunkten und/oder Erfassungszeiträumen zugeordnet zu empfangen.

Die Auswerteeinheit 15 ist derart konfiguriert, dass durch diese

Unterschiede Δ lp, IWF, beispielsweise Differenzen, zwischen Bilddaten verschiedener Bilder ermittelbar sind. Die Bilddaten sind dabei Bilddaten eines ersten Bildes lp, die mit der ersten Konfiguration I (Fig. 3a) des Mikroskops 1 erfasst wurden sowie Bilddaten eines zweiten Bildes IWF, die mit der zweiten Konfiguration II (Fig. 3b) des Mikroskops 1 erfasst wurden. Die Bilddaten des ersten Bildes lp stellen einen erfassten Datensatz von Bilddaten dar, während die Bilddaten des zweiten Bildes IWF als ein Referenzdatensatz nutzbar sind.

Die Auswerteeinheit 15 steht weiterhin mit einer Anzeige 16 in Verbindung, mittels der die Bilddaten des ersten Bildes lp, die Bilddaten des zweiten Bildes IWF und/oder in Abhängigkeit der ermittelten Unterschiede Δ lp, IWF bereitgestellte Bilddaten eines Kontrastbilds IPRK des Objekts 12 angezeigt oder anzeigbar sind.

In der Fig. 3b dargestellten zweiten Konfiguration II ist die Phasenmaske 13 aus dem Strahlengang entfernt und der Wechselvorrichtung 19 zugestellt.

Ein drittes Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Mikroskops 1 ist in der Fig. 4 dargestellt. Die Phasenmaske 13 ist in der Pupille 8 und im Strahlengang angeordnet und verbleibt in der ersten und in der zweiten Konfiguration I, II des Mikroskops 1 dort.

Die Phasenmaske 13 ist durch ein Flüssigkristallelement 17 oder durch einen räumlichen Lichtmodulator 18 realisiert, die jeweils mindestens in einem

Betriebszustand betrieben werden können, in dem diese einen optischen

Gradienten OG quer zur optischen Achse 7 bewirken. Das Flüssigkristallelement 17 beziehungsweise der räumliche Lichtmodulator 18 sind außerdem in einem

Betriebszustand betreibbar, in dem kein optischer Gradient OG bewirkt ist und die Wirkung als Phasenmaske 13 nahezu oder vollständig aufgehoben ist. Die

Phasenmaske 13 ist durch die Auswerteinheit 15 ansteuerbar.

In weiteren möglichen Ausführungen des Mikroskops 1 ist die Phasenmaske 13 durch gegeneinander verkippte Spiegelflächen 20.1 mindestens zweier Spiegel 20 gebildet. In dem Strahlengang des Mikroskops 1 sind weitere Objektive 23

vorhanden, die jeweils aus mindestens einer optischen Linse bestehen. In der Fig. 5 ist eine solche Anordnung als ein viertes Ausführungsbeispiel des Mikroskops 1 dargestellt. In der ersten Konfiguration I gelangt die Objektstrahlung 30 auf die gegeneinander verkippten Spiegelflächen 20.1 der Spiegel 20. Die

Objektstrahlung 30 wird aufgrund der unterschiedlich geneigten Spiegelflächen 20.1 entlang zweier gegeneinander versetzter Strahlengänge zur Abbildungseinheit 9 reflektiert und durch diese als zweite gegeneinander versetzte Teilbilder in der Bildebene 10 und auf der Erfassungseinheit 1 1 abgebildet. Durch die

Erfassungseinheit 1 1 ist das erste Bild lp erfassbar (siehe Fig. 3a, 3b).

Um das zweite Bild IWF (siehe Fig. 3a, 3b) mittels der zweiten Konfiguration II erfassen zu können, sind die Spiegel 20 mit den verkippten Spiegelflächen 20.1 gegen einen Spiegel 20, insbesondere einen planen Spiegel 20, austauschbar (durch einen Doppelpfeil angedeutet dargestellt). Durch den planen Spiegel 20 wird die Objektstrahlung 30 in nur einem Strahlengang zur Abbildungseinheit 9 reflektiert.

In einer alternativen Ausführung sind die Spiegelflächen 20.1 mittels einer

ansteuerbaren Aktorik gegeneinander kippbar. Um das zweite Bild IWF ZU erfassen, sind die Spiegelflächen 20.1 zueinander ausrichtbar, sodass diese beispielsweise in einer gemeinsamen Ebene ausgerichtet sind.

Ein fünftes Ausführungsbeispiel des Mikroskops 1 ist in Fig. 6 mit einem

deformierbaren Spiegel 21 als Phasenmaske 13 in einer Pupille 8 dargestellt. Die Objektstrahlung 30 ist über einen Spiegel 20 und ein weiteres Objektiv 23 auf den deformierbaren Spiegel 21 reflektiert. Je nach Ansteuerungszustand des

deformierbaren Spiegels 21 ist der Strahlengang zwischen diesem und der

Erfassungseinheit 1 1 abgelenkt, so dass mittels der Ansteuerung des deformierbaren Spiegels 21 die erste Konfiguration I, die zweite Konfiguration II oder eine weitere Konfiguration des Mikroskops 1 bewirkbar sind.

Die Phasenmaske 13 ist in möglichen Ausführungen in Teilbereiche 13.1 geteilt, wobei mindestens einer der Teilbereiche 13.1 einen gegenüber den anderen

Teilbereichen 13.1 abweichenden optischen Gradienten OG aufweist.

In den Fig. 7a bis 7d sind symmetrisch geteilte Phasenmasken 13 in der Draufsicht dargestellt. Die Verläufe der optischen Gradienten OG der jeweiligen Teilbereiche 13.1 sind durch Pfeile symbolisiert.

In einer Ausführung der Phasenmaske 13 weist einer der beiden Teilbereiche 13.1 einen optischen Gradienten OG auf (Fig. 7a). Die Phasenmaske 13 wird so in den Strahlengang in der Pupille 8 eingebracht, dass der Strahlengang in der Pupille 8 halb abgedeckt ist.

In einer nicht dargestellten möglichen Ausführung befindet sich in der Mitte der Phasenmaske 13 ein Loch, der von einem Teilbereich 13.1 umfangen ist, der einen optischen Gradienten OG aufweist. Die Fig. 7b zeigt eine Phasenmaske 13 mit gegenläufigen und symmetrisch verlaufenden optischen Gradienten OG. In diesem Fall bleibt der Schwerpunkt der optischen Gradienten OG im ersten Bild relativ zum zweiten Bild beibehalten.

Eine in vier Teilbereiche 13.1 geteilte Phasenmaske 13 ist in der Fig. 7c dargestellt. Die optischen Gradienten OG der jeweils diagonal zueinander angeordneten

Teilbereiche 13.1 verlaufen einander entgegengesetzt. Jeder der optischen

Gradienten OG verläuft außerdem in eine andere Richtung. Durch diese Ausführung der Phasenmaske 13 ist die Bildung des Phasengradienten PG in zwei zueinander orthogonale Richtungen bewirkbar, wodurch die Ausbildung einer„Seher-Richtung", vermieden wird. Dies ist weder für das Halbpupillen-Kontrastverfahren noch für DIC möglich. Die EP 2 645 146 B1 zeigt daher beispielsweise Lösungen für viele gepaarte Halbpupillenblenden, die auf einem Rad angeordnet sind und sequentiell eingebracht werden, wobei aber die Anzahl der aufzunehmenden Bilder steigt.

Die Fig. 7d stellt schematisch eine Phasenmaske 13 dar, deren Teilbereiche 13.1 aus einem äußeren Kreisring und einem inneren Kreis bestehen, deren optische Gradienten OG einander gegenläufig ausgebildet sind.

In weiteren möglichen Ausführungen der Phasenmaske 13 können die

Teilbereiche 13.1 als Sektoren eines Kreises oder eines Kreisrings ausgebildet sein.

Es ist weiterhin möglich, dass die Teilbereiche 13.1 als Kombinationen von Sektoren, einem oder mehreren Kreisen und/oder einem oder mehreren Kreisringen realisiert sind. Alle Ausführungen der Phasenmaske 13 können um eine parallel zur optischen Achse 7 verlaufenden Drehachse 22, damit auch um die optische Achse 7 selbst, drehbar sein. In der Figur 7d ist die Drehachse 22 durch den Schnittpunkt eines dem besseren Verständnisses wegen eingezeichneten Querstrichs mit dem mittleren, einen optischen Gradienten OG symbolisierenden Pfeil, gekennzeichnet.

Ein mittels eines Mikroskopierverfahrens gemäß dem Stand der Technik erhaltenen Kontrastbildes IPRK der Stärkekörnern einer Kartoffelzelle ist in der Fig. 8a dargestellt. Die Fig. 8b zeigt einen Ausschnitt eines mittels eines erfindungsgemäßen

Mikroskopierverfahrens erhaltenen Kontrastbildes IPRK von Stärkekörnern der

Kartoffelzelle.

Das mittels der Erfindung ermöglichte bessere Sectioning ist in den Figuren 8a und 8b veranschaulicht. Dargestellt sind zwei Ebenen eines z-Stapels aus einem Schnitt einer Kartoffelknolle in Phasenkontrast gemäß dem erfindungsgemäßen

Mikroskopierverfahren (Fig. 8a) und dem Stand der Technik (Fig. 8b). Die teils übereinander angeordneten Stärkekörner sind bei dem in der Fig. 8a gezeigten herkömmlichen Phasenkontrast in allen Ebenen der Fig. 8b sichtbar, während in dem mittels des erfindungsgemäßen Mikroskopierverfahren erzeugten Kontrastbildes IPRK der Fig. 8a nur die im Schärfentiefenbereich liegenden Ränder der Stärkekörner kontrastiert werden. Die Ausführung des erfindungsgemäßen Mikroskopierverfahrens wird anhand der Fig. 3a und 3b erläutert.

Mittels des in der ersten Konfiguration I befindlichen Mikroskops 1 werden Bilddaten eines ersten Bildes lp des in der Objektebene 5 angeordneten Objekts 12 erfasst. Dazu wird die Beleuchtungsstrahlung 3 durch die Lichtquelle 2 bereitgestellt und in die Objektebene 5 fokussiert. Diejenigen Anteile der Beleuchtungsstrahlung 3, die durch das Objekt 12 treten (Objektstrahlung 30), sind aufgrund des optischen

Gradienten OGobj des Objektes 12 hinsichtlich ihrer Phase verschoben, sodass für die Objektstrahlung 30 ein Phasengradient PGobj ausgebildet ist.

Die in der Pupille 8 angeordnete Phasenmaske 13 bewirkt den

Phasengradienten PG der Objektstrahlung 30, wobei dessen konkrete Ausprägung von der Gestaltung der Phasenmaske 13, des optischen Gradienten OGobj und des Phasengradienten PGobj sowie des mindestens einen optischen Gradienten OG der Phasenmaske 13 abhängt.

Die Objektstrahlung 30 wird mittels der Abbildungseinheit 9 in die Bildebene 10 abgebildet und durch die Erfassungseinheit 1 1 ortsaufgelöst als Bilddaten des ersten Bildes IP erfasst.

Der durch den optischen Gradienten OGobj des Objekts 12 bewirkte

Phasengradient PGobj führt zu einer dem Phasengradienten PGobj proportionalen Verschiebung der Beugungsordnungen des Objekts 12 in der Fourier-Ebene. Wird in einer Fourier-Ebene, insbesondere in der Pupille 8, die insbesondere eine

Objektivpupille sein kann, ein Phasengradient PG, beispielsweise mittels der

Phasenmaske 13 in der halben Pupille 8, bewirkt, so wird ein dem

Phasengradient PGobj proportionaler Teil des Beugungsmusters zusätzlich dem Phasengradienten PG ausgesetzt und ein ebenfalls dem Phasengradienten PGobj proportionaler Teil des Beugungsmusters der anderen Hälfte der Pupille 8 entzogen. Der Phasengradient PG führt dazu, dass die den Phasengradient PG durchlaufende Bildinformation auf der Erfassungseinheit 1 1 senkrecht zum Phasengradienten PG verschoben abgebildet wird. Es entsteht also ein aus zwei leicht zueinander versetzten Teilbildern bestehendes Bild Ip auf der beispielsweise als Bildsensor ausgebildeten Erfassungseinheit 1 1 . Die Ermittlung von Unterschieden Δ IP, IWF zwischen dem unbeeinflussten Bild IWF und dem Bild Ip führt damit zu einem durch Bilddaten eines Kontrastbildes IPRK repräsentierten Bildkontrasts, der proportional zu dem in der Pupille 8 verschobenen Anteil der Beugungsordnungen und damit proportional zum lokalen

Phasengradienten PGobj in der Objektebene 5 ist. Anschließend wird die zweite Konfiguration II des Mikroskops 1 herbeigeführt, indem mittels der Auswerteeinheit 15 die Zustellvorrichtung 14 angesteuert wird und die Phasenmaske 13 aus der Pupille 8 entfernt, insbesondere aus dieser herausbewegt wird, so dass der Strahlengang nicht mehr durch die Phasenmaske 13 beeinflusst ist.

In der zweiten Konfiguration II wird ein Weitfeldbild des Objekts 12 aufgenommen und als Bilddaten eines zweiten Bildes IWF, insbesondere als Referenzdatensatz, durch die Auswerteeinheit 15 gespeichert. In weiteren Ausgestaltungen des Mikroskopierverfahrens werden erst die Bilddaten der zweiten Bilder IWF mittels der zweiten Konfiguration II und anschließend die Bilddaten der ersten Bilder Ip mittels der ersten Konfiguration I erfasst.

Zur Erzeugung des Kontrastbildes IPRK wird der Unterschied Δ Ip, IWF zwischen den Bilddaten des ersten Bildes Ip und den Bilddaten des zweiten Bildes IWF ermittelt. In Abhängigkeit des ermittelten Unterschieds Δ Ip, IWF beziehungsweise der ermittelten Unterschiede Δ Ip, IWF werden die Bilddaten des Kontrastbildes IPRK ermittelt.

Insbesondere kann das erste Bild Ip vom zweiten Bild IWF subtrahiert und

gegebenenfalls normiert werden. Als Ergebnis ergibt sich das für den

Phasengradienten PG sensitive Kontrastbild IPRK.

Dabei können die Unterschiede Δ Ip, IWF direkt als Bilddaten des Kontrastbildes IPRK genutzt werden.

Die Unterschiede Δ Ip, IWF können auch mit Wichtungsfaktoren und/oder

Funktionswerten, beispielsweise von Point-Spread-Funktionen, verrechnet werden. Das Kontrastbild IPRK ist insbesondere für Längenskalen sensitiv, die dem Abstand der Teilbilder proportional sind.

Eine Normierung, wie dies beim Halbpupillenkontrast nötig ist, ist nicht erforderlich, da das ungestörte Durchlicht-Bild (zweites Bild IWF) bereits vorliegt und nicht aus den beiden Halbpupillenbildern synthetisiert werden muss. Das setzt voraus, dass die Phasenmaske 13 in der Pupille 8 nur die Phasenlage beeinflusst.

Wird durch die Phasenmaske 13 auch die Transmission beeinflusst, können die Bildintensitäten geeignet normiert werden und zum Beispiel wie folgt auf die mittlere Intensität des zweiten Bildes IWF bezogen werden:

'PRK — F p ^■

Bezugszeichen

1 Mikroskop

2 Lichtquelle

3 Beleuchtungsstrahlung

4 Kondensor

5 Objektebene

6 Objektiveinheit

7 optischen Achse

8 Objektivpupille

9 Abbildungseinheit

10 Bildebene

1 1 Erfassungseinheit

12 Objekt

13 Phasenmaske

13.1 Teilbereich (der Phasenmaske 13)

14 Zustellvorrichtung

15 Auswerteinheit

16 Anzeige

17 Flüssigkristallelement

18 räumlicher Lichtmodulator

19 Wechselvorrichtung

20 Spiegel

20.1 Spiegelfläche

21 deformierbarer Spiegel

22 Drehachse

23 weitere Objektive

30 Objektstrahlung

I erste Konfiguration

II zweite Konfiguration

OG optischer Gradient

OGobj optischer Gradient (des Objekts 12)

PG Phasengradient

PGobj Phasengradient (des Objekts 12)