Il est bien connu que la culture d'embryons somatiques de plantes et de jeunes plantes qui en sont issues nécessite l'utilisation d'un milieu de culture sucré. Cependant la présence de sucre attire les microorganimes tels que champignons, bactéries, algues, protozoaires et virus. Or une protection maximale est nécessaire pour assurer la culture, la croissance et l'obtention de plantules puis de plantes saines. Cet inconvénient est évité en effectuant la culture en conditions stériles, ce qui alourdit et complique l'expérimentation.

Une autre voie serait d'ajouter des antibiotiques. Cette solution a été tentée par exemple pour la culture d'embryons de carotte cf Synseedsl993 Ch ; 15 F. Molle et coll.) mais s'est révélée inutilisable en raison d'une phytotoxicité inacceptable provoquant le blocage de la croissance des embryons. On a utilisé des fongicides à large spectre tels que le carbendazime ou le benomyl mais ils ne se sont révélés non phytotoxiques qu'à faibles doses, pour lesquelles leur action était tout à fait insuffisantes. Il en est de même avec certaines combinaisons de fongicides et d'antibiotiques de la littérature.

Il est donc connu que le problème d'une protection efficace des milieux de culture pour embryons somatiques dans des conditions non stériles reste entier et qu'il y a un besoin pour résoudre cette difficulté. Cette difficulté résulte d'une plus grande sensibilité, en conditions non stériles, des embryons par rapport aux graines, des embryons aux produits phytosanitaires et au fait qu'il faut également protéger ces embryons contre l'action de micro-organismes autres que les pathogènes.

La demanderesse a maintenant découvert un nouveau milieu de culture permettant de résoudre ce problème avec obtention d'une protection efficace par l'utilisation de matières actives protectrices particulières. Par protection efficace on entend une protection d'au moins 10% de la surface du milieu.

Plus particulièrement l'invention concerne milieu de culture pour tissus méristématiques, en condition non stériles, comprenant un milieu sucré, caractérisé en ce qu'il contient en outre une quantité efficace et non

phytotoxique d'au moins une matière active protectrice contre les micro- organismes choisie dans le groupe comprenant une matière active fongicide phytosanitaire et une matière active bactéricide rémanente.

Au sens de la présente description, on entend par"tissu méristématique"tout tissu végétal, ou ensemble de cellules végétales, capable, lorsqu'il est mis dans des conditions convenables, de se développer jusqu'à former une plante entière ou partie de plante entière. Sous 1'expression"tissu" on inclut toute sorte de tissus végétaux, notamment : le tissu somatique, les masses pro-embryogènes (connu en anglais sous le nom de pro-embryogenic masses, l'embryon somatique, le tissu zygotique, la graine, le germe, le bourgeon adventice, les pousses, le primordium de tige (connu en anglais sous le nom de shoot primordium), les analogues de protocorn (connus en anglais sous le nom de protocorn like body), le tissu connu en anglais sous le nom de green spot, les cellules germinales et semences naturelles (connues en anglais sous le nom de germ line), les jeunes plants.

Les végétaux concernés par l'invention sont de nature les plus diverses et incluent les cultures vivrières telles que le riz, le blé, l'orge, le maïs, le soja ; les cultures légumières telles que le céleri, le persil, la salade, le chou-fleur, la carotte, l'aubergine, la tomate, l'oignon, l'ail, le gingembre, les fraises, les melons, l'asperge ; les cultures vivrières et/ou industrielles telles que le colza, la canne à sucre, la betterave à sucre, le tabac, le café ; les cultures à but médical telles que la belladone, le ginseng ; les cultures ornementales telles que les chrysanthèmes, les glaïeuls, les lys, les orchidées, les amaryllis, les géranium, les bégonia, les violettes du Cap, la poinsettia ; des arbres ou espèces arborescentes ou arbustes telles que les résineux, les palmiers, les arbres fruitiers, la vigne, les arbres à feuilles caduques, et autres.

Le tissu méristématique peut être sec, déshydraté ou sous forme hydratée jusqu'à 100% d'humidité.

Au sens de la présente invention, on entend par"micro-organismes" ceux appartenant aux classes des champignons, bactéries, algues, virus et protozoaires.

De même, on entend par"milieu de culture"tout milieu, solide (par exemple milieu gélosé) ou liquide (solution nutritive), éventuellement adsorbés sur des substrats de culture tels que laine de roche, acétate de cellulose, fibres polyethylène, polyuréthannes, noix de coco, permettant la culture de tissus méristématiques, in vitro ou en serre, éventuellement avec relargage contrôlé

des matières actives. Le milieu peut être statique, apporté une fois pour toutes ou renouvelé régulièrement sous forme, soit d'un flux continu, soit d'un flux discontinu (batch).

Le sucre est présent dans milieu selon l'invention à une concentration comprise en général entre 0, lmg et 200 g/l et de préférence comprise entre 5 g/1 et 200 g/1.

Par"matière active phytosanitaire", on entend essentiellement une matière active fongicide. Celle ci est de préférence choisie dans le groupe comprenant les dérivés du cuivre, les dérivés de l'oxyquinoléine, les dithiocarbamates, les dicarboximides, les phénylpyrroles, les triazoles. De manière particulièrement préférée, on utilise des fongicides choisis dans le groupe comprenant l'oxychlorure de cuivre, l'oxyquinoléine, l'oxyquinoléate de cuivre, le mancozèbe, le manèbe, le thirame, le fludioxonil, et l'iprodione.

Dans la présente demande les noms de matières fongicides sont les noms communs (cf Pesticide Manual 1995).

De manière particulièrement préférée, le milieu contient au moins deux fongicides.

Un autre aspect important de l'invention est que ces fongicides sont utilisés en quantité non phytotoxique pour le tissu méristématique, c'est à dire à des concentrations, qui peuvent être plus faibles que celles habituellement utilisées pour la protection des plantes entières. Plus précisément le milieu contient de 0,1mg à 10g/l, et de préférence de 1 mg à 1 g/1 de matière active fongicide.

Plus particulièrement et de préférence, la concentration est comprise entre : -0,1 et 10 mg/1 pour les dérivés du cuivre, -0,1 et 10 mg/1 pour les dérivés de l'oxyquinoléine, -0,1 et 10 mg/1 pour les dérivés dithiocarbamiques, -0,1 et 10 mg/1 pour les dérivés phénylpyrroles, -0,1 et 1000 mg/1 pour les dérivés dicarboximides.

Par"matière active bactéricide", on entend essentiellement une matière active bactéricide ou bactériostatique. Celle-ci peut appartenir à une famille quelconque, la préférence étant donnée au dérivés de l'acide salicylique tel que par exemple l'acide salicylique, l'acide acétylsalicylique, les salicylates ou encore aux thiazolines, telle que par exemple la 1,2-benzisothiazoline-3-one, voire des antibiotiques.

Le milieu peut contenir plusieurs bactéricides.

La concentration en matière active bactéricide est de 0,1 à 100 mg/l, et de préférence de 0,1 à 100 et de préférence de 0,1 à 10 mg/1 de matière active.

Plus particulièrement et de préférence, la concentration est comprise entre : -0,1 et 10 mg/1 pour les dérivés de l'acide salicylique, -0,1 et 5 mg/1 pour la 1,2-benzisothiazoline-3-one.

Le milieu selon l'invention peut encore contenir d'autres matières actives ou adjuvants à condition que les quantités soient non phytotoxiques pour les tissus méristématiques. Pour la fabrication du milieu ci-dessus, il suffit de mélanger les ingrédients décrits avec la base du milieu. Si le milieu final est solide, le mélange se fait à chaud en phase liquide pour être ensuite versé dans des récipients de laboratoire tels que des boites de Petri ou Magenta.

Les conditions de culture et les résultats seront mieux compris à l'aide des exemples suivants, sans que ceux-ci limitent la portée de l'invention.

Exemple 1 : Test de protection d'un milieu de culture Différents milieux de culture sont fabriqués à partir de la solution nutritive de Heller (He 15), caractérisée par la présence de saccharose, qui est utilisée pour assurer la germination des embryons somatiques.. Cette solution est composée des macronutrients de Heller (Ann. Sci. Nat. Bot. Biol. Veg. 14 : 1-223,1953), des micronutrients de Murashige et Skoog (Physiol. Plant. 15 : 473-497,1962) et de 15 g/1 de saccharose. Elle est gélifiée dans 1'exemple par 6 g/1 de gelrite, le pH étant maintenu à 5,6. Après fabrication et stérilisation par autoclavage d'environ 3,5 litres de solution nutritive gélosée de Heller (He 15), environ 250 ml des milieux de Heller suivants sont fabriqués.

1. Heller sans matière active 2. Heller + oxyquinoléine 1 mg/1 + thirame 5 mg/1 3. Heller + mancozèbe 10 mg/1 4. Heller + oxyquinoléate de cuivre 1 mg/1 + mancozèbe 10 mg/1 5. Heller + oxyquinoléate de cuivre 1 mg/1 + fludioxonil 10 mg/1 6. Heller + oxyquinoléate de cuivre 1 mg/1 + iprodione 100 mg/1 Les modalités de fabrication et de dilution des solutions mères de matières actives (m. a.) sont données dans le tableau 1 suivant : Matière formulât ! Quantité volume active on de m. a. par de solution mère litre de par litre de milieu solution mère de culture oxyquinol Cryptonol 0,2 5 éine oxyquinol m. a. 1 1 éate de cuivre technique 100% thirame Pomarsol 1 5 mancozèb Dithane 2 5 e M45 fludioxoni Saphire 2 5 1 iprodione Rovral 2 5 aqua flo

La solution mère est fabriquée par dilution de la matière active, formulée ou non, dans un milieu de Heller dépourvu de saccharose. Le milieu de culture est fabriqué en ajoutant une fraction de la solution mère dans le milieu de base, qui contient 15 g/1 de saccharose.

Chaque solution nutritive gélosée est répartie dans des boîtes Magenta (Sigma, USA) à raison d'environ 40 ml par boîte. Les boîtes Magenta sont amenées en mini-serre qui sont ouvertes sans précautions particulières en conditions non stériles, à raison d'une boîte par milieu et par mini-serre.

La température est d'environ 20°C, avec une humidité relative modulable de 30 à 70% par système brouillard. Les serres permettent d'utiliser l'éclairage naturel mais, si celui-ci est trop faible, on utilise un éclairage d'appoint fixe à l'aide de lampes à vapeur de sodium haute pression de 400 watts.

Quatorze jours après la mise en place, la surface du milieu de culture contaminée par les micro-organismes est mesurée dans chaque boîte ainsi que le nombre de colonies qui se sont développées.

Les résultats sont donnés dans le tableau 2 suivant : Matière Surface contaminée actives ombre de foyers mm2 % de % de la surface totale la surface témoin 0 17906 86 100 08 mancozèbe 104 0,5 0,6 10 mg/l Oxyquinoléin 766 4 4 e 1 mg/l + thirame 5 mg/1 Oxyquinoléat 0 0 0 e de cuivre 1 mg/1 + mancozèbe 10 mg/1 Oxyquinoléat 1763 8 10 e de cuivre 1 mg/1 8 + iprodione 100 mg/l

Le critère d'activité est que la protection soit telle que moins de 10% de la surface totale soit contaminée.

Dans ces conditions on observe que tous les produits testés apportent une excellente protection.

Exemple 2 : Test de protection d'un milieu de culture En procédant selon le même protocole que celui décrit à 1'exemple 1, mais avec les milieux de Heller suivants : 7. Heller sans matière active 8. Heller + oxyquinoléate de cuivre 10 mg/1 9. Heller + oxyquinoléate de cuivre 1 mg/1 + thirame 5 mg/1 on obtient les résultats donnés dans le tableau 3 suivant : Matière N Surf actives ombre de ace foyers contaminée mm % de % de 2 la surface totale la surface témoin 0 1 457 22 100 8 4 Oxyquinoléat 1 3 0,0 0,0 e de cuivre 10 mg/1 Oxyquinoléat 3 129 0,6 3 e de cuivre 1 mg/1 +thirame5 mg/1

Exemple 3 : Test de protection d'un milieu de culture En procédant selon le même protocole que celui décrit à 1'exemple 1, mais avec les milieux de Heller suivants : 10. Heller sans matière active 11. Heller + oxyquinoléate de cuivre 1 mg/1 12. Heller + thirame 10 mg/1 13. Heller + acide salicylique 10 mg/1 14. Heller + 1,2-benzisothiazoline-3-one 10 mg/1 15. Heller + oxyquinoléate de cuivre 1 mg/1 + thirame 5 mg/1 16. Heller + oxyquinoléate de cuivre 1 mg/1 + thirame 5 mg/1 + acide salicylique lmg/1 17. Heller + thirame 5 mg/1 + acide salicylique 1 mg/1 18. Heller + thirame 5 mg/1 + 1,2-benzisothiazoline-3-one 10 mg/1 Ces milieux de culture géloses sont fabriqués à partir de lasolution nutritive de Heller (He 15), dont la composition est décrite dans le tableau n° de 1'exemple 1.

Les modalités de fabrication et de dilution des solutions mères sont données das les exemples précédents. Dans le cas de l'acide salicylique et de la 1,2-benzisothiazoline-3-one, ces modalités sont données dans le tableau 4 suivant : Matière Formu Quantité Volume active lation en g de m. a. par en ml de solution en g m. a. litre de solution mère par litre de par litre de milieu de mère milieu de culture culture acide Sygma 10 salicylique : réf. logos 1 1 lg/l 3007, USA 1,2-benziso formul thiazo line-3-one : ation liquide à 1 10 10g/l20% On obtient les résultats donnés dans le tableau 5 suivant Matière N Surf actives ombre de ace foyers contaminée mm % de % de 2 la surface totale la surface témoin 0 9 192 92 100 2 49 oxyquinoléat 3 539 26 28 e de cuivre 1 mg/1 5 3 thirame 10 2 69 0,3 0,3 mg/l acide 9 185 89 96 salicylique 0 18 10 mg/1 1,2- 7 104 5 5 benzisothiazoline-3-2 one 10 mg/l Oxyquinoléat 6 163 8 8 e de cuivre 1 mg/l 5 + thirame 5 mg/l Oxyquinoléat 5 590 3 3 e de cuivre 1 mg/1 + thirame 5 mg/l + acide salicylique 1 mg/l thirame 5 4 139 7 7 mg/l 2 + acide salicylique 1 mg/l thirame 5 2 869 4 5 mg/l + 1,2- benzisothiazoline-3- one 10 mg/1

Dans ces conditions on observe que le thirame, la benzisothiazoline-3- one ainsi que des mélanges à base d'oxyquinoléate de cuivre et d'acétylsalicylique et/ou de thirame, à des doses où ces produits seuls sont inefficaces apportent une excellente protection, de sorte que moins de 10% de la surface totale est contaminée.

Exemple 4 ; test de culture d'embryons somatiques de carottes A) Suspension cellulaire :

Les embryons somatiques sont obtenus selon la méthode décrite dans Cryo-Lett. 12 : 319-328,1991, si ce n'est que l'embryogenèse est obtenue en présence de 0,2 % ° en poids de charbon actif, et déshydratés selon la méthode décrite dans C. R. Acad. Sci. Paris, Sér. III, 314,423,1992. Les embryons ainsi obtenus ont une teneur en eau inférieure à 0,35 grammes d'eau par gramme de matière sèche.

B) Germination des embryons : Les boîtes de Petri contenant les embryons posés sur papier filtre sont placées pendant 3 jours dans l'obscurité à 4°C dans des dessiccateurs où l'humidité relative est maintenue à 96% par une solution sursaturée de nitrate de potassium. Ensuite les papiers filtres sont transférés dans l'obscurité à 4°C sur milieu de Heller à 145 g/1 de saccharose. Au bout d'un jour, ils sont de nouveau déplacés sur milieu de Heller à 80 g/1 de saccharose, à la lumière et à 25°C. Au bout d'un jour, on peut disposer des embryons.

Les embryons somatiques sont placés en germination en chambre de culture à 25°C sous une photopériode de 16 h de jour et 8 h de nuit et une intensité lumineuse de 15 ttE/m2/s. Le milieu de germination est un milieu gélosé de Heller contenant 15 g/1 de saccharose, additionné ou non de matières actives. Les milieux sont répartis dans des boites Magenta à raison de 30 ml de milieu par boîte. Les embryons somatiques sont répartis sur les différents milieux à raison de 60 embryons par milieu et de 10 embryons par boîte, en conditions aseptiques.

Les différents milieux de Heller contiennent les mélanges de matières actives suivantes préparés comme aux exemples précédents : 19. Heller sans matière active 11. Heller + oxyquinoléate de cuivre 1 mg/1 + mancozèbe 10 mg/1 5. Heller + oxyquinoléate de cuivre 1 mg/1 + fludioxonil 10 mg/1 6. Heller + oxyquinoléate de cuivre 1 mg/1 + iprodione 100 mg/1 20. Heller + oxyquinoléine de cuivre 1 mg/1 + thirame 5 mg/1 16. Heller + oxyquinoléate de cuivre 1 mg/1 + thirame 5 mg/1 + acide salicylique 1 g/1 18. Heller + thirame 5 mg/1 + 1,2-benzisothiazoline-3-one 1 mg/1 21. Heller +oxyquinoléate de cuivre 1 mg/1 + fenpiclonil 1 m/gl Les taux de conversion des embryons sont mesurés environ 5 semaines après les semis et définis comme étant le nombre d'embryons présentant la première paire de feuilles vraies rapporté au nombre total d'embryons.

Le poids frais de la partie aérienne de la jeune plante (au dessus du collet) est mesuré à la balance de précision. Le poids frais est le marqueur de développement des plantes.

Le taux de conversion et le poids frais sont indiqués dans le tableau 6 suivant. Matières actives Taux de Poids frais moyen conversion (%) des plantes (mg) sans 95 117 8 oxyquinoléate de cuivre 83 124 ~ 15 1 mg/1 + mancozèbe 10 mg oxyquinoléate de cuivre 95 115 12 1 mg/1 + fludioxonil 10 mg/1 oxyquinoléine de cuivre 95 115 12 1 mg/1 + thirame 5 mg/1 oxyquinoléate de cuivre 98 126 ~ 13 1 mg/1 + iprodione 100 mg/1 oxyquinoléate de cuivre 90 104 17 1 mg/1 + thirame 5 mg/1 + acide salicylique 1 mg/l thirame 5 mg/1 + 1,2- 98 142 10 benzisothiazoline-3-one 1 mg/1 oxyquinoléate de cuivre 95 114 ~ 15 1 mg/l + fenpiclonil 1 m/gl

Ce tableau montre que tous les taux de conversion en plantes sont supérieurs à la valeur acceptable de 80% et même pour la plupart au moins égaux à 95%. Ceci montre l'excellente propriété des matières actives selon l'invention de ne pas altérer le développement en plantes des embryons somatiques.