La présente Invention est relative à des ferments lactiques, et à leurs utilisations, en particulier pour l'obtention de produits dotés de propriétés anti-diarrhéiques.

Les produits laitiers fermentes du type yoghourt sont obtenus par fermentation du lait avec une combinaison de souches des bactéries lactiques Streptococcus thermophilus et Lactobacill us bulgaricus . Ces bactéries se développent rapidement dans le lait en produisant des quantités importantes d'acide lactique et provoquent la coagulation du lait en quelques heures. Lors de l'ingestion régulière de yoghourt, la flore spécifique du yoghourt apparaît dans les selles, mais disparaît à l'arrêt de la consommation, car elle ne s' implante pas chez l'homme.

D'autres bactéries lactiques font au contraire partie de la flore banale du tractus digestif de l'homme ,• il s'agit en particulier de Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus casei et de bactéries du genre BidifidoJacteriu-n. Un certain nombre d'espèces de Lactojbacillus sont présentes dans la flore intestinale de l'homme bien portant, et leur présence assure un rôle d'équilibre vis à vis des autres groupes microbiens.

On a depuis longtemps cherché à obtenir des laits fermentes qui, tout en offrant à la consommation des propriétés organoleptiques agréables, contiennent en quantité élevée des bactéries lactiques présentes naturellement dans la flore intestinale de l'homme, notamment des bactéries du genre Lactobacillus , capables de se développer dans l'intestin et de contribuer à l'équilibre de la flore intestinale.

Les espèces Lactobacillus casei et Lactobacillus acidophiluε font en ce sens l'objet d'un intérêt croissant.

L'effet éventuel de ces bactéries sur certaines pathologies digestives (troubles gastro¬ intestinaux, gastro-entérites perturbation du transit) a été étudié. Plusieurs études ont ainsi montré chez l'enfant l'effet bénéfique de ferments lactiques, administrés sous forme de laits fermentes ou sous forme de poudre, sur la durée de la diarrhée.

TOUHAMI et al., [Ann. Pédriatr. (Paris) 39, n° 2, p. 79-86 (1992)] ont comparé l'effet du lait et du yoghourt chez l'enfant atteint de diarrhée persistante. 78 enfants hospitalisés présentant une diarrhée persistante depuis au moins 15 jours ont été alimentés par du lait ou du yoghourt. L'échec du traitement étant défini comme une non rémission de la diarrhée au bout de 5 jours, le nombre d'échecs était significativement plus bas dans le groupe yoghourt (15%) que dans le groupe lait (45%) . Ce résultat traduit indirectement une diminution de la durée de l'épisode diarrhéique avec le yoghourt. ISOLAURI et al., [Pediatrics, vol. 88 (l) , p.90-97 (1991)], ont procédé à une étude chez des enfants atteints de diarrhée aiguë depuis moins de 7 jours. 71 enfants au total, ont reçu du L. casei GG (L. casei subεp . rhamnosus) sous forme lyophilisée, ou un lait fermenté par L. casei GG ou un yoghourt thermisé. La durée de la diarrhée après traitement était alors de 2,4 jours dans le groupe témoin contre 1,4 jours dans le groupe L. casei GG sous forme lyophilisée ou sous forme d'un lait fermenté, soit une diminution significative de 42%.

Selon le même modèle, cette équipe a également étudié sur les diarrhées à rotavirus l'effet de l'administration de L. casei GG sous forme de poudre, par rapport à 2 produits du commerce, l'un étant une préparation de L. casei rhamnosus (Lactophilus) et l'autre un lait fermenté avec les ferments du yoghourt et

contenant L. casei rhamnosus (YALACTA®) [MAJAMAA et al.,

Journal of Pédiatrie Gastroenterology and Nutrition

(USA), Apr.1995, 20(3) p. 333-8] , Cette étude montre une réduction significative de la durée de la diarrhée à rotavirus dans le groupe L. casei GG (1,8 jours) par rapport aux groupes Lactophilus (2,8 jours) et YALACTA®

(2,6 jours) . Cela se traduit par une réduction de 36% par rapport à Lactophilus et de 31% par rapport à YALACTA®.

Les deux études précédentes montrent l' intérêt de L. casei εubεp . rhamnosus dans la réduction de la durée de la diarrhée, du moins dans le cas de diarrhée aiguë ou à rotavirus.

Il a également été montré, chez l'enfant atteint de diarrhée, que la consommation de yoghourt réduit significativement le volume des selles par rapport à la consommation de lait [BHAN et al . , Les laits fermentes. Actualités de la Recherche, John LIBBEY Eurotext Lid, P. 233-239 (1989)] .

Le travail de [LING et al., Ann. Nutri. Metab. 36, p. 162-166, (1992)] chez des personnes âgées (non atteintes de diarrhée) montre qu'un lait fermenté par L. casei GG normalise la consistance des selles en comparaison avec un groupe contrôle ne consommant pas ce lait fermenté. Cependant Lactobacill us casei a un développement très lent et souvent irrégulier dans le lait, et les produits obtenus ont un goût peu agréable, amer, et souvent en outre trop acide.

De nombreuses tentatives ont été réalisées pour produire des produits fermentes avec Lactobacillus casei en association avec tout ou partie des ferments du yoghourt, mais aucune n'a jusqu'à présent permis d'obtenir un résultat satisfaisant.

Il est connu qu'une grande variabilité existe dans les produits obtenus par fermentation, et que le résultat obtenu dépend en grande partie de la nature du

ferment. Par exemple, les courbes de croissance, ainsi que la production d'acide lactique, la production d'arômes et l'épaississement du milieu varient de façon importante, d'une espèce de bactéries lactiques à une autre, et même souvent au sein d'une même espèce.

En outre, les bactéries lactiques sont le plus souvent utilisées sous la forme de ferments complexes, et les interactions entre les différentes souches au cours de la fermentation modifient les propriétés des souches, par rapport à celles observées en culture pure.

Au total, la conjugaison entre la variabilité au sein de chaque espèce, et les interactions entre les différentes souches dans des populations en mélange complexe, rend imprévisible le comportement des souches lactiques dans les ferments.

Or, au cours de leurs recherches sur la symbiose des ferments lactiques, les Inventeurs ont découvert un nouveau ferment du yoghourt particulièrement avantageux lorqu'il est utilisé en association avec des bactéries du genre Lactobacillus pour l'obtention d'un produit laitier fermenté.

La présente Invention a pour objet un ferment du yoghourt constitué par un mélange des trois bactéries lactiques Streptococcus thermophilus DN-001 147, Streptococcus thermophilus DN-001 339, et Lactobacillus bulgari cus DN-100 182, ainsi qu'un ferment lactique, caractérisé en ce qu'il comprend le ferment du yoghourt tel que défini ci-dessus, et comprend en outre une ou plusieurs autres espèces de bactéries lactiques. Ces autres bactéries lactiques peuvent être choisies dans le groupe constitué par les genres Lactobacillus, Bifidobacterium, et Lactococcus. Elles appartiennent de préférence au groupe Lactobacillus casei , et de préférence encore il peut s'agir de la bactérie Lactobacillus paracasei subεp . paracasei DN- 114 001.

Les souches de Lactobacillus paracasei subsp. paracasei DN-114 001, Lactobacillus bulgaricus

DN-100 182, Streptococcus thermophilus DN-001 147,

Streptococcus thermophilus DN-001 339, utilisées pour la présente invention ont été déposées selon le Traité de Budapest le 30 décembre 1994, auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) tenue par l'Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, à Paris, sous les numéros respectifs : 1-1518 pour la souche Lactobacillus paracasei subεp . paracasei DN- 114 001 ,- 1-1519 pour la souche Lactobacillus bulgaricus DN-100 182 ,• 1-1520 pour la souche Streptococcus thermophilus DN- 001 147 ; le numéro 1-1521 pour la souche Streptococcus thermophilus DN-001 339. Les caractéristiques de ces souches sont en outre les suivantes :

Souche Lactobacillus paracasei subsp . paracasei DN-114 001

Morphologie : microorganisme Gram-positif, non mobile et ne formant pas de spores, se présentant sous la forme de petits bacilles fins. Métabolisme hétérofermentaire, catalase (-), gluconate (+) . Fermentation des sucres : ribose (+) , adonitol (+) , galactose (+) , glucose (+) , fructose (+) , mannose (+), L- sorbose (+) , mannitol (+) , sorbitol (+) , alpha-methyl D- glucoside (+) , N-acetyl-glucosamine (+) , arbutine (+) , esculine (+) , salicine (+) , cellobiose (+) , maltose (+) , lactose (+) , saccharose (+) , tréhalose (+) , a eta- gentiobiose (+) , turanose (+) , tagatose (+) . - Souche Streptococcuε thermophilus DN-001 147

Morphologie : microorganisme Gram-positif, non mobile et ne formant pas de spores, se présentant sous la forme de gros streptocoques en diplocoques et chaines courtes. Métabolisme : homofermentaire, catalase (-) . Fermentation des sucres : D-glucose (+) , D-fructose (+) , saccharose (+) , lactose (+) .

- Souche Streptococcus thermophil us DN-001 339 Morphologie : microorganisme Gram-positif, non mobile et ne formant pas de spores, se présentant sous la forme de gros streptocoques en diplocoques et chaines courtes. Métabolisme : homofermentaire, catalase (-) . Fermentation des sucres : D-glucose (+) , saccharose (+) , lactose (+) .

- Souche Lactobacillus bulgaricus DN-100 182 : Morphologie : microorganisme Gram-positif, non mobile et ne formant pas de spores, se présentant sous la forme de bacilles très courts et trapus. Métabolisme homofermentaire, catalase (-) . Fermentation des sucres ribose (+) , D-glucose (+) , D-mannose (+) , lactose (+) .

L'association du ferment du yoghourt conforme à l'Invention avec des bactéries du genre Lactobacillus , et avec Lactobacillus casei en particulier, permet d'obtenir des produits possédant une population élevée de Lactobacilles, une très bonne stabilité au cours du temps, une texture onctueuse et d'excellentes propriétés organoleptiques.

L' Invention a également pour objet un procédé de préparation d'un produit laitier fermenté, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend la mise en oeuvre d'un ferment du yoghourt ou d'un ferment lactique conforme à l'Invention, tels que définis ci-dessus.

La présente Invention a également pour objet les produits laitiers fermentes susceptibles d'être obtenus par un procédé conforme à l'Invention, tel que défini ci-dessus. Selon un mode de réalisation préféré d'un produit laitier fermenté conforme à l'Invention, il contient entre lxlO ⁸ et l,2xl0 ⁹ cellules de L. casei par ml, entre 2χl0 ⁸ et lxlO ⁹ cellules de S . thermophil us par ml, et entre 4χl0 ⁶ et 2 ^χ l0 ⁷ cellules de L. i ulgraricus par ml.

Des produits laitiers fermentes conformes à l'Invention peuvent être à base de lait entier, écrémé ou supplémenté, pouvant contenir notamment des matières grasses, des matières sèches hydrophiles du lait, des protéines de soja, des sucres et des fruits en morceaux ou en purée.

Les Inventeurs ont également constaté que les ferments lactiques et les préparations de lait fermenté conformes à l'Invention, associant des ferments du yoghourt avec des Lactobacillus , possédaient des propriétés anti-diarrhéiques supérieures à celles des ferments et préparations de l'art antérieur préconisées dans ce but.

La présente Invention a également pour objet l'utilisation de ferments lactiques et de préparations de lait fermentéconformes à l'invention, pour l'obtention de produits anti-diarrhéiques.

La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention de préparations de lait fermenté mettant en oeuvre des ferments lactiques conformes à l'Invention, et à des exemples montrant leurs propriétés anti-diarrhéiques.

Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLE 1 - OBTENTION DE PREPARATIONS DE LAIT FERMENTE : COMPARAISON DE FERMENTS LACTIQUES CONFORMES A L'INVENTION AVEC DES FERMENTS LACTIQUES DE L ^• ART ANTERIEUR.

On ajoute de la poudre de lait à du lait entier, à raison de 4 grammes de poudre pour 100 grammes de lait. Après homogénéisation, le mélange est pasteurisé 10 minutes à 95°C, puis refroidi à 38°C avant d'être

ensemencé avec des cultures actives des différentes souches.

La préparation A contient uniquement la souche Lactobacillus paracasei subsp . paracasei DN- 114 001, ensemencée à une concentration initiale de 2χl0 ⁷ cellules par ml. Après 35 heures d'incubation à 37°C, le pH atteint la valeur de 4,7 et la préparation est conservée à 4°C. La concentration de la souche DN-114 001 est alors de 4χl0 ⁹ cellules par ml . - La préparation B est ensemencée avec le mélange des souches : Streptococcus thermophilus DN-001 147 (5 ^χ l0 ⁴ cellules par ml) , Streptococcus thermophil uε DN-001 339 (5χl0 ³ cellules par ml) , et Lactobacilluε bulgaricus DN-100 182 (lxlO ⁵ cellules par ml) . L'incubation est réalisée à 37°C ; après environ 1 heure, le pH atteint 4,7, et la préparation est transférée à 4°C. Les concentrations dans le produit fermenté sont : Streptococcus thermophilus DN-001 147 Streptococcus thermophiluε DN-001 339 (5xl0 ⁸ cellules par ml.), et Lactobacilluε bulgaricuε DN-100 182 (7χl0 ⁶ cellules par ml) .

La préparation C est une préparation commerciale de ferments du yoghourt THY71 (TEXEL) utilisée comme contrôle dans le test de dégustation. La préparation est ensemencée avec Streptococcus thermophiluε et Lactobacilluε bulgaricuε à des concentrations identiques (environ 3 l0 ⁶ cellules par ml) . Après 3h30 d'incubation à 44°C, on atteint un pH de 4,7 et la préparation est conservée à 4°C. La concentration est alors de 5χl0 ⁸ cellules par ml pour S. thermophilus et 2χl0 ⁸ cellules par ml pour L. bulgaricuε .

- La préparation D est ensemencée avec le mélange des souches suivantes : Lactobacilluε paracaεei subsp . paracasei DN-114 001 (2χl0 ⁷ cellules par ml) , Streptococcus thermophilus DN-001 147 (5χl0 ⁴ cellules par ml) , Streptococcus thermophil uε DN-001 339 (5 ^χ l0 ³

cellules par ml) , et Lactobacillus bulgaricuε DN-100 182

(lxlO ⁵ cellules par ml) . L'incubation est réalisée à

37°C ; après environ 12 h d'incubation, le pH atteint 4,7 et la préparation est transférée à 4°C. Les concentrations dans le produits fermenté sont

LactoJbacillus paracasei subεp. paracaεei DN-114 001

(6xl0 ⁸ cellules par ml) Streptococcus thermophilus

DN-001 147 et Streptococcus thermophiluε DN-001 339

(5xl0 ⁸ cellules par ml) , et LactoJbacillus Jbulgaricus DN-100 182 (lxlO ⁷ cellules par ml) .

- Les propriétés organoleptiques des quatre préparations sont évaluées après 7 jours de conservation à 8°C.

Les résultats sont illustrés par le Tableau I ci-dessous :

TABLEAU I

Préparation Texture Arôme / goût Appréciation générale

Cassant Caillé,

- A - Granuleux Amer,Goût (-) Légèrement légèrement épais rance.

- B - Epais Onctueux Fade (+)

Arôme yoghourt

- C - Epais type (+++)

Goût frais

- D - Très épais Goût crémeux (+++) Onctueux

La préparation -D- présente une population élevée en L. paracasei εubεp . paracaεei , une très bonne stabilité au cours du temps, une texture onctueuse, et d'excellentes propriétés organoleptiques.

EXEMPLE 2 : INFLUENCE DE PREPARATIONS DE LAIT FERMENTE CONFORMES A L'INVENTION SUR LA DUREE DE LA DIARRHEE

Les préparations utilisées sont les suivantes :

- préparation "Yoghourt": il s'agit de la préparation B obtenue, comme décrit à l'Exemple l ci- dessus, à partir d'un ferment du yoghourt conforme à l'Invention. - préparation "B.C." : il s'agit de la préparation D obtenue, comme décrit à l'Exemple 1 ci- dessus, à partir du ferment lactique conforme à l' Invention.

- préparation "Lait" : il s'agit d'un lait gélifié, non-fermenté, dont la composition est la suivante :

- Saccharose 6 g

- Guar 0,6 g

- Carraghenane 0,15 g - Lait entier QSP 100 ml.

Cette préparation a été traitée à 130°C pendant quelques secondes.

L'étude est réalisée sur une population de 265 enfants en crèche. Les enfants ont été répartis en 3 groupes par randomisation et ont consommé régulièrement 125 g (enfants de 6 à 18 mois) , ou 250 g (enfants de plus de 18 mois) soit de la préparation "Lait", soit de la préparation "Yoghourt", soit de la préparation "B.C.", pendant 3 périodes successives de 1 mois, entrecoupées de périodes sans supplementation de 1 mois. L'essai a été conduit en double aveugle.

L'analyse est effectuée sur la population d'enfants ayant présenté au moins un épisode diarrhéique

(n = 62) au cours de la période d'observation (6 mois) . La durée de la diarrhée est définie comme le temps écoulé entre l'apparition de la diarrhée (3 selles

liquides par jour) et la disparition des selles liquides. Plus pratiquement, cela représente le nombre de jours après apparition de l'épisode diarrhéique, pendant lesquels l'enfant présente encore au moins une selle liquide. Les résultats sont représentés dans le Tableau II ci dessous.

TABLEAU II

Produit Nombre d'enfants Nombre de jours de diarrhée

Lait 20 3,8 ± 1,8

Yoghourt 24 3,1 ± 1,7

B. C. 18 2,9 ± 2,6

Total 62 3,3 ± 2,0

Ces résultats montrent que, chez les enfants présentant des diarrhées, la supplementation de l'alimentation avec la préparation "Yoghourt" ou la préparation "B.C." réduit le nombre de jours de diarrhée par rapport à la préparation "Lait" . Cette réduction est de 18% dans le cas de la préparation "Yoghourt", et de 24% dans le cas de la préparation "B.C.". EXEMPLE 3 - INFLUENCE DES DIFFERENTES

PREPARATIONS SUR LA DUREE DE NORMALISATION DES SELLES

L'analyse est effectuée sur la même population d'enfants (n = 62) que l'exemple 2.

La durée de normalisation des selles est le temps écoulé entre la dernière selle liquide et le retour à des selles moulées. Plus pratiquement, cela représente la durée requise pour un retour à un transit normal .

Les résultats sont représentés dans le Tableau III ci dessous.

TABLEAU III

Nombre de jours

Produit Nombre d'enfants avant normalisation

Lait 20 2,6 ± 2,4

Yoghourt 24 2,0 ± 1,6

B. C. 18 1,2 ± 1,0

Total 62 1,9 ± 1,8

Ces résultats montrent que chez les enfants ayant présenté des diarrhées, la supplementation de l'alimentation avec la préparation "B.C." réduit significativement le temps de normalisation des selles par rapport à la préparation "Lait" , ^• la réduction observée est de 54% . Le temps de normalisation des selles est plus rapide avec la préparation "B.C." (1,2 ± 1,0) qu'avec la préparation "Yoghourt" (2,0 ± 1,6) .

EXEMPLE 4 - INFLUENCE DES DIFFERENTES PREPARATIONS SUR LA DUREE TOTALE DE L'EPISODE DIARRHEIQUE. L'analyse est effectuée sur la même population d'enfants (n = 62) que l'exemple 2.

La durée totale de l'épisode diarrheique est le temps écoulé entre le début de la diarrhée (> trois selles liquides par jour) et la fin de la période de normalisation (retour à des selles moulées) . Si un enfant a présenté plus d'un épisode diarrheique, cette analyse prend en compte l'épisode où ce délai calculé est le plus grand.

Les résultats sont représentés dans le Tableau IV ci dessous

TABLEAU IV

Durée totale de

Produit Nombre d'enfants 1 ' épisode diarrheique (jours)

Lait 20 6,9 ± 3,0

Yoghourt 24 4,8 ± 2,3

B. C. 18 3,9 ± 2,4

Total 62 5,2 ± 2,8

Ces résultats montrent que chez les enfants ayant présenté des diarrhées, la supplementation de l'alimentation avec la préparation "B.C." réduit significativement la durée totale de l'épisode diarrheique ; la réduction observée est de 44% par rapport à la préparation "Lait", et de 19% par rapport à la préparation "Yoghourt". La durée totale de l'épisode diarrheique est plus courte avec la préparation "B.C."

(3,9 ± 2,4) qu'avec la préparation "Yoghourt"

(4,8 ± 2,3) .

EXEMPLE 5 - INFLUENCE DES DIFFERENTES PREPARATIONS SUR LE NOMBRE TOTAL DE JOURS OU LES ENFANTS PRESENTENT UN TRANSIT INTESTINAL PERTURBE.

L'analyse est effectuée sur la même population d'enfants (n = 62) que l'exemple 2.

Le nombre total de jours où les enfants présentent un transit intestinal perturbé est calculé en sommant le nombre de jours où les enfants ont présenté une ou plusieurs selles anormales en consistance ou en fréquence. Lorsque l'enfant a présenté plusieurs épisodes diarrhéiques, l'analyse prend en compte l'ensemble de ces épisodes.

Les résultats sont représentés dans le Tableau

V ci dessous

TABLEAU V

Perturbation du

Produit Nombre d'enfants transit intestinal (jours) lait 20 8,0 ± 5,3

Yoghourt 24 5,3 ± 2,5

B. C. 18 4,3 ± 2,7

Total 62 5,9 ± 3,9

Ces résultats montrent que chez les enfants ayant présenté des diarrhées, la supplementation de l'alimentation avec la préparation "B.C." réduit significativement le nombre total de jours où le transit intestinal de l'enfant est perturbé par rapport à la préparation "Lait" ; la réduction observée est de 46%. Le nombre de jours avec des selles anormales en consistance ou en fréquence est plus faible avec la préparation "B.C." (4,3 ± 2,7), qu'avec la préparation "Yoghourt" (5,3 ± 2,5) .

Conclusion : Les préparations conformes à l' Invention permettent donc de réduire la durée totale de l'épisode diarrheique, en diminuant la durée pendant laquelle l'enfant présente une ou plusieurs selles liquides par jour et en diminuant la durée pendant laquelle l'enfant présente des selles molles. La propriété anti-diarrhéique se traduit également par une diminution du nombre de jours pendant lesquels l'enfant présente des selles de consistance ou de fréquence anormales.