Oligosacaridos utilizables para inhibir la mitosis de astrocitos y células tumorales del sistema nervioso. Su procedimiento de obtención.

Campo de la técnica

Oligosacáridos (C07H3) y preparaciones medicamentosas que contienen ingredientes orgánicos activos (A61K31).

Introducción

La muerte o lesión neuronal está siempre asociada con un aumento en el número, tamaño y apariencia fibrosa de los astrocitos. La transición de los astrocitos del estado quiescente al estado reactivo tiene gran importancia desde el punto de vista clínico porque da lugar a la formación de la cicatriz glial que es uno de los principales problemas para la recuperación funcional del sistema nervioso central. Después de una lesión la proliferación de astrocitos precede al crecimiento de axones e impide su paso a través del área dañada, lo que hace imposible el restablecimiento de las sinapsis. Por tanto, la reparación del sistema nervioso central requiere la intervención externa para modificar el transcurso relativo de la proliferación glial y el crecimiento axonal. Así, resulta de gran importancia la purificación de las substancias naturales involucradas en el control de la división de las células gliales o la síntesis de moléculas similares a dichas substancias naturales.

En estudios recientes hemos demostrado la existencia en cerebro de rata sana de inhibidores de la mitosis de astrocitos cuyos niveles disminuyen considerablemente después de una lesión y también hemos postulado que el dominio estructural responsable de la inhibición posiblemente sea un carbohidrato complejo relacionado con los grupos sanguíneos A H o Lewis [Nieto-Sampedro, M. and Broderick, J.T. (1988) A soluble brain molecule related to epidemial growth factor receptor es a mitogen inhibitor for astrocytes. J. Neurosci. Res. 22: 28-35]. Además hemos comprobado que oligosacáridos de estructuras similares a los grupos sanguíneos son capaces de inhibir la proliferación de astrocitos in vitro.

Estado de la técnica

La patente europea EP 0394971 (de 31/10/90) reivindica el uso de Inhibidores conteniendo oligosaáricos, del crecimiento de células endoteliares y angiogenesis. La patent se refiere a compuestos conteniendo de 6 a 8 sacáridos en su molécula- Puede también citars la patente europea EP 0208623 (de 14/01/87) tiulada Uso de poli y oligosacáridos par obtención de medicamentos activos en la patología de los tejidos conjuntivos.

Los compuestos objeto de la presente invención son nuevos y por consiguiente no hay nada publicado referente a su síntesis.

Descripción de la invención

En esta patente se describe un procedimiento de obtención de oligosacáridos inhibi¬ dores de la mitosis de astrocitos y células tumorales del sistema nervioso, probablemente análogos de inhibidores naturales, y la investigación de su actividad inhibitoria.

Se han preparado trisacáridos de fórmula general 8 y tetrasacáridos de fórmula general

13 a partir de β-lactósidos de fórmula general 1. Los intermedios comunes para la síntesis de productos de tipo 8 y 13 (compuestos de fórmula general 2) han sido los 3'-O- -alil-β-lactósidos obtenidos a partir de 1 previa activación selectiva de la posición 3' con óxidos de alquil estaño y posterior alilación. La bencilación controlada de los compuestos de tipo 2 da lugar a compuestos perbencilados (3) y a productos parcialmente bencilados (4). Los compuestos de tipo 3 se han utilizado en la síntesis de los trisacáridos de tipo 8 y los compuestos de tipo 4 se han utilizado en la síntesis de los tetrasacáridos de tipo 13.

1 R ¹ = - n-alquilo, o o arilo

R ² =R ³ =R ⁴ = H

2 R ¹ = - n-alquilo, o (CH ₂ ) ₇ -CO ₂ Me, o (CH-^NCBz, o arilo R ² = R ³ = H, R ⁴ = alilo

3 R ¹ = C _j -Cg n-aiquilo, o (CH ₂ ) ₇ -CO ₂ Me, o (CH^NCBz, o arilo R ² = R ³ = bencilo, R ⁴ = alilo

4 R ¹ = C _j - n-alquilo, o (CH^-CO- _j Me, o (CH^NCBz, o arilo R ² = bencilo, R ³ = H R ⁴ = alilo

5 R ¹ = C, - n-alquilo, o (CHJ ₇ -C0 ₂ Me, o (CH;-) ₇ NCBz, o arilo R ² = R ³ = bencilo, R ⁴ = H

6 R ¹ = C _j - n-alquilo, o (CH^-CO- _j Me, o (CH^NCBz, o arilo

R ² = R ³ = bencilo, R4 =

7 R ¹ = C _j - n-alquilo, o

(CH ₂ ) ₇ -CO ₂ Me, o (CH^NCBz, o arilo

R2 ² = _ _P R3 ³ _ = T HT, p R4 ⁴ _ =

8 R ¹ = - n-alquilo, o (CH^-CO-Me, o (CH^NCBz, o arilo

9 R ¹ = -Cg n-alquilo, o (CH^-CO^e, o (Cíi^NCBz, o arilo

10 R ¹ = -Cg n-alquilo, o (CH ₂ ) ₇ -CO ₂ Me, o (CH^NCBz, o arilo

11 R ¹ = - n-alquilo, o (CH^-CO _^ Me, o (CH^NCBz, o arilo, R ² = bencilo,

12 R ¹ = - n-aIquüo,o(CH^α> ₂ Me,o(CH ₂ ) _τ NCBz, o arilo

R ² = H, R ³

13 R ¹ = C _j - n-alquilo, o ( H-) ₁ -C0 ₂ Mc, o (CH^NCBz, o arilo

Los compuestos de fórmula general 3 se han sometido a dasalilación para dar com¬ puestos de tipo 5 que se han glicosilado con un donador de 2-azido-2-desoxi-α-D-galac- topiranosilo dando los trisacáridos protegidos de tipo 6. La reducción del grupo azido acom¬ pañada de desbencilación con acetilación simultanea del grupo amino dio lugar a intermedios del tipo 7 que tras O-desacetilación condujeron a los trisacáridos de tipo 8.

Los compuestos de fórmula general 4 se han glicosilado con un donador de α-D — fucopiranosilo para dar los trisacáridos protegidos de tipo 9 que por desalilación han condu¬ cido a compuestos de fórmula general 10. Los compuestos de tipo 10 se han sometido a una segunda reacción de glicosilación con un donador de 2-azido-2-desoxi-α-D-galactopirano- silo para dar los tetrasacáridos protegidos de tipo 11. La desbencilación de los productos de tipo 11 con reducción concomitante del grupo azido y N-acetilación simultanea del grupo

amino condujo a los intermedios de tipo 12 que por O-desacetilación dieron lugar, finalmen te, a los tetrasacáridos de tipo 13.

La actividad inhibitoria de los oligosacáridos sintetizados se ha investigado analizand sus efectos sobre la incorporación de timidina al DNA en diferentes células del sistem nervioso durante el proceso de división celular. Los resultados indican que compuestos d este tipo tienen una potencial aplicación como inhibidores de la división celular, particu larmente en el control de la aparición de la cicatriz glial y en el tratamiento de tumores de sistema nervioso.

Los siguientes ejemplos ilustran el proceso sintético y muestran las mediciones de actividad biológica con algunos de los productos preparados. Debe ser entendido, sin embar¬ go, que la invención no está limitada a los reactivos y condiciones mostrados en los ejem¬ plos.

Ejemplos

Preparación del trisacárido 8

Una mezcla de metil β-lactósido (1 con R ¹ = Me, 17.26 g, 45.24 mmol), óxido de dibutilestaño (14.62 g, 58.75 mmol) y tamiz molecular tipo 3Á (58 g) en acetonitrilo (975 mi) se calentó a reflujo con agitación durante 14 h. Posteriormente, se añadieron bromuro de tetrabutilamonio (7.21 g, 22.38 mmol) y bromuro de alilo (55.2 g, 0.45 mol) y se continuó la calefacción. Al cabo de 9 h se añade más bromuro de tetrabutilamonio (2.4 g, 7.5 mmol) y bromuro de alilo (19 g, 0.15 mol) y se dejó continuar la reacción durante 14 h adicionales. La mezcla de reacción se filtró y el filtrado se concentró a sequedad. Al residuo se adicionó acetato de etilo y el sólido precipitado de metil 3 -alil-β-lactósido (2 con R ¹ = Me, 7.27 g) se filtró. El filtrado se concentró y al residuo resultante se adicionó metanol hasta aparecer un sólido cristalino que se filtró y desechó. El filtrado se evaporó a sequedad y se fraccionó en una columna de gel de sílice empleando acetato de etilo-metanol (6:1 -> 3:2) como eluyente. Se obtuvo una fracción que contiene 2 (5.82 g) que se juntó con el obtenido anteriormente.

El compuesto 2 (5 g, 14 mmol) se trató con cloruro de bencilo (30 mi) en presenci de hidróxido potásico (9 g) y la mezcla se calentó a 100 °C durante 30 min. Transcurrid este tiempo, se dejó enfriar, se diluyó con cloroformo (150 mi) y se lavó sucesivamentre co agua, H ₂ SO ₄ 1M y agua. La disolución clorofórmica se secó (Na ₂ SO ₄ ) y evaporó. El residu se pasó a través de una columna de gel de sílice empleando hexano-acetato de etilo (1:0 - 4:1) como eluyente. Se obtuvo primero el compuesto 3 (R ¹ = Me) (4.90 g, 41%) y a conti nuación 4 (R ¹ = Me) (2.92 g, 28%).

El compuesto 3 (5 g, 5.34 mmol) se disolvió en una mezcla de acetato de etilo-eta nol-ácido acético -agua (2:2:1:1, 60 mi) y se calentó a 80-90 °C con agitación en presenci de catalizador de Pd al 10% sobre carbón activo (200 mg). Al cabo de 10 h el Pd/C se filtró se lavó con cloroformo y el filtrado y aguas de lavado se juntaron y lavaron con una disolu ción acuosa de NaHCO ₃ y, posteriormente, agua. La fase orgánica se concentró y el residu se cromatografió en una columna de gel de sílice (hexano-acetato de etilo 5:1 →* 3:1) par obtener 5 (R ¹ = Me) (2.61 g, 55%).

Una mezcla de 5 (1.5 g, 1.67 mmol), cianuro mercúrico (2.41 g, 9.53 mmol), bromuro mercúrico (3.48 g, 9.65 mmol) y tamiz molecular tipo 4 Á en diclorometano (85 mi), se agitó a temperatura ambiente bajo atmósfera de argón durnate 1 h. Al cabo de este tiempo, se adicionó bromuro de 3,4,6-tri-O-acetil-2-azido-2-desoxi-α-D-galactopiranosilo (0.77 g, 1.95 mmol) disuelto en diclorometano (5 mi) y se continuó la agitación. Pasadas 13 y 22 horas se adicionó más bromuro de galactopiranosilo (0.85 g, en cada adición) y la reacción se dejó estar durante 60 h, tras lo cual se filtró y el filtrado se lavó sucesivamente con diso¬ luciones acuosas de Nal al 10%, NaHCO ₃ saturada y agua. La fase orgánica se secó (Na ₂ SO ₄ ) y evaporó. El simpo resultante se pasó a través de una columna de gel de sílice (hexano-a¬ cetato de etilo 3:1 -> 7:4) para dar lugar a 6 (R ¹ = Me) (1.7 g, 87%) como un simpo. [a] _D +61.2 ² (c = 0.7, cloroformo).

El compuesto 6 (1.75 g, 1.45 mmol) disuelto en etanol (100 mi) en presencia de anhídrido acético (2 mi) se hidrogenó empleando catalizador de paladio sobre carbón activo

(1 g) durante 4 días. La suspensión se filtró sobre celita y el filtrado se concentró a sequedad para dar un simpo que se purificó sobre una columna de gel de sílice (cloroformo-metanol

8:1). Se obtuvo 7 (R ¹ = Me) (0.75 g, 75%). P.f. 149-151 °C, [a] _D +94.0 ² (c = 0.6, etanol Este compuesto se disolvió en una solución 0.1 M de metóxido sódico en metanol (4 mi) temperatura ambiente, se dejó estar durante 30 min y a continuación se trató con amberlit IR-120 (H ⁺ ) hasta neutralidad, se filtró y se concentró a sequedad para dar el trisacárido (R ¹ = Me) (0.54 g, 95%), como un sólido. P.f. 293-298 °C, [a] _D +124.5 ^Q (c = 0.5, agua).

Preparación del tetrasacárido 13

Una mezcla de 4 (R ¹ = Me) (2.94 g, 3.48 mmol) (obtenido de la bencilación de 2) o bromuro mercúrico (0.4 g, 1.11 mmol), tamiz molecular 4Á (5.7 g) en diclorometano (40 mi se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. Pasado este tiempo, se adicionó bromuro d 2,3,4-tri-O-bencil-a-L-fucopiranosilo (2.4 g, 4.83 mmol) disuelto en diclorometano (40 mi lentamente durante 5 h y se continuo la agitación durante 1 h adicional, tras lo cual, l mezcla de reacción se filtró sobre celita, se lavó sucesivamente con disoluciones acuosas de KI al 10%, NaHCO ₃ saturada y agua. La fase orgánica se secó (Na ₂ SO ₄ ) y evaporó a seque- dad. El residuo simposo se pasó a través de una columna de gel de sílice (hexano-acetato de etilo 5:1) para obtener 9 (R ¹ = Me) (3.94 g, 84%) como un simpo. [a] _D -40.3 ^a (c = 0.7, cloroformo).

El compuesto 9 (3.57 g, 2.83 mmol) disuelto en acetato de etilo (28 mi) y etanol 95% (140 mi), se trató con ácido p-toiuensulfónico (0.28 g) y catalizador de paladio sobre carbón activado (0.52 g). La mezcla se calentó a 80 ^δ C con agitación durante 1 h y 30 min, pasado este tiempo se filtró sobre celita, se adicionó trietilamina (0.5 mi) y se evaporó. El simpo resultante se cromatografió sobre una columna de gel de sílice (hexano-acetato de etilo 4:1) dando lugar a 10 (R ¹ = Me) (2.24 g, 65%), [a] _D -40.8 ^a (c = 0.6, cloroformo).

Una mezcla de 10 (2.12 g, 1.73 mmol), cianuro mercúrico (2.1 g, 8.31 mmol), bromuro mercúrico (3.04 g, 8.43 mmol), tamiz molecular 4Á (11.4 g) en diclorometano (76 mi) se agitó a temperatura ambiente durante 1 h, tras la cual, se añadió una disolución de bromuro de 3,4,6-tri-O-acetil-2-azido-2-desoxi-α-D-galactopiranosilo (2 g, 5.07 mmol) disuelto en diclorometano (40 mi) y se continuó la agitación. AI cabo de 20, 30, 52 y 76 h se adicionó más bromuro de galactopiranosilo (0.4, 0.43, 0.23 y 0.2 g respectivamente) y, después de 92 h, más Hg(CN) ₂ y HgBr ₂ (1.05 y 1.52 g, respectivamente). Pasadas 120 h, la

mezcla de reacción se filtró sobre celita, se lavó con disoluciones acuosas de KI al 10%, NaHCO ₃ saturada y agua. La solución orgánica se evaporó a sequedad y el residuo se pas a través de una columna de gel de sílice (hexano-acetato de etilo 3:1 -> 7:4). Se obtuvo 1 (R ¹ = Me) (2.22 g), impurificado con el bromuro de galactopiranosilo, que se utilizó en l siguiente etapa. Esta fracción (2.17 g) se disolvió en etanol absoluto (100 mi) conteniend anhídrido acético (1.5 mi) y se trató con hidrógeno en presencia de catalizador de paladi sobre carbón activo (0.5 g) durante 60 h. La suspensión se filtró sobre celita y se evaporó sequedad. El residuo se fraccionó en columna de gel de sílice (cloroformo-metanol 6:1) y se obtuvo 12 (R ¹ = Me) (0.86 g, 74%) como un sólido. P.f. 162-167 ^Q C, [α] _D +28.2° (c = 0.9, metanol).

El compuesto 12 (0.81 g, 0.97 mmol) se trató con una disolución 0.1M de metóxido sódico en metanol (150 mi) durante 30 min. La mezcla de reacción se neutralizó con amber- lita IR-120 (H ⁺ ) y se evaporó. Se obtiene 13 (R ¹ = Me) (0.69 g, 100%), como un sólido. P.f. 165-167 ^a C, [α] _D +33.8 ^S (c = 0.4, agua).

Actividad biológica de los compuestos 8 y 13

La inhibición de la mitosis producida por los oligosacaridos sintetizados se comprobó in vitro midiendo la incorporación de timidina tritiada [Nieto-Sampedro, M. (1987) Astrocyte mitogenic activity in aged normal and alzheimer's human brain. Neurobiol. Aging. 8: 249-2- 52] en cultivos de astrocitos preparados según el método de McCarthy y de Vellis [McCar- thy, K.D. and de Vellis, J. (1980) Preparation of sepárate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell. Biol. 85: 890-902] y en cultivos de células tumora¬ les del sistema nervioso. Las tablas 1 y 2 recogen los ejemplos concretos de las inhibiciones producidas por los compuestos 8 y 13 a diferentes concentraciones sobre astrocitos y las lineas celulares A7 (glioma), N ₂ A y N1E 115 (neuroblastomas).

TABLA 1 Inhibición de la incorporación de timidina (% respecto al control) producida en dife¬ rentes células por el compuesto 8 (R ¹ = Me)

Conc (μM) N2A N1E 115

1000.0 72.1 87.3 500.0 53.2 73.8 250.0 45.7 54.4 125.0 21.6 21.8 62.5 9.6 11.3 31.3 0.0 0.0 15.6 0.0 0.0

TABLA 2 Inhibición de la incorporación de timidina (% respecto al control) producida en dife¬ rentes células por el compuesto 13 (R ¹ = Me)

Conc (μM) N2A N1E 115

1000.0 100.0 100.0

500.0 95.1 96.4

250.0 73.8 64.4

125.0 46.3 40.8

62.5 38.2 22.6

31.3 11.2 8.9

15.6 4.1 0.0