Stoffgemisch und Verwendung eines Stoffgemischs für eine Polymerase- Kettenreaktion

Stand der Technik

Mikrofluidische Diagnosesysteme wie sogenannte Lab-on-a-Chip-Systeme erlauben die automatisierte und integrierte Durchführung komplexer fluidischer Arbeitsabläufe für den spezifischen Nachweis unterschiedlicher Moleküle. Aus der DE 10 2011 017 596 AI ist beispielsweise ein Lab-on-a-Chip-System zum Nachweis von Nukleinsäuren aus Zellen einer in das Lab-on-a-Chip-System einzugebenden Probe bekannt. Dabei werden Zellen in der Probe lysiert und deren DNA extrahiert, um diese anschließend mittels einer Polymerase- Kettenreaktion zu amplifizieren und auf einem DNA-Microarray nachzuweisen.

Die Effektivität der Polymerase-Kettenreaktion und des anschließenden

Nachweis über das DNA-Microarray hängen dabei maßgeblich von einer Qualität der Probenaufbereitung ab.

Offenbarung der Erfindung

Vorteile der Erfindung

Gegenstand der Erfindung ist ein Stoffgemisch für eine Polymerase- Kettenreaktion, insbesondere für eine Polymerase-Kettenreaktion, kurz PCR, in einer mikrofluidischen Vorrichtung, wobei das Stoffgemisch mindestens 2,5, bevorzugt mindestens 3 Millimolar Magnesiumchlorid aufweist. Gegenstand der Erfindung ist ferner eine mikrofluidische Vorrichtung mit einem solchen Stoffgemisch, wobei das Stoffgemisch insbesondere in der mikrofluidischen Vorrichtung vorgelagert ist.

Unter einem Molar ist insbesondere eine Stoffkonzentration von einem Mol pro Liter zu verstehen. Unter 2,5 Millimolar Magnesiumchlorid kann somit

insbesondere eine Stoffmenge von 2,5 Tausendstel Mol Magnesiumchlorid in einem Volumen von einem Liter des Stoffgemisches verstanden werden.

Das vorgestellte Stoffgemisch hat den Vorteil, dass ein nach einer Lyse der Zellen in der Probe üblicher Schritt einer DNA-Aufreinigung, welcher

insbesondere einen Einsatz von Waschpuffern für beispielsweise ein Umpuffern erfordert, entfallen kann. Somit werden vorteilhafterweise Sensitivitätsverluste bei einem nachfolgenden Nachweis, beispielsweise über einen Microarray oder mittels einer quantitiven PCR, durch eine im Zuge der DNA-Aufreinigung erfolgten Verdünnung vermieden. Eine DNA-Aufreinigung umfasst

typischerweise eine Vermischung des Lysats, also insbesondere des Gemischs aus lysierter Probe und Lysepuffer, mit einem Bindepuffer und eine nachfolgende Inkontaktbringen mit einem Feststoff, meist einer Silikamembran, für eine

Bindung von DNA aus dem Lysat mit der Oberfläche des Feststoffs. Eine

Bindung der gesamten in dem Lysat vorhandenen DNA mit der Oberfläche ist normalerweise nicht möglich. Anschließend erfolgt eine Waschung des Feststoffs gefolgt von einer Ablösung der noch an der Oberfläche des Feststoffs

gebundenen DNA mit einem weiteren Puffer, die sogenannte Elution. Eine vollständige Ablösung der gebundenen DNA ist hier normalerweise nicht möglich. Somit ergeben sich sowohl bei der Bindung an den Feststoff als auch bei der nachfolgenden Ablösung Verluste an DNA, was sich negativ auf die Sensitivität eines Nachweises der DNA auswirkt. Im Gegensatz dazu ist es aufgrund der Erfindung vorteilhafterweise möglich, die gesamte lysierte Probe dem erfindungsgemäßen Stoffgemisch unmittelbar zuzugeben und damit die gesamte Probe mit der gesamten darin enthaltenen DNA für eine weitere

Prozessierung in der mikrofluidischen Vorrichtung zu verwenden.

Insbesondere ist eine DNA-Aufreinigung üblicherweise deshalb erforderlich, um in einem für eine thermische, chemische oder Ultraschall-Lyse verwendeten Stoffgemisch enthaltene Ethylendiamintetraessigsäure, kurz EDTA, und andere PCR-Inhibitoren nach der Lyse soweit zu entfernen oder zu verdünnen, um eine Behinderung der nachfolgenden Polymerase-Kettenreaktion durch EDTA zu minimieren. Bei dem für die Lyse verwendeten Stoffgemisch kann es sich beispielsweise um eine für die Lyse erforderlichen Pufferlösung handeln, auch Lysepuffer genannt.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass EDTA eine für die Polymerase- Kettenreaktion erforderliche Menge an Magnesiumchlorid bindet, insbesondere komplexiert, und somit für die nachfolgende Polymerase-Kettenreaktion inaktiviert. Durch die erfindungsgemäße Mindestmenge an Magnesiumchlorid in dem Stoffgemisch für die Polymerase-Kettenreaktion wird die durch EDTA inaktivierte Menge an Magnesiumchlorid kompensiert und genügend

Magnesiumchlorid für die Polymerase-Kettenreaktion bereitgestellt. Dies hat den Vorteil, dass eine Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung des

Stoffgemisches unmittelbar nach einer Lyse mit EDTA enthaltenden Lysepuffer durchgeführt werden kann. Wie bereits oben erwähnt, können daher

vorteilhafterweise ansonsten erforderliche Zwischenschritte, insbesondere eine DNA-Aufreinigung, zwischen Lyse und Polymerase-Kettenreaktion weggelassen werden.

Vorzugsweise umfasst das Stoffgemisch mehr als 2,5 Millimolar

Magnesiumchlorid, insbesondere mindestens oder mehr als 3 Millimolar Magnesiumchlorid, ganz bevorzugt mindestens 4 Millimolar Magnesiumchlorid. Es kann auch mindestens 3,5 oder mindestens 4,5 Millimolar Magnesiumchlorid aufweisen. Eine maximale Menge von 10 Millimolar Magnesiumchlorid ist vorzugsweiseausreichend, um eine typischerweise gegebene Konzentration von EDTA im Lysepuffer auszugleichen Insbesondere kann das Stoffgemisch zwischen 3,5 und 4,5 Millimolar Magnesiumchlorid umfassen, da dieser

Konzentrationsbereich für die meisten Anwendungen einer Polymerase- Kettenreaktion in Kombination mit üblicherweise erhältlichen Lysepuffern, welche EDTA enthalten, ausreicht.

In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung liegt das Stoffgemisch in gefriergetrockneter Form vor. Dies hat den Vorteil, dass das Stoffgemisch in kompakter und einfacher Weise einer mikrofluidischen Vorrichtung zugegeben oder vorzugsweise in der mikrofluidischen Vorrichtung vorgelagert werden kann. Besonders vorteilhaft ist hierbei, dass das gefriergetrocknete Stoffgemisch mit der gesamten lysierten Probe in einfacher Weise für eine Rehydrierung des Stoffgemisches vermischt werden kann. Aufgrund der oben erläuterten

Kompensierung des inhibitorischen Effekts der EDTA muss die lysierte Probe vor dem Vermischen mit dem Stoffgemisch vorteilhafterweise nicht weiter prozessiert werden. Eine Rehydrierung des Stoffgemisches kann jedoch optional durch zusätzliche Zugabe einer Flüssigkeit unterstützt werden, beispielsweise durch Zugabe von Wasser.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Gemisch, insbesondere ein zweites Stoffgemisch, umfassend ein erfindungsgemäßes Stoffgemisch für eine

Polymerase, wobei das Gemisch zusätzlich zu einer Konzentration von mindestens 2,5 Millimolar Magnesiumchlorid für jedes in dem Gemisch enthaltene Millimolar an EDTA mindestens 1 Millimolar, bevorzugt mindestens

1,5 Millimolar, ganz bevorzugt mindestens 2,0 Millimolar Magnesiumchlorid umfasst. Das erfindungsgemäße Gemisch kann somit neben dem

erfindungsgemäßen Stoffgemisch einen für die Lyse der Probe zu benutzenden Lysepuffer und insbesondere auch die lysierte Probe umfassen. Dieses Gemisch hat den Vorteil, dass die inhibierende Wirkung einer durch den Lysepuffeer vorliegenden hohen EDTA-Konzentration durch eine entsprechend hohe

Konzentration an Magnesiumchlorid wie oben beschrieben kompensiert wird. Gegenstand der Erfindung ist auch eine Verwendung dieses Gemischs für eine Polymerase Kettenreaktion, insbesondere für eine Polymerase- Kettenreaktion in einer mikrofluidischen Vorrichtung,

Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Verwendung eines Stoffgemisches für eine Polymerase Kettenreaktion, insbesondere für eine Polymerase- Kettenreaktion in einer mikrofluidischen Vorrichtung, wobei das Stoffgemisch mindestens 2,5, bevorzugt mindestens 3 Millimolar Magnesiumchlorid aufweist.

Wie oben ausgeführt, kann das Stoffgemisch mehr als 2,5 Millimolar

Magnesiumchlorid aufweisen, insbesondere mindestens oder mehr als 3

Millimolar Magnesiumchlorid, ganz bevorzugt mindestens 4 Millimolar

Magnesiumchlorid. Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein Verfahren zur Durchführung einer Polymerase- Kettenreaktion, insbesondere einer Durchführung einer Polymerase- Kettenreaktion in einer mikrofluidischen

Vorrichtung mit einem mindestens 2,5, bevorzugt mindestens 3 Millimolar Magnesiumchlorid aufweisenden Stoffgemischs.

Bevorzugt wird das Stoffgemisch mit einer Probe vermischt, wobei die Probe vorzugsweise lysierte Zellen enthält. Wie oben ausgeführt, hat die

erfindungsgemäße Verwendung bzw. das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, dass der Effekt einer Inaktivierung von Magnesiumchlorid für eine nachfolgende Polymerase- Kettenreaktion durch in der Probe enthaltene EDTA vorteilhafterweise durch die erfindungsgemäße Mindestmenge an

Magnesiumchlorid in dem Stoffgemisch kompensiert wird.

Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung wird das Stoffgemisch mit einem Gemisch aus einer Probe und einem Lysepuffer vermischt, wobei die Vermischung vorzugsweise nach Durchführung einer Lyse von in der Probe enthaltenen Zellen unter Zuhilfenahme des Lysepuffers erfolgt. Dies hat den Vorteil, dass eine sonst übliche DNA-Aufreinigung wie oben beschrieben vermieden werden kann. Somit ist es vorteilhafterweise möglich, die gesamte lysierte Probe dem erfindungsgemäßen Stoffgemisch unmittelbar zuzugeben und damit die gesamte Probe mit der gesamten darin enthaltenen DNA für eine weitere Prozessierung in der mikrofluidischen Vorrichtung zu verwenden.

In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung wird zumindest ein Teil des Magnesiumchlorids des Stoffgemischs vor oder nach einem Vermischen der Probe mit einer Restmenge des Stoffgemisches mit der Probe vermischt. Dies hat den Vorteil, dass das erfindungsgemäße Stoffgemisch erst beim Vermischen mit der Probe realisiert wird, und somit das Stoffgemisch nicht vor dem

Vermischen bereits vorbereitet werden muss. Dies hat insbesondere den Vorteil, dass kommerziell erhältliche vorgegebene Stoffgemische für eine Polymerase- Kettenreaktion, welche üblicherweise bis zu 2 Millimolar Magnesiumchlorid bereits enthalten und als PCR-Mastermix bezeichnet werden, durch Zugabe von mindestens 0,5, bevorzugt mehr als 0,5, insbesonders mindestens 1 Millimolar Magnesiumchlorid zum erfindungsgemäßen Stoffgemisch weitergebildet werden können. Vorzugsweise erfolgt das Vermischen des Stoffgemischs mit der Probe nach einer Lyse zumindest eines Teils von in der Probe enthaltenen Zellen. Dabei kann, wie bereits oben ausgeführt, durch bei der Lyse verwendetes EDTA inaktiviertes Magnesiumchlorid durch die Zugabe des Stoffgemischs

vorteilhafterweise ausgeglichen werden

In einer besonders vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung erfolgt das

Vermischendes Stoffgemisches mit der Probe nach einer Lyse zumindest eines Teils von Zellen der Probe ohne DNA-Aufreinigung. Insbesondere ist vorteilhafterweise keine DNA-Aufreinigung nach einer Lyse und vor dem

Vermischen mit dem Stoffgemisches und nach folgender Polymerase- Kettenreaktion erforderlich. Damit wird, wie oben beschrieben ein Verlust an Probenmaterial verhindert und eine Ausbeute an Probenmaterial für eine nachfolgende Prozessierung maximiert.

In einer besonders bevorzugten Weiterbildung der Erfindung korreliert eine Menge von Magnesiumchlorid in dem Stoffgemisch für die Polymerase- Kettenreaktion positiv mit einer Menge von EDTA in einem Stoffgemisch für eine Lyse. Bei dem Stoffgemisch für die Lyse kann es insbesondere um eine

Pufferlösung für die Lyse handeln, welches insbesondere nach der Lyse mit dem

Stoffgemisch für die Polymerase-Kettenreaktion vermischt wird Dies hat den Vorteil, dass abhängig von einer Menge von EDTA ausreichend

Magnesiumchlorid zugegeben wird, um die Inaktivierung zumindest eines Teils des Magnesiumchlorids durch das EDTA auszugleichen. Vorzugsweise wird für jedes Millimolar EDTA im Stoffgemisch für die Lyse mindestens ein Millimolar, bevorzugt mindestens 1,5 Millimolar, ganz bevorzugt mindestens 2,0 Millimolar Magnesiumchlorid dem Stoffgemisch für die Polymerase-Kettenreaktion zugegeben, wobei das Stoffgemisch für die Polymerase-Kettenreaktion vor der Zugabe bereits mindestens 2,5 Millimolar Magnesiumchlorid umfasst. Wie oben beschrieben umfasst die Erfindung auch ein Gemisch umfassend das erfindungsgemäße Stoffgemisch für eine Polymerase-Kettenreaktion und insbesondere ein Stoffgemisch für eine Lyse, wobei das Gemisch zusätzlich zu einer Konzentration von mindestens 2,5 Millimolar Magnesiumchlorid für jedes in dem Gemisch enthaltene Millimolar an EDTA mindestens 1 Millimolar, bevorzugt mindestens 1,5 Millimolar, ganz bevorzugt mindestens 2,0 Millimolar Magnesiumchlorid und zusätzlich mindestens 2,5 Millimolar Magnesiumchlorid umfasst.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen schematisch dargestellt und in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Für die in den verschiedenen Figuren dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente werden gleiche Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung der Elemente verzichtet wird.

Es zeigen

Figur 1 eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Stoff gern ischs gemeinsam mit einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion,

Figur 2 ein Flussdiagramm der erfindungsgemäßen Verwendung bzw. des

erfindungsgemäßen Verfahrens und

Figur 3 ein schematisches Diagramm eines über ein DNA-Microarray des

mikrofluidischen Systems durchgeführten DNA-Nachweises nach Verwendung des erfindungsgemäßen Stoffgemisches.

Ausführungsformen der Erfindung

Figur 1 zeigt einen Ausschnitt einer mikrofluidische Vorrichtung 100, welche eine erste Kammer 130 für eine Lyse einer in der ersten Kammer 130

aufgenommenen Probe 50 aufweist. Die erste Kammer 130 umfasst einen Filter 120 zur Akkumulation von zu lysierenden Zellen, beispielsweise Bakterien, aus der Probe 50. Bei dem Filter kann es sich beispielsweise um einen Filter aus beispielsweise Polytetrafluorethylen, Polyvinylidenfluorid oder Polycarbonat mit Porengrößen zwischen 0,025 μηη bis 10 μηη, bevorzugt zwischen 0,1 μηη und 1 μηη handeln. Beispielsweise kann es sich dabei um einen Filter von Merck Millipore® wie Isopore™, Mitex™, Omnipore™ oder Durapore™ handeln. Nach einer Aufkonzentration der Zellen auf dem Filter 120 kann eine Lyse,

beispielsweise eine thermische Lyse, unter Zuhilfenahme eines Lysepuffers durchgeführt werden, welcher Ethylendiamintetraessigsäure enthält. Der

Lysepuffer kann ferner beispielsweise 1 % Triton X-100, 0,5% tween 20, 10 Millimolar TRIS-HCL und 1 Millimolar ETDA umfassen. Für die Durchführung einer thermischen Lyse kann die mikrofluidische Vorrichtung 100 eine an die erste Kammer 130 angrenzende erste Heizeinrichtung 140 umfassen.

Die erste Kammer 130 ist mit einer zweiten Kammer 180 über ein Ventil 110 fluidisch verbunden. In diesem Ausführungsbeispiel weist die zweite Kammer

180 ein Stoffgemisch 10 für die Polymerase- Kettenreaktion auf, wobei das Stoffgemisch mindestens 2,5, bevorzugt mindestens 3 Millimolar

Magnesiumchlorid umfasst. Das Stoffgemisch 10 kann beispielsweise in der Kammer 180 im Zuge der Herstellung der mikrofluidischen Vorrichtung 100 in der Kammer 130 in gefriergetrockneter Form vorgelagert werden Dabei kann das

Stoffgemisch 10 neben dem mindestens 2,5, bevorzugt mindestens 3 Millimolar Magnesiumchlorid weitere Stoffe für die Durchführung einer Polymerase- Kettenreaktion umfassen. Alternativ können ein Teil des Stoffgemischs, insbesondere die mindestens 3 Millimolar Magnesiumchlorid, separat von einem Rest des Stoffgemischs 10 in der zweiten Kammer 180 vorgelagert werden.

Beispielsweise kann ein kommerziell erhältliches Stoffgemisch für eine

Polymerase- Kettenreaktion, wie beispielsweise illustra PuReTaq Ready-To-Go™ von GE Healthcare, LyoSphere™ von BioLyph LLC oder High Fidelity PCR EcoDry™ von Clontech Laboratories, Inc., vor Zugabe in die erste Kamer 130 mit dem erfindungsgemäßen Stoffgemisch 10 vermischt werden oder beide

Stoffgemische können nebeneinander in der ersten Kammer 130 vorgelagert werden. Üblicherweise enthält ein solches kommerziell erhältliches Stoffgemisch für eine Polymerase-Kettenreaktion bereits bis zu 2 Millimolar Magnesiumchlorid, so dass entsprechend mindestens 0,5, bevorzugt mindestens 1 Millimolar Magnesiumchlorid zusätzlich hinzugefügt werden müssen.

Nach der in der ersten Kammer 130 erfolgten Lyse kann das Gemisch aus Lysepuffer und lysierter Probe bei geöffnetem Ventil 110 in die zweite Kammer 180 befördert und dort mit dem vorgelagerten Stoffgemisch 10 für die

anschließende Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion vermischt werden, was einem Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Gemischs umfassend ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Stoffgemischs 10 entspricht. Für die Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion kann die mikrofluidische Vorrichtung 100 eine an die zweite Kammer 180 angrenzende zweite

Heizeinrichtung 150 umfassen.

Die zweite Kammer 180 kann mit einer dritten Kammer 190 für einen Nachweis von über die Polymerase-Kettenreaktion amplifizierten DNA-Sequenzen mittels eines in der zweiten Kammer 180 vorgesehenen Microarrays 195 fluidisch verbunden sein.

Figur 2 zeigt ein Flussdiagramm eines Ausführungsbeispiels der

erfindungsgemäßen Verwendung bzw. des erfindungsgemäßen Verfahrens 200. Dieses Ausführungsbeispiel kann beispielsweise in der mikrofluidischen

Vorrichtung 100 der Figur 1 durchgeführt werden. In einem ersten Schritt 201 wird eine Probebereitgestellt, beispielsweise durch Einbringen der Probe in die erste Kammer 130 der mikrofluidischen Vorrichtung 100. In einem zweiten Schritt 202 erfolgt eine Lyse von in der Probe enthaltenen Zellen unter Zuhilfenahme eines Lysepuffers. Nach erfolgter Lyse wird die lysierten Probe in einem dritten Schritt 203 mit einem Stoffgemisch vermischt, wobei das Stoffgemisch mindestens 2,5 Millimolar Magnesiumchlorid umfasst und wobei das

Stoffgemisch 10 in einer zweiten Kammer 180 der mikrofluidischen Vorrichtung 100 vorgelagert sein kann. Dabei kann das Stoffgemisch ferner weitere

Substanzen für eine Polymerase-Kettenreaktion umfassen. Alternativ können diese weiteren Substanzen mit der Probe separat mit dem Stoffgemisch vermischt werden. In einem vierten Schritt 204 erfolgt die Polymerase- Kettenreaktion, wobei vorteilhafterweise zwischen der Lyse im zweiten Schritt 202 und der Polymerasen- Kettenreaktion im vierten Schritt 204 keine

Aufreinigung der lysierten Probe durchgeführt werden muss. In einem fünften Schritt 205 werden in der Probe über die Polymerase-Kettenreaktion

vervielfältigte DNA-Abschnitte detektiert, beispielsweiseunter Verwendung eines Microarrays oder mittels einer quantitativen PCR, beispielsweise in der dritten Kammer 190 der mikrofluidischen Vorrichtung 100 aus Figur 1. Figur 3 zeigt ein schematisches Diagramm 300 eines über ein DNA-Microarray eines mikrofluidischen Systems durchgeführten DNA-Nachweises nach

Verwendung des erfindungsgemäßen Stoffgemisches. Für vier verschiedene Sonden 301, 302, 303, 304 des DNA-Microarrays, wobei jede Sonde 301, 302, 303, 304 für einen unterschiedlichen DNA-Abschnitt des gram-positiven

Bakteriums caMRSA8 sensitiv ist, ist jeweils eine Intensität eines

Nachweissignals 310 für fünf unterschiedliche Konzentrationen 321, 322, 323, 324, 325 Magnesiumchlorid in dem für die Polymerase- Kettenreaktion verwendeten Stoffgemisch dargestellt. Für die vor der Polymerase- Kettenreaktion durchgeführte Lyse wurde in diesem Beispiel einer Probe mit ca.

1000 Bakterien ein Lysepuffer verwendet, welcher 1% Octoxinol 9, 0,5%

Polysorbat 20, 10 Millimolar Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-Hydrochlorid mit pH-Wert von 8,0 und 1 Millimolar EDTA umfasste. Nach der Lyse wurden dem Stoffgemisch, welches bereits 2 Millimolar Magnesiumchlorid aus einem

Standardgemisch von Reagenzien für eine Polymerase-Kettenreaktion umfasste, umfassend die Probe mit den lysierten Bakterien und dem Lysepuffer in fünf verschiedenen Einzelversuchen 321, 322, 323, 324, 325 0,5 Millimolar

Magnesiumchlorid, 1 Millimolar Magnesiumchlorid, 1,5 Millimolar

Magnesiumchlorid, 2 Millimolar Magnesiumchlorid beziehungsweise 2,5

Millimolar Magnesiumchlorid für die Weiterbildung zu einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Stoffgemischs zugegeben. Wie aus Figur 3 ersichtlich, ermöglicht es die angeführte Zugabe von Magnesiumchlorid, DNA-Sequenzen des Bakteriums caMRSA8 erfolgreich über die Polymerase-Kettenreaktion zu vervielfältigen, wobei die Vervielfältigung bei einer Zugabe von 2,5 Millimolar Magnesiumchlorid verglichen mit den Zugaben der genannten geringeren

Konzentrationen am effektivsten ist. Bereits bei einer Zugabe von 0,5 Millimolar Magnesiumchlorid, so dass das Stoffgemisch insgesamt 2,5 Millimolar

Magnesiumchlorid aufweist, ist der vorteilhafte Effekt der Erfindung zu erkennen. Bevorzugt ist für eine größere Wirkung eine Zugabe von 1 Millimolar

Magnesiumchlorid empfohlen, also insgesamt 3 Millimolar Magenesiumchlorid im

Stoffgemisch. Ganz bevorzugt ist eine Zugabe von mindestens 2 Millimolar Magnesiumchlorid, also insgesamt mindestens 4 Millimolar Magenesiumchlorid im Stoffgemisch. Ohne Zugabe von Magnesiumchlorid wurde kein

Nachweissignal erhalten, was auf eine nicht erfolgreiche Polymerase- Kettenreaktion schließen lässt. Durch die Zugabe von Magnesiumchlorid konnte jedoch die durch EDTA bewirkte Hemmung der Polymerase- Kettenreaktion ohne DNA-Aufreinigung und ohne die Verwendung weiterer Pufferlösungen oder Verdünnungen vorteilhaferweise kompensiert werden.