MEIO DE CULTURA MMP PARA PRODUÇÃO DE LIPOPEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS A PARTIR DO CULTIVO DE BACTÉRIAS, PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE LIPOPEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS E USO DO MESMO

Campo da Invenção

[0001] A presente invenção descreve um meio de cultura para bactérias visando à produção de lipopeptídeos antimicrobianos. Mais especificamente, a presente invenção refere-se um meio de cultura preferencial para a espécie Paenibacillus elgii. A presente invenção se situa no campo da microbiologia e da biotecnologia.

Antecedentes da Invenção

[0002] O surgimento de novas cepas de micro-organismos patogênicos resistentes aos antibióticos tradicionais tem impulsionado cada vez mais a busca por novas moléculas antimicrobianas. Infecções causadas por esses patógenos constituem um dos maiores problemas enfrentados por hospitais no mundo inteiro. Assim a busca por novas moléculas antimicrobianas tornaram- se uma necessidade cada vez mais urgente. Dentre as novas classes de antimicrobianos emergentes, os Peptídeos Antimicrobianos (PAM's) têm -se mostrado particularmente interessantes, por serem moléculas que apresentam rápida e eficiente atividade contra diversos patógenos e por possuírem ainda baixa toxicidade e boa estabilidade. São ainda efetivos contra uma vasta gama de patógenos e o interesse industrial por essas moléculas tem crescido bastante nos últimos anos (LAVERTY et al., 2010; PIRRI et al., 2009; ZASLOFF, 2002).

[0003] Lipopeptídeos antimicrobianos constituem moléculas formadas por uma pequena cadeia de aminoácidos ligada um ácido graxo e são produzidos por um mecanismo de síntese não ribossomal. Este tipo de síntese proporciona a síntese de uma grande diversidade de moléculas apresentando elementos não usuais em síntese ribossomal como aminoácidos modificados e D-aminoácidos (FINKING; MARAHIEL, 2004).

[0004] Bactérias do género Paenibacillus têm sido citadas frequentemente na literatura pelo seu grande potencial biotecnológico. Destacam-se pela produção de peptídeos antimicrobianos de amplo espectro, dentre os quais podemos citar as polimixinas e as fusaricidinas (ANANDARAJ et al., 2009; KIM et al., 2004; WU et al., 2010).

[0005] A família das Pelgipeptinas é uma classe de lipopeptídeos antimicrobianos produzidos por Paenibacillus elgii. Esta compreende 4 isoformas de lipopeptídeos que possuem uma cadeia de nove aminoácidos ligada de forma cíclica a uma cadeia de ácido graxo. Cada uma das 4 isoformas variam a porção de ácido graxo pela diferença de 1 CH ₂ , assim como os aminoácidos na posição 2 da cadeia peptídica, que pode ser uma L-valina ou L-isoleucina (DING et al., 201 1 ; WU et al., 2010).

[0006] Os principais fatores de importância para a produção industrial dessas moléculas é o desenvolvimento de um meio de cultura que proporcione alta produção de lipopeptídeos aliadas a um baixo custo e fácil purificação. O meio mineral proporciona fácil purificação e maior reprodutibilidade de rendimento, uma vez que há um controle maior dos componentes do meio. Já o glicerol constitui uma fonte de carbono de baixo custo, uma vez que constitui um importante subproduto da indústria do biodiesel (SILVA; MACK; CONTIERO, 2009).

[0007] Adicionalmente, a produção de lipopeptídeos por Paenibacillus requer um meio que atenda uma série de requerimentos nutricionais da bactéria. Estes requisitos são facilmente atendidos quando se adota um meio de cultura rico em nutrientes (meio complexo). No entanto, a grande dificuldade desta técnica é a abundância de componentes presentes neste meio que não são metabolizados pela bactéria e geram assim um extrato rico em impurezas e de difícil purificação. A eliminação desses resíduos requer uma etapa de precipitação ácida ou ainda de extração com butanol, técnica que muito laborosa e produtora de resíduos poluentes.

[0008] Na busca pelo estado da técnica em literaturas científica e patentária, foram encontrados os seguintes documentos que tratam sobre o tema:

[0009] O documento PI 0204124-3 A2 revela que sobre um meio de cultura para a produção de substâncias antimicrobianas. Mais especificamente, o documento descreve que a substância microbiana é um lipopeptídeo. Diferentemente da presente invenção, o documento não revela um meio de cultura específico para a espécie Paenibacillus elgii, como também não apresenta características que possibilitam a produção de um meio de cultura que proporcione um alto rendimento na produção de Pelgipeptinas. Ademais, este documento se difere da presente invenção por não revelar um processo de produção de lipopeptídeo que envolve um meio de cultura específico e que apresenta a vantagem técnica de não apresentar no processo uma etapa de purificação.

[0010] O documento US 9534019 B2 revela um processo de extração de lipopeptídeos de culturas da bactéria Paenibacillus, mais especificamente Paenibacillus elgi. Ainda, o documento refere-se ao uso de tais peptídeos para a composição para uso profilático e para tratamento de animais e plantas. Diferentemente da presente invenção, o documento não descreve sobre um meio de cultivo específico para a espécie Paenibacillus elgii.

[0011] O artigo "Isolation and Identification of Lipopeptide and Antibiotics from Paenibacillus elgii B69 with Inhibitory Activity Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus" Ding e colaboradores (2012) testaram diversos meios de cultura (SSP meio, caldo nutriente, caldo LB e caldo GS) a fim de identificar em qual meio a cepa de Paenibacillus elgii alcançaria um rendimento máximo na produção de Pelgipeptinas. Sendo que, no artigo o meio GS apresentou o maior rendimento. O meio GS descrito por Ding é diferente da presente invenção, que contem nutrientes como cálcio, indispensável para o processo de esporulação e completo ciclo celular da bactéria, além de participar da sinalização intracelular. Além disso, o meio GS e carece de nutrientes como zinco, manganês e ferro, elementos que constituem co-fatores para enzimas importantes como a DNA polimerase dentre outras. Sendo assim, apesar da bactéria ser capaz de crescer e produzir Pelgipeptinas, ela pode não ter sido capaz de atingir seu melhor desempenho no meio GS. Ainda, o meio descrito na presente invenção foi capaz de incrementar em 17 vezes a produção de Pelgipeptinas, quando comparado ao meio GS descrito por Ding.

[0012] Os documentos supracitados não descrevem sobre o meio MMP desenvolvido na presente invenção, assim como, nenhum dos documentos antecipam um processo que utilizam um meio MMP e que não necessitem de uma etapa de purificação para a extração do peptídeo. Assim, do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.

[0013] Em vista dos processos atuais utilizados para a produção de lipopeptídeos por Paenibacillus, não exaustivamente, destaca-se os problemas constantes no estado da técnica dos meios de cultivo apresentarem uma abundância de componentes presentes que não são metabolizados pela bactéria e geram assim um extrato rico em impurezas que são de difícil purificação, havendo a necessidade de mais uma etapa de purificação para a obtenção do lipopeptídeo. Além disso, em termos de rendimento, uma melhor otimização do processo é desejada, de forma a proporcionar um processo em que se obtenham maiores quantidades de lipopeptídeos.

Sumário da Invenção

[0014] Dessa forma, a presente invenção tem por objetivo resolver os problemas constantes no estado da técnica a partir de uma composição e utilização de um meio de cultura, denominado MMP, para bactérias, mais especificamente da espécie Paenibacillus elgii visando à produção de lipopeptídeos antimicrobianos. Adicionalmente, o meio de cultura MMP desenvolvido na presente invenção para a produção de Pelgipeptinas (lipopeptídeos antimicrobianos) foi desenvolvido de forma a proporcionar um alto rendimento na produção de Pelgipeptinas, assim como baixa produção de biofilme, baixo custo e fácil purificação.

[0015] O meio de cultivo MMP da presente invenção destaca-se por ser um meio mineral que atende os requisitos nutricionais da bactéria e que gera um extrato pobre em impurezas. Adicionalmente, alterações nas fontes de carbono, nitrogénio e adição de aminoácidos específicos promovem um incremento na produção de lipopeptídeos, aliada a um perfil cromatográfico limpo e que minimiza a produção de exopolissacarídeos, que por sua vez aumenta a viscosidade da cultura. Dessa forma, o meio de cultura MMP possibilita um maior rendimento dos metabólitos de interesse, não sendo necessária uma etapa de purificação, uma vez que o sobrenadante livre de células já atende os pré-requisitos de alta concentração das moléculas de interesse e baixo teor de impurezas.

[0016] Dessa forma, em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um Meio de cultura MMP para produção de lipopeptídeos antimicrobianos por bactérias sendo que o meio compreende os seguintes componentes:

de 1 ,8% a 2,5% de Glicerol em relação ao peso total do meio

MMP;

de 0,7% a 1 % de (NH ₄ ) ₂ SO ₄ em relação ao peso total do meio

MMP;

de 0,03% a 0,06% de Arginina em relação ao peso total do meio

MMP;

de 0,10% a 0,2% de K ₂ HPO ₄ em relação ao peso total do meio

MMP;

de 0,03% a 0,06% de Triptofano em relação ao peso total do meio

MMP;

de 0,015 a 0,025% de MgSO ₄ .7 H2O em relação ao peso total do meio MMP;

de 0,008% a 0,015% de CaCI ₂ .2H ₂ O em relação ao peso total do meio MMP;

de 0,08% a 0,15% de NaCI em relação ao peso total do meio

MMP;

de 0,0008% a 0,0015% de FeSO ₄ .7 H ₂ O em relação ao peso total do meio MMP;

de 0,0008% a 0,0015% de MnSO ₄ em relação ao peso total do meio MMP e;

de 0,0008% a 0,0015% de ZnSO ₄ em relação ao peso total do meio MMP.

[0017] Dessa forma, o segundo aspecto da presente invenção refere-se a um processo para produção de lipopeptídeos antimicrobianos utilizando o meio de cultura MMP, conforme definido no primeiro aspecto da invenção e as seguintes etapas:

a) transferência asséptica de uma colónia isolada de uma bactéria produtora de lipopeptídeos previamente cultivada em meio ágar nutriente para um frasco contendo no máximo 40% do seu volume de caldo nutriente;

b) incubação em uma temperatura entre 30 e 38°C com agitação, até que a absorbância a 600nm da cultura esteja entre 0,6 - 0,8;

c) retirada de 1 % do volume da cultura e lavagem asséptica das células com meio MMP estéril;

d) inoculo das células previamente lavadas em frasco contendo 40% do volume de meio MMP estéril;

e) incubação do microrganismo em uma temperatura entre 30 a 38°C com agitação, até que a absorbância a 600nm da cultura esteja entre 0,6 - 0,8;

f) transferência de 1 % da cultura em meio MMP para novo frasco contendo meio MMP (na mesma proporção acima citada) ou para fermentador contendo o meio de cultivo MMP;

g) incubação entre 30 a 38°C, sob agitação constante por um tempo necessário para a completa esporulação da cultura;

h) separação das células por centrifugação para obtenção do sobrenadante contendo os lipopeptídeos antimicrobianos.

em que a bactéria produtora de lipopeptídeos pertencem ao género

Paenibacillus e Bacillus.

[0018] Em um terceiro aspecto, a invenção refere-se ao Uso do meio MMP para a produção lipopeptídeos antimicrobiano a partir do cultivo de bactérias que produzem lipopeptídeos antimicrobianos como metabólitos.

[0019] Ainda, o conceito inventivo comum a todos os contextos de proteção reivindicados refere-se ao meio de cultura MMP.

[0020] Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.

Breve Descrição das Figuras

[0021] Com o intuito de melhor definir e esclarecer o conteúdo do presente pedido de patente, são apresentadas as presente figuras:

[0022] A Figura 1 mostra a estrutura geral das Pelgipeptinas. Dab: ácido 2,4-diaminobutírico; Phe: fenilalanina; Leu: leucina; Val: valina Ser: serina. R e X variam de acordo com o lipopeptídeo.

[0023] A Figura 2 mostra a avaliação geral da concentração de pelgipeptinas no sobrenadante em diferentes meios de cultivo, após 96 horas de crescimento.

[0024] A Figura 3 mostra a comparação dos perfis cromatográficos de: A: Sobrenadante do cultivo em meio caldo nutriente após etapa de pré- purificação. B: Sobrenadante do cultivo em meio MMP sem etapa de pré- purificação. Descrição Detalhada da Invenção

[0025] A presente invenção descreve uma composição de meio de cultura, denominada MMP, e a utilização do meio MMP para bactérias, mais especificamente da espécie Paenibacillus elgii visando à produção de lipopeptídeos antimicrobianos.

[0026] Ainda, o meio de cultura MMP da presente invenção permite a produção de pelgipeptinas a partir do cultivo de Paenibacillus. Produção de outros lipopeptídeos de interesse comercial a partir de espécies produtoras como Paenibacillus e BacHIus.

[0027] O meio de cultivo também pode ser utilizado para produção de polipeptinas por BacHIus circulans, assim como a produção de outros lipopeptídeos como polimixina e surfactina por outras espécies de BacHIus e Paenibacillus. Há um potencial de aplicação devido à semelhança dessas moléculas e suas vias sintéticas, no entanto este potencial ainda não foi explorado e testes são necessários para avaliar estas aplicações.

[0028] Em especial, a Paenibacillus elgii produz, sob condições aeróbias, lipopeptídeos pertencentes à família das Pelgipeptinas por meio de síntese não ribossomal. E a produção desses peptídeos depende diretamente da composição do meio de cultivo, o que afeta seu rendimento e composição do extrato de lipopeptídeos. Ademais, o processo de purificação dessas moléculas apresentam diferentes etapas quando cultivados em meios complexos ou definidos. Esta bactéria foi inicialmente isolada do solo e não constitui um agente patogênico humano ou animal.

[0029] A produção de pelgipeptinas depende diretamente da composição do meio de cultivo, o que afeta seu rendimento e composição do extrato de lipopeptídeos. Sendo que o meio de cultura MMP para produção de Pelgipeptinas foi desenvolvido na presente invenção de forma a proporcionar um alto rendimento na produção de Pelgipeptinas assim como baixa produção de biofilme, baixo custo e fácil purificação.

[0030] Dessa forma, em um primeiro aspecto a presente invenção refere- se a um Meio de cultura MMP para produção de lipopeptídeos antimicrobianos por bactérias sendo que o meio compreende os seguintes componentes:

de 1 ,8% a 2,5% de Glicerol em relação ao peso total do meio

MMP;

de 0,7% a 1 % de (NH ₄ ) ₂ SO ₄ em relação ao peso total do meio

MMP;

de 0,10% a 0,2% de K ₂ HPO ₄ em relação ao peso total do meio

MMP;

de 0,03% a 0,06% de Arginina em relação ao peso total do meio

MMP;

de 0,03% a 0,06% de Triptofano em relação ao peso total do meio

MMP;

de 0,015 a 0,025% de MgSO ₄ .7 H ₂ O em relação ao peso total do meio MMP;

de 0,008% a 0,015% de CaCI ₂ .2H ₂ O em relação ao peso total do meio MMP;

de 0,08% a 0,15% de NaCI em relação ao peso total do meio

MMP;

de 0,0008% a 0,0015% de FeSO ₄ .7 H ₂ O em relação ao peso total do meio MMP;

de 0,0008% a 0,0015% de MnSO ₄ em relação ao peso total do meio MMP e;

de 0,0008% a 0,0015% de ZnSO ₄ em relação ao peso total do meio MMP.

[0031] Em uma concretização de invenção, o meio de cultura MMP compreende preferencialmente os seguintes componentes:

de 2,0 % de Glicerol em relação ao peso total do meio MMP;

de 0,8% de (NH ₄ ) ₂ SO ₄ em relação ao peso total do meio MMP; de 0,17% de K ₂ HPO ₄ em relação ao peso total do meio MMP; de 0,05 % de Arginina em relação ao peso total do meio MMP; de 0,05 % de Triptofano em relação ao peso total do meio MMP; de 0,02% de MgSO ₄ .7.H ₂ O em relação ao peso total do meio

MMP;

de 0,01 % de CaCI ₂ .2H ₂ O em relação ao peso total do meio MMP; de 0,01 % de NaCI em relação ao peso total do meio MMP;

de 0,001 % de FeSO ₄ .7.H ₂ O em relação ao peso total do meio

MMP;

de 0,001 % de MnSO ₄ em relação ao peso total do meio MMP e; de 0,001 % de ZnSO ₄ em relação ao peso total do meio MMP.

[0032] O processo de fabricação do meio de cultivo descrito acima envolve as seguintes etapas:

preparar uma solução 0,5M de K ₂ HPO ₄ e esterilizar por filtração; pesar todos os componentes, exceto K ₂ HPO ₄ e solubilizar em 98% do peso total de água. Ajustar o pH para 5;

esterilizar em autoclave a 121 °C por 20 minutos e;

adicionar de forma asséptica 2% da solução de K ₂ HPO ₄ ;

em que o pH final do meio deve ser 7,0±0,5.

[0033] Em outra concretização do primeiro aspecto, a bactéria cultivada pertence ao género Paenibacillus, especificamente a bactéria é Paenibacillus elgii.

[0034] O meio de cultivo MMP da presente invenção destaca-se por ser um meio mineral que atende os requisitos nutricionais da bactéria e que gera um extrato pobre em impurezas. Adicionalmente, alterações nas fontes de carbono, nitrogénio e adição de aminoácidos específicos promovem um incremento na produção dos lipopeptídeos, aliada a um perfil cromatográfico limpo e que minimiza ainda a produção de exopolissacarídeos, o que aumenta a viscosidade da cultura. Dessa forma, o meio de cultura MMP possibilita um maior rendimento dos metabólitos de interesse, não sendo necessário uma etapa de purificação, uma vez que o sobrenadante livre de células já atende os pré-requisitos de alta concentração das moléculas de interesse e baixo teor de impurezas.

[0035] Um dos pontos de maior relevância da presente invenção é o emprego do meio MMP e a incubação entre 30 e 37°C preferencialmente a 37 ^Q C, uma vez que a produção de lipopeptídeos a partir de bactérias é uma prática clássica. No entanto este meio em particular possibilita a eliminação de uma etapa de purificação (hidrólise ácida ou extração com solvente orgânico). Essas duas técnicas são empregadas com o objetivo de limpar e concentrar o extrato, antes deste ser submetido à cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Por tratar-se de uma bactéria isolada do solo, Paenibacillus é classicamente incubada a 30 ^Q C. No entanto, experimentos evidenciaram que o microrganismo em questão atinge, em menos tempo, uma maior densidade celular quando incubado a 37 ^Q C.

[0036] Dessa forma, em um segundo aspecto, a presente invenção se refere a um processo para produção de lipopeptídeos antimicrobianos utilizando o meio de cultura MMP, conforme definido no primeiro aspecto da invenção e as seguinte etapas:

a) transferência asséptica de uma colónia isolada de uma bactéria produtora de lipopeptídeos previamente cultivada em meio ágar nutriente para um frasco contendo no máximo 40% do seu volume de caldo nutriente;

b) incubação em uma temperatura entre 30 e 38°C com agitação, até que a absorbância a 600nm da cultura esteja entre 0,6 - 0,8;

c) retirada de 1 % do volume da cultura e lavagem asséptica das células com meio MMP estéril;

d) inoculo das células previamente lavadas em frasco contendo 40% do volume de meio MMP estéril;

e) incubação do microrganismo em uma temperatura entre 30 a 38°C com agitação, até que a absorbância a 600nm da cultura esteja entre 0,6 - 0,8;

f) transferência de 1 % da cultura em meio MMP para novo frasco contendo meio MMP (na mesma proporção acima citada) ou para fermentador contendo o meio de cultivo MMP;

g) incubação entre 30 a 38°C, sob agitação constante por um tempo necessário para a completa esporulação da cultura;

h) separação das células por centrifugação para obtenção do sobrenadante contendo os lipopeptídeos antimicrobianos.

[0037] Em uma concretização do segundo aspecto da invenção os lipopeptídeos antimicrobianos em questão são pelgipeptinas.

[0038] Em outra concretização do segundo aspecto da invenção a agitação utilizada nas etapas (b), (e) e (g) ocorrem de 180 a 220 rpm, preferencialmente 200 rpm.

[0039] Em outra concretização do segundo aspecto, a visualização da abundância de esporos livres na etapa (g) pode ser visualizada por microscopia.

[0040] Em outra concretização do segundo aspecto, as temperaturas de incubação utilizadas nas etapas (b), (e) e (g) do processo são preferencialmente 37 ^Q C.

[0041] Em outra concretização do segundo aspecto, o produto obtido no final da etapa (h) pode ser purificado por algum método de purificação, como exemplo, por meio de CLAE - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

[0042] Por tratar-se de um meio mineral, o extrato deste meio apresenta- se limpo, não havendo a abundância de impurezas existente nas culturas provenientes de meios de cultivo complexos. Sendo possível assim eliminar a etapa de purificação que envolve precipitação ácida ou solvente orgânico.

[0043] Em um terceiro aspecto, a invenção refere-se ao uso do meio MMP para a produção lipopeptídeos antimicrobianos a partir do cultivo de bactérias que produzem lipopeptídeos antimicrobianos como metabólitos.

[0044] Em uma concretização do terceiro aspecto, o meio de cultivo MMP é utilizado para produzir Pelgipeptinas a partir do cultivo de PaenibacHIus elgii. [0045] Para exemplificar o uso deste invento, o mesmo foi comparado com três meios de cultivo descritos na literatura que objetivam a produção de lipopeptídeos antimicrobianos (Figura 2). A figura 2 compara a produção de pelgipeptinas em diferentes meios, sendo eles Caldo nutriente, GS e KL (estado da técnica) e as versões intermediárias de desenvolvimento do meio MMP. As modificações foram feitas em função da fonte de carbono e adição de aminoácidos. Foram elas:

- MMPvl : meio sem adição de aminoácidos, glicerol como fonte de carbono;

- MMPv2: meio sem adição de aminoácidos, amido como fonte de carbono;

- MMPv3: meio com adição do aminoácido triptofano, glicerol como fonte de carbono;

- MMPv4: meio com adição do aminoácido arginina, glicerol como fonte de carbono;

- MMPvõ: meio com adição dos aminoácidos arginina e triptofano combinados, glicerol como fonte de carbono;

[0046] Assim empregou-se o meio Caldo Nutriente (WU et al., 2010), meio GS (DING et al., 201 1 ) e Meio KL (PAULUS; GRAY, 1964), assim como as versões intermediárias do seu processo de desenvolvimento, de forma que a versão final (versão 5), conforme descrita no primeiro aspecto, apresentou o melhor rendimento quando comparado às demais, exibindo um incremento de 17 vezes mais pelgipeptinas que o meio GS proposto por Ding et al. Para a produção dessas moléculas e 3 vezes maior que o meio KL proposto por Paulus para produção de Polimixina (lipopeptídeos de estrutura semelhante produzida por Paenibacillus polimixa).

[0047] A produção de Pelgipeptinas em meio complexo exige uma etapa de pré-purificação, para remoção dos principais componentes que não são de interesse. Esta etapa é feita por meio de precipitação ácida ou ainda com o emprego do solvente orgânico butanol (DING et al., 201 1 ; WU et al., 2010). O emprego desta etapa é caro, além de gerar resíduos extremamente poluentes e indesejados (ácido clorídrico ou butanol). No entanto, faz-se necessária para se evitar prejuízos durante a purificação por CLAE, uma vez que os componentes indesejados podem entupir a coluna cromatográfica.

[0048] Desta forma o invento aqui relatado, se propõe a eliminação da necessidade do emprego da etapa de pré-purificação, uma vez que o sobrenadante obtido do cultivo de PaenibacHIus elgii no meio de cultura que é objeto deste invento proporciona um perfil cromatógráfico mais limpo, ausente de impurezas advindas do meio complexo, conforme demonstra a figura 3.

[0049] Os versados na arte valorização os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes, abrangidas no escopo das reivindicações anexas.