CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la generación de nanoburbujas de 1 - metilciclopropeno (1-MCP) modificadas que presentan un alto grado de estabilidad en solución acuosa y que permiten inhibir la acción del etileno en diferentes procesos biológicos, tales como maduración de frutos, inhibición de procesos asociados a senescencia y pérdida de clorofila en órganos vegetales bajo condiciones de estrés. Además, pueden reducir la acción del etileno en el metabolismo de plantas, haciéndola menos susceptible al estrés hídrico, estrés por baja temperatura, estrés por condiciones del suelo entre otros.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

El etileno es un compuesto con una estructura química simple, hidrocarburo insaturado que contiene solo 2 carbonos y un doble enlace que los une y, que se encuentra presente en las plantas influyendo en la maduración y caída de frutas, mediante la regulación de diversos bio-procesos y senescencia (Zacarías, 1993 “Ethylene”; Faust, 1989 "Physiology of températe zones trees”). Su naturaleza gaseosa le confiere características especiales, únicas entre los distintos fito- reguladores (Becerra, 2005“Evaluation of 1-mcp (1 -methyclicopropen), as an ethylene inhibitor in the ripening ofkiwi fruits”).

El etileno regula la maduración y senescencia de productos agrícolas a nivel molecular, bioquímico y fisiológico (Kesari et al., 2007“Ethylene-induced ripening in banana evokes expression of defense and stress related genes in fruit tissue”), debido a que estimula la expresión de genes que codifican para las enzimas relacionadas con los cambios durante la maduración y/o senescencia (Jiang y Fu, 2000“Ethylene regulation of fruit ripening: Molecular aspects”). El etileno posee dos roles en la post cosecha, por un lado, ocasiona que los frutos adquieran características organolépticas óptimas para su consumo, pero también es responsable de la senescencia de los tejidos, generando efectos desfavorables en la calidad de estos (Bapat et al., 2010“Ripening of fleshy fruit: Molecular insight and the role of ethylene”). El etileno, también participa en la caída de flores que tiene relación directa con la cuaja de frutos. Asimismo, el etileno es una hormona vegetal que participa en múltiples procesos como respuesta a diversos tipos de estrés (daño mecánico, sequía, inundación, enfermedades, plagas), senescencia, floración en algunas plantas, inducción de pelos radiculares, elongación de raíces, síntesis de pigmentos y aromas, y degradación de la clorofila.

La inhibición de la acción del etileno puede producir efectos benéficos, por ejemplo, en el transporte y almacenamiento de frutas. Dentro de los efectos beneficiosos de inhibir la acción de etileno también se pueden mencionar entre otros, el retraso en el proceso de maduración de frutos, inhibición de procesos asociados a senescencia y pérdida de clorofila en órganos vegetales, bajo condiciones de estrés la reducción de la acción del etileno en el metabolismo de una planta, haciéndola menos susceptible al estrés hídrico, estrés por baja temperatura, estrés por condiciones del suelo.

El etileno también se encuentra directamente asociado a cualquier tipo de estrés que las plantas puedan tener, por lo tanto, herramientas que inhiban las hormonas o etileno en los diferentes procesos de estrés mencionado anteriormente, generarían cambios considerables en la pre y post cosecha, por ejemplo, de frutas.

El conocimiento del mecanismo de acción del etileno ha permitido generar diferentes tecnologías y procedimientos para disminuir sus efectos negativos, entre los cuales se puede mencionar la refrigeración, uso de atmósferas modificadas y controladas entre otros, sin embargo, los retardantes químicos de madurez son los que han mostrado mayor eficiencia en el control de la madurez y senescencia de frutos, hortalizas y flores (Arora et al., 2008“Postharvest biology and technology of fruits, vegetables and flowers”) (Tablal ). Tabla 1. Proceso de inhibición de etileno mediante el uso de agentes químicos (Sereck et al, 2006“Controlling ethylene responses in flowers at the receptor level”).

Estrategias químicas para inhibir los efectos del etileno

Solución actual

Los retardantes químicos de maduración se pueden clasificar en inhibidores de la síntesis del etileno, que incluyen productos tales como amino etoxi-vinil- glicina (AVG) y ácido amino oxiacético (AOA); inhibidores de la señalización (acción) del etileno, como 1 -metilciclopropeno (1 -MCP) y sales de plata (nitrato y tiosulfato de plata) (Serek et al., 2006“Controlling ethylene responses in flowers at the receptor level”), entre otros. Otro grupo de retardantes son los oxidantes de etileno, siendo el permanganato de potasio KMnÜ4 el producto más importante (Wills y Warton,2004 “Efficacy of potassium permanganate impregnated into alumina beads to reduce atmospheric ethylene”). Sin embargo, el uso de KMnC genera situaciones de riesgo dado que es un irritante para los usuarios, nocivo por ingestión, y representa un peligro de fuego en contacto con materiales combustibles, además de ser considerado un contaminante ambiental. También se ha considerado la estabilización del gas 1 -MCP en agua, molécula inhibidora de etileno en plantas. La desventaja de este producto dado que es un gas contenido en ciclodextrinas, es que una vez que está en un medio líquido es rápidamente liberado a la atmósfera, lo que obliga a tener condiciones de alta hermeticidad del recinto utilizado para lograr su eficacia sobre la acción del etileno.

1-Metilciclopropeno (1-MCP)

El 1 -metilciclopropeno (en inglés, 1 -methylcyclopropene) es un regulador vegetal de síntesis que actúa como inhibidor de la acción del etileno.

En la actualidad es uno de los compuestos más promisorios para la regulación de la maduración de frutos climatéricos, inhibición de la senescencia de hortalizas de hoja, de flores de corte y de muchas especies de plantas ornamentales. La exposición durante varias horas al 1-metilciclopropeno en concentraciones variables según la especie (pero que pueden ser tan bajas como 0,2 pL L ^_1 , por ejemplo, en peras), vuelve a ciertas frutas y hortalizas insensibles al etileno por períodos de tiempo considerables (días a semanas). El 1 - metilciclopropeno actuaría bloqueando el acceso del etileno a su sitio en el receptor transmembrana presumiblemente ubicado en la membrana plasmática, por lo cual los tejidos se tornan incapaces de percibir la presencia del etileno. Se han efectuado numerosos ensayos exitosos en manzanas, ciruelas, kiwis, caquis, paltas, peras, tomates y otros frutos climatéricos y, en la actualidad es muy utilizado a nivel comercial para manzanas. En vista de diversas publicaciones relacionadas con este compuesto que describen sus características y usos, se sabe que el 1-MCP (C4H6) es una olefina cíclica, a temperatura y presión estándar es un gas con un peso molecular de 54 g/mol (Blankenship y Dole, 2003 Ί -Methylcyclopropene: A Review. Postharvest Biology and Technology”). El 1 -MCP ocupa los receptores del etileno de manera irreversible, bloqueando la cascada de transducción de señales que conllevan a la expresión de genes relacionados con la respuesta al etileno (In et al., 2013“-MCP occupies ethylene receptors irreversibly, blocking the signal transduction Cascade that leads to the expression of genes related to the response to ethylene”). La afinidad del 1 -MCP por los receptores es diez veces mayor a la del etileno y actúa a concentraciones más bajas, también regula la biosíntesis de etileno a través de la inhibición de un proceso auto catalítico (Blankenship y Dole, 2003 “1 - Methylcyclopropene: A Review. Postharvest Biology and Technology”). El compuesto no es tóxico, es inodoro, estable a temperatura ambiente, además, es de fácil aplicación y altamente eficaz para proteger muchas especies agrícolas de la acción del etileno, incluyendo, frutos, vegetales, flores cortadas y plantas en maceta (Serek et al., 2006“Controlling ethylene responses in flowers at the receptor level”; Watkings, 2006“The use of 1 -methylcyclopropene (1 - MCP) on fruits and vegetables”; Huber, 2008“The use of 1 - methylcyclopropene (1 - MCP) on fruits and vegetables”). A pesar de que la unión del 1 -MCP es irreversible, se ha reportado que los tejidos pueden recuperar la sensibilidad al etileno, debido a la capacidad de síntesis de nuevos receptores (Cameron y Reid, 2001 “1 -MCP blocks ethylene-induced petal abscission of Pelargonium peltatum but the effect is transient”), lo cual depende de la especie, tejido, estado de desarrollo y ambiente (Varanasi et al., 2013 “Differential suppression of ethylene biosynthesis and receptor genes in 'Golden Delicious' apple by preharvest and postharvest 1 -MCP treatments”).

La concentración de 1 -MCP necesaria para bloquear la acción del etileno varía de acuerdo con la especie, cultivo, estado de maduración, capacidad de producción de nuevos receptores, tiempo y temperatura de exposición (Watkins, 2006“The use of 1 -methylcyclopropene (1- MCP) on fruits and vegetables”). Las dosis óptimas varían entre especies, pero Blankenship y Dole (2003) “Methylcyclopropene: A Review. Postharvest Biology and Technology” reportan diferentes concentraciones y temperaturas para la aplicación de 1 -MCP, las cuales se pueden encontrar entre 0,1 a 100 pL L ^_1 a 20 - 25°C por 6 a 24 h. Por ejemplo, la concentración recomendada para productos de uso comercial (EthylBIoc ^® y ™SmartFresh) está entre 0,6 a 2,0 pL L ^_1 (según etiqueta de producto).

Para superar las desventajas descritas en el estado del arte y relacionadas con técnicas de aplicación del 1 - MCP, la presente solicitud propone la generación de nanoburbujas de 1 -MCP modificadas, las cuales muestran un alto grado de estabilidad en solución acuosa y permiten inhibir la acción del etileno en diferentes procesos biológicos.

Nanoburbujas

Las burbujas son cavidades llenas de aire o gas dentro de un líquido. En el líquido, las burbujas tienen presiones de equilibrio interno, al menos las que se encuentran en el medio ambiente. Cada burbuja está rodeada por una interfaz que posee propiedades diferentes a la de la solución global. Por ejemplo, los surfactantes pueden estabilizar burbujas de todos los tamaños, pero las burbujas también pueden formarse sin ellos. Las burbujas grandes (> 100 pm de diámetro) aumentan en tamaño rápidamente (> 6 mm s ^_1 ) y suben directamente a la superficie donde colapsan y, en consecuencia, disgregan el aire o gas contenido en ellas. Las microburbujas (1 pm - 100 pm de diámetro), proporcionan un área de superficie más alta por unidad de volumen que las burbujas más grandes que se ven comúnmente debido a su menor tamaño, éstas pueden producirse por numerosos métodos y se han utilizado para solubilización de lodos, purificación de agua, tratamiento de aguas residuales, administración de fármacos y como agente de contraste junto con ultrasonido. Las microburbujas no son estables durante largos períodos (~ minutos), suben lentamente (10 ^-3 - 10 mm ^x s ^_1 ) e indirectamente a la superficie donde colapsan, pero las más pequeñas < 20 pm de diámetro) se contraen para formar nanoburbujas más estables y efectivas.

Solo estas pequeñas burbujas (< 1 pm de diámetro) son estables durante períodos significativos en suspensión (aumentan a menos de 10 ^-2 pm ^x s ^_1 , pero esto se contrarresta con un movimiento browniano de más de 1 pm ^x s ^_1 ) en comparación con burbujas más grandes o más pequeñas que desaparecen rápidamente de las suspensiones acuosas, a menos que se estabilicen con agentes tensoactivos. Normalmente, las nanoburbujas están presentes en cantidades más bajas en soluciones acuosas. Es necesaria la presencia de núcleos de cavitación en agua pura, la formación de los núcleos permite la presencia de nanoburbujas de aire en el agua, particularmente cuando esta agua no contiene micropartículas extrañas y el recipiente carece de defectos en las paredes (http://www1.lsbu.ac.uk/water/nanobubble.html). Las nanoburbujas son generalmente reconocidas en la literatura científica actual como aquellas cavidades gaseosas con diámetros menores a una miera. Tales cavidades (burbujas) a menudo tienen más de 100 nm de diámetro, pero el término‘nano’ se aplica principalmente a partículas de diámetro más pequeño (< 100 nm, ISO/TS 27687: 2008).

El área de superficie de un volumen de burbujas es inversamente proporcional al diámetro de la burbuja. Así, para el mismo volumen de burbuja, su área de superficie (A) aumenta proporcionalmente a la reducción del diámetro de la burbuja (D; A = 6/D); por ejemplo, 1 mi de burbujas con un radio de 100 nm (2 x 1.015 burbujas) tiene 1.000 veces más superficie (60 m ² ) que 1 mi de burbujas de

0,1 mm (2 x 106 burbujas, 0,06 m ² ).

T ambién se ha propuesto encapsular el gas 1 -MCP en agua mediante el uso de nanotecnología, específicamente mediante la transformación del gas 1-MCP en nanoburbujas de tamaño entre 70 nm y 300 nm. Las nanoburbujas son burbujas extremadamente pequeñas (nanométricas 10 ^-9 m) que se encuentran sumergidas y estabilizadas en agua. Se debe tener presente que, durante los últimos años las nanoburbujas han sido el foco de mucha atención en varios campos de investigación debido a sus asombrosos efectos y, a que aún está bajo discusión la razón por la cual son tan estables, desafiando varios principios básicos de la termodinámica de gases.

En el estado del arte relacionado con nanoburbujas se pueden encontrar algunos documentos publicados tal como US 2017 202775 que divulga una solución de nanoburbujas de gas libres mezcladas con un material lipídico para usarse en sistemas de administración de contraste y/o administración de fármacos por ultrasonidos, y pertenece al campo técnico de la medicina. El documento US 2016 166716 se refiere a una nanoburbuja que comprende una cubierta externa continua, comprendiendo la cubierta externa un material polimérico reticulado, una pared interna de la cubierta exterior continua y un núcleo hueco dentro de la cubierta exterior continua. Por último, el documento IN 2919 MU2013 divulga complejos de nanoburbujas y nanopartículas comprenden (i) nanoburbujas con una composición de un fosfolípido; un derivado anfifílico de vitamina E; un gas y (ii) nanopartículas con una composición de ácido graso; fosfolípido; droga; agente pro- apoptótico. Las nanoburbujas de los complejos de nanoburbujas y nanopartículas se pueden usar como agentes de contraste de ultrasonidos y también como portadores de SLG cargados con fármacos.

Sin embargo, ninguno de estos documentos divulga nanoburbujas de 1 - MCP modificadas con un azúcar de tipo alimentario que permitan inhibir la acción del etileno en diferentes procesos biológicos, o reduzcan la acción del etileno en el metabolismo de plantas.

Relacionado con la invención de la presente solicitud, se tiene un ejemplo de aplicación de nanoburbujas de 1 -MCP que se menciona en la publicación Pongprasert, N., P. et al. (2012)“1 -MCP Micro and nanobubbles using as a novel postharvest technique for delay postharvest ripening of banana fruits. 10th National Postharvest Conference, Khon Khen, Thailand”, en donde se divulga que la fumigación con 1 -metilciclopropano (1 -MCP) se utiliza ampliamente, por ejemplo, para extender la vida post cosecha y mantener la calidad de plátanos verdes y, que un tiempo de aplicación más prolongado, la maduración desigual y maduración verde son desventajas asociadas con la fumigación con 1 -MCP de plátanos. Los autores han investigado la aplicación de una tecnología de micro y nano burbujas para el manejo post cosecha, formulando preparaciones de 1 -MCP diseñadas para usar como soluciones acuosas de micro y nano-burbujas (MNB). Mediante esta investigación se llegó a la conclusión de que las micro y nanoburbujas (1 -MCP- MNB) tienen potencial para ser utilizadas y, que ralentizan la maduración de la fruta de plátano, así como otras especies. Sin embargo, la aplicación de 1 -MCP-MNB mencionada por los autores requiere de un equipo generador de nanoburbujas de aire, aire que se inyecta en una piscina con varios litros de agua y, luego se disuelve el producto de mercado. Este producto es un polvo que contiene 1 -MCP al 3% v/p encapsulado en ciclodextrina que al sumergirlo en agua en piscinas de 25 litros aproximadamente, comienza a desprender rápidamente el gas 1 -MCP y el que se libera a la atmosfera quedando inutilizadas grandes cantidades de dicho gas. Luego, se sumergen los plátanos para realizar el tratamiento. Este sistema genera una logística de proceso muy compleja, a saber, transportar grandes cantidades de agua, además de requerir comprar el producto actual del mercado que tiene encapsulado al 1 -MCP. Es imperativo mencionar que el proceso propuesto por los investigadores en esta publicación no es transportable, razón por la cual no se pueden realizar aplicaciones directas en el campo. Por otro lado, se requiere producir nanoburbujas de aire y 1 -MCP, lo cual disminuye la concentración de nanoburbujas de 1 -MCP en la solución preparada. Además, el proceso de sumergir las frutas en estas piscinas favorecería el desarrollo, crecimiento y acumulación de bacterias y hongos en conjunto con una temperatura óptima para la pudrición de frutas, lo que genera numerosas complicaciones en su efectividad y eficiencia, por ejemplo, en el campo. En vista de lo anterior, la presente solicitud propone nanoburbujas de 1 -MCP modificadas con azúcares de uso alimentario, las cuales se presentan en forma de aditivos que contienen nanoburbujas en altas concentraciones, permitiendo una mejor eficiencia del gas 1 -MCP en la inhibición de la acción del etileno. Las nanoburbujas de 1 -MCP modificadas con azúcares son muy estables y versátiles ya que se obtienen en altas concentraciones que se aplican como aditivo, fácil de transportar y aplicar. Estas nanoburbujas se pueden aplicar mediante aspersión en maquinaria convencional, aviones, drones, sistemas de riego tanto en espacios cerrados como en amplias superficies de campo, sin producirse la difusión del gas 1 -MCP hacia la atmósfera.

Nanoburbujas de 1-MCP modificadas con azúcares

La presente invención describe la generación de nanoburbujas de 1 -MCP modificadas con azúcares que muestran un alto grado de estabilidad en solución acuosa para inhibir la acción del etileno en diferentes procesos biológicos.

La estabilidad de las nanoburbujas de 1 -MCP se debe a que la molécula de 1 -MCP es hidrofóbica y de baja solubilidad en solución acuosa en comparación con CO2. Sin embargo, la presencia de enlaces dobles en el anillo propílico contribuye a que las moléculas de 1 -MCP se empaqueten eficientemente a través de interacciones tipo pi-pi, que son complementadas con interacciones de Van der Waals. Estas dos interacciones moleculares compensan la volatilidad del gas 1 - MCP permitiendo la estabilización de la nanoburbuja.

En la obtención de las nanoburbujas de 1 -MCP, un proceso de generación de cavitaciones es un elemento fundamental al momento de producir las nanoburbujas y, para lograr exitosamente la producción de nanoburbujas se requiere de la generación de cavitaciones a nivel de nano-escala, las que recolectan rápidamente moléculas del gas 1 -MCP que están débilmente solubilizadas en agua. Una cavitación genera un micro-entorno libre de agua que es mucho más estable que su interacción con el agua. De esta misma forma, la cavitación puede albergar un alto número de moléculas de gas hasta que la repulsión gas-gas supere la interacción gas-agua. La generación de nano- cavidades es de una vida media muy corta, cercana de 2 microsegundos, sin embargo, se ha observado a través de simulaciones moleculares que una cavidad de 6 nm se llena de moléculas de gas en menos de 200 picosegundos debido a la alta difusión que suelen tener moléculas gaseosas en un medio acuoso.

Con el objetivo de proporcionar una mayor estabilidad a las nanoburbujas del gas 1 -MCP, la presente solicitud propone el uso de pequeños azucares de uso alimentario, los cuales interactuarían con la superficie de la nanoburbuja y, además generarían una red de puentes de hidrógeno entre los azúcares que formarían un tipo de“decorado” o recubrimiento que rodea la nanoburbuja. Lo anterior permitirá obtener una solución de nanoburbujas con una vida media mayor y con una menor sensibilidad al trabajo y manipulación en el lugar de aplicación como, por ejemplo, en cultivos o campos. El azúcar de uso alimentario utilizado para estabilizar las nanoburbujas de 1-MCP se puede seleccionar entre ásteres de sacarosa, maltodextrinas, almidón de diferentes tipos, hidroximetil celulosa, disacáridos y monosacáridos en general.

Las nanoburbujas de 1 -MCP modificadas con azúcares propuestas por la presente solicitud presentan una serie de aplicaciones y usos entre los cuales se puede mencionar aspersión con maquinaria convencional en instalaciones de empacadoras de frutas o packing, en diferentes sectores tales como: drench (lugar donde se humedece la fruta con agua), línea de embalaje, pre-fríos, almacenamiento, refrigerado y transporte. La aspersión en campo se puede realizar mediante el uso maquinaria convencional, aviones o drones.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con la generación de nanoburbujas de 1 -MCP modificadas con azúcares de uso alimentario que tienen un tamaño que varía entre 50 y 600 nm. Estas nanoburbujas muestran un alto grado de estabilidad en solución acuosa y permiten inhibir la acción del etileno en diferentes procesos biológicos. Además, pueden reducir la acción del etileno en el metabolismo de plantas, haciéndola menos susceptible al estrés hídrico, estrés por baja temperatura, estrés por condiciones del suelo entre otros.

La presente invención también se relaciona con el método de preparación de las nanoburbujas de 1-MCP modificadas con azúcares, sus diferentes usos y aplicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1 : Síntesis de 1 -MCP en un sistema de destilación simple.

Figura 2: Síntesis de 1 -MCP con recolección de gas en donde se muestra la mezcla de reacción de 1 -metilciclopropeno con tetrahidrofurano (Figura 2A) y la obtención del precipitado al finalizar la reacción (Figura 2B).

Figura 3: Producto de síntesis obtenido (1 -MCP) por método 1.

Figura 4: Producto de síntesis obtenido (1 -MCP) por método 2.

Figura 5: Resultados del análisis dispersión de luz dinámica (DLS). Figura 6: Concentración de nanoburbujas (partículas/ml) v/s diámetro en nanómetros (Size nm) de nanoburbujas de 1 -MCP modificadas con azúcares.

Figura 7: Distribución de tamaño de nanoburbujas de 1 -MCP, diámetro en nanómetros (Size nm) de nanoburbujas de 1 -MCP modificadas con azúcares.

Figura 8: Diseño experimental. La figura muestra plátanos separados en tres grupos que fueron asperjados con agua, solución de 1 -MCP en ciclodextrina (SF) y nanoburburjas de 1 -MCP modificadas (NBS). Los frutos además fueron expuestos a 1 ppm de etileno por 24 h para acelerar el proceso de maduración y posteriormente fueron evaluados diferentes parámetros.

Figura 9A: Registro fotográfico de los plátanos después de haber sido expuestos a 1 ppm de etileno por 24 h y almacenamiento en aire a 20 °C.

Figura 9B: Registro fotográfico de los plátanos después de haber sido expuestos a 1 ppm de etileno por 96 h y almacenamiento en aire a 20 °C

Figura 10: Evolución del parámetro de color a ^* (CIE 1976, color en los rangos rojo-azul) de plátanos tratados con agua (control), 1 -MCP en ciclodextrina (SF) y nanoburbujas de 1 -MCP modificadas (NBS) después de haber sido expuestos 1 ppm de etileno por 24 h y almacenamiento en aire a 20 °C.

Figura 1 1 : Evolución del parámetro de color b ^* (CIE 1976, color en los rangos azul-amarillo) de plátanos tratados con agua (control), 1 -MCP en ciclodextrina (SF) y nanoburbujas de 1 -MCP modificadas (NBS) después de haber sido expuestos 1 ppm de etileno por 24 h y almacenamiento en aire a 20 °C.

Figura 12: Evolución del parámetro de color luminosidad L ^* (CIE 1976) de plátanos tratados con agua (control), 1 -MCP en ciclodextrina (SF) y nanoburbujas de 1 -MCP modificadas (NBS) después de haber sido expuestos 1 ppm de etileno por 24 h y almacenamiento en aire a 20 °C.

Figura 13: Árbol de cerezo.

Figura 14: Árbol de cerezo luego de aplicar nanoburbujas de 1 -MCP modificadas.

Figura 15: Predio seleccionado para realizar las pruebas de aplicación de nanoburbujas de 1 -MCP modificadas en arándanos.

Figura 16: Selección de arbustos de arándanos marcados con cintas de color naranjo.

Figura 17: Cosecha de arándanos con tratamiento.

Figura 18: Rabos de Cerezas con tratamiento almacenadas por 30 días a

0 ^e C.

Figura 19: Coloración de los rabos de cerezas con tratamiento de nanoburbujas de 1 -MCP modificadas, almacenadas 30 días a 0 ^e C.

Figura 20: Rabos de Cerezas sin tratamiento almacenadas por 30 días a

0 ^e C.

Figura 21 : Coloración de los rabos de cerezas sin tratamiento, almacenadas 30 días a 0 ^e C.

Figura 22: Arándanos post cosecha almacenados 30 días a.- sin tratamiento; b y c.- con tratamiento de nanoburbujas de 1 -MCP modificadas.

Figura 23: Grupo 1 (a) arándanos sin tratamiento b y c.- arándanos tratados con nanobuburbujas de 1 -MCP modificadas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA REALIZACIÓN La presente solicitud tiene como objetivo la generación de nanoburbujas de 1 -MCP modificadas con azúcares de uso alimentario, las cuales presentan un tamaño que varía entre 50 y 600 nm. Los azúcares de uso alimentario utilizado para estabilizar las nanoburbujas de 1 -MCP se selecciona del grupo que consiste en ásteres de sacarosa, maltodextrinas, almidón de diferentes tipos, hidroximetil celulosa, disacáridos y monosacáridos en general. El rango de concentración de los azúcares de uso alimentario en la nanoburbuja de 1-MCP modificadas varía entre 0,01 - 3 ppm y la concentración de nanoburbujas de 1 -MCP en solución acuosa puede variar entre 0,01 ug/L - 3,0 ug/L.

Se ha determinado que estas nanoburbujas de 1 -MCP modificadas muestran un alto grado de estabilidad en solución acuosa y permiten inhibir la acción del etileno en diferentes procesos biológicos, tales como maduración de frutos, inhibición de procesos asociados a senescencia y pérdida de clorofila en órganos vegetales bajo condiciones de estrés, reducción de la acción del etileno en el metabolismo de una planta, haciéndola menos susceptible al estrés hídrico, estrés por baja temperatura, estrés por condiciones del suelo entre otros.

Se han seleccionado estos azúcares de uso alimentario mediante estudios teóricos-experimentales debido a su inocuidad y uso en la industria de alimentos, además por su capacidad para formar puentes de hidrógenos entre ellos sobre el área ínter-facial de las nanoburbujas de 1 -MCP, lo cual permite estabilizarlas y aumentar su vida media por largos períodos de tiempo (entre 12 y 14 meses). Tal como se menciona anteriormente, la concentración de los azúcares de uso alimentario en las nanoburbujas de 1 -MCP modificadas varía entre 0,01 ppm y 3 ppm, siendo estas concentraciones suficientes para estabilizar nanoburbujas que presentan tamaños que varían entre 50 y 600 nanómetros, observándose una población predominante entre 100 - 200 nanómetros.

Dependiendo del objetivo, las nanoburbujas de 1 -MCP modificadas de la presente invención se pueden aplicar mediante aspersión en productos vegetales para inhibir o retrasar la acción del etileno, con maquinaria convencional en instalaciones de empacadoras de frutas o packing, en diferentes sectores tales como: drench, línea de embalaje, pre-fríos, almacenamiento refrigerado y transporte. La aspersión en campo se pude realizar mediante el uso de maquinaria convencional, aviones o drones.

Por último, la presente invención se refiere al método de preparación de las nanoburbujas modificadas de 1 -MCP que comprende las etapas de preparación in situ de las nanoburbujas de 1 -MCP y estabilización con los diferentes azúcares de uso alimentario. EJEMPLOS DE APLICACIÓN Síntesis de 1 - metilciclopropeno

La síntesis de 1 -Metilciclopropeno se llevó a cabo por dos métodos:

Método 1 : Síntesis de 1 -MCP en un sistema de destilación simple.

En un balón de doble boca de fondo redondo de 250 mL, el cual se encuentra conectado a un sistema de destilación simple, se adicionan 10 mL de tetrah id roturan o seco y 2 mL de 1 -clorometilpropeno (Figura 1 ), en donde ambos reactivos fueron inyectados a través de una septa química. El sistema cerrado se mantuvo en atmósfera inerte de argón, la mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos a 30 ^e C de temperatura. Una vez transcurrido el tiempo de homogenización se adicionaron 22 ml_ de fenillitio, se mantuvo la reacción por 30 minutos más, con agitación constante, la temperatura de reacción varió desde los 30 ^e C hasta los 50 ^e C de forma espontánea (Muestra 1 ). Los gases liberados, fueron obtenidos por destilación. Método 2: Síntesis de 1 -MCP con recolección de gas.

En un balón de doble boca de fondo redondo de 250 mL, (en donde ambas bocas fueron selladas con septas químicas y a las cuales se conectaron cuatro jeringas de 10 mL cada una), se adicionaron 10 mL de tetrahidrofurano seco y 2 mL de 1 -clorometilpropeno (Figura 2A), en donde ambos reactivos fueron inyectados a través de una septa química. El sistema cerrado se mantuvo con atmósfera inerte de argón, la mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos a 30 ^e C de temperatura. Una vez transcurrido el tiempo de homogenización se adicionaron 22 mL de fenillitio, posteriormente se mantuvo la reacción por 30 minutos más, con agitación constante, la temperatura de reacción varió desde los 30 ^e C hasta los 50 ^e C de forma espontánea (Figura 2B). El gas eliminado fue contenido en las jeringas con el fin de cuantificar la cantidad de gas liberado.

Posteriormente, el producto de reacción obtenido en ambos métodos fue filtrado por gravitación y el sólido fue lavado con tetrahidrofurano (THF) seco, luego fue secado y almacenado en atmosfera de argón (Muestra 2) (Figura 3 y 4). Procedimiento de preparación de nanoburbujas de 1-MCP modificadas a.- Producción de nanoburbujas por dispersión de qas 1-MCP en diferentes soluciones acuosas. Una vez obtenido el producto sólido, se procedió a neutralizarlo utilizando una 1 L de solución de NaCI 0,1 N, la generación de las nanoburbujas de 1 -MCP se realizó suministrando el 1 -MCP liberado como dispersión en agua con una concentración de 20% v/v. Luego, se adicionaron a los diferentes tipos azúcares (sacarosa y almidón) y sales en concentraciones que se encuentran en el rango de 0,01 ppm y 3 ppm. La velocidad de agitación fue de 25.000 rpm a volúmenes de 2 L con exposiciones de rotación de 1-7 minutos. El margen óptimo de la velocidad periférica se situó entre 6 y 24 m/s. en donde la cantidad de potencia suministrada al sistema fue de 500 W. b.- Nanoburbujas de 1 -MCP modificadas con azúcares

La preparación de nanoburbujas de 1 -MCP modificadas con azucares se realiza mediante una dispersión del gas 1 -MCP en diferentes soluciones acuosas que contienen azúcares de uso alimentarios, seleccionados desde el grupo que consiste de ásteres de sacarosa, maltodextrinas, almidón de diferentes tipos, hidroximetil celulosa, disacáridos y monosacáridos en general, en una concentración que varía entre 0,01 - 3 ppm. Se utiliza gas 1 -metilciclopropeno, obtenido in situ desde una síntesis de Fisher and Douglas.

Todas las soluciones de nanoburbujas de 1 -metilciclopropeno estabilizadas fue almacenada a 4 ^e C para estudiar su estabilidad y caracterización mediante DLS, nanosight y su aplicación en terreno.

Caracterización de nanoburbujas de 1 -metilciclopropeno (1-MCP) modificadas Para determinar la estabilidad de las nanoburbujas de 1-MCP modificadas se realiza un análisis de dispersión dinámica de la luz (DLS), a la que a veces se hace referencia como dispersión de luz cuasi elástica (QELS), técnica no invasiva y bien establecida para medir el tamaño y distribución de tamaño de moléculas y partículas típicamente en la región sub-micrométrica. Las aplicaciones típicas de la dispersión de luz dinámica son la caracterización de partículas que se han dispersado o disuelto en un líquido. El movimiento browniano de las partículas o moléculas en suspensión hace que la luz láser se disperse en diferentes intensidades. Del análisis de estas fluctuaciones de intensidad se obtiene la velocidad del movimiento browniano y, por lo tanto, el tamaño de partícula utilizando la relación de Stokes-Einstein:

D Ab= [kT / (6 TT r ps)] Ecuación de Stokes-Einstein deducida a partir de la teoría hidrodinámica, aplicable a la difusión de partículas coloidales a través de un disolvente que se comporta como un medio continuo. D _ab : Constante de difusión; r: radio del soluto; ps: viscosidad del solvente; kb: constante de Boltzmann; T: temperatura; y TT: pi, número irracional.

El tamaño (diámetro hidrodinámico) y distribución de tamaño de las nanoburbujas de 1 -MCP estabilizadas fue determinado por dispersión de luz dinámica (DLS) con el equipo Nano Zetasizer Malvern, modelo ZEN 3600. Determinación de tamaño de nanoburbujas de 1 -MCP modificadas mediante dispersión de luz dinámica

Los análisis de tamaño de nanoburbujas de 1-MCP modificadas, se llevaron a cabo mediante dispersión de luz dinámica (DLS) en un equipo Nano Zetasizer Malvern, modelo ZEN 3600, a una longitud de onda de 532 nm y un ángulo fijo de dispersión de 173°. La muestra líquida (1 mi) se midió con una cubeta de camino óptico de 1 cm. Se midieron 12 veces por triplicado para obtener una media de distribución de tamaño y su desviación estándar.

El potencial Z de las nanoburbujas de 1 -MCP modificadas se determinó en un equipo Nano Zetasizer Malvern, modelo ZEN 3600 con una cubeta que consta de un capilar en forma de U que utiliza dos electrodos de placas paralelas planas (disposable capillary cell, Malvern Instrument, UK), se midieron 12 veces por triplicado con el objetivo de obtener medias y desviación estándar.

Además, las nanoburbujas de 1 -MCP modificadas se caracterizaron con un equipo NanoSight NS3Q0, en el cual el análisis de rastreo de nanopartículas (NTA) utiliza las propiedades tanto de dispersión de luz como de movimiento browniano para obtener la distribución del tamaño de las partículas en muestras en una suspensión líquida. Un rayo láser se pasa a través de la cámara de la muestra, y las partículas en suspensión en el camino del haz dispersan la luz de tal manera que pueden verse fácilmente a través de un microscopio de 20 aumentos a una distancia de trabajo lejana, en el que está montada una cámara de video. La cámara captura un archivo de video de las partículas en estado de movimiento browniano. El software de análisis de rastreo de nanopartículas (NTA) realiza un seguimiento de muchas partículas individualmente y utiliza la ecuación Stokes- Einstein para calcular sus diámetros hidrodinámicos.

Nanosight proporciona mediciones de alta resolución del tamaño, concentración y agregación de las partículas, además proporciona monitoreo en tiempo real de cambios sutiles en las características de las poblaciones de partículas, con una validación visual para confirmar el análisis, en donde se analiza la permanencia de un tamaño nanométrico y una población o concentración de las nanoburbujas por mi y su permanencia en el tiempo.

Para determinar el tamaño y concentración de nanoburbujas de 1 -MCP modificadas en Nanosight las muestras fueron preparadas en agua MiliQ, posteriormente se tomó una alícuota de 1 mi con una jeringa desechable y se inyectó en equipo Nanosight.

Resultados a.- Producción de nanoburbujas por dispersión de gas 1-MCP en diferentes soluciones acuosas. Las nanoburbujas de 1 -metilciclopropeno se caracterizaron mediante DLS y Nanosight.

Los resultados indican que las nanoburbujas de 1-MCP obtenidas por método 1 , tienen una distribución de tamaño promedio de 90 nanómetros y un potencial Z de -10,6 eV.

Los resultados indican que las nanoburbujas de 1-MCP obtenidas por método 2, tienen una distribución de tamaño promedio de 100 nanómetros.

Nanosight Tabla 2. Resumen de resultados de tamaño (149,7 nm) y de concentración de nanoburbujas de 1 -MCP (3.95 ^* 107) obtenidas por método 2 de síntesis.

Resultados

Stats: Merged Data Mean: 147,7 nm

Mode: 126,0 nm

SD: 39,8 nm

D10: 101 .6 nm

D50: 132.6 nm

D90: 199,3 nm

Stats: Mean +/- Standard Error Mean: 149,7 +/- 8,2 nm

Mode: 150,0 +/- 25,1 nm

SD: 38,5 +/- 3,0 nm

D10: 102.4 +/- 9,8 nm

D50: 141 ,6 +/- 8,6 nm

D90: 196.4 +/- 9,9 nm

Concentration (Upgrade): 3,95 e+007 +/- 4,99 e+006

particles/ml

5,3 +/- 0,5 particles/frame

5,5 +/- 0,5 centres/frame Las nanoburbujas de 1 -MCP obtenidas mediante el método 1 , fueron caracterizadas en equipo Nanosight, los resultados indican que las nanoburbujas tienen un tamaño promedio de 147 nm, con una concentración de nanoburbujas por mL de 3,95 ^* 106 (Tabla 2). Tabla 3. Resumen de resultados de tamaño (148 nm) y de concentración de nanoburbujas de 1 -MCP (4.1 1 ^* 107) obtenidas por método 2 de síntesis.

Resultados

Stats: Merged Data

Mean: 148,8 nm

Mode: 127,4 nm

SD: 59,3 nm

D10: 93,7 nm

D50: 130,1 nm

D90: 191 ,0 nm

Stats: Mean +/- Standard Error

Mean: 145,5 +/- 1 1 ,8 nm

Mode: 126,8 +/- 3,4 nm

SD: 45,5 +/- 17,4 nm

D10: 102,0 +/- 6,5 nm

D50: 138,5 +/- 8,7 nm D90: 212,5 +/- 39,1 nm

Concentration (Upgrade): 4,1 1 e+007 +/- 6,28 e+006

particles/ml

4,4 +/- 0,9 particles/frame

6,7 +/- 2,9 centres/frame

Las nanoburbujas de 1 -MCP obtenidas mediante el método 2, fueron caracterizadas en equipo Nanosight, los resultados indican que las nanoburbujas tienen un tamaño promedio de 148 nm, con una concentración de nanoburbujas por mL de 4,1 1 ^* 10 ⁷ (Tabla 3). Estudios de estabilidad de las nanoburbujas de 1-MCP modificadas

Para determinar la estabilidad de las nanoburbujas de 1 -MCP se realizó un análisis de dispersión dinámica de la luz y DLS y Nanosight en donde se analizaron la permanencia de un tamaño nanométrico y, una población o concentración de nanoburbujas por mL y su permanencia en el tiempo, para lo cual se realizaron los siguientes estudios:

Resultados a.- Evolución diámetro de nanoburbuia modificada vs Tiempo

Este análisis consistió en medir el tamaño de las nanoburbujas de 1 -MCP a diferentes tiempos de evolución; 1 , 2, 3, 24 y 192 horas (8 días, 1 mes, 6 meses, 1 año) a 4°C y 25°C.

Las nanoburbujas fueron almacenadas a 4°C y 25°C, durante 6 meses, observando que el almacenaje óptimo es a 4 ^e C de temperatura. b.- Diámetro crítico vs. Tiempo de revolución

Este análisis consistió en medir diámetros críticos para diferentes tiempos de revolución del equipo homogenizador 10.000, 15.000, 20.000 y 25.000 RPM.

El diámetro óptimo se logró cuando se utilizó 25.000 RPM, mientras menor velocidad de aplicación se utilizaba, el diámetro se encontraba en el tamaño de las mieras. c.- Diámetro vs. diferentes tipos de azúcares a 1 hora del tiempo de evolución de las nanoburbujas. Durante la síntesis, la molécula de 1 -MCP se estabilizó con la sal de litio y NaCI (0,1 N). d.- Determinar concentración de 1-MCP mediante espectroscopia UV-Visible.

En este análisis se determinó mediante un barrido espectrofotométrico UV- visible en un rango entre 200 y 800 nanómetros. La mayor absorbancia se encontró a una longitud de onda de 220-300 nanómetros con una absorbancia máxima de 3.000 (u.a) correspondiente a una concentración 0,6% v/v. Nanoburbujas de 1-MCP modificadas con azúcares

Tamaño de nanoburbujas de 1 -MCP modificadas con azúcares determinado por dispersión de luz dinámica (DLS)

La Figura 5 muestra un resumen de porcentaje promedio de nanoburbujas de 1 -MCP modificadas con azúcares, según su diámetro en nanómetros (Size statistics Report). El software del equipo NanoZetasizer entrega un tamaño promedio de nanoburbujas de 322 nanómetros. Observaciones y/o conclusiones a partir del informe resumen entregado por el software del equipo nano zetasizer (Figura 5): se puede observar que las nanoburbujas de 1 -MCP modificadas con azúcares tienen un diámetro promedio de 322 nm.

Tamaño y concentración de nanoburbujas de 1-MCP modificadas con azúcares

La Figura 6 muestra la concentración de nanoburbujas (partículas/ml) v/s diámetro en nanómetros (Size nm) de nanoburbujas de 1 -MCP modificadas con azúcares y resumen entregado por el software del equipo Nanosight del tamaño promedio de las nanoburbujas en nanómetros (nm) con una concentración determinada en nanoburbujas/ml.

Observaciones y/o conclusiones a partir del informe resumen entregado por el software del equipo Nanosight: se puede observar que las nanoburbujas de 1 - MCP modificadas con azúcares, tienen un diámetro promedio entre 171 ,8 nm +/- 15,8 nm y una concentración de 1 ,67 ^* 10 ⁷ NBs/ml +/- 5,7 ^* 10 ⁶ (Figura 6).

Los resultados obtenidos en DLS y Nanosight confirman que la superficie de las nanoburbujas de 1-MCP están modificadas y/o decoradas y estabilizadas con un azúcar.

Determinación de la eficacia de nanoburbujas de 1-MCP modificadas con azúcares - proceso post cosecha en plátanos

Diseño experimental: Para determinar la eficacia de las nanoburbujas de 1 -MCP modificadas en la inhibición de la acción de etileno, por ejemplo, en plátanos, se realizaron los siguientes pasos:

Se utilizaron tres grupos de plátanos con tres individuos cada uno. Los plátanos fueron separados en tres grupos los cuales fueron asperjados con agua, solución de 1-MCP en ciclodextrina (SF) y nanoburbujas de 1 -MCP modificadas (NBS).

Después los frutos fueron expuestos a 1 ppm de etileno por 24 h para acelerar el proceso de maduración y posteriormente fueron evaluados diferentes parámetros.

Estos grupos de plátanos fueron colocados dentro de cajas plásticas selladas y sobre cada grupo se aplicó un tratamiento de interés (agua, solución de 1 -MCP en ciclodextrina (SF) y nanoburbujas de 1 -MCP modificadas (NBS)) mediante aspersión. Los tratamientos fueron denominados: control (buffer PBS), SF (smartfresh) y NBS (nanoburbujas de 1 -MCP modificadas).

Posterior a la aplicación de los diferentes tratamientos, las cajas fueron selladas y se aplicó etileno a través de una septa situada en la tapa de cada caja utilizando una jeringa Hamilton obteniéndose en el interior de la caja una concentración de 1 ppm de etileno. Las cajas permanecieron cerradas durante 24 horas y una vez trascurrido este tiempo fueron abiertas. Se realizó un seguimiento fotográfico del color de la fruta utilizando un colorímetro. Cada individuo (plátano) fue evaluado de forma independiente cada 24 horas por aproximadamente una semana. En la Figura 8 se puede observar el diseño experimental en donde los plátanos fueron separados en tres grupos los cuales fueron asperjados con agua, solución de 1 -MCP en ciclodextrina (SF) y nanoburbujas de 1 - MCP modificadas (NBS). Después los frutos fueron expuestos a 1 ppm de etileno por 24 h para acelerar el proceso de maduración, y posteriormente fueron evaluados diferentes parámetros.

Resultados obtenidos:

Utilizando un colorímetro se logró registrar el cambio de color de los plátanos a lo largo del tiempo. Se utilizaron los índices L ^* , a ^* y b ^* (CIE 1976), que denotan los cambios de luminosidad y color en los rangos rojo-azul (a ^* ) y azul-amarillo (b ^* ) presentados en la Tabla 4. Se observó que en las primeras 72 horas los tres tratamientos presentaron un color muy similar, sin embargo, a las 96 horas de tratamiento el control cambió su color de verde a amarillo, indicando que este grupo comenzó a madurar. Tabla 4. Datos de color expresados como parámetros L ^* , a ^* y b ^* para cada tratamiento (control, 1-MCP en ciclodextrinas y NBS) a las 24, 48, 72, 96, 168 y 192 horas.

Tratamiento Tiempo (h) L ^* a ^* b ^*

Control Ó 53,07 -16,74 35,39

SF 0 55,65 -17,26 35,48

NBS 0 50,81 -15,65 32,31

Control 24 54,06 -13,67 35,23

SF 24 54,51 -14,49 35,15 NBS 24 52,50 -15,70 34,09

Control 48 52,90 -14,66 35,45

SF 48 52,74 -14,05 34,65

NBS 48 50,94 -15,46 33,01

Control 72 54,21 -13,97 37,82

SF 72 51 ,19 -13,65 32,39

NBS 72 50,97 -14,68 32,30

Control 96 60,53 ^: T23 42,13

SF 96 50,32 -13,1 1 32,21

NBS 96 51 ,40 -15,25 32,20

Control 68 64,01 2^5 49,02

SF 168 49,97 -12,52 31 ,74

NBS 168 48,73 -13,13 31 ,34

Control Ϊ92 62,94 5 2 49,31

SF 192 49,5 -12,2 31 ,69

NBS 192 49,87 -13,87 31 ,81

Este cambio de color también se evidenció con el registro fotográfico (Figuras 4A y 4B).

En la Figura 10 se observan las diferencias del valor a ^* (rango rojo-verde, CIE 1976) a lo largo del tiempo (0, 24, 48, 72, 96, 168 y 192 horas) para los tratamientos control (Rojo), SF (azul) y NBS (amarillo). Las barras representan la desviación estándar, ^* corresponde a las diferencias estadísticas utilizando Test Tukey p < 0,05. Se observa que el tratamiento control tuvo una evolución del color de la piel lo que se aprecia con un valor de a ^* positivo debido a la avanzada maduración, en comparación con los frutos tratados con 1 -MCP en ciclodextrina y nanoburbujas de 1 -MCP modificadas.

En la Figura 1 1 se observan las diferencias del valor b ^* (rango amarillo-azul), CIE 1976) a lo largo del tiempo (0, 24, 48, 72, 96, 168 y 192 horas) para los tratamientos control (Rojo), SF (azul) y NBS (amarillo). Las barras representan la desviación estándar, ^* corresponde a las diferencias estadísticas utilizando Test Tukey p < 0,05. Al cabo de 192 h el control presentó un notorio color amarillo (49,31) debido a estado avanzado de maduración comparado con los frutos tratados con 1 -MCP en ciclodextrina y nanoburbujas de 1 -MCP modificadas.

En la Figura 12 se observan las diferencias del valor L ^* (luminosidad, CIE 1976) a lo largo del tiempo (0, 24, 48, 72, 96, 168 y 192 horas) para los tratamientos control (Rojo), SF (azul) y NBS (amarillo). Las barras representan la desviación estándar. Los asteriscos señalan diferencias estadísticas utilizando Test Tukey p < 0,05. Estos resultados indican una maduración mayor en el tratamiento control y perdida del color verde, por tanto, la piel de los plátanos presentó una mayor luminosidad contrastada con los frutos tratados con 1 -MCP en ciclodextrina y nanoburbujas de 1 -MCP modificadas.

De los resultados se observa que, a partir de las 96 horas de monitoreo, los parámetros L ^* , a ^* y b ^* muestran un aumento significativo en el tratamiento control en comparación a SF y NBS. Estas diferencias se prolongan hasta el final de las pruebas realizadas (192 horas). Respecto a los tratamientos SF y NBS no se observan diferencias significativas para estos tratamientos a lo largo del experimento en ninguno de los parámetros evaluados, lo que señala un efectivo control de la maduración a pesar del desafío con 1 ppm de etileno.

El valor de a ^* (rango rojo-verde, CIE 1976) indica que mientras más negativo sea este valor, más cercana está la muestra a las tonalidades verdes. De esta misma forma el valor b ^* se mueve entre los colores azul y amarillo. Mientras mas positivo es este valor, más amarilla es la muestra. Con esta perspectiva se puede concluir que los plátanos control sufrieron una pérdida del color verde y una ganancia de color amarillo a partir de las 96 horas. En contraste, los tratamientos SF y NBS no presentaron cambios relevantes a lo largo de las pruebas realizadas. El cambio de color desde el verde al amarillo es parte de la maduración normal de un plátano, lo que indica que los tratamientos SF y NBS sufrieron un retraso en su maduración a diferencia del tratamiento control.

Determinación de sólidos solubles

Para llevar a cabo este ensayo se extrajo pulpa de cada individuo (plátano) que se homogenizó utilizando un mortero de cerámica, se colocó en un tubo y centrifugó a 20.000 x g por 5 minutos. Luego, se utilizó una gota del sobrenadante y se midió el contenido de sólidos solubles utilizando un refractómetro digital. En la Tabla 5 se muestra el contenido de sólidos solubles (Grados Brix).

Tabla 5. Contenido de Solidos solubles (Grados Brix) 1 - MCP NBS de 1-MCP

Control

ciclodextrina modificada

33,1 8,6 6,3

33,4 7,5 6,3

36,6 6,6 7,8

El contenido de sólidos solubles en la industria es utilizado como indicador de madurez. En el caso de las pruebas realizadas se observa que el control presenta 34,4 grados Brix en comparación a los tratamientos 1 -MCP ciclodextrina y NBS, los cuales presentan respectivamente 7,6 y 6,8 grados Brix. Esto indica que el tratamiento control se encontraba totalmente maduro al finalizar el experimento, a diferencia de lo que ocurre con los tratamientos con 1 -MCP ciclodextrina y NBS. Estos azúcares, preferentemente sacarosa, proviene de la degradación paulatina del almidón a lo largo de la maduración. Diseño experimental de aplicación de nanoburbujas de 1-MCP modificadas con azúcares en cerezos, aplicación en terreno

El objetivo de este estudio fue determinar si la aplicación mediante aspersión de nanoburbujas de 1 -MCP modificadas en cerezos antes de realizar la cosecha de cerezas tiene efecto en la conservación de la coloración verde de los rabos de cerezas.

Los estudios de aplicación mediante aspersión de nanoburbujas de 1 -MCP modificadas en terreno fueron realizados en árboles de cerezos (Prunus cerazus), se eligió un predio ubicado en la séptima región, donde se seleccionaron tres árboles de cerezos de tres metros de altura aproximadamente, los cuales fueron marcados con cintas de color rojo, los cerezos fueron seleccionados con una separación entre ellos de al menos 5 metros (Figura 13). Posteriormente, se aplicó mediante aspersión 500 ml_ de la muestra de nanoburbujas de 1 -MCP modificadas a los cerezos seleccionados (Figura 14).

La cosecha de cerezas se realizó 24 horas post aplicación de nanoburbujas de 1 -MCP modificadas.

Diseño experimental de evaluación de efectividad de nanoburbujas de 1-MCP modificadas

Para determinar la eficacia de las nanoburbujas de 1 -MCP modificadas en la inhibición de la acción de etileno post cosecha de los rabos de cerezas, se realizaron las siguientes pruebas para lo cual se utilizaron tres grupos de cerezas con tres individuos cada uno. Estos grupos de cerezos fueron almacenados dentro de cajas plásticas selladas y sobre cada grupo se etiquetó como Grupo 1 : cerezas sin tratamiento, que corresponden a cerezas sin aplicación de nanoburbujas de 1 -MCP modificadas. Grupo 2: cerezas con tratamiento, en donde a las cerezas se les aplicó nanoburbujas de 1 -MCP modificadas 24 horas antes de la cosecha. La técnica utilizada para la conservación de cerezas fue la refrigeración, las cerezas que fueron tratadas con nanoburbujas de 1 -MCP modificadas (Cerezas con tratamiento) y las cerezas sin tratamiento (Cerezas sin tratamiento) fueron almacenadas durante 30 días a 0 ± 0,5 ^e C de temperatura con una humedad relativa del 95%.

Las cajas permanecieron cerradas durante 30 días y una vez trascurrido este tiempo fueron abiertas. Se realizó un seguimiento del color del rabo del cerezo. Cada individuo (cerezo) fue evaluado de forma independiente.

Diseño experimental de aplicación de 1-MCP en arándanos en terreno.

El objetivo de este estudio fue determinar si la aplicación de nanoburbujas de 1 -MCP modificadas en arándanos (Vaccinium myrtillos) pre- cosecha, tiene efecto en la conservación de arándanos almacenados durante 30 días post cosecha.

Los estudios de aplicación de nanoburbujas de 1 -MCP modificadas en terreno fueron realizados en arándanos, en un predio ubicado en la séptima región, donde se seleccionaron tres arbustos de arándanos de 1 ,5 metros de altura aproximadamente (Figura 15). Los arbustos seleccionados fueron marcados con cintas de color naranjo y fueron seleccionados con una separación entre ellos de al menos 3 filas (Figura 16).

Una vez seleccionados los arbustos y marcados, se le aplicó la muestra con nanoburbujas de 1 -MCP modificadas (arándanos con tratamiento), se esperó alrededor de una hora luego de la aplicación del tratamiento y se prosiguió a la cosecha de Grupo 1 : arándanos sin tratamiento, Grupo 2: arándanos con tratamiento (Figura 17). Los arándanos fueron almacenados y conservados en refrigeración a 0 +/- 0,5 ^e C de temperatura durante 30 días con una humedad relativa del 95%.

Para determinar la eficacia de las nanoburbujas de 1 -MCP modificadas en la inhibición de la acción de etileno post cosecha, en arándanos, se realizó las siguientes pruebas en donde se utilizaron tres grupos de arándanos (1. Blanco sin tratamiento, dos grupos con tratamiento).

Estos grupos de arándanos fueron almacenados dentro de cajas plásticas y sobre cada grupo se etiquetó como Grupo 1(a): arándanos sin tratamiento, Grupo 2 (b y c): arándanos con tratamiento. Las cajas permanecieron cerradas durante 30 días y una vez trascurrido este tiempo fueron abiertas y, se realizó un seguimiento del color arándano.

Resultados

Diseño experimental de aplicación de nanoburbujas de 1-MCP modificadas en cerezos, aplicación en terreno. Transcurrido el tiempo de almacenamiento bajo refrigeración a 0 +/- 0,5 ^e C de temperatura durante 30 días, de las cerezas con tratamiento y cerezas sin tratamiento, se pudo observar que las cerezas con tratamiento (Figura 18) mantuvieron la coloración verde del rabo de cerezas (Figura 19), a diferencia de las cerezas control sin tratamiento (Figura 20) que cambiaron a la coloración café oscura (Figura 21 ).

Diseño experimental de aplicación de 1-MCP en arándanos en terreno. Transcurrido el tiempo de almacenamiento bajo refrigeración a 0 +/- 0,5 ^e C de temperatura durante 30 días, de los arándanos con tratamiento y arándanos sin tratamiento (Figura 22), se pudo observar que los arándanos con tratamiento (Figura 23b y 23c) mantuvieron la coloración a diferencia de los arándanos sin tratamiento, los cuales se oscurecieron en el tiempo (Figura 23a).