以下、本発明を実施例によりさらに具体的� ��説明するが本発明はこれら実施例に制限さ� ��るものではない。
〔実施例1〕IgG2およびIgG4の酸性条件下におけ る安定性の向上
IgG2、IgG4化ヒト化IL-6レセプター抗 体発現ベクターの作製・発現
 Fcγレセプターへの結合性を低下させるため にヒト化抗ヒトIL-6レセプター抗体であるヒ� �化PM1抗体(Cancer Res. 1993 Feb 15;53(4):851-6)の定 常領域はIgG1アイソタイプであるが、定常領� �をIgG2に置換した分子(WT-IgG2、配列番号:13)、� ��よび、IgG4(Mol Immunol. 1993 Jan;30(1):105-8.)に置 換した分子(WT-IgG4、配列番号:14)を作製した。 IgGの発現には動物細胞発現用ベクターを使用 した。参考例1で使用しているヒト化PM1抗体(I gG1)の定常領域部分のNheI/NotI消化とligationによ り定常領域をIgG2あるいはIgG4に置換した発現� ��クターを構築した。各DNA断片の塩基配列は� ��BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosys tems)を用い、DNAシークエンサーABI PRISM 3730xL� �DNA SequencerまたはABI PRISM 3700 DNA Sequencer(App lied Biosystems)にて、添付説明書記載の方法に� ��い決定した。L鎖としてWT(配列番号:15)を用� �、WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4の発現は以下の方法� �実施した。ヒト胎児腎癌細胞由来HEK293H株(Inv itrogen)を10 % Fetal Bovine Serum (Invitrogen)を含� �DMEM培地(Invitrogen)へ懸濁し、5~6 × 10 ⁵ 個 /mLの細胞密度で接着細胞用ディッシュ(直 径10 cm, CORNING)の各ディッシュへ10 mLずつ蒔� ��こみCO ₂ インキュベーター(37℃、5 % CO ₂ )内で一昼夜培養した後に、培地を吸引除去� �、CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培地6.9 mLを添加した。� ��製したプラスミドDNA混合液(合計13.8μg)を1μg /mL Polyethylenimine (Polysciences Inc.) 20.7μLとCHO-S -SFMII培地 690μLと混合して室温10分間静置し� �ものを各ディッシュの細胞へ投入し、4~5時� �、CO ₂ インキュベーター(37℃にて5 % CO ₂ )内でインキュベートした。その後、CHO-S-SFM-I I(Invitrogen)培地6.9 mLを添加して、3日間 CO ₂ インキュベーター内で培養した。培養上清を 回収した後、遠心分離(約2000 g、5分間、室温 )して細胞を除去し、さらに0.22μmフィルターM ILLEX ^(R) -GV(Millipore)を通して滅菌した。該サンプルは� ��用するまで4℃で保存した。
(1) ヒト化PM1抗体(PM-1 VH + IgG1)H鎖:配列番号: 12(アミノ酸配列)
(2) ヒト化PM-1 VH + IgG2H鎖:配列番号:13(アミ� �酸配列)
(3) ヒト化PM-1 VH + IgG4H鎖:配列番号:14(アミ� �酸配列)

WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4のプロテイン A塩酸溶出による精製
 得られた培養上清にTBS中に懸濁させた50μL� �rProtein A Sepharose ^TM  Fast Flow(Amersham Biosciences)を添加し、4℃で4� �間以上転倒混和した。その溶液を0.22μmのフ� ��ルターカップUltrafree ^(R) -MC(Millipore)に移し、TBS 500μLにて3回洗浄後、r Protein A Sepharose ^TM 樹脂に100μLの10mM HCl, 150mM NaCl, pH2.0に懸濁� �て2分間静置したのち、抗体を溶出させた(塩 酸溶出法)。直ちに、6.7μLの1.5M Tris-HCl , pH  7.8を加えて中和した。溶出は2回行い、200μL� �精製抗体を得た。

塩酸溶出法により精製したWT-IgG1� �WT-IgG2、WT-IgG4のゲルろ過クロマトグラフィー 分析
 塩酸溶出法により得られた精製品の会合体� ��量を評価するためにゲルろ過クロマトグラ� ��ィー分析を行った。
会合体評価法:システム Waters Alliance
       カラム G3000SWxl(TOSOH)
       移動相 50mM sodium phosphate, 300mM KC l, pH7.0
       流速・波長 0.5ml/min、220nm
 結果を図1に示した。WT-IgG1の精製後の会合� �含量は2%程度であったのに対して、WT-IgG2、� �よび、WT-IgG4の精製後の会合体含量は25%程度� ��あった。このことから、IgG1は塩酸溶出時の 酸に対して安定であるが、IgG2およびIgG4は塩� ��溶出時の酸に対して不安定であり変性・会� ��化が進行したと考えられ、IgG2およびIgG4は� �IgG1と比較して酸性条件下における安定性が� ��いことが明らかとなった。IgG分子の精製に� ��いては、プロテインAが多用されるが、IgG分 子のプロテインAからの溶出は酸性条件下で� �われる。またIgG分子を医薬品として開発す� �上で必要なウィルス不活化は、一般に酸性� �件下において行われる。これらのことから� �IgG分子の酸性条件下における安定性は高い� �うが望ましいが、IgG2およびIgG4分子は酸性条 件下における安定性がIgG1よりも劣ることが� �かり、医薬品として開発するには酸性条件� �での変性・会合化という課題が存在するこ� �が初めて明らかとなった。医薬品として開� �するには変性・会合化という課題が解決さ� �ることが望ましいと考えられたが、これま� �にアミノ酸置換によりこれを解決する方法� �報告されていない。

WT-IgG2、WT-IgG4のCH3ドメイン改変体� ��作製と評価
 IgG2およびIgG4分子は酸性条件下における安� �性がIgG1よりも劣ることが示されたため、IgG2 およびIgG4分子の酸性条件下での安定性を改� �させる改変体を検討した。IgG2およびIgG4分子 の定常領域のモデルより、酸性条件下におけ る不安定要因として、CH3ドメインにおけるCH3 /CH3界面の不安定性が考えられ、IgG2において� ��EUナンバリングの397番目のメチオニン、IgG4� ��おいてはEUナンバリングの409番目のアルギ� �ンがそれぞれIgG2およびIgG4のCH3/CH3界面を不� �定化していると考えられた。IgG1においては� ��EUナンバリングの397番目はバリンであり、40 9番目はリジンであることから、IgG2 のEUナン バリングの397番目のメチオニンをバリンに改 変した抗体(IgG2-M397V 配列番号:16(アミノ酸配� ��)、および、IgG4のEUナンバリングの409番目の アルギニンをリジンに改変した抗体(IgG4-R409K� �配列番号:17(アミノ酸配列))を作製した。
 目的の抗体の発現ベクターの作製・発現・� ��製は、上述の塩酸溶出の方法を用いて行っ� ��。Protein Aからの塩酸溶出法により得られた 精製品の会合体含量を評価するためにゲルろ 過クロマトグラフィー分析を行った。
会合体評価法:システム Waters Alliance
       カラム G3000SWxl(TOSOH)
       移動相 50mM sodium phosphate, 300mM KC l, pH7.0
       流速・波長 0.5ml/min、220nm
 結果を図1に示した。WT-IgG1の精製後の会合� �含量は2%程度であったのに対して、WT-IgG2、� �よび、WT-IgG4の精製後の会合体含量は25%程度� ��あった。それに対して、CH3ドメイン改変体� ��あるIgG2-M397V、および、IgG4-R409Kの会合体含� �がIgG1と同等レベルの2%程度であった。IgG2 � �EUナンバリングの397番目のメチオニンをバリ ンに改変することで、あるいは、IgG4のEUナン バリングの409番目のアルギニンをリジンに改 変することで、IgG2抗体およびIgG4抗体の酸性� ��件下における安定性を向上させることが可� ��であることが明らかになった。精製抗体を2 0mM sodium acetate, 150mM NaCl, pH6.0の溶液に対し て透析(EasySEP, TOMY)を行い、約0.1mg/mLのタンパ ク質濃度で、40℃から100℃まで1℃/minの昇温� �度でDSC測定(熱変性中間温度、Tm値測定)を行� ��た。WT-IgG2、WT-IgG4、IgG2-M397V、および、IgG4-R4 09Kの熱変性中間温度を測定した結果、WT-IgG2� �WT-IgG4に比べてIgG2-M397V、IgG4-R409Kはそれぞれ� �変を導入したCH3ドメインのTm値が高いことが 分かった。このことから、IgG2-M397V、IgG4-R409K� ��それぞれWT-IgG2、WT-IgG4に比べて熱安定性に� �いても優れていることが分かった。
 IgG2およびIgG4はプロテインAを用いた精製工� ��およびウィルス不活化工程において酸性条� ��下に暴露されることから、同工程における� ��性・会合化が課題であったが、IgG2及びIgG4� �定常領域配列として、IgG2-M397VおよびIgG4-R409K を使用することによって、その課題を解決す ることが可能であることが明らかになり、同 改変はIgG2及びIgG4抗体を医薬品として開発す� ��上で極めて有用であることが分かった。ま� ��、IgG2-M397VおよびIgG4-R409Kは熱安定性にも優� �ている点からも有用であることが分かった� �

〔実施例2〕IgG2のジスルフィド結合由来のヘ� ��ロジェニティーの改善
WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4のプロテイン A酢酸溶出による精製
 実施例1で得られた培養上清にTBS中に懸濁さ せた50μLのrProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham� �Biosciences)を添加し、4℃で4時間以上転倒混和 した。その溶液を0.22μmのフィルターカップUl trafree ^(R) -MC(Millipore)に移し、TBS 500μLにて3回洗浄後、r Protein A Sepharose ^TM 樹脂に100μLの50 mM 酢酸ナトリウム水溶液, p H 3.3に懸濁して2分間静置したのち、抗体を� �出させた。直ちに、6.7μLの1.5M Tris-HCl, pH 7. 8を加えて中和した。溶出は2回行い、200μLの� ��製抗体を得た。

WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4の陽イオン交 換クロマトグラフィー(IEC)分析
 精製されたWT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4の均一性を� ��価するために陽イオン交換クロマトグラフ� ��ーによる分析を行った。
IEC評価法:システム Waters Alliance
      カラム ProPac WCX-10 (Dionex)
      移動相 A : 25mM MES-NaOH, pH6.1
          B : 25mM MES-NaOH, 250mM Na-Acetate , pH6.1
      流速・波長 0.5ml/min、280nm
      グラジエント B : 50%-75% (75min) WT-I gG1分析時
             B : 30%-55% (75min) WT-IgG2、 WT-IgG4分析時
 結果を図2に示した。WT-IgG1、WT-IgG4はイオン� ��換分析でシングルピークであったが、WT-IgG2 は複数のピークが存在していることが分かり 、IgG2分子は、IgG1やIgG4と比較してヘテロジェ ニティーが多いことが分かった。実際、IgG2� �アイソタイプは、ヒンジ領域のジスルフィ� �結合に由来するヘテロジェニティー(不均一� ��)が報告されており(非特許文献10)、図2に示� ��れたIgG2のヘテロピークもこれに由来する目 的物質/関連物質と考えられる。目的物質/関� ��物質のヘテロジェニティーの製造間差を維� ��しつつ医薬品として大量に製造することは� ��しく、医薬品として開発する抗体分子は望� ��しくは可能な限り均一な(ヘテロジェニティ ーが少ない)物質であったほうがよい。よっ� �野生型IgG2は、抗体を医薬品として開発する� ��あたって重要な均一性に課題があると考え� ��れた。実際、US20060194280(A1)において、天然� �IgG2はイオン交換クロマトグラフィー分析に� ��いてジスルフィド結合に由来する様々なヘ� ��ロピークが観察されており、これらのピー� ��間では生物活性が異なることも報告されて� ��る。このヘテロピークを単一化する方法と� ��て、US20060194280(A1)においては精製工程にお� �るリフォールディングが報告されているが� �製造においてこれらの工程を用いることは� �ストがかかり煩雑であるため、好ましくは� �ミノ酸置換によりヘテロピークを単一化す� �方法が望ましい。医薬品として開発するに� �ヒンジ領域のジスルフィド結合に由来する� �テロジェニティーが解決されることが望ま� �いと考えられたが、これまでにアミノ酸置� �によりこれを解決する方法は報告されてい� �い。

WT-IgG2のCH1ドメイン、ヒンジ領域� �改変体の作製と評価
 図3に示すとおりIgG2分子に関しては様々な� �スルフィド結合パターンが考えられる。IgG2� ��ヒンジ領域に由来するヘテロジェニティー� ��原因として、ジスルフィド結合の掛け違い� ��および、フリーのシステインの存在が考え� ��れた。IgG2はupper hinge領域に2つのシステイ� �を有し(EUナンバリング219番目と220番目、こ� �upper hingeの2つのシステインに隣接するシス� ��インとして、H鎖のCH1ドメインに存在するEU� ��ンバリング131番目のシステインとL鎖のC末� �のシステイン、および、2量化する相手H鎖の 同じupper hingeの2つのシステインが挙げられ� �。すなわち、IgG2のupper hinge周辺にはH2L2の会 合した状態では合計8個のシステインが隣接� �ており、これにより、ジスルフィド結合の� �け違い、および、フリーのシステインによ� �様々なヘテロジェニティーが存在すること� �考えられる。
 IgG2のヒンジ領域に由来するヘテロジェニテ ィーを低減することを目的にIgG2のヒンジ領� �配列とCH1ドメインの改変を行った。IgG2にお� ��てジスルフィド結合の掛け違い、および、� ��リーのシステインによるヘテロジェニティ� ��を回避するための検討を行った。各種改変� ��の検討の結果、野生型IgG2定常領域配列のう ち、H鎖のCH1ドメインに存在するEUナンバリン グ131番目のシステインと133番目のアルギニン をそれぞれセリンとリジンに改変し、H鎖のup per hingeに存在するEUナンバリング219番目のシ ステインをセリンに改変する(以下、IgG2-SKSC)( IgG2-SKSC:配列番号:18)ことによって、熱安定性� ��低下させることなくヘテロジェニティーを� ��避することが可能であると考えられた。こ� ��により、IgG2-SKSCのH鎖とL鎖の共有結合は、EU ナンバリング220番目のシステインとL鎖のC末� ��のシステインでジスルフィド結合により均� ��に形成されると考えられる(図4)。
 IgG2-SKSCの発現ベクターの作製、発現、精製� ��参考例1に記した方法で実施した。精製され たIgG2-SKSCおよび野生型IgG2(WT-IgG2)の均一性を� �価するために陽イオン交換クロマトグラフ� �ーによる分析を行った。
IEC評価法:システム Waters Alliance
      カラム ProPac WCX-10 (Dionex)
      移動相 A : 25mM MES-NaOH, pH5.6
       B : 25mM MES-NaOH, 250mM Na-Acetate, pH5 .6
      流速・波長 0.5ml/min、280nm
      グラジエント B : 50%-100% (75min) 
 結果を図5に示した。上述のとおり、WT-IgG2� �複数のピークが存在しているが、IgG2-SKSCは� �ングルピークとして溶出することが分かっ� �。IgG2のヒンジ領域のジスルフィド結合に由� ��するヘテロジェニティーは、EUナンバリン� �220番目のシステインとL鎖のC末端のシステイ ンで単一のジスルフィド結合を形成するよう なIgG2-SKSCの改変を導入することで回避できる ことが示された。また、実施例1と同様の方� �で、WT-IgG1、WT-IgG2およびIgG2-SKSCの熱変性中間 温度を測定した結果、WT-IgG2はWT-IgG1に比べて� ��いTm値を示すFabドメインのピークが観察さ� �たが、IgG2-SKSCにおいてはそのピークが認め� �れなかった。このことから、IgG2-SKSCはWT-IgG2� ��比較して熱安定性においても優れているこ� ��が分かった。
 野生型IgG2は、抗体を医薬品として開発する にあたって重要な均一性に課題があると考え られたが、IgG2-SKSCをIgG2の定常領域配列とし� �使用することにより、この課題を解決する� �とが可能であることが明らかになり、IgG2を� ��薬品として開発する上で極めて有用である� ��とが分かった。また、IgG2-SKSCは熱安定性に� ��優れている点からも有用であることが分か� ��た。 

〔実施例3〕IgG分子のC末端ヘテロジェニティ� ��の改善
WT-IgG1のH鎖C末端δGK抗体の発現ベ� �ター構築
 抗体のC末端配列のヘテロジェニティーとし て、C末端アミノ酸のリジン残基の欠損、お� �び、C末端の2アミノ酸のグリシン、リジンの 欠損によるC末端アミノ基のアミド化が報告� �れており(非特許文献12)、医薬品として開発� ��る上ではこれらのヘテロジェニティーは存� ��しないことが望ましい。実際、ヒト化PM-1抗 体であるTOCILIZUMABにおいても、その主成分は� ��基配列上存在するC末端アミノ酸のリジンが 翻訳後修飾により欠損した配列であるが、リ ジンが残存している副成分もヘテロジェニテ ィーとして存在する。そこで、C末端アミノ� �のヘテロジェニティーを低減させることを� �的にC末端アミノ酸の改変を行った。具体的� ��は、野生型IgG1のH鎖定常領域のC末端のリジ� ��およびグリシンを塩基配列上あらかじめ欠� ��させることで、C末端の2アミノ酸のグリシ� �、リジンの欠損によるC末端アミノ基のアミ� ��化を抑制することが可能かどうかを検討し� ��。
 参考例1で得たヒト化PM1抗体(WT)のpB-CHベクタ ーを用いてH鎖C末端配列に変異を導入した。Q uikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を� ��いて、添付説明書記載の方法でEUナンバリ� �グ447番目のLysおよび/またはEUナンバリング44 6番目のGlyをコードする塩基配列について、� �れを終止コドンとする変異を導入した。こ� �により、C末端の1アミノ酸のリジン(EUナンバ リング447)をあらかじめ欠損させた抗体、C末� ��の2アミノ酸のグリシン(EUナンバリング446)� �リジン(EUナンバリング447)をあらかじめ欠損� ��せた抗体の発現ベクターを作製した。ヒト� ��PM1抗体のL鎖と発現させることでH鎖C末端δK� ��体、および、H鎖C末端δGK抗体を得た。発現� ��精製は参考例1で記した方法で実施した。

 精製したH鎖C末端δGK抗体の陽イオン交換ク� ��マトグラフィー分析を以下のとおりに行っ� ��。精製したH鎖C末端δGK抗体を用いて以下の� ��法で陽イオン交換クロマトグラフィーによ� ��分析を行い、C末端欠損がヘテロジェニティ ーに及ぼす影響を評価した。陽イオン交換ク ロマトグラフィー分析条件は以下のとおりで あり、ヒト化PM1抗体、H鎖C末端δK抗体、H鎖C� �端δGK抗体のクロマトグラムを比較した。
   カラム:ProPac WCX-10 (Dionex) 
   移動相:A: 25 mmol/L MES/NaOH, pH 6.1
       B: 25 mmol/L MES/NaOH, 250 mmol/L NaCl,� �pH 6.1
   流速:0.5 mL/min
   グラジエント:25 %B(5 min)→(105 min)→67 % B→(1 min)→100 %B (5 min)
   検出:280 nm

 未改変ヒト化PM-1抗体、H鎖C末端δKおよびH鎖 C末端δGK抗体の分析結果を図6に示す。非特許 文献10から、主ピークよりも保持が遅い塩基� ��ピークにH鎖C末端449番目のLys残存体、447番� �のProアミド体が含まれるが、H鎖C末端δK で� ��認められなかった塩基性ピークの大幅な減� ��がH鎖C末端δGK抗体では認めたことから、H鎖 C末端の2アミノ酸を欠損させることによって� ��めてH鎖C末端ヘテロジェニティーを軽減す� �ことが可能であると分かった。
 H鎖C末端の2残基の欠損の及ぼす熱安定性へ� ��影響を評価するために、DSCによるH鎖C末端δ GK抗体の熱変性温度測定を行った。DSC測定用� ��して150 mM NaClを含む20 mM 酢酸緩衝液、pH6. 0に透析することで緩衝液を置換した。ヒト� �PM1抗体、H鎖C末端δGK抗体およびリファレン� �溶液(透析外液)を十分に脱気した後、これら をそれぞれ熱量計セルに封入し40℃での熱平� ��化を十分に行った。次にDSC走査を40℃~100℃� ��約1K/分走査速度で行った。得られた変性ピ� ��クについて、非特許文献(Rodolfoら、Immunology� �Letters、1999年、p47-52)を参考にピークアサイ� �を行ったところ、C末端欠損はCH3ドメインの� ��変性温度に影響しないことを確認した。
 これにより、H鎖定常領域のC末端のリジン� �よびグリシンを塩基配列上あらかじめ欠損� �せることで、抗体の熱安定性に影響を与え� �ことなく、C末アミノ酸のヘテロジェニティ� ��を低減させること可能となった。ヒト抗体� ��常領域IgG1、IgG2、IgG4において、C末端配列は いずれもEUナンバリング447番目がLys、EUナン� �リング446番目がGlyになっていることから、� �件等で見出されたC末アミノ酸のヘテロジェ� ��ティーを低減させる方法はIgG2定常領域とIgG 4定常領域にも適用可能であると考えられる� �

〔実施例4〕新規最適化定常領域M14δGK配列の� ��製
 抗原を中和することが目的の抗体医薬にお� ��てはFc領域の有するADCC等のエフェクター機� ��は必要ではなく、従って、Fcγレセプターへ の結合は不必要である。免疫原性や副作用の 点から考えるとFcγレセプターへの結合は好� �しくない可能性も考えられる(非特許文献5、 6)。ヒト化抗IL-6レセプターIgG1抗体であるTOCIL IZUMABはIL-6レセプターに特異的に結合し、そ� �生物学的作用を中和することで、関節リウ� �チ等のIL-6が関連する疾患の治療薬として利� ��可能であり、Fcγレセプターへの結合は不必 要である。

Fcγレセプター非結合の最適化定� �領域M14δGK、M11δGK、M17δGKの作製と評価
 Fcγレセプターへの結合を低下させる方法と しては、IgG抗体のアイソタイプをIgG1からIgG2� ��るいはIgG4アイソタイプに変える方法が考え られる(Ann Hematol. 1998 Jun;76(6):231-48.)。Fcγレ� ��プターへの結合を完全に無くす方法として� ��、人工的な改変をFc領域に導入する方法が� �告されている。例えば、抗CD3抗体や抗CD4抗� �は抗体のエフェクター機能が副作用を惹起� �るため、Fc領域のFcγレセプター結合部分に� �生型配列には存在しないアミノ酸変異(非特� ��文献3、7)を導入したFcγレセプター非結合型 の抗CD3抗体や抗CD4抗体の臨床試験が現在行わ れている(非特許文献5、8)。また、IgG1のFcγR� �合部位(EUナンバリング:233、234、235、236、327� ��330、331番目)をIgG2(EUナンバリング:233、234、2 35、236)およびIgG4(EUナンバリング:327、330、331� ��目)の配列にすることでFcγレセプター非結� �型抗体を作製することが可能であると報告� �れている(特許文献3)。しかしながら、IgG1に� ��れらの変異を全て導入すると、天然には存� ��しないT-cellエピトープペプチドとなりうる9 アミノ酸の新しいペプチド配列が出現し、免 疫原性のリスクが高まることが考えられる。 医薬品として開発する上では、免疫原性リス クは極力下げることが望ましい。

 上述の課題を解決するために、IgG2の定常 領域への改変を検討した。IgG2の定常領域はFc γR結合部位のうちEUナンバリング:233、234、235 、236が非結合型であるが、FcγR結合部位のう� ��EUナンバリング:327、330、331番目は非結合型� ��IgG4とは異なる配列であるため、EUナンバリ� ��グ:327、330、331番目のアミノ酸をIgG4の配列� �改変する必要がある(Eur J Immunol. 1999 Aug;29( 8):2613-24におけるG2δa)。しかしながら、IgG4はE Uナンバリング:339番目のアミノ酸がアラニン� ��あるのに対して、IgG2はスレオニンであるた め、EUナンバリング:327、330、331番目のアミノ 酸をIgG4の配列に改変しただけでは天然には� �在しないT-cellエピトープペプチドとなりう� �9アミノ酸の新しいペプチド配列が出現して� ��まい、免疫原性リスクが生じる。そこで、� ��述の改変に加えて新たにIgG2のEUナンバリン� ��:339番目のスレオニンをアラニンに改変する ことで、新しいペプチド配列の出現を防ぐこ とが可能であることを見出した。

 これらの変異に加えて、実施例1で見出し たIgG2の酸性条件下での安定性を向上させるIg G2 のEUナンバリングの397番目のメチオニンか らバリンへの変異、実施例2で見出されたヒ� �ジ領域のジスルフィド結合に由来するヘテ� �ジェニティーを改善させるEUナンバリングの 131番目のシステインからセリンへの変異、133 番目のアルギニンからリジンへの変異、219番 目のシステインからセリンへの変異を導入し た。さらに131番目と133番目の変異導入に伴い 天然には存在しないT-cellエピトープペプチド となりうる9アミノ酸の新しいペプチド配列� �出現してしまい免疫原性リスクが生じるこ� �から、EUナンバリングの137番目のグルタミン 酸からグリシンへの変異、138番目のセリンか らグリシンへの変異を導入することで、131番 目から139番目付近のペプチド配列を天然に存 在するヒト配列と同一のものとした。さらに 、C末端に由来するヘテロジェニティーを低� �させるためにH鎖C末端のEUナンバリングの446� ��447番目のグリシンおよびリジンを欠損させ� ��。これらの変異を全て導入した定常領域配� ��をM14δGKとした(M14δGK:配列番号:5)。M14δGKはT- cellエピトープペプチドとなりうる9アミノ酸� ��新しいペプチド配列として219番目のシステ� ��ンからセリンへの変異を導入した1ヶ所が存 在するが、システインとセリンはアミノ酸配 列としての性質が似ていることから免疫原性 のリスクは極めて小さいと考えられ、TEPITOPE� ��よる免疫原性予測においても免疫原性の変� ��は認められなかった。

 可変領域配列としてWTを有し、定常領域配� �としてM14δGKを有するH鎖抗体配列(M14δGK:配列 番号:5、WT-M14δGK:配列番号:19)の発現ベクター� ��参考例1に記された方法で作製し、H鎖とし� �WT-M14δGK、L鎖としてWTを用いて参考例1に記し た方法で発現・精製した。
 また、同様の方法で、IgG4定常領域にFcγレ� �プターへの結合を低下させるためにEUナンバ リング:233、234、235、236番目に変異を導入し(E ur J Immunol. 1999 Aug;29(8):2613-24におけるG4δb、 この改変においては新しい非ヒト配列が生じ るため免疫原性リスクが上昇する)、免疫原� �リスクを低減させるために上述の改変に加� �てヒンジ領域のジスルフィド結合様式をM14δ GKと同じにするためにEUナンバリング:131、133� ��137、138、214、217、219、220、221、222番目に変� ��を導入し、さらに酸性条件下での安定性を� ��上させるためにEUナンバリング409番目に変� �を導入し(実施例1)、C末端のヘテロジェニテ� ��ーを低下させるためにEUナンバリング446番� �と447番目を欠損させた(実施例3)WT-M11δGK(M11δG K:配列番号:8、WT-M11δGK:配列番号:21)の発現ベ� �ターを作製した。
 さらに、IgG1定常領域にFcγレセプターへの� �合を低下させるためにEUナンバリング:233、23 4、235、236、327、330、331、339番目に変異を導� �し(Eur J Immunol. 1999 Aug;29(8):2613-24におけるG1 δab)、さらにC末端のヘテロジェニティーを低 下させるためにEUナンバリング446番目と447番� ��を欠損させた(実施例3)WT-M17δGK(M17δGK:配列番 号:10、WT-M17δGK:配列番号:20)を作製した。
 H鎖としてWT-M17δGKあるいはWT-M11δGK、L鎖とし てWTを用いて実施例1に記した方法で発現・精 製した。

WT-M14δGK、WT-M17δGK、WT-M11δGKのFcγ� �セプター結合性の評価
 FcγRIへの結合評価は以下のとおりに行った� ��Biacore T100 を用いて、センサーチップに固� ��化したヒト由来 Fcγ receptor I (以下、FcγRI ) と、アナライトとして用いたIgG1、IgG2、IgG4  、M11δGK、M14δGK、M1δGK 7を相互作用させ、� �の結合量を比較した。ヒト由来の FcγRI と� ��ては Recombinant Human FcRIA / CD64 (R&D syst ems) を用い、サンプルとして IgG1、IgG2、IgG4� �、M11δGK、M14δGK、M17δGK を用いて測定を行っ た。アミンカップリング法によりセンサーチ ップ CM5 (BIACORE) に FcγRIを固定化した。最� ��的なhFcγRIの固定量は、約13000 RU(resonance uni ts) であった。ランニングバッファーとしてH BS-EP+を用い、流速は20 μL/minとした。サンプ� ��をHBS-EP+を用いて100 μg/mLの濃度に調整した� ��分析は、抗体溶液の10 μLをインジェクトす る2分間を結合相とし、その後HBS-EP+に切り換� ��、4分間の解離相とした。解離相終了後、20� �μLの5 mM水酸化ナトリウムをインジェクトす ることにより、センサーチップを再生した。 この結合・解離・再生を分析の1サイクルと� �、各種抗体溶液をインジェクトし、センサ� �グラムを得た。アナライトはそれぞれ IgG4� �IgG2、IgG1、M11、M14、M17 の順に流し、それを� �2 回繰り返した。測定した結合量データを� �較した結果を図7に示した。その結果、結合� ��は IgG1 > IgG4 >> IgG2 = M11δGK = M14� �δGK = M17δGK の順に減少しており、野生型� �IgG2、M11δGK、M14δGK、M17δGK は野生型のIgG1、I gG4 よりも FcγRIに対して結合が弱いことが� �らかとなった。

 FcγRIIaへの結合評価は以下のとおりに行� �た。Biacore T100 を用いて、センサーチップ� �固定化したヒト由来 Fcγ receptor IIa (以下� �FcγRIIa) と、アナライトとして用いたIgG1、Ig G2、IgG4 、M11δGK、M14δGK、M17δGKを相互作用さ� ��、その結合量を比較した。ヒト由来の FcγR IIa としては Recombinant Human FcRIIA/CD32a (R& D systems) を用い、サンプルとして IgG1、IgG2� ��IgG4 、M11δGK、M14δGK、M17δGK を用いて測定� �行った。アミンカップリング法によりセン� �ーチップ CM5 (BIACORE) に FcγRIIa を固定化� �た。最終的に約 3300 RU の FcγRIIa を固定� �した。ランニングバッファーとしてHBS-EP+を� ��い、流速は20 μL/minとした。その後、ベー� �ラインが安定になるまでランニングバッフ� �ーを流し、測定はベースラインが安定して� �ら行った。固定化した FcγRIIa に対して、� �ナライトとして各 IgG アイソタイプ (IgG1,  IgG2, IgG4) および変異を導入した抗体 (M11δGK , M14δGK, M17δGK) を相互作用させ、その結合� ��を観察した。ランニングバッファーには HB S-EP+ を用い、流速は 20 μL/min 、測定温度� � 25℃とした。各 IgG および 改変体は 100  μg/mL に調整し、アナライトとして 20 μL � �し、固定化した FcγRIIa と相互作用させた� �相互作用後は 200 μL のランニングバッフ� �ーを流すことで FcγRIIa からアナライトを� �離させ、センサーチップを再生させた。ア� �ライトはそれぞれ IgG4、IgG2、IgG1、M11δGK、M1 4δGK、M17δGK の順に流し、それを 2 回繰り� �した。測定した結合量データを比較した結� �を図8に示した。その結果、結合量は IgG1 &g t; IgG2 = IgG4 > M11δGK = M14δGK = M17δGK � �順に減少しており、M11δGK、M14δGK、M17δGK は 野生型のIgG1、IgG2、IgG4 のいずれよりも FcγR IIa に対して結合が弱いことが明らかとなっ� ��。

 FcγRIIbへの結合評価は以下のとおりに行� �た。Biacore T100 を用いて、センサーチップ� �固定化したヒト由来 Fcγ receptor IIb(以下、F cγRIIb) と、アナライトとして用いたIgG1、IgG2 、IgG4 、M11δGK、M14δGK、M17δGKを相互作用させ 、その結合量を比較した。ヒト由来の FcγRII b としては Recombinant Human FcRIIB/C (R&D sys tems) を用い、サンプルとして IgG1、IgG2、IgG4  、M11δGK、M14δGK、M17δGK を用いて測定を行� �た。アミンカップリング法によりセンサー� �ップ CM5 (BIACORE) に FcγRIIb を固定化した� �最終的に約 4300RU の FcγRIIb を固定化した� ��その後、ベースラインが安定になるまでラ� ��ニングバッファーを流し、測定はベースラ� ��ンが安定してから行った。固定化した FcγR IIb に対して、アナライトとして各 IgG  ア� ��ソタイプ  (IgG1, IgG2, IgG4) および変異を� �入した抗体 (M11δGK, M14δGK, M17δGK) を相互� �用させ、その結合量を観察した。ランニン� �バッファーには HBS-EP+を用い、流速は 20 μ L/min 、測定温度は 25°C とした。各 IgG お� ��び 改変体は 200 μg/mL に調整し、アナラ� �トとして 20 μL 流し、固定化した FcγRIIb  と相互作用させた。相互作用後は 200 μL の ランニングバッファーを流すことで FcγRIIb  からアナライトを解離させ、センサーチップ を再生させた。アナライトはそれぞれ IgG4、 IgG2、IgG1、M11δGK、M14δGK、M17δGK の順に流し� �それを 2 回繰り返した。測定した結合量デ ータを比較した結果を図9に示した。その結� �、結合量は IgG4 > IgG1 > IgG2 > M11δG K = M14δGK = M17δGK の順に減少しており、M11 δGK、M14δGK、M17δGK は野生型のIgG1、IgG2、IgG4� �のいずれよりも FcγRIIb に対して結合が弱� �ことが明らかとなった。

 FcγRIIIaへの結合評価は以下のとおりに行� ��た。Biacore T100 を用いて、センサーチップ� ��固定化したヒト由来 Fcγ receptor IIIa(以下� �FcγRIIIa) と、アナライトとして用いたIgG1、I gG2、IgG4 、M11δGK、M14δGK、M17δGKを相互作用さ せ、その結合量を比較した。ヒト由来の Fcγ RIIIa としてはhFcγRIIIaV-His6(組み換えhFcγRIIIaV- His6:社内調製品)を用い、サンプルとして IgG1 、IgG2、IgG4 、M11δGK、M14δGK、M17δGK を用いて 測定を行った。アミンカップリング法により センサーチップ CM5 (BIACORE) に FcγRIIIaを固� ��化した。最終的なhFcγRIIIaV-His6の固定量は、 約8200 RU(resonance units) であった。ランニン� �バッファーとしてHBS-EP+を用い、流速は5 μL/ minとした。サンプルを、HBS-EP+を用いて250 μg /mLの濃度に調整した。分析は、抗体溶液の10� �Lをインジェクトする2分間を結合相とし、そ の後HBS-EP+に切り換え、4分間の解離相とした� ��解離相終了後、20 μLの5 mM塩酸をインジェ� ��トすることにより、センサーチップを再生� ��た。この結合・解離・再生を分析の1サイク ルとし、各種抗体溶液をインジェクトし、セ ンサーグラムを得た。アナライトはそれぞれ  IgG4、IgG2、IgG1、M11δGK、M14δGK、M17δGK の順� �流した。測定した結合量データを比較した� �果を図10に示した。その結果、結合量は IgG1  >> IgG4 > IgG2 > M17δGK > M11δGK  = M14δGK の順に減少しており、M11δGK、M14δGK� ��M17δGK は野生型のIgG1、IgG2、IgG4 よりも Fc� �RIIIa に対して結合が弱いことが明らかとな� ��た。また、Eur J Immunol. 1999 Aug;29(8):2613-24� �報告されているG1δabの変異を含むM17δGKと比� ��して、M11δGK、M14δGKのほうがさらに弱い結� �であることが明らかとなった。

 以上より、WT-M14δGK、WT-M17δGK、WT-M11δGKの� ��種Fcγレセプターへの結合は野生型のIgG1と� �較して著しく低下していることが確認され� �。WT-M14δGK、WT-M17δGK、WT-M11δGKを定常領域と� �て使用することで、Fcγレセプターを介したA PCへの取り込みに由来する免疫原性リスクやA DCC等のエフェクター機能に由来する副作用を 回避することが可能であり、抗原を中和する ことが目的の抗体医薬の定常領域配列として 有用である。

WT-M14δGK、WT-M17δGK、WT-M11δGKの高濃 度安定性試験
 WT-M14δGK、WT-M17δGK、WT-M11δGKの高濃度製剤に� ��ける安定性の評価を行った。WT-IgG1、WT-M14δG K、WT-M17δGK、WT-M11δGKの精製抗体を20mM histidine  chloride, 150mM NaCl, pH6.5の溶液に対して透析( EasySEP, TOMY)を行い、その後限外ろ過膜により 濃縮し、高濃度安定性試験を行った。条件は 以下のとおりである。
抗体:WT-IgG1、WT-M14δGK、WT-M17δGK、WT-M11δGK
緩衝液:20mM histidine chloride, 150mM NaCl, pH6.5
濃度:61mg/mL
保存温度と期間:40℃-2W、40℃-1M、40℃-2M
会合体評価法:システム Waters Alliance
       カラム G3000SWxl(TOSOH)
       移動相 50mM sodium phosphate, 300mM KC l, pH7.0
       流速・波長 0.5ml/min、220nm
       サンプルを1/100に希釈して分析

 Initial(製剤調製直後)および各条件で保存� ��の製剤の会合体含有量を上述のゲルろ過ク� ��マトグラフィー法により評価し、initialから 会合体含量の変化量について図11に示した。� ��の結果、WT-IgG1と比較してWT-M14δGK、WT-M17δGK� ��WT-M11δGKの会合体増加量は低く、WTの会合体� ��加量の約1/2であった。また、図12に示すよ� �にFab断片の増加量に関しては、WT-IgG1とWT-M17� �GKは同程度であったが、WT-M14δGKとWT-M11δGKはW TのFab断片増加量の約1/4であった。IgGタイプ� �抗体製剤の劣化経路として、WO 2003/039485に� �されているように、会合体の生成とFab分解� �の生成が主に挙げられる。WT-M14δGKとWT-M11δGK は、WT-IgG1と比較して会合体とFab断片の生成� �2つの点で製剤的安定性に優れていることが� ��出された。これにより、IgG1定常領域では安 定性が十分ではなく、医薬品として開発可能 な高濃度溶液製剤が作れなかった抗体におい ても、定常領域としてWT-M14δGK、WT-M17δGK、WT-M 11δGKを用いることがより高い安定性を有する 高濃度溶液製剤が作製可能になると考えられ た。

 特にM14δGKは、本来IgG2分子が有する酸性� �件下での不安定性を向上させ、ヒンジ領域� �ジスルフィド結合に由来するヘテロジェニ� �ィーを改善し、Fcγレセプターに結合せず、T -cellエピトープペプチドとなりうる9アミノ酸 の新しいペプチド配列を最小限に抑え、且つ 、高濃度製剤における安定性がIgG1よりも優� �た新規な定常領域配列として極めて有用で� �ると考えられた。

〔実施例5〕M31δGKの作製と評価
 実施例4で作製したM14δGKに対し、EUナンバリ ング:330、331、339番目をIgG2の配列に改変したM 31δGKを作製した(M31δGK:配列番号:7)。可変領域 配列としてWTを有し、定常領域配列としてM31� �GKを有するH鎖抗体配列(WT-M31δGK:配列番号:22)� ��発現ベクターを参考例1に記された方法で作 製し、H鎖としてWT-M31δGK、L鎖としてWTを用い� ��、WT-M31δGKを参考例1に記した方法で発現・� �製した。
 WT-M31δGKに加えて、同時に発現・精製したWT- IgG2およびWT-M14δGKの陽イオン交換クロマトグ� ��フィー分析を以下のとおりに行った。陽イ� ��ン交換クロマトグラフィー分析条件は以下� ��とおりであり、WT-IgG2、WT-M14δGK、WT-M31δGKの� ��ロマトグラムを比較した。
   カラム:ProPac WCX-10 (Dionex) 
   移動相:A: 25 mmol/L MES/NaOH, pH 6.1
       B: 25 mmol/L MES/NaOH, 250 mmol/L NaCl,� �pH 6.1
   流速:0.5 mL/min
   グラジエント:0 %B(5 min)→(65 min)→100 %B →(1 min)
   検出:280 nm
 WT-IgG2、WT-M14δGK、WT-M31δGKの分析結果を図13� �示す。WT-IgG2は複数のピークが存在している� ��、WT-M31δGKはWT-M14δGKと同様シングルピーク� �して溶出することが分かった。WT-M31δGKにお� ��てもIgG2のヒンジ領域のジスルフィド結合に 由来するヘテロジェニティーは回避できるこ とが示された。

〔実施例6〕WT-M14の血漿中滞留性評価
ヒトにおける血漿中滞留性の予測 方法
 IgG分子の血漿中滞留性が長い(消失が遅い)� �は、IgG分子のサルベージレセプターとして� �られているFcRnが機能しているためである(Nat  Rev Immunol. 2007 Sep;7(9):715-25)。ピノサイトー シスによってエンドソームに取り込まれたIgG 分子は、エンドソーム内の酸性条件下(pH6.0付 近)においてエンドソーム内に発現しているFc Rnに結合する。FcRnに結合できなかったIgG分子 はライソソームへ進みライソソームで分解さ れるが、FcRnへ結合したIgG分子は細胞表面へ� �行し血漿中の中性条件下(pH7.4付近)においてF cRnから解離することで再び血漿中に戻る。
 IgGタイプの抗体として、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4 のアイソタイプが知られているが、これらの ヒトでの血漿中半減期は、IgG1、IgG2が約36日� �IgG3が約29日、IgG4が16日であることが報告さ� �ており(Nat Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1369-72.)、Ig G1およびIgG2の血漿中滞留性が最も長いと考え られている。一般に抗体医薬のアイソタイプ はIgG1、IgG2、IgG4であるが、これらのIgG抗体の 薬物動態をさらに向上する方法として、IgGの 定常領域の配列を改変することで上述のヒト FcRnへの結合性を向上させる方法が報告され� �いる(J Biol Chem. 2007 Jan 19;282(3):1709-17、J Im munol. 2006 Jan 1;176(1):346-56)。
 マウスFcRnとヒトFcRnでは種差が存在するこ� �から(Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Dec 5;103(49 ):18709-14)、定常領域の配列を改変したIgG抗体� ��ヒトにおける血漿中滞留性を予測するため� ��は、ヒトFcRnへの結合評価およびヒトFcRnト� �ンスジェニックマウスにおいて血漿中滞留� �を評価することが望ましいと考えられた(Int� �Immunol. 2006 Dec;18(12):1759-69)。

ヒトFcRnへの結合評価
 FcRnはFcRnとβ2-microglobulinの複合体である。公 開されているヒトFcRn遺伝子配列(J. Exp. Med.  180 (6), 2377-2381 (1994))を元に、オリゴDNAプラ� ��マーを作製した。ヒトcDNA(Human Placenta Marath on-Ready cDNA, Clontech)を鋳型とし、作製したプ� ��イマーを用いPCR法により遺伝子全長をコー� ��するDNA断片を調整した。得られたDNA断片を� ��型に、PCR法によりシグナル領域を含む細胞� ��領域(Met1-Leu290)をコードするDNA断片を増幅し 、動物細胞発現ベクターへ挿入した(ヒトFcRn� ��ミノ酸配列 配列番号:24)。同様に、公開さ� ��ているヒトβ2-microglobulin遺伝子配列(Proc. Nat l. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26), 16899-16903 (2002))を� ��に、オリゴDNAプライマーを作製した。ヒトc DNA(Hu-Placenta Marathon-Ready cDNA, CLONTECH)を鋳型� �し、作製したプライマーを用いPCR法により� �伝子全長をコードするDNA断片を調製した。� �られたDNA断片を鋳型に、PCR法によりシグナ� �領域を含むβ2-microglobulin全長(Met1-Met119)をコ� �ドするDNA断片を増幅し、動物細胞発現ベク� �ーへ挿入した(ヒトβ2-microglobulinアミノ酸配� � 配列番号:25)。
 可溶型ヒトFcRnの発現は以下の手順で行った 。調製したヒトFcRnおよびヒトβ2-microglobulinの プラスミドを、10 % Fetal Bovine Serum (Invitroge n)を用いたlipofection法により、ヒト胎児腎癌� �胞由来HEK293H株(Invitrogen)の細胞へ導入した。� ��られた培養上清を回収した後、IgG Sepharose  6 Fast Flow(Amersham Biosciences)を用い、(J Immunol.  2002 Nov 1;169(9):5171-80.)の方法に従い精製を� �った。その後、HiTrap Q HP(GE Healthcare)により 精製を行った。
 ヒトFcRnへの結合評価にはBiacore 3000 を用い 、センサーチップに固定化したProtein Lある� �はウサギ抗ヒトIgG Kappa chain抗体へ結合させ た抗体に、アナライトとしてヒトFcRnを相互� �用させた際のヒトFcRnの結合量よりaffinity(KD)� ��算出した。具体的には、ランニングバッフ� ��ーとして150mM NaClを含む50mM Na-phosphate buffer 、pH6.0を用い、アミンカップリング法により� ��ンサーチップ CM5 (BIACORE) にProtein Lあるい はウサギ抗ヒトIgG Kappa chain抗体を固定化し� ��。その後、抗体を0.02% Tween20を含むランニ� �グバッファーで希釈してインジェクトしチ� �プに抗体を結合させた後、ヒトFcRnをインジ� ��クトし、ヒトFcRnの抗体への結合性を評価し た。
 Affinityの算出にはソフトウエア、BIAevaluation� ��用いた。得られたセンサーグラムより、ヒ� ��FcRnインジェクト終了直前の抗体へのhFcRn結� ��量を求め、これをsteady state affinity法でフ� �ッティングしてヒトFcRnに対する抗体のaffinit yを算出した。

ヒト FcRnトランスジェニックマウ スにおける血漿中滞留性の評価
 ヒト FcRnトランスジェニックマウス(B6.mFcRn- /-.hFcRn Tg line 276 +/+ マウス、Jackson Laborator ies)における体内動態の評価は以下の通り行� �た。抗体をマウスに1 mg/kgの投与量で静脈内 に単回投与し適時採血を行った。採取した血 液は直ちに4℃、15,000 rpmで15分間遠心分離し� ��血漿を得た。分離した血漿は、測定を実施� ��るまで-20℃以下に設定された冷凍庫に保存� ��た。血漿中濃度はELISA法を用いて測定した� �

WT-M14のヒトにおける血漿中滞留性 の予測評価
 WT-IgG1とWT-M14のヒトFcRnへの結合性の評価をBI Acoreにより行った結果、表1に示すとおり、WT- M14の結合性のほうが僅かにWT-IgG1よりも優れ� �いた。
 しかしながら、WT-IgG1とWT-M14のヒトFcRnトラ� �スジェニックマウスにおける血漿中滞留性� �評価を行った結果、図14に示すとおり、WT-IgG 1とWT-M14は同等の血漿中滞留性を示したこと� �ら、M14の定常領域はヒトにおいてもIgG1の定� ��領域と同等の血漿中滞留性を示すと考えら� ��た。

〔実施例7〕薬物動態を向上させたWT-M44、WT-M5 8、WT-M73の作製
WT-M58分子の作製
 実施例6に示したとおり、WT-M14のヒト FcRnト ランスジェニックマウスにおける血漿中滞留 性はWT-IgG1と同等であった。薬物動態を向上� �せる方法として、抗体の等電点を低下させ� �方法とFcRnへの結合性を増強する方法が知ら� ��ているが、WT-M14の薬物動態を向上させるこ� ��を目的に以下の改変を導入した。具体的に� ��、実施例4においてWT-M14から作製したWT-M31δG KのEUナンバリング397番目のバリンをメチオニ ンに改変し、268番ヒスチジンをグルタミンへ 改変し、355番アルギニンをグルタミンへ改変 し、419番グルタミンをグルタミン酸へ改変し た。これら4箇所の改変をWT-M31δGK に導入し� �WT-M58(配列番号:26(アミノ酸配列))を作製した� ��発現ベクターの作製は、実施例1の方法で作 製し、H鎖としてWT-M58を使用し、L鎖としてL(WT )を用いたWT-M58の発現・精製は実施例1に記載� ��た方法で行った。

WT-M73分子の作製
 一方、IgG1に対して、EUナンバリング:434番目 をアラニンに置換したWT-M44(配列番号:27(アミ� ��酸配列))を作製した。さらにM44に対してH鎖C 末端のヘテロジェニティーを低減するために 446番目のグリシンおよび447番目のリジンを欠 損させたWT-M83(配列番号:58(アミノ酸配列))を� �製した。また、WT-M58に対して、EUナンバリン グ:434番目をアラニンに置換したWT-M73(配列番� ��:28(アミノ酸配列))を作製した。
 これらの発現ベクターの作製は、実施例1の 方法で作製し、H鎖としてWT-M44あるいはWT-M58� �るいはWT-M73を使用し、L鎖としてL(WT)を用い� �WT-M44およびWT-M58およびWT-M73の発現・精製は� �施例1に記載した方法で行った。

WT-M44、WT-M58、WT-M73のヒトにおける 血漿中滞留性の予測評価
 WT-IgG1、WT-M44、WT-M58およびWT-M73のヒトFcRnへ� �結合性の評価をBIAcoreにより行った結果、表2 に示すとおり、WT-M44、WT-M58およびWT-M73の結合 性はWT-IgG1よりもそれぞれ約2.7倍、約1.4倍お� �び約3.8倍程度優れていた。
 WT-IgG1、WT-M14およびWT-M58のヒトFcRnトランス� �ェニックマウスにおける血漿中滞留性の評� �を行った結果、図24に示すとおり、WT-M58はWT- IgG1、WT-M14と比較して薬物動態の向上が確認� �れた。さらにWT-IgG1、WT-M44、WT-M58およびWT-M73� ��ヒトFcRnトランスジェニックマウスにおける 血漿中滞留性の評価を行った結果、図15に示� ��とおり、WT-M44、WT-M58およびWT-M73はいずれもW T-IgG1と比較して薬物動態の改善が確認され、 その薬物動態の改善効果はヒトFcRnへの結合� �と相関した。なかでもWT-M73に関しては、WT-Ig G1と比較して28日後の血漿中濃度が約16倍改善 していたことから、ヒトにおいてもM73の定常 領域を有する抗体はIgG1の定常領域を有する� �体と比較して大幅に薬物動態が向上すると� �えられた。

〔実施例8〕様々な抗体における新規定常領� �M14およびM58によるヘテロジェニティー低減� �果
 実施例4に示すとおり、抗IL-6レセプター抗� �であるヒト化PM1抗体(WT)において、定常領域� ��IgG2からM14に変換することにより、IgG2のヒ� �ジ領域に由来するヘテロジェニティーを低� �できることが確認された。そこで、ヒト化PM 1抗体以外IgG2タイプの抗体に対しても、定常� ��域をM14あるいはM58に変換することでヘテロ� ��ェニティーを低減できるかどうかを検討し� ��。
 ヒト化PM1抗体以外の抗体として、抗IL-6レセ プター抗体であるF2H/L39(F2H/L39_VHアミノ酸配列  配列番号:29、F2H/L39 VLアミノ酸配列 配列番 号:30)、抗IL-31レセプター抗体であるH0L0(H0L0_VH アミノ酸配列 配列番号:31、H0L0_VLアミノ酸配 列 配列番号:32)、抗RANKL抗体であるDNS(DNS_VHア ミノ酸配列 配列番号:33、DNS_VLアミノ酸配列� �配列番号:34)、を使用した。それぞれの抗体� ��対して、定常領域をIgG1(配列番号:1)、IgG2(配 列番号:2)、および、M14(配列番号:5)あるいはM5 8(配列番号:35)にしたものを作製した。
 ヘテロジェニティーの評価方法として、陽� ��オン交換クロマトグラフィーによる評価を� ��った。作製した抗体のヘテロジェニティー� ��評価は、カラムとしてProPac WCX-10 (Dionex)を� ��い、移動相Aとして20mM Sodium Acetate, pH5.0、� ��動相Bとして20mM Sodium Acetate, 1M NaCl, pH5.0� �使用し、適切な流速およびグラジエントを� �いて実施した。陽イオン交換クロマトグラ� �ィー(IEC)による評価を行った結果を図16示し� ��。
 図16に示したとおり、抗IL-6レセプター抗体� ��あるヒト化PM1抗体(WT)だけでなく、抗IL-6レ� �プター抗体であるF2H/L39、抗IL-31レセプター� �体であるH0L0、抗RANKL抗体であるDNSにおいて� �、定常領域をIgG1からIgG2に変換することでヘ テロジェニティーが増大し、定常領域をM14あ るいはM58に変換することでいずれの抗体にお いてもヘテロジェニティーを低減できること が確認された。これより、H鎖のCH1ドメイン� �存在するEUナンバリング131番目のシステイン とH鎖のupper hingeに存在するEUナンバリング219 番目のシステインをセリンに改変することに より、可変領域の抗体配列および抗原の種類 に関わらず、天然型IgG2に由来するヘテロジ� �ニティーを低減できることが示された。

〔実施例9〕様々な抗体における新規定常領� �M58による薬物動態改善効果
 実施例7に示したとおり、抗IL-6レセプター� �体であるヒト化PM1抗体(WT)において、定常領� ��をIgG1からM58に変換することにより、ヒトFcR nへの結合性が向上し、ヒトFcRnトランスジェ� ��ックマウスにおいて薬物動態が向上するこ� ��が見出された。そこで、ヒト化PM1抗体以外� ��IgG1抗体に対しても、定常領域をM58に変換す ることで薬物動態を向上できるかどうかを検 討した。
 ヒト化PM1抗体(WT)以外の抗体として、抗IL-31� ��セプター抗体であるH0L0(H0L0_VHアミノ酸配列� �配列番号:31、H0L0_VLアミノ酸配列 配列番号:3 2)、抗RANKL抗体であるDNS(DNS_VHアミノ酸配列 � �列番号:33、DNS_VLアミノ酸配列 配列番号:34)� �を使用した。それぞれの抗体に対して、定� �領域をIgG1(配列番号:1)およびM58(配列番号:35)� ��したものを作製し、実施例6に示した方法で ヒトFcRnへの結合性を評価した。その結果を� �3に示した。
 表3に示したとおり、抗IL-31レセプター抗体� ��あるH0L0、抗RANKL抗体であるDNSにおいても、� ��常領域をIgG1からM58に変換することで、抗IL- 6レセプター抗体であるWT同様、ヒトFcRnへの� �合性が向上することが確認された。これよ� �、可変領域の抗体配列および抗原の種類に� �わらず、定常領域をIgG1からM58に変換するこ� ��でヒトにおける薬物動態が向上する可能性� ��示された。

〔実施例10〕CH1ドメインのシステインの及ぼ� ��ヘテロジェニティーおよび安定性への影響
 実施例2に示したとおり、天然型IgG2のヘテ� �ジェニティーを低減することを目的にIgG2の� ��ンジ部分のシステインおよびCH1ドメインに� ��在するシステインの改変を行った。各種改� ��体の検討の結果、野生型IgG2定常領域配列の うち、H鎖のCH1ドメインに存在するEUナンバリ ング131番目のシステインと133番目のアルギニ ンをそれぞれセリンとリジンに改変し、H鎖� �upper hingeに存在するEUナンバリング219番目の システインをセリンに改変した定常領域であ るSKSC(配列番号:38)によって、安定性を低下さ せることなくヘテロジェニティーを低減する ことが可能であるとことが見出された。
 一方、ヘテロジェニティーを低減する方法� ��して、H鎖のupper hingeに存在するEUナンバリ� ��グ219番目のシステインのみをセリンに改変� ��る方法、および、220番目のシステインのみ� ��セリンに改変する方法が考えられる。IgG2の EUナンバリング219番目のシステインをセリン� ��改変した定常領域であるSC(配列番号:39)、お よび、IgG2のEUナンバリング220番目のシステイ ンをセリンに改変した定常領域であるCS(配列 番号:40)を定常領域と有するWT-SC(配列番号:41)� ��よびWT-CS(配列番号:42)を作製し、WT-IgG1、WT-Ig G2、WT-SKSCおよびWT-M58とのヘテロジェニティー および熱安定性の比較を行った。また、WT以� ��の抗体として、異なる抗IL-6レセプター抗体 であるF2H/L39(F2H/L39_VHアミノ酸配列 配列番号: 29、F2H/L39_VLアミノ酸配列 配列番号:30)に対し て、定常領域をそれぞれIgG1(配列番号:1)、IgG2 (配列番号:2)、SC(配列番号:39)、CS(配列番号:40) 、SKSC(配列番号:38)、M14(配列番号:5)にしたF2H/L 39-IgG1、F2H/L39-IgG2、F2H/L39-SC、F2H/L39-CS、F2H/L39-S KSC、F2H/L39-M14を作製し、ヘテロジェニティー� ��比較を行った。
 WT-IgG1、WT-IgG2、WT-SC、WT-CS、WT-SKSC、WT-M58およ びF2H/L39-IgG1、F2H/L39-IgG2、F2H/L39-SC、F2H/L39-CS、F 2H/L39-SKSC、F2H/L39-M14のヘテロジェニティーの� �価方法として、陽イオン交換クロマトグラ� �ィーによる評価を行った。カラムとしてProPa c WCX-10 (Dionex)を用い、移動相Aとして20mM Sodi um Acetate, pH5.0、移動相Bとして20mM Sodium Aceta te, 1M NaCl, pH5.0を使用し、適切な流量および グラジエントを用いて実施した。陽イオン交 換クロマトグラフィーによる評価を行った結 果を図17に示した。
 その結果、図17に示すとおり、WTとF2H/L39の� �ずれにおいても、定常領域をIgG1からIgG2に変 換することでヘテロジェニティーが増大した が、定常領域をSKSCおよびM14あるいはM58に変� �することでヘテロジェニティーが大幅に低� �された。一方、定常領域をSCにした場合は定 常領域をSKSCとした場合と同様にヘテロジェ� �ティーが大幅に低減されたが、定常領域をCS にした場合は十分にヘテロジェニティーが改 善しなかった。
 一般に抗体を医薬品として開発するために� ��ヘテロジェニティーが少ないことに加えて� ��安定な製剤を調製するため高い安定性を有� ��ることが望ましい。そこで安定性の評価方� ��として、示走差査型熱量測定(DSC)による熱� �性中間温度(Tm値)の評価を行った(VP-DSC、Microc al社製)。熱変性中間温度(Tm値)は安定性の指� �であり、医薬品として安定な製剤を作製す� �ためには、熱変性中間温度(Tm値)が高いこと� ��望ましい(J Pharm Sci. 2008 Apr;97(4):1414-26.)。W T-IgG1、WT-IgG2、WT-SC、WT-CS、WT-SKSC、WT-M58を20mM  sodium acetate, 150mM NaCl, pH6.0の溶液に対して� �析(EasySEP, TOMY)を行い、約0.1mg/mLのタンパク� �濃度で、40℃から100℃まで1℃/minの昇温速度� ��DSC測定を行った。得られたDSCの変性曲線を� ��18に、Fab部分のTm値を以下の表4に示した。
 WT-IgG1およびWT-IgG2のTm値はほぼ同等で約94℃� ��度(IgG2のほうが約1℃低い)であったのに対し て、WT-SCおよびWT-CSのTm値は約86℃であり、WT-I gG1およびWT-IgG2と比較して著しくTm値が低下し ていた。一方、WT-M58、WT-SKSCのTm値は約94℃で� ��り、ほぼWT-IgG1およびWT-IgG2と同等であった� �WT-SCおよびWT-CSは安定性がIgG2と比較して著し く低いことから、医薬品として開発するため には、CH1ドメインのシステインもセリンに改 変したWT-SKSCおよびWT-M58のほうが好ましいと� �えられた。WT-SCおよびWT-CSのTm値がIgG2と比較� ��て大幅に低下した理由として、WT-SCおよびWT -CSはIgG2のジスルフィド結合パターンとは異� �る様式を取っているためと考えられた。
 また、DSC変性曲線を比較した場合、WT-IgG1、 WT-SKSC、WT-M58のFab部分の変性ピークはシャー� �かつ単一であったのに対して、WT-SCおよびWT- CSはこれらと比較して、Fab部分の変性ピーク� ��ブロードであり、WT-IgG2はFab部分の変性ピー クの低温側にショルダーピークが認められた 。DSCの変性ピークは単一成分の場合は通常シ ャープな変性ピークを示すが、Tmが異なる複� ��成分(つまりヘテロジェニティー)が存在す� �場合、変性ピークはブロードになると考え� �れる。すなわち、WT-IgG2、WT-SCおよびWT-CSには 複数成分存在し、WT-SCおよびWT-CSは、天然型Ig G2のヘテロジェニティーが十分低減されてい� ��い可能性が示唆された。このことから、野� ��型IgG2のヘテロジェニティーはヒンジ部分の システインのみならず、CH1ドメインに存在す るシステインの両方が関与していると考えら れ、DSC上のヘテロジェニティーを低減するた めにはヒンジ部分のシステインのみならず、 CH1ドメインのシステインも改変する必要があ ると考えられた。また、上述のとおり、ヒン ジ部分のシステインのみならず、CH1ドメイン のシステインを改変することで初めて野生型 IgG2と同等の安定性を有することが可能であ� �。
 以上より、IgG2のヒンジ領域に由来するヘテ ロジェニティーを低減した定常領域として、 ヒンジ部分のシステインのみをセリンに置換 した定常領域であるSCとCSはヘテロジェニテ� �ーおよび安定性の観点で不十分であると考� �られ、ヒンジ部分のシステインに加えて、CH 1ドメインに存在するEUナンバリング131番目の システインもセリンに置換することで初めて IgG2と同等の安定性を維持しつつヘテロジェ� �ティーを大幅に低減することが可能である� �とが見出された。そのような定常領域とし� �は、上述のM14、M31、M58、M73等が挙げられ、� �にM58およびM73は薬物動態が向上し、安定性� �高く、ヘテロジェニティーが低減されてい� �ことから、抗体医薬品の定常領域として非� �に有用であると考えられた。

〔実施例11〕PK/PDが改善した完全ヒト化IL-6レ� ��プター抗体の作製
 TOCILIZUMAB(H鎖 WT-IgG1(配列番号:12)、L鎖 WT(配� ��番号:15))に対して、PK/PDが改善した完全ヒト 化IL-6レセプター抗体の作製するために以下� �示す分子を作製した。完全ヒト化IL-6レセプ� ��ー抗体として、定常領域に実施例7で作製し たM73あるいはM83を使用したFv3-M73(H鎖 VH4-M73 � ��列番号:48、L鎖 VL1-kappa 配列番号:49)、Fv4-M73 (H鎖 VH3-M73 配列番号:46、L鎖 VL3-kappa 配列番 号:47)、Fv5-M83(H鎖 VH5-M83 配列番号:44、L鎖 VL5 -kappa 配列番号:45)を作製した。
 作製したFv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83のIL-6レ セプターへのアフィニティーをTOCILIZUMABと比� ��した。これらの抗体のIL-6レセプターへのア フィニティーを測定した結果を表5に示した(� ��法は参考例参照)。また、BaF/gp130の中和活性 をTOCILIZUMABおよびコントロール(参考例の公知 の高親和性高IL-6レセプター抗体、US 2007/02809 45におけるVQ8F11-21 hIgG1)と比較した(方法は参� ��例参照)。これらの抗体のBaF/gp130による生物 活性を測定した結果を図19(IL-6終濃度 300 ng/m L:TOCILIZUMAB、コントロール、Fv5-M83)および図20( IL-6終濃度 30 ng/mL:TOCILIZUMAB、Fv3-M73、Fv4-M73)に 示した。表5に示すとおり、Fv3-M73、Fv4-M73は、 TOCILIZUMABと比較して2~3倍程度強いアフィニテ� ��ーを有し、Fv5-M83はTOCILIZUMABと比較して100倍� ��度強いアフィニティーを示した(Fv5-M83では� �フィニティーの測定が困難であったため、� �常領域をIgG1にしたFv5-IgG1を用いてアフィニ� �ィーを測定した。定常領域は一般にアフィ� �ティーに影響しないと考えられる)。また、� ��20に示すとおりFv3-M73、Fv4-M73は、TOCILIZUMABと� ��較してやや強い活性を示し、図19に示すと� �りFv5-M83はTOCILIZUMABと比較して50%阻害濃度と� �て100倍以上の極めて強い活性を有し、且つ� �公知の高親和性高IL-6レセプター抗体である� ��ントロールと比較しても50%阻害濃度として� ��10倍程度高い中和活性を示した。
 TOCILIZUMAB、コントロール、Fv3-M73、Fv4-M73、お よびFv5-M83の等電点を当業者公知の方法によ� �等電点電気泳動により測定した結果、TOCILIZU MABの等電点は約9.3、コントロールは約8.4~8.5� �Fv3-M73は約5.7~5.8、Fv4-M73は約5.6~5.7、Fv5-M83は5.4 ~5.5であり、いずれの抗体もTOCILIZUMABおよびコ ントロールと比較して等電点が大幅に低下し た。また、可変領域VH/VLの理論等電点をGENETYX (GENETYX CORPORATION)により計算したところ、TOCIL IZUMABの理論等電点は9.20、コントロールは7.79� ��Fv3-M73は5.49、Fv4-M73は5.01、Fv5-M83は4.27であり� ��いずれの抗体もTOCILIZUMABおよびコントロー� �と比較して等電点が大幅に低下した。よっ� �、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はTOCILIZUMABおよ びコントロールと比較して薬物動態が向上し ていると考えられた。
 TOCILIZUMAB、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83の可� �領域配列に存在するT-cellエピトープをTEPITOPE (Methods. 2004 Dec;34(4):468-75)を用いて解析を行� �た。その結果、TOCILIZUMABは多くの配列がHLAに 結合するT-cellエピトープが存在すると予測さ れたが、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はT-cellエ ピトープに結合すると予測された配列が大幅 に減少した。また、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5- M83はフレームワークにマウス配列が残存せず 完全ヒト化されている。これらのことから、 Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83の免疫原性はTOCILI ZUMABと比較して大幅に免疫原性リスクが低減� ��れている可能性が示唆された。

〔実施例12〕完全ヒト化IL-6レセプター抗体の サルPK/PD試験
 TOCILIZUMAB、コントロール、Fv3-M73、Fv4-M73、お よびFv5-M83をカニクイザルに1 mg/kgで静脈内に 単回投与し血漿中濃度推移を評価した(方法� �参考例参照)。TOCILIZUMAB、Fv3-M73、Fv4-M73、およ びFv5-M83の静脈内投与後の血漿中濃度推移を� �21に示した。その結果、Fv3-M73、Fv4-M73、およ� ��Fv5-M83はいずれもTOCILIZUMABおよびコントロー� ��と比較してカニクイザルにおいて大幅に薬� ��動態が改善した。なかでも、Fv3-M73とFv4-M73� �薬物動態はTOCILIZUMABと比較して大幅に改善し た。
 カニクイザル膜型IL-6レセプターがどの程度 中和されているかの薬効を評価するために、 抗体投与6日目から18日目(TOCILIZUMABに関しては 3日目から10日目)までカニクイザルIL-6 5μg/kg� ��腰背部に連日皮下投与し、24時間後の各個� �のCRP濃度を測定した(方法は参考例参照)。各 抗体投与時のCRP濃度推移を図22に示した。カ� ��クイザル可溶型IL-6レセプターがどの程度中 和されているかの薬効を評価するために、カ ニクイザル血漿中の非結合型のカニクイザル 可溶型IL-6レセプター濃度を測定し、可溶型IL -6レセプターの中和率を計算した(方法は参考 例参照)。各抗体投与時の可溶型IL-6レセプタ� ��の中和率の推移を図23に示した。
 Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はいずれもTOCILIZ UMABおよび公知の高親和性抗IL-6レセプター抗� ��であるコントロールと比較してカニクイザ� ��膜型IL-6レセプターをより持続的に中和しCRP の増加を長期間抑制した。また、Fv3-M73、Fv4-M 73、およびFv5-M83はいずれもTOCILIZUMABおよびコ� ��トロールと比較してカニクイザル可溶型IL-6 レセプターをより持続的に中和し非結合型の カニクイザル可溶型IL-6レセプターの増加を� �期間抑制した。これより膜型IL-6レセプター� ��よび可溶型IL-6レセプターの中和の持続性に 関しては、Fv3-M73、Fv4-M73、およびFv5-M83はいず れもTOCILIZUMABおよびコントロールよりも優れ� ��いることが見出された。なかでもFv3-M73とFv4 -M73の中和の持続性は極めて優れていた。一� �、Fv5-M83のほうがFv3-M73とFv4-M73よりCRPおよび� �結合型カニクイザル可溶型IL-6レセプターを� ��く抑制していることから、Fv5-M83は膜型IL-6� �セプターおよび可溶型IL-6レセプターをFv3-M73 とFv4-M73および公知の高親和性抗IL-6レセプタ� ��抗体であるコントロールよりも強力に中和� ��ていると考えられた。これはFv5-M83がコント ロールよりもIL-6レセプターへのアフィニテ� �ーが強く、且つ、BaF/gp130における生物活性� �強いことがカニクイザルのin vivoにおいて反 映された結果であると考えられる。
 これらのことから、TOCILIZUMABおよびコント� �ールと比較して、Fv3-M73とFv4-M73は抗IL-6レセ� �ター中和抗体として作用の持続性が極めて� �れており投与頻度および投与量を大幅に低� �することが可能であり、また、Fv5-M83は抗IL-6 レセプター中和抗体として作用の強さに極め て優れており、また作用の持続性にも優れて いることが見出された。よってFv3-M73、Fv4-M73� ��およびFv5-M83はIL-6アンタゴニストとしての� �薬品として有用であると考えられる。

〔参考例〕
組み換えカニクイザル可溶型IL-6� �セプター(cIL-6R)の調製
 公開されているアカゲザルIL-6レセプター遺 伝子配列 (Birney et al, Ensembl 2006, Nucleic Aci ds Res. 2006 Jan 1;34(Database issue):D556-61.) を元 にオリゴDNAプライマーを作製し、カニクイザ ル膵臓から調製されたcDNAを鋳型とし、プラ� �マーを用いて、PCR法によりカニクイザルIL-6� ��セプター遺伝子全長をコードするDNA断片を� ��製した。得られたDNA断片を動物細胞発現ベ� ��ターへ挿入し、これを用いてCHO定常発現株( cyno.sIL-6R産生CHO細胞)を作製した。cyno.sIL-6R産� ��CHO細胞の培養液をHisTrapカラム(GEヘルスケア バイオサイエンス) で精製後、Amicon Ultra-15  Ultracel-10k(Millipore)を用いて濃縮し、Superdex200pg 16/60ゲルろ過カラム(GEヘルスケアバイオサイ� ��ンス)でさらに精製を行い、可溶型カニクイ ザルIL-6レセプター(以下、cIL-6R)の最終精製品 とした。

組み換えカニクイザルIL-6(cIL-6)の� ��製
 カニクイザルIL-6は以下のように調製した。 SWISSPROT Accession No.P79341に登録されている212� �ミノ酸をコードする塩基配列を作成し、動� �細胞発現ベクターにクローニングし、CHO細� �に導入することで定常発現細胞株を作製し� �(cyno.IL-6産生CHO細胞)。cyno.IL-6産生CHO細胞の培 養液をSP-Sepharose/FFカラム(GEヘルスケアバイオ サイエンス) で精製後、Amicon Ultra-15 Ultracel- 5k(Millipore)を用いて濃縮し、Superdex75pg26/60ゲル ろ過カラム(GEヘルスケアバイオサイエンス)� �さらに精製を行い、Amicon Ultra-15 Ultracel-5k(Mi llipore)を用いて濃縮し、カニクイザルIL-6(以� �、cIL-6)の最終精製品とした。

公知高親和性抗IL-6レセプター抗� �の作製
 公知の高親和性抗IL-6レセプター抗体として 、US 2007/0280945 A1に記載されている高親和性� ��IL-6レセプター抗体であるVQ8F11-21 hIgG1(US 200 7/0280945 A1, H鎖アミノ酸配列:配列番号:19、L� �アミノ酸配列:配列番号:27)を発現させるため 、動物細胞発現用ベクターを構築した。抗体 可変領域については、合成オリゴDNAを組み合 わせたPCR法(assembly PCR)により作製し、定常領 域についてはIgG1を使用した。Assembly PCR法に� ��り抗体可変領域と定常領域を結合させ、動� ��発現用ベクターへ挿入し、目的のH鎖発現ベ クターおよびL鎖発現ベクターを作製した。� �られた発現ベクターの塩基配列は当業者公� �の方法で決定した。作製した発現ベクター� �用い、発現・精製を行った。発現・精製は� �施例1に記載した方法で行い、高親和性抗IL-6 レセプター抗体(以降、コントロール、と記� �)を得た。

ヒトgp130発現BaF3細胞(BaF/gp130)によ� ��生物活性評価
 IL-6/IL-6レセプター依存性増殖を示すBaF3/gp130 を用いて、IL-6レセプター中和活性を評価し� �。BaF3/gp130を10% FBSを含むRPMI1640培地で3回洗� �した後に、5x10 ⁴  cells/mLとなるように600 ng/mLないしは60 ng/mL� ��human interleukin-6 (TORAY)(終濃度は300 ng/mLない しは30 ng/mL)、適当量の組換え可溶性ヒトIL-6� ��セプター(SR344)および10% FBSを含むRPMI1640培� �に懸濁し、96 well-plate (CORNING)の各wellに50μL� ��つ分注した。次に、精製した抗体を10% FBS� �含むRPMI1640に希釈して、各wellに50μLずつ混合 した。37℃、5% CO ₂ 条件下で、3日間培養し、PBSで2倍に希釈したW ST-8試薬(Cell Counting Kit-8、株式会社同仁化学� ��究所)を20μL/wellで加え、直後にSUNRISE CLASSIC( TECAN)を用いて450 nmの吸光度(参照波長620 nm)� �測定した。2時間培養した後に、再度450 nmの 吸光度(参照波長620 nm)を測定し、2時間の吸� �度変化を指標にIL-6レセプター中和活性を評� ��した。

BiacoreによるIL-6レセプターへの結� ��評価
 Biacore T100 (GE Healthcare) を用いて、抗原抗� ��反応の速度論的解析を行った。センサーチ� ��プ上にアミンカップリング法でanti-IgG(γ-chai n specific)F(ab’) ₂ を適当量固定化し、次にpH7.4において目的の� ��体を結合させ、さらにpH7.4において種々の� �度に調整したIL-6レセプターであるSR344をア� �ライトとして流し、抗体とSR344の相互作用を 測定した。測定は全て37℃で実施した。測定� ��得られたセンサーグラムから、カイネティ� ��スパラメーターである結合速度定数 k _a  (1/Ms)、および解離速度定数 k _d  (1/s) を算出し、その値をもとに K _D  (M) を算出した。各パラメーターの算出に� � Biacore T100 Evaluation Software (GE Healthcare)を� ��いた。

サルPK/PD試験による抗体血漿中濃� ��、CRP濃度、非結合型可溶型IL-6レセプターの 測定
 カニクイザル血漿中濃度測定はELISA法にて� �業者公知の方法で測定した。
CRP濃度はサイアスR CRP (関東化学株式会社)� �て、自動分析装置(TBA-120FR、東芝メディカル� ��ステムズ株式会社)を用いて測定した。
カニクイザル血漿中の非結合型のカニクイザ ル可溶型IL-6レセプター濃度を以下の通り測� �した。カニクイザルの血漿30μLを0.22 μmのフ ィルターカップ(Millipore)において乾燥させた� ��量のrProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) 樹脂に添加することで血漿中に存在する全て のIgG型抗体(カニクイザルIgG、抗ヒトIL-6レセ� ��ター抗体および抗ヒトIL-6レセプター抗体-� �ニクイザル可溶型IL-6レセプター複合体)をPro teinAに吸着させた。その後、高速遠心機でス� ��ンダウンし、パス溶液を回収した。パス溶� ��にはproteinAに結合した抗ヒトIL-6レセプター� ��体-カニクイザル可溶型IL-6レセプター複合� �は含まれないため、proteinAパス溶液中のカニ クイザル可溶型IL-6レセプター濃度を測定す� �ことによって、非結合型の可溶型IL-6レセプ� ��ー濃度を測定可能である。カニクイザル可� ��型IL-6レセプター濃度は、上記で作製したカ ニクイザル可溶型IL-6レセプター(cIL-6R)をスタ ンダードに用いて、ヒトIL-6レセプター濃度� �測定する当業者公知の方法で測定した。可� �型IL-6レセプターの中和率は以下の計算式に� ��って計算した。
(抗体投与後の非結合型の可溶性IL-6レセプタ� ��濃度í抗体投与前の可溶性IL-6レセプター濃� ��)×100