MODIFIZIERTES CYANOPHYCIN

GEBIET DER ERFINDUNG

[1] Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Veresterung von Cyanophycin mit verschiedenen Alkoholen, verestertes Cyanophycin sowie verschiedene Verwendungen und Zusammensetzungen der in der Erfindung beschriebenen Verfahren und Produkte.

BESCHREIBUNG

[2] Cyanophycin (auch als CGP bezeichnet: Cyanophycin Granule Polypeptide) wurde 1887 von Borzi bei mikroskopischen Untersuchungen an Cyanobakterien entdeckt (Borzi, 1887) und wurde später in sämtlichen Arten von Cyanobakterien gefunden (Oppermann-Sanio et al., 2003). Die CGP-Molekülstruktur ist mit der von Poly(asparaginsäure) verwandt, aber im Gegensatz zu synthetischer Polyasparaginsäure ist es ein kammartiges Polymer mit a-Amino-a-Carboxy- verknüpften L-Asparaginsäureresten, die das Rückgrat des Polymers darstellen und L-Arginin- Resten, die an die ß-Carboxylgruppen von Asparaginsäuren gebunden sind. Aus Cyanobakterien isoliertes Cyanophycin ist hochgradig polydispers und zeigt auf SDS Gelen einen Molekulargewichtsbereich von etwa 25-100 kDa, was einem Polymerisationsgrad von 90-400 entspricht.

[31 Die Biosynthese von Cyanophycin wurde in den 1970er Jahren von Simon und Mitarbeitern ausführlich untersucht (Simon, 1971; Simon und Weathers, 1973; Simon und Weathers, 1976; Simon, 1973; Simon, 1976), was zur Identifizierung der Enzyme der Cyanophycin Synthese führte. Diese Synthetasen und die für die Enzyme kodierenden Gene (cphA) in verschiedenen Organismen zu finden (Ziegler et al., 1998; Aboulmagd et al., 2000; Berg et al., 2000; Hai et al., 2002).

[4] Cyanophycin ist ein biologisch abbaubares Poly-Elektrolyt mit einer Poly-Dispersität von 20 bis lOokDa (entspricht 70 bis 350 Arg-Asp Repetiereinheiten). Poly-Elektrolyte haben vielfältige Einsatzmöglichkeiten in der Polymer-Industrie oder Pharmazie. Poly-Elektrolyte können beispielsweise als Superabsorber, Flockungshilfsmittel oder per Layer-by-Layer- Verfahren zur Oberflächenmodifikation von Feststoffen eingesetzt werden. In der Medizin oder Pharmazie werden sie als Träger- oder Hilfsstoff eingesetzt. Weiter kann Cyanophycin aufgrund seiner positiv geladenen Guanidin-Gruppe als Poly-Kation eingesetzt werden. Poly-Kationen, die bereits in der Industrie eingesetzt werden sind: Poly-(Allylamine), Poly-(l-Lysine), Poly- (Ethyleneimine), Poly-(Dimethyldiallylammonium-Chlorid), Poly-(Allylamine Hydrochlorid) oder Chitosan.

[51 Zwar wäre Cyanophycin ein überaus interessantes Biopolymer für verschiedene industrielle Anwendungen, jedoch ist seine Handhabung generell schwierig aufgrund seiner Löslichkeit. Natives Cyanophycin ist zwischen pH 2,5 bis 8 sowie bei pH 12,5 unlöslich. Grund hierfür ist die Ladung des Polymers: Bei neutralem pH liegt Cyanophycin als Zwitter-Ion vor, was die Wasserlöslichkeit herabsetzt.

[6] Es ist somit eine Aufgabe der Erfindung, ein neues Derivat Cyanophycin zu Verfügung zu stellen, welches die oben genannten Schwierigkeiten bei der Handhabung des Biopolymer überwindet und damit Cyanophycin der industriellen Verwendung zugänglich macht.

KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

[7] Die Aufgabe der Erfindung wird durch eine Veresterung der Carboxy-Gruppe des Arginins des Cyanophycins erreicht, sodass Cyanophycin nicht mehr als Zwitter-Ion vorliegt und somit bei neutralem pH löslich wird. Darüber hinaus können durch die Verwendung spezifischer Alkohole (hydrophil oder hydrophob, einwertig oder mehrwertig) neue Eigenschaften in ein Cyanophycinpolymer eingeführt werden. Die Erfindung wird in der nachfolgenden Kurzbeschreibung der einzelnen Erfindungsaspekte beschrieben:

[8] In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Esters eines Cyanophycinpolymers oder eines Esters eines Cyanophycinpolymer-Derivats, umfassend das Reagieren des Cyanophycinpolymers oder des Cyanophycinpolymer-Derivats mit einem Alkohol (HO-X) zu einem Ester eines Cyanophycinpolymers oder einem Ester eines Cyanophycinpolymer-Derivats, und Wasser, unter Reaktionsbedingungen die eine Veresterung des Alkohols mit mindestens der Carboxylgruppe eines Cyanophycinmonomers erlauben, wobei das mindestens eine Cyanophycinmonomer Bestandteil des Cyanophycinpolymers oder des Cyanophycinpolymer-Derivats ist.

[9] In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung einen Ester eines Cyanophycinpolymers, gemäß einer Struktur der Formel (II) mit n > 2, vorzugsweise mit n > 10, weiter vorzugsweise mit n = 50 - 500 (oder 70-350): wobei R ausgewählt wird aus einem primären-, sekundären- oder tertiären Alkohol, und/oder einwertigen oder mehrwertigen Alkoholen, vorzugsweise ausgesucht aus einem der folgenden Reste, wobei m eine natürliche Zahl > o ist:

[10] In einem driten Aspekt betrifft die Erfindung eine Verwendung des Esters eines Cyanophycinpolymers gemäß den vorstehenden Aspekten, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, beispielsweise als Träger-, und/oder Hilfstoff.

[11] In einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen therapeutisch aktiven Stoff und einen Ester eines Cyanophycinpolymers gemäß dem zweiten Aspekt, und, vorzugsweise, mindestens einen weiteren Träger- und/ oder Hilfsstoff.

[12] In einem fünften Aspekt betrifft die Erfindung eine Verwendung des Esters eines Cyanophycinpolymers gemäß den vorstehenden Aspekten der Erfindung, bei der Einbringung einer Nukleinsäure in eine biologische Zelle (folgend genannt: Transfektion).

[13] In einem sechsten Aspekt betrifft die Erfindung ein Transfektionsmittel, oder eine Transfektionszusammensetzung, umfassend ein Ester eines Cyanophycins gemäß der Erfindung.

[14] In einem siebten Aspekt betrifft die Erfindung einen Transfektions-Kit, umfassend das Transfektionsmittel der Erfindung, sowie optional einen weiteren Puffer oder Mittel zur Durchführung einer Transfektion.

[15] In einem achten Aspekt betrifft die Erfindung eine Verwendung des Esters eines Cyanophycinpolymers gemäß der Erfindung als:

• Ionenaustauscher, insbesondere als stationäre Phase bei einer lonenaustauschchromatographie; oder • Beschichtungsmaterial, vorzugsweise für Nanopartikel; oder

• In Polymerlegierungen, Polymerblends oder Copolymeren; oder

• als Bestandteil von Polyelectrolyte Multilayers (PEMs); oder

• in einem Polyelectrolyte Bridging-Verfahren.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

[16] Im Folgenden werden die detaillierten Aspekte der Erfindung beschrieben. Diese Aspekte sind mit spezifischen Ausführungsformen aufgeführt, aber die Beschreibung soll so verstanden werden, dass diese Ausführungsformen in beliebiger Weise und in beliebiger Anzahl miteinander kombiniert werden können, die weitere Ausführungsformen der Erfindung darstellen. Die verschiedenen hier beschriebenen Beispiele und bevorzugten Ausführungsformen sind nicht so auszulegen, dass die vorliegende Erfindung nur auf die ausdrücklich beschriebenen Ausführungsformen beschränkt ist. Die Beschreibung sollte so verstanden werden, dass sie Ausführungsformen stützt und umfasst, die zwei oder mehr der ausdrücklich beschriebenen Ausführungsformen kombinieren oder die eine oder mehrere der ausdrücklich beschriebenen Ausführungsformen mit einer beliebigen Anzahl der offenbarten und/oder bevorzugten Aspekte kombinieren.

[17] In einem erstem Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Esters eines Cyanophycinpolymers oder eines Esters eines Cyanophycinpolymer-Derivats, umfassend das Reagieren des Cyanophycinpolymers oder des Cyanophycinpolymer-Derivats mit einem Alkohol (HO-X) zu einem Ester eines Cyanophycinpolymers oder einem Ester eines Cyanophycinpolymer-Derivats, und Wasser, unter Reaktionsbedingungen die eine Veresterung des Alkohols mit mindestens der Carboxylgruppe eines Cyanophycinmonomers erlaubt, wobei das mindestens eine Cyanophycinmonomer Bestandteil des Cyanophycinpolymers oder des Cyanophycinpolymer-Derivats ist.

[18] Im Rahmen des vorliegenden Textes wird der Begriff "Veresterung" für alle hier genannten Reaktionen zur Herstellung von Cyanophycin-Ester verwendet. Unter den Begriff „Veresterung“ fällt also sowohl die Reaktion einer Säure mit einem Alkohol (Esterbildung) wie auch die Reaktion eines Alkohols mit einem Ester (Umesterung). In einem bevorzugten Verfahren gemäß der Erfindung wird ein Cyanophycin in Anwesenheit einer Säure mit einem Alkohol verestert („Fischer Veresterung“). Somit ist besonders bevorzugt, dass die Reaktion des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Anwesenheit einer Säure, vorzugsweise Schwefelsäure durchgeführt wird.

[191 Die mittels des Verfahrens bereitgestellten Ester sind entsprechend einer Umesterung gemäß der Erfindung zugänglich. Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung in einem alternativen ersten Aspekt ein Verfahren zur Herstellung eines Esters eines Cyanophycinpolymers oder eines Esters eines Cyanophycinpolymer-Derivats, umfassend das Reagieren eines Ausgangsesters eines Cyanophycinpolymers oder eines Ausgangsesters eines Cyanophycinpolymer-Derivats mit einem Alkohol (HO-X) zu einem neuen Ester des Cyanophycinpolymers oder Esters eines Cyanophycinpolymer-Derivats, unter Reaktionsbedingungen die eine Umesterung des Alkohols mit dem Alkoholrest des Ausgangsesters des Cyanophycinmonomers oder eines Ausgangsesters eines Cyanophycinpolymer-Derivats erlaubt.

[20] Der Begriff „Ester eines Cyanophycinpolymers“ oder „Ester eines Cyanophycinpolymer- Derivats“, soll im Rahmen der vorliegenden Offenbarung alle Ester von Cyanophycin umfassen die an der freien Carboxylgruppe des Argininrestes mit einem Alkohol verestert sind. Insbesondere umfasst sind Polymere des Cyanophycins in denen mindestens eine Argininseitenkette (ein Monomer) entsprechend der Erfindung verestert ist, weiter vorzugsweise mindestens zwei Seitenketten, weiter vorzugsweise mindestens drei Argininseitenketten, weiter vorzugsweise mindestens 5 Seitenketten, weiter vorzugsweise mindestens 9 Seitenketten, weiter vorzugsweise mindestens 10, 15, 30, mindestens 50 oder mehr Seitenketten. Hierbei können die Seitenketten eines Polymers durchaus mit unterschiedlichen Alkoholen gemäß der Erfindung verestert werden.

[21] In einer besonders bevorzugten Ausführung der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, wobei innerhalb des Cyanophycinpolymers oder des Cyanophycinpolymer- Derivats mindestens zwei Cyanophycinmonomere mit verschiedenen Alkoholen verestert werden. In einer alternativen Ausführung des Verfahrens werden die Cyanophycinmonomere eines Polymers mit dem gleichen Alkohol verestert.

[22] Für die vorliegende Offenbarung ist ein Cyanophycinpolymer ein Molekül mit der Struktur (I), mit n > 2, vorzugsweise mit n > 8, weitervorzugsweise mit n = 50 - 500 (oder weiter bevorzugt 70-350):

[231 In Zusammenhang mit der vorliegenden Offenbarung soll insbesondere der Alkohol HO- X ausgesucht werden aus einem primären Alkohol wie Methanol, Ethanol oder 1-Propanol; Mercaptoethanol, Glyzerin oder einem Polyethylenglykol (PEG), oder anderen sekundären- oder tertiären Alkoholen, und/ oder einwertigen oder mehrwertigen Alkoholen.

[24] Insbesondere bevorzugte Alkohole zur Verwendung in Zusammenhang mit der vorliegenden Offenbarung sind in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführt und stellen einzelne aber auch in Kombination bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung dar:

[25] Tabelle 1: Alkohole geeignet und bevorzugt zur Verwendung für die vorliegende Erfindung:

[26] Ein besonders bevorzugtes Verfahren betrifft die Veresterung gemäß der Erfindung mit der Verwendung eines Polyethylenglykols (PEG). Der Begriff Polyethylenglykol (PEG, Macrogol) wird hier verwendet, um ein Kondensationspolymer aus Ethylenoxid und Wasser mit der allgemeinen Formel HO-(CH 2 -CH 2 -O) n -H zu bezeichnen. Die niedermolekularen Vertreter von n=2 bis n=4 sind Diethylenglykol, Triethylenglykol bzw. Tetraethylenglykol. Gegebenenfalls wird die Abkürzung (PEG) in Kombination mit einem numerischen Suffix verwendet, das das durchschnittliche Molekulargewicht des PEG angibt. Die verschiedenen Formen von PEG werden nach ihrem Molekulargewicht unterschieden (niedrig: 200-1500 D; hoch: >1500 D). Besonders bevorzugt im Kontext der Erfindung sind allerdings kurzkettige PEGs mit n im Bereich von 2 bis 20.

[27] Ein hergestellter Ester des Cyanophycinpolymers hat somit bevorzugt die folgende Struktur II, mit n > 2, vorzugsweise mit n > 10, weiter vorzugsweise mit n = 50 - 500 (oder 70- 350): wobei R = X.

[28] Eine weitere Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung betrifft die folgenden

Reaktionsbedingungen der Veresterung:

• Eine Reaktionstemperatur von 5O°C bis 12O°C, vorzugsweise Ö5°C bis 9O°C, weiter vorzugsweise etwa 7O°C bis etwa 8o°C; und/oder

• Dass die Reaktion unter ständigem Rühren durchgeführt wird.

[29] Nachfolgend der Veresterung gemäß der Erfindung kann in einer besonders bevorzugten Ausführung das Verfahren einen weiteren Schritt der Aufreinigung des Esters eines Cyanophycinpolymers oder des Esters eines Cyanophycinpolymer-Derivats umfassen. Besonders bevorzugt ist hierbei eine Aufreinigung durch Fällung, wie beispielsweise eine Kältefällung, oder eine Aufreinigung mittels Dialyse.

[30] Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, welche bevorzugt ist, betrifft die Veresterung wobei das Cyanophycinpolymer mindestens neun oder mehr Monomere aufweist, und wobei die Reaktionsbedingungen so gewählt werden, dass mindestens die Carboxylgruppen von neun oder mehr Monomeren verestert werden, wobei vorzugsweise mehr als 50% der Carboxylgruppen verestert werden.

[31] In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung einen Ester eines

Cyanophycinpolymers, gemäß einer Struktur der Formel (II) mit n > 2, vorzugsweise mit n > 10, weiter vorzugsweise mit n = 50 - 500 (oder 70-350): wobei R ausgewählt wird aus einem primären-, sekundären- oder tertiären Alkohol und/oder einwertigen oder mehrwertigen Alkoholen.

[32] Insbesondere bevorzugt ist R ein Alkohol, der ausgewählt wird aus der Tabelle 1, und weiter vorzugsweise ausgesucht wird aus einem der folgenden Reste, wobei m eine natürliche Zahl > o ist:

[331 In einem alternativen zweiten Aspekt umfasst ein erfindungsgemäßer Ester eines Cyanophycins mindestens zwei Dipeptid-Monomere mit unterschiedlichen Alkoholketten, die an den Arginincarboxylketten erfindungsgemäß verestert sind. Solche Mischpolymerester können beispielsweise durch Verwendung von Alkoholgemischen bei der Veresterung erhalten werden. Hierbei können die unterschiedlichen Monomere völlig zufällig im Cyanophycinpolymer vorkommen. Denkbar sind solche Mischpolymere mit weiter bevorzugt mindestens 3, 4, 5, 6, 7 oder mehr unterschiedlichen Alkoholanteilen.

[341 Gemäß der vorliegenden Erfindung soll ein solcher Ester eines Cyanophycinpolymers, mit einem Verfahren gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung herstellbar sein, und/oder hergestellt worden sein.

[35] Bevorzugt ist ein Ester eines Cyanophycinpolymers, welches vollständig, oder im Wesentlichen vollständig, also mindestens zu 80%, vorzugsweise 90%, 95%, oder 99% veresterte Carboxylgruppen aufweist.

[36] Auch bevorzugt ist, dass ein Ester eines Cyanophycinpolymers erfindungsgemäß rein kationisch vorliegt - also bevorzugt nicht als Zwitterion vorliegt. Insbesondere kann ein Ester eines Cyanophycinpolymers erfindungsgemäß eine erhöhte Löslichkeit im Vergleich zu einem in Kettenlänge identischen aber unveresterten Cyanophycipolymer aufweisen.

[37] Weiter bevorzugt in Kontext der Erfindung ist ein PEG Ester eines Cyanophycinpolymers.

[38] Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft einen Propylester eines Cyanophycinpolymers, gemäß der vorliegenden Erfindung (Propyl-CP). Weitere Aspekte der Erfindung eines Propyl-CP betreffen die Verwendung als Adhäsionsmittel, insbesondere als Zelladhäsionsmittel. Weiter betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Esters gemäß eines Cyanophycinpolymers gemäß der Erfindung als antibakterielle Substanz. Beispielsweise in Kontext einer Sterilisationsvorrichtung. Denkbare Ausführungsformen betreffen daher eine Schutzvorrichtung, die mit einem Ester eines Cyanophycinpolymers gemäß der Erfindung behandelt wurde (wie beispielsweise eine Mund-Nasenbedeckung, oder auch andere Abdeckung zur sterilen Verpackung oder Abschottung).

[39] In einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung eine Verwendung des Esters eines Cyanophycinpolymers gemäß den vorstehenden Aspekten, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, beispielsweise als Träger-, und/oder Hilfstoff.

[40] In einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen therapeutisch aktiven Stoff und einen Ester eines Cyanophycinpolymers gemäß dem zweiten Aspekt, und, vorzugsweise, mindestens einen weiteren Träger- und/ oder Hilfsstoff.

[41] In einem fünften Aspekt betrifft die Erfindung eine Verwendung des Esters eines Cyanophycinpolymers gemäß den vorstehenden Aspekten der Erfindung, bei der Einbringung einer Nukleinsäure in eine biologische Zelle (folgend genannt: Transfektion).

[42] In einem sechsten Aspekt betrifft die Erfindung ein Transfektionsmittel, oder eine Transfektionszusammensetzung, umfassend ein Ester eines Cyanophycins gemäß der Erfindung.

[431 In einem siebten Aspekt betrifft die Erfindung einen Transfektions-Kit, umfassend das Transfektionsmittel der Erfindung, sowie optional einen weiteren Puffer oder Mittel zur Durchführung einer Transfektion.

[441 Bei den vorgenannten Aspekten im Zusammenhang einer Transfektion, wird ein Ester eines Cyanophycinpolymers gemäß der Erfindung als in Kombination mit einem weiteren Transfektionsmittel verwendet, beispielsweise mit einem Lipidpartikel-basierten Mittel wie Lipopfectamin. Insbesondere bevorzugt ist ein Ethylester eines Cyanophycins in den vorgenannten Aspekten der Erfindung zu verwenden.

[45] In einem achten Aspekt betrifft die Erfindung eine Verwendung des Esters eines Cyanophycinpolymers gemäß der Erfindung als:

• Ionenaustauscher, insbesondere als stationäre Phase bei einer lonenaustauschchromatographie; oder

• Beschichtungsmaterial, vorzugsweise für Nanopartikel; oder

• Bestandteil in Polymerlegierungen, Polymerblends oder Copolymeren; oder

• Bestandteil von Polyelectrolyte Multilayers (PEMs); oder

• Bestandteil in einem Polyelectrolyte Bridging-Verfahren.

[46] Die hier verwendeten Ausdrücke „der [vorliegenden] Erfindung“, „gemäß der Erfindung“, „nach der Erfindung“ und dergleichen sollen sich auf alle Aspekte und Ausführungsformen der hier beschriebenen und/ oder beanspruchten Erfindung beziehen.

[471 Wie hier verwendet, ist der Begriff „umfassend“ so zu verstehen, dass er sowohl "einschließlich" als auch "bestehend aus" umfasst, wobei beide Bedeutungen ausdrücklich beabsichtigt sind, und daher einzeln offengelegte Ausführungsformen gemäß der vorliegenden Erfindung darstellen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezeichnen die Begriffe „ungefähr“ und „annähernd“ oder „etwa“ ein Genauigkeitsintervall, das der Fachmann dahingehend versteht, dass die technische Wirkung des betreffenden Merkmals noch gewährleistet ist. Der Begriff bezeichnet typischerweise eine Abweichung von dem angegebenen Zahlenwert um ±20%, ±15%, ±10% und beispielsweise ±5%. Wie dem Fachmann klar sein wird, hängt die spezifische Abweichung eines numerischen Wertes für einen bestimmten technischen Effekt von der Art des technischen Effekts ab. So kann beispielsweise ein natürlicher oder biologischer Effekt im Allgemeinen eine größere Abweichung aufweisen als ein vom Menschen geschaffener oder technischer Effekt. Die spezifische Abweichung eines Zahlenwerts für einen bestimmten technischen Effekt hängt von der Art des technischen Effekts ab.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

[48] Die Abbildungen zeigen:

[49] Abbildung 1: Schematischer Aufbau zur Veresterung von Cyanophycin. Links für Alkohole mit Siedetemperatur über ioo°C und rechts für Alkohole mit Siedetemperatur unter ioo°C.

[50] Abbildung 2: zeigt eine horizontale native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE). Pro Spur wurden 40pg Polymer aufgetragen. Bei der EtOH-CP/ DNA wurden 40pg genomische dsDNA zugegeben. IEF-Marker ist ein Proteinmarker für isoelektrische Fokussierung, der genommen wurde, weil er kein SDS enthält.

[51] Abbildung 3: zeigt eine isoelektrische Fokussierung von Cyanophycin und den wasserlöslichen Cyanophycin Estern. A) IEF-Gel mit "normaler Laufrichtung" zur Anode hin. Bei dieser Laufrichtung kann nur natives Cyanophycin und der Marker ins Gel laufen. B) Foto von den Proben in den Geltaschen. Die Cyanophycin-Ester bilden einen weißen Schlier und laufen zur Kathode hin. C) ) IEF-Gel mit umgekehrter Polung. Bei dieser Laufrichtung können nur noch die Cyanophycin-Ester in das Gel einlaufen. D) Foto von den Proben in den Geltaschen bei umgekehrter Polung. Der Lade-Farbstoff (Neutral-Rot) läuft in die entgegengesetzte Richtung. Hierbei fließt der Farbstoff in den Anodenpuffer, der einen sauren pH hat. Neutral-Rot fungiert als pH Indikator und ändert seine Farbe von rot zu gelb.

[52] Abbildung 4: zeigt SDS-PAGE von nativem Cyanophycin (CP) und PEGyliertem Cyanophycin (PEG CP). Geladen wurden jeweils 20 und 40pg pro Tasche. [53] Abbildung 5: zeigt ein Beispiel in dem 0,05 % Propyl-CP in Wasser Flüssigfilm auf eine Glasplatte aufgebracht wurde. Im Anschluss werden Bakterienzellen übersät und fixiert (ähnlich wie bei polylysinbeschichteten Oberfläche). Unterabbildung A zeigt ein mikroskopisches Bild der Fixierung der Zellen vor Waschung, Abbildung 5B zeigt ein Bild nach einmaliger Waschung, und Abbildung 5C nach zweimaliger Waschung.

[54] Abbildung 6: zeigt eine Bestimmung der Luftkeime nach Durchströmen der mit Sporen gesättigten Luft durch eine mit Propyl-CP behandelte Schicht eines Vliesstoffs geleitet wurde; A: 10% Propyl CP enfernt alle Sporen; B: selbst nach 1 Woche bleibt die Flasche steril.

[55] Abbildung 7: zeigt eine Endpunktmessung der antimikrobiellen Aktivität in Anwesenheit von Propyl-CP-Ester; mehrere angegebene Stämme wurden bei unterschiedlichen Konzentrationen von Propyl-CP (P-CPH) in M9 Medium inokuliert; Negativkontrolle, schwarzer Balken: ohne Zusatz, positive Kontrolle: Zusatz eines Antibiotikums, Chloramphenicol (CM); nach der Inkubation über Nacht wurde die optische Dichte der Kultur bestimmt, um das Bakterienwachstum zu ermitteln. Abbildung am Schluss zeigt die Kontrolle. Die Datensäulen entsprechen in Reihenfolge von links nach rechts (in jeder Abbildung) der Legende von oben nach unten.

[56] Abbildung 8: zeigt das Wachstum der E. coli-Kultur in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Propyl-CP-Ester. Kontrollen: Keine Zugabe (Schwarz) oder Antibiotikum Chloramphenicol (CM). Gezeigt sind Wachstumskurven mit Propyl-CP Konzentrationen von 10 bis 150 pg/ml in 10er Schritten.

[57] Abbildung 9: zeigt einen Wachstumsvergleich verschiedener Bakterien in Anwesenheit von Propyl-CP (P-CPH) oder Polylysin (PL).

BEISPIELE

[58] Bestimmte Aspekte und Ausführungsformen der Erfindung werden nun anhand von Beispielen und unter Bezugnahme auf die hierin enthaltenen Beschreibungen, Abbildungen und Tabellen erläutert. Solche Beispiele für die Verfahren, Verwendungen und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung sind nur repräsentativ und sollten nicht so verstanden werden, dass der Umfang der vorliegenden Erfindung nur auf solche repräsentativen Beispiele beschränkt ist.

[59] Die Beispiele zeigen:

[60] Beispiel 1: Chemikalien, Laborgeräte, Laborausstattung und Aufbau:

[61] Cyanophycin (wasserfrei)

[L-Asp(4-L-Arg)]n / CAS Nr. 213250-52-3

Molekulargewicht 20-iookDa, extrahiert aus Synechocystis sp. PCC 6803

Reinheit >90%

Konzentrierte Schwefelsäure (>96%)

H ₂ SO ₄ / CAS Nr. 7664-93-9

[62] Alkohole:

Methanol, CH ₃ OH, CAS Nr. 67-56-1

Ethanol, C ₂ H ₅ OH, CAS Nr. 64-17-5

Propanol, C ₃ HsO, CAS Nr. 71-23-8

Butanol, C ₄ H _lo O, CAS Nr. 71-36-3

Octanol, CsHisO, CAS Nr. 111-87-5

Phenol, CÖHÖO, CAS Nr. 108-95-2

Polyethylenglycol, (C ₂ H ₄ O) _n , CAS Nr. 25322-68-3

Thiodiglycol, C ₄ HI _O O ₂ S, CAS Nr. 111-48-8

Glycerol, C ₃ HsO ₃ , CAS Nr. 56-81-5

[63] Natriumhydroxid

NaOH / CAS Nr. 1310-73-2

[64] Paraffin

C _n H _2n +2 / CAS Nr. 8012-95-1

[65] Trocknungsmittel Silica Gel Blau

SiO ₂ / CAS Nr. 7631-86-9 [66] Doppelt destilliertes Wasser ddH ₂ 0 / CAS Nr. 7732-18-5

[67] Magnetrührer mit Heizplatte, Photometer, Zentrifugen

[68] Ein- und Zweihals-Rundkolben, Kristallisationsschale, Trocknungsrohr, Zentrifugenröhrchen (50ml), Dialyseschlauch (Ausschlussgröße 3,5 kDa)

[69] Aufbau;

[70] Für Alkohole mit Siedetemperatur über ioo°C: Ein 50ml Rundkolben mit Rührmagnet und Trocknungsrohr (Trocknungsmittel: Silica Gel Blau) werden in einem Paraffinöl-Bad auf einem Magnetrührer mit Heizplatte platziert (siehe Abbildung 1 links).

[71] Für Alkohole mit Siedetemperatur unter ioo°C: Ein 50ml Zweihalskolben mit Rührmagnet und Trocknungsrohr (Trocknungsmittel: Silica Gel Blau) werden in einem Paraffinöl-Bad auf einem Magnetrührer mit Heizplatte platziert (siehe Abbildung 1 rechts). Die freie Öffnung wird mit einem Schliffstopfen verschlossen.

[72] Beispiel 2: Durchführung der Veresterung:

1. Zunächst werden 20ml eines Alkohols vorgelegt. Liegt der Alkohol bei Raumtemperatur als Feststoff vor, wird er zunächst auf seine jeweilige Schmelztemperatur erwärmt.

2. Unter ständigem Rühren werden 100mg lyophilisiertes Cyanophycin dem Alkohol zugesetzt. Cyanophycin ist in den meisten Alkoholen unlöslich und bildet einen weißen Niederschlag.

3. Der homogenen Suspension wird unter ständigem Rühren tropfenweise insgesamt iml >96% H2SO4 zugesetzt.

4. Der Reaktionsansatz wird unter ständigem Rühren erwärmt (Paraffinöl-Bad konstant auf 70- 8o°C gehalten) und für mehrere Stunden inkubiert.

[73] Inkubationszeit: Die genaue Inkubationszeit variiert in Abhängigkeit zum verwendeten Alkohol. Der Fortschritt der Reaktion kann an der Trübung des Reaktionsansatzes geschätzt werden. Der entstehende Cyanophycin-Ester ist in dem jeweiligen Alkohol löslich. Ist die Trübung des ungelösten Cyanophycins verschwunden, ist die Reaktion mehrheitlich abgelaufen. Wenn der Reaktionsansatz komplett klar ist, wird er für eine weitere Stunde inkubiert.

[74] Alkohole mit Siedetemperatur <ioo°C: Durch die Wärme-Inkubation verdampft ein großes Volumen des eingesetzten Alkohols. In einer solchen Situation würde man einen Rücklaufkühler verwenden, was jedoch hier ungünstig ist. Bei der Reaktion entsteht Wasser, was entfernt werden muss, um das Reaktionsgleichgewicht in Richtung des Esters zu verschieben (Trocknungsrohr). Wasser würde im Rücklaufkühler ebenfalls kondensieren und somit nicht effizient entfernt werden. Daher wird über die Inkubationsdauer konstant frischer Alkohol tropfenweise zugesetzt - hierzu wird die zweite Öffnung des Zweihalskolben verwendet (Abbildung i rechts).

5. Nach der Inkubation wird der Reaktionsansatz langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Im nächsten Schritt wird der Ester aus dem Reaktionsansatz gereinigt.

[75] Beispiel 3: Reinigung durch Kälte-Fällung

1. Der Reaktionsansatz wird für 12h bei -8o°C inkubiert.

2. Der Ansatz wird bei 30.000 xg für 45min bei -io°C zentrifugiert. (Kühlkette nicht unterbrechen)

3. Das Polymer-Pellet wird mit -20°C kaltem ioo%igen Ethanol bzw. Propanol überschichtet und erneut zentrifugiert (30.000 xg, 40min, -io°C). Diesen Waschschritt nochmal wiederholen.

4. Das Polymer-Pellet an der Luft bei Raumtemperatur trocken.

[76] Beispiel 4: Reinigung durch Dialyse

[77] Bleibt der Cyanophycin-Ester nach einer mehrstündigen Inkubation bei -8o°C nach wie vor in Lösung oder kristallisiert der Alkohol aus, wird das Reaktionsprodukt durch Dialyse gereinigt. Notwendig hierfür ist, dass der Alkohol mit Wasser mischbar ist.

1. Der Reaktionsansatz wird auf 4°C gekühlt.

2. Unter ständigem Rühren werden 10ml, 4°C kaltes ddH20 zugesetzt.

3. Im Anschluss wird der Reaktionsansatz, der sich in einem Eis-Bad befindet durch die Zugabe von NaOH neutralisiert (pH 7). Hierbei ist darauf zu achten, dass die Kühlkette nicht unterbrochen wird. Ab der Zugabe von ddH20 muss die Neutralisation schnell verlaufen, um saure Hydrolyse zu minimieren. Ebenfalls darf der pH nicht ins Basische kommen, um basische Hydrolyse zu vermeiden.

4. Ist der pH für mehrere Minuten stabil, wird der gesamte Reaktionsansatz in einen Dialyseschlauch (Cut-off 3,5 kDa) gefüllt.

5. Dialysiert wird gegen endmineralisiertes Wasser in einem Durchfluss-Dialyseverfahren. Die Fließgeschwindigkeit beträgt 1-2 L/h für 24h.

6. Der dialysierte Reaktionsansatz wird im Anschluss in einer Petrischale bei 6o°C in einem Trockenschrank getrocknet.

[78] Beispiel 5: Nachweis der erfolgreichen Veresterung

[79] UV-Vis-Spektrum [80] Cyanophycin und seine Derivate haben aufgrund ihrer Peptidbindungen ein Absorptionsmaximum bei 2oo-2ionm.

[81] SDS-PAGE

[82] Die Veresterung kann sich auf die Molmassenverteilung bzw. Polydispersität auswirken, was durch eine SDS-PAGE sichtbar gemacht werden kann.

[83] Horizontale native Polyacrylamide Gel Elektrophorese

[84] Die horizontale native Polyacrylamide Gel Elektrophorese ist eine neue Methode zur Validierung der Nettoladung der Polymere. Unmodifiziertes Cyanophycin ist ein Ampholyt aufgrund seiner zwei freien funktionellen Gruppen: Guanidin- und die Carboxy-Gruppe. Durch die Veresterung, bei der die Carboxy-Gruppe involviert ist, wird die negative Ladung entfernt, weshalb die Cyanophycin-Ester reine Polykationen sind.

[85] Bei dieser Methode wird ein natives Polyacrylamid Gel in eine horizontale Gießvorrichtung gegossen. Der Kamm für die Probentaschen wird in der Mitte des Gels platziert. Das Gel hat einen pH von 8,8 und der Laufpuffer hat einen pH von 8,3. Der isoelektrische Punkt (IP) von nativem Cyanophycin liegt zwischen 5,3 und 6. Liegt der pH über dem IP ist das Polymer negativ geladen und fließt zur Anode, was im Falle von nativem Cyanophycin passiert. Die modifizierten Ester hingegen sind selbst bei diesem hohen pH positiv geladen und wandern zur Katode. Dieses Experiment zeigt, dass die Modifikation die Nettoladung des Polymers verändert hat (siehe Abbildung 2).

[86] Beispiel 5: Eigenschaften der erfinderischen Cyanophycin-Ester

[87] Natives Cyanophycin ist ein Ampholyt aufgrund seiner zwei freien funktionellen Gruppen: Guanidin und die Carboxy-Gruppe. Durch die Veresterung, bei der die Carboxy-Gruppe involviert ist, wird die negative Ladung entfernt. Daher ist eine Änderung im isoelektrischen Punkt (IP) der Cyanophycin-Ester zu erwarten. Aus diesem Grund haben wir eine isoelektrische Fokussierung (IEF) durchgeführt. Hierbei werden die Polymere in einem pH-Gradienten elektrophoretisch aufgetrennt und sammeln sich an der Stelle im Gradienten, wo ihre Netto-Ladung null entspricht (=der isoelektrische Punkt). Durch die Entfernung der negativen Ladungen würde man bei den Cyanophycin-Estern eine Verschiebung des IP in den basischen Bereich erwarten.

[88] Der IP von unmodifiziertem Cyanophycin liegt zwischen 5,3 und 6 (Abbildung 3 A). Die wasserlöslichen Cyanophycin-Ester (Methanol, Ethanol und Prophanol verestert), die in dieser Studie getestet wurden, konnten nicht ins Gel einlaufen (Abbildung 3 A). Bereits wenige Minuten nach dem Anlegen des elektrischen Feldes wurde sichtbar, dass die Ester einen weißen Schlier bildeten und in die entgegengesetzte Richtung wanderten (zu der Kathode) (Abbildung 3 B). Der Lade-Farbstoff (Neutral-Rot) lief normal ins Gel ein (zur Anode hin). [89] Es wurde eine weitere IEF durchgeführt, bei der jedoch die Polarität umgekehrt wurde (Abbildung 3 C & D). Durch die umgekehrte Polung konnte unmodifiziertes Cyanophycin, der Lade-Farbstoff (Abbildung 3 D) sowie der Marker nicht ins Gel einlaufen, die Ester jedoch schon.

[90] Die entgegengesetzte Laufrichtung der Cyanophycin-Ester zeigt deutlich, dass die Veresterung die negativen Ladungen entfernen konnte und diese Derivate daher keine Ampholyte mehr sind, sondern reine kationische Polymere.

[91] Beispiel 6: Herstellung von PEG-Cyanophycin

[92] Bei der sogenannten "PEGylierung" werden Stoffe mit Polyethylenglycol (PEG) konjugiert. Diese Methode findet bereits seit den 70er Jahren Anwendung und wird häufig zur Modifikation von biopharmazeutischen Wirkstoffen oder Diagnostika verwendet (Turecek et al. 2016). Auch bei nicht-viralen Vektoren bzw. Trägersubstanzen für Gentherapien werden PEGylierungen häufig durchgeführt (Grün et al. 2021). Hierbei konnte beobachtet werden, dass eine solche Modifikation bei Polyplexen (Komplex aus Nukleinsäure und einem polykationischen Polymer) zu einer verringerten Toxizität und erhöhter Stabilität führen kann.

[93] Aufgrund seiner endständigen Hydroxygruppen ist es möglich, über das erfinderische Verfahren Cyanophycin auch mit PEG zu verestern. Es gelang im Kontext der vorliegenden Erfindung, PEGyliertes Cyanophycin herzustellen. Das Polymer ist gut in Wasser löslich und hat ein hohes Molekulargewicht (2okDa->iookDa) (siehe Abbildung 4).

[94] Beispiel 7: Verwendung bei einer Transfektion

[95] Poly-kationische Substanzen habe verschiedene Anwendungsmöglichkeiten, wie beispielsweise die Nutzung als Transfektions-Reagenz. Transfektion mittels Poly-kationischer Substanzen ist in vielen Bereichen bereits etabliert.

[96] In einem ersten wurde mit Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) gezeigt, dass eine Interaktion zwischen Cyanophycin und Nukleinsäuren stattfindet und dass die Stabilität des Komplexes pH abhängig ist. Während natives Cyanophycin in den EMSA's nur bei saurem pH (< 2,5) stabile Komplexe bildete, war es mit Ethyl-Cyanophycin möglich, auch bei pH 6 noch stabile Komplexe zu bilden, die zu einem Gelshift führen.

[97] Kationische Lipid Transfektion ist eine der am weitesten verbreiteten Methode zum

Einbringen von Fremd-DNA in eukaryotische Zellen. Dieses Verfahren basiert auf einem artifiziellen Liposom, welches die Nukleinsäure umhüllt und mit der Zellmembran fusioniert. Die Firma Invitrogen AG vertreibt hierfür ein breites Angebot an Produkten für die kationische Lipid Transfektion: (Lipofectamin™ -Reihe:

„https : / / www.thermofisher. com/ de / de/home/brands/ product- brand/lipofectamine.html?gclid=EAIaIQobChMI8tjIoprO8AIVBuh3C holWQ6dEAAYASAAEgL xGPD_BwE&ef_id=EAIaIQobChMI8tjIoprO8AIVBuh3CholWQ6dEAAYA SAAEgLxGPD_BwE: G:s&s_kwcid=AL!3652!3!36i76238i36i!b!!g!!%2Blipofectamin e&cid=bid_clb_t&_roi_co_cp oooo_pjtoooo_bidooooo_ose_gaw_nt_pur_con)“

[98] Das laut Anbieter aktuell effizienteste Kit für die Lipid-Transfektion ist das Lipofectamine™ 3000 Reagenz. Laut Herstellerprotokoll wird die Nukleinsäure zunächst mit einer poly-kationischen Substanz (P3000) inkubiert. Anschließend wird Lipofectamine zugegeben, welches den Komplex in ein Lipid-Vesikel hüllt. In einem ersten Versuch wurde getestet, ob es möglich ist, das kationische P3000 durch eines der mit der Erfindung hergestellten Cyanophycin-Derivate zu ersetzen. Aufgrund seiner guten Löslichkeit bei neutralem pH wurde daher Ethyl-Cyanophycin verwendet. In den Tests wurde ein GFP-codierendes Plasmid als zu transfizierende Testnukleinsäure genutzt. Klassische Lipofection mittels Lipofectamin 3000 ergab eine Effizienz von 30,7%. Ersetzt man das kationische P3000 komplett durch Ethyl-CP waren 39,8% der Zellen positiv, was im Vergleich zur Kontrolle eine Steigerung von etwa 30 % ergibt. In der negativ-Kontrolle, in der nur Ethyl-CP mit Plasmid-DNA eingesetzt wurde (ohne Lipofectamin), wurden erwartungsgemäß keine positiven Zellen detektiert. Von Lipofektamin und P3000 ist bekannt, dass es zytotoxisch wirkt. Eine wichtige Frage war daher, ob Ethyl-CP weniger zytotoxisch wirkt. Bei einer ersten mikroskopischen Analyse zeigte sich, dass Ethyl-CP weniger toxisch wirkt als P3000. In dem Ansatz, bei dem Ethyl-CP verwendet wurde, sind weniger tote Zellen zu beobachten.

[99] Beispiel 8: Eigenschaften und Anwendungen von Erfindungsgemäßen CP Estern

[100] Ein erfindungsgemäß hergestellter Propyl-CP Ester (-O-CH2-CH2-CH3) wurde aufgereinigt und für verschiedene Verwendungen auf Eigenschaften überprüft.

[101] Insbesondere zeigen die Abbildungen 5-9 sowohl die Eigenschaft von Propyl-CP als Zelladhäsionsmediator und als Wachstumshemmer (verklebt die Zellen). Die Eigenschaften von Propyl-CP entsprechen denen des bekannten Polylysin. Entsprechend ist ein Propyl-CP eine alternative für alle Verwendungen in denen auch Polylysin verwendet wird.

REFERENZEN

[102] Die Referenzen sind:

Turecek, Peter L., et al. "PEGylation of biopharmaceuticals: a review of chemistry and nonclinical safety information of approved drugs." Journal of pharmaceutical sciences 105.2 (2016): 460- 475-

Grun, Molly K., et al. "PEGylation of poly (amine-co-ester) polyplexes for tunable gene delivery." Biomaterials 272 (2021): 120780.