PARTICULES A BASE DE POL YELECTROL YTES ET DE PRINCIPE ACTIF A LIBéRATION MODIFIEE ET FORMULATIONS PHARMACEUTIQUES CONTENANT CES PARTICULES

DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention concerne de nouveaux transporteurs de principe(s) actif(s) -PA-, en particulier protéinique(s) et peptidique(s), ainsi que de nouvelles formulations pharmaceutiques à libération modifiée contenant lesdits transporteurs de PA. La demande concerne également les applications, notamment thérapeutiques, de ces formulations pharmaceutiques. Ces formulations pharmaceutiques actives concernent aussi bien la thérapeutique humaine que vétérinaire.

L'abréviation PA utilisée dans tout le présent exposé vise au moins un principe actif.

ETAT DE LA TECHNIQUE

Dans le domaine de la libération prolongée des PA pharmaceutiques notamment des peptides/protéines thérapeutiques, on cherche très souvent à reproduire au mieux chez le patient une concentration plasmatique en peptide ou en protéine proche de la valeur observée chez le sujet sain.

Cet objectif se heurte à la faible durée de vie des protéines dans le plasma qui conduit à injecter de façon répétée la protéine thérapeutique. La concentration plasmatique en protéine thérapeutique présente alors un profil "en dents de scie" caractérisé par des pics élevés de concentration et des minima de concentration très bas. Les pics de concentration, très supérieurs à la concentration basale chez le sujet sain, ont des effets nocifs très marqués du fait de la toxicité élevée des protéines thérapeutiques telles que certaines cytokines. Par ailleurs, les minima de concentration sont inférieurs à la concentration nécessaire pour avoir un effet thérapeutique, ce qui entraîne une mauvaise couverture thérapeutique du patient et des effets secondaires graves à long terme.

Aussi, pour reproduire chez le patient une concentration plasmatique en protéine thérapeutique proche de la valeur idéale pour le traitement du patient, il importe que la formulation pharmaceutique considérée permette de libérer la protéine thérapeutique sur une durée prolongée, de façon à limiter les variations de concentration plasmatique au cours du temps.

Par ailleurs, cette formulation active doit, de préférence, satisfaire au cahier des charges suivant, déjà connu de l'homme de l'art :

1 - libération prolongée d'une protéine thérapeutique active et non dénaturée, par

exemple humaine ou synthétique, de sorte que la concentration plasmatique est maintenue au niveau thérapeutique ;

2 - viscosité à l'injection suffisamment basse pour être aisément injectable;

3 - forme biocompatible et biodégradable présentant un excellent profil de toxicité et de tolérance.

Pour tenter d'atteindre ces objectifs, l'une des meilleures approches proposées dans l'art antérieur fut de développer des formes à libération prolongée de protéine(s) thérapeutique(s) constituées par des suspensions, liquides et peu visqueuses de nanoparticules chargées en protéines thérapeutiques. Ces suspensions ont permis l'administration aisée de protéines thérapeutiques natives.

Ainsi, la société Flamel Technologies a proposé une voie, dans laquelle la protéine thérapeutique est associée à des nanoparticules d'un copolyaminoacide comprenant des groupements hydrophobes et des groupements hydrophiles. La demande de brevet US 2006/0099264 divulgue des polyaminoacides amphiphiles comprenant des résidus acide aspartique et/ou des résidus glutamiques, au moins une partie de ces résidus étant porteuses de greffons comportant au moins un motif alpha-tocophérol, e.g. : (polyglutamate ou polyaspartate greffé par l'alpha tocophérol d'origine synthétique ou naturelle). Ces homopolyaminoacides "modifiés hydrophobes" forment spontanément dans l'eau une suspension colloïdale de nanoparticules, lesquelles sont aptes à s'associer aisément en suspension aqueuse à pH 7,4, avec au moins une protéine active (insuline).

La durée de libération in vivo de la (ou les) protéine(s) active(s) (e.g. insuline) "vectorisée" par les suspensions selon US 2006/0099264 gagnerait à être augmentée.

L'augmentation de la durée de libération a été partiellement obtenue par les formes pharmaceutiques décrites dans la demande PCT WO-A-05/051416. Dans cette demande, est divulguée une suspension colloïdale de nanoparticules (0,001-0,5 μm) de poly(L- glutamate de sodium) modifiée hydrophobe et injectée à une concentration telle qu'après injection sous-cutanée, il se forme in situ chez le patient un gel au contact de l'albumine endogène. La protéine est alors lentement libérée sur une période typique d'une semaine. Cependant, lorsque la concentration en protéine thérapeutique à administrer est relativement élevée, comme c'est le cas par exemple pour l'hormone de croissance humaine, la durée de libération est limitée à quelques jours.

La durée de libération de ces formes gagnerait à être encore augmentée.

BREVE DESCRIPTION DE L'INVENTION

L'un des objectifs de l'invention est de proposer de nouvelles particules chargées en PA, libérant le PA sur une durée prolongée de plusieurs jours, voire plusieurs semaines. Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles particules formant une suspension stable en solution aqueuse.

Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles particules chargées en PA et stables sous forme lyophilisée.

Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles particules aptes à être conservées sous forme lyophilisée.

Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles particules facilement redispersibles après lyophilisation.

Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles particules libérant une protéine ayant préservé son activité biologique. Un autre objectif de l'invention est de proposer un nouveau procédé de préparation de ces microparticules.

Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation pharmaceutique solide pour la libération prolongée de PA en particulier une forme poudre sèche pour inhalation et administration pulmonaire. Pour atteindre ces objectifs, parmi d'autres, les inventeurs ont eu le mérite de découvrir, après de longues et laborieuses recherches, que, de façon tout à fait surprenante et inattendue, le mélange dans des conditions spécifiques de deux polymères (par exemple de copolyaminoacides) polyélectrolytes de polarité opposée, l'un au moins étant porteur de groupements hydrophobes, associés à au moins un PA, conduit à des particules de taille comprise entre 1 et 100 μm capables de libérer in vitro ou in vivo une protéine ou un peptide sur une durée prolongée.

D'où il s'ensuit que l'invention concerne tout d'abord des particules pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), caractérisées en ce qu'elles comprennent: a) un premier polymère polyélectrolyte (PEl), de préférence un alpha polyaminoacide linéaire, à l'état chargé, porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit premier polymère polyélectrolyte (PEl) formant spontanément dans l'eau une solution colloïdale de particules à au moins une valeur pHm du pH comprise entre 3 et 8; b) un second polymère polyélectrolyte (PE2), de préférence un alpha polyaminoacide linéaire, de polarité opposée à celle du premier polymère polyélectrolyte (PEl), ledit second polymère polyélectrolyte (PE2) formant dans l'eau une solution ou une solution colloïdale à au moins ladite valeur pHm du pH; à

la condition que, si le premier polymère électrolyte (PEl) est un polyaminoacide, alors le second polymère polyélectrolyte (PE2) n'est ni la polylysine ni la polyéthylène imine; c) au moins un principe actif (PA) associé de façon non covalente aux particules de la solution colloïdale du premier polymère polyélectrolyte (PEl ); lesdites particules pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA) étant obtenues par mélange, à pH égal à pHm, du premier polymère polyélectrolyte (PEl) sous forme de solution colloïdale de particules associées au principe actif (PA) avec le second polymère polyélectrolyte (PE2) sous forme de solution ou de solution colloïdale.

L'invention concerne également un procédé de préparation de particules pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), ces particules étant en particulier celles décrites ci-dessus, comprenant les étapes suivantes:

1) la préparation, à une valeur pHm du pH comprise entre 3 et 8, d'une solution colloïdale aqueuse d'un premier polymère polyélectrolyte (PEl) à l'état chargé, porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit premier polymère polyélectrolyte (PEl) étant capable de former spontanément dans l'eau une solution colloïdale de particules à au moins une valeur pHm du pH comprise entre 3 et 8; 2) l'ajout d'au moins un principe actif (PA) au premier polymère polyélectrolyte (PEl) obtenu à l'étape 1, ledit principe actif s'associant de façon non covalente aux particules de la solution colloïdale dudit premier polymère polyélectrolyte (PEl);

3) la préparation d'un second polymère polyélectrolyte (P E2) de polarité opposée à celle du premier polymère polyélectrolyte (PEl), ledit second polymère polyélectrolyte (PE2) formant dans l'eau une solution ou une solution colloïdale à au moins ladite valeur pHm du pH; à la condition que, si le premier polymère électrolyte (PEl) est un polyaminoacide, alors le second polymère polyélectrolyte (PE2) n'est ni la polylysine ni la polyéthylène imine;

4) le mélange, à pH égal à pHm, du premier polymère polyélectrolyte (PEl) sous forme de solution colloïdale de particules associées au principe actif (PA) obtenu à l'étape 2) avec le second polymère polyélectrolyte (PE2) sous forme de solution ou de solution colloïdale obtenu à l'étape 3).

L'invention concerne également des particules pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), caractérisées en ce qu'elles comprennent :

a) un premier polymère polyélectrolyte (PEl), de préférence un alpha polyaminoacide linéaire, à l'état chargé, porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit premier polymère polyélectrolyte (PEl) formant spontanément dans l'eau une solution colloïdale de particules à au moins une valeur pHm du pH comprise entre 3 et 8 ; b) un second polymère polyélectrolyte (PE2), de préférence un alpha polyaminoacide linéaire, de polarité opposée à celle du premier polymère polyélectrolyte (PEl), porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit second polymère polyélectrolyte (PE2) formant dans l'eau une solution ou une solution colloïdale à au moins ladite valeur pHm du pH ; c) au moins un principe actif (PA) associé de façon non covalente aux particules de la solution colloïdale du premier polymère polyélectrolyte (PEl) ; lesdites particules pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA) étant obtenues par mélange à pH égal à pHm du premier polymère polyélectrolyte (PEl) sous forme de solution colloïdale de particules associées au principe actif (PA) avec le second polymère polyélectrolyte (PE2) sous forme de solution ou de solution colloïdale.

L'invention concerne également un procédé de préparation de particules pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), ces particules étant en particulier celles décrites ci-avant, comprenant les étapes suivantes : 1) la préparation, à une valeur pHm du pH comprise entre 3 et 8, d'une solution colloïdale aqueuse d'un premier polymère polyélectrolyte (PEl) à l'état chargé, porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit premier polymère polyélectrolyte (PEl) étant capable de former spontanément dans l'eau une solution colloïdale de particules à au moins une valeur, pHm, du pH comprise entre 3 et 8 ;

2) l'ajout d'au moins un principe actif (PA) au premier polymère polyélectrolyte (PEl) obtenu à l'étape 1, ledit principe actif s'associant de façon non covalente aux particules de la solution colloïdale dudit premier polymère polyélectrolyte (PEl) ; 3) la préparation d'un second polymère polyélectrolyte (PE2) de polarité opposée à celle du premier polymère polyélectrolyte (PEl), porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit second polymère polyélectrolyte (PE2) formant dans l'eau une solution ou une solution colloïdale à au moins ladite valeur pHm du pH ; 4) le mélange, à pH égal à pHm, du premier polymère polyélectrolyte (PEl) sous forme de solution colloïdale de particules auxquelles est associé le principe actif (PA) obtenu à l'étape 2) avec le second polymère polyélectrolyte (PE2) sous forme de solution ou de solution colloïdale obtenu à l'étape 3).

L'invention concerne également une formulation pharmaceutique pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), ladite formulation comprenant des particules telles que décrites ci-dessus. L'invention concerne également un procédé de préparation de médicaments, en particulier pour administration parentérale, muqueuse, sous-cutanée, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, intracérébrale ou dans une tumeur, voire par voie orale, nasale, pulmonaire, vaginale, transdermique ou oculaire, consistant essentiellement à mettre en œuvre au moins une formulation telle que décrite ci-dessus.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

Définitions

Dans la présente description, on entend par solution un mélange homogène solvant et polymère sous forme de chaîne individuelle.

Dans la présente description, on entend par solution colloïdale une suspension de particules dont le diamètre moyen mesuré par le test T' est inférieur ou égal à 0,5 μm.

Dans la présente description, on entend par pH de demi-neutralisation, le pH auquel la moitié des groupements ionisables est ionisée. Dans la présente description, on entend par pHm le pH auquel s'effectue le mélange du premier polymère polyélectrolyte (PEl) auquel est associé le principe actif (PA) avec le second polymère polyélectrolyte (PE2).

Dans la présente description, on définit le pH physiologique comme étant par exemple égal à 7,2 ± 0,4. Dans la présente description, on entend par polyélectrolyte un polymère porteur de groupements capables de s'ioniser dans l'eau, ce qui crée une charge sur le polymère.

Dans la présente description, on entend par polyampholyte un polyélectrolyte porteur d'au moins deux types de groupements qui se dissocient respectivement en groupements anioniques et cationiques. Dans la présente description, l'expression « être porteur » signifie que le groupement porté est pendant, c'est-à-dire que ledit groupement est un groupement latéral par rapport à la chaîne principale du polymère. En particulier, lorsque le polymère est un polyaminoacide comprenant des résidus "acide aminé", ledit groupement pendant est un groupement latéral par rapport aux résidus "acide aminé" et est un substituant de la fonction carbonyle en γ du résidu "acide aminé" qui le porte.

Dans la présente description, on entend par polarité d'un polyélectrolyte, la polarité de la charge globale portée par ce polyélectrolyte à la valeur pHm du pH.

Dans la présente description, on entend par densité apparente le volume occupé par

1 g de particules. La densité apparente est mesurée par toute méthode connue de l'homme du métier, telle que la méthode de gradient de densité.

Dans la présente description, on entend par petite molécule, une molécule ayant un poids moléculaire inférieur à 1 kDa. Pour mesurer la taille des particules selon l'invention, résultant de l'association du premier polymère polyélectrolyte (PEl) et du second polymère polyélectrolyte (PE2), on utilise le test T. Pour évaluer la taille des particules de la solution colloïdale du premier polymère polyélectrolyte (PEl), on utilise de préférence le test T'.

Le résultat du test T est un diamètre médian D50, tel que 50% de particules présentes dans l'échantillon ont une taille inférieure ou égale à cette valeur (D50). Le résultat du test T' est un diamètre hydrodynamique moyen.

Test T de mesure de la taille des microparticules par diffraction laser:

On obtient les données relatives au D50 qui est le diamètre en dessous duquel se trouvent 50 % des objets analysés. Ce diamètre des particules selon l'invention est mesuré selon le mode opératoire défini ci-après :

Les solutions de particules sont préparées en diluant 400 μl de l'échantillon à analyser dans un tube à essai de 5 ml avec 600 μl d'eau déminéralisée, puis en passant la préparation au vortex pendant 10 s (10 ± 5). Ces solutions sont ensuite introduites au goutte à goutte dans la cellule de mesure jusqu'à ce que l'obscuration soit comprise entre

5 % et 20 %, puis elles sont analysées par diffraction de la lumière grâce à un appareil de type Malvern Mastersizer 2000, fonctionnant avec deux longueurs d'onde 466 et 632 nm.

Le D50 des particules est calculé à partir de la théorie de Mie en utilisant les indices de réfraction suivants : n _flu , _de = 1.33 + i.0, npolymere ^≈ 1.59 + i.O et les approximations de Fraunhofer, comme décrit dans la norme ISO 13320.

Test T' de mesure de la taille des nanoparticules par diffusion quasi-élastique de la lumière:

Le diamètre hydrodynamique moyen des particules de polymère selon l'invention est mesuré selon le mode opératoire Md défini ci-après :

Les solutions de polymère sont préparées à des concentrations de 1 ou 2 mg/ml en milieu NaCl 0,15 M et laissées sous agitation pendant 24 h. Ces solutions sont ensuite filtrées sur 0,8-0,2 μm, avant de les analyser en diffusion dynamique de la lumière grâce à un appareil de type Malvern Compact Goniometer System, fonctionnant avec un faisceau laser He-Ne de longueur d'onde 632,8 nm et polarisé verticalement. Le diamètre

hydrodynamique des nanoparticules de polymère est calculé à partir de la fonction d'autocorrélation du champ électrique par la méthode des cumulants, comme décrit dans l'ouvrage « Surfactant Science Séries » volume 22, Surfactant Solutions, Ed. R. Zana, chap. 3, M. Dekker, 1984.

Test L de mesure de la libération du principe actif:

On injecte 50 μl de formulation dans un cube de 1,5 cm de côté de mousse polyuréthane-polyéther (PU-PE) baigné par un flux de 2,83 ml/h d'un milieu aqueux contenant 30 mg/g d'albumine bovine fraction V (Aldrich), 0,01 M de tampon phosphate, 0,0027 M de chlorure de potassium, 0,137 M de chlorure de sodium (PBS de Aldrich) et 0,015 M d'acétate d'ammonium (Aldrich). On prélève régulièrement de la phase continue dont la teneur en protéine est analysée par ELISA (kit Immunotech IM3193).

On peut alors tracer la masse totale de protéine libérée en sommant celle trouvée dans chacun des prélèvements et la rapporter à la quantité totale injectée.

Au sens de l'invention, le terme "protéine" désigne aussi bien une protéine qu'un peptide, qu'il s'agisse d'un oligo ou d'un polypeptide. Cette protéine ou ce peptide peuvent être modifiés ou non, par exemple, par greffage d'un ou de plusieurs groupements polyoxyéthyléniques. Les premier et second polymères polyélectrolytes (PEl) et (PE2) sont des polymères linéaires, biocompatibles et biodégradables, porteurs de groupements ionisables anioniques et/ou cationiques, par exemple des fonctions aminés ou acides carboxyliques. De préférence, le polymère PEl ou PE2 est porteur de groupements ionisables d'une polarité donnée (anionique ou cationique). De tels polymères sont par exemples des polyaminoacides, des polysaccharides anioniques tels que le sulfate de dextran, la carboxyméthylcellulose, la gomme arabique, l'acide hyaluronique et ses dérivés, les polygalacturoniques, les polyglucuroniques, ou des polysaccharides cationiques tels que le chitosan, ou également du collagène et ses dérivés de type gélatine. II n'est pas exclu qu'un polymère porteur de groupements ionisables d'une polarité donnée, soit également porteur d'une petite fraction de 1 à 30 % molaire de groupements ionisables de la polarité opposée. En plus des groupements ionisables anioniques ou cationiques et des groupements hydrophobes, le premier ou second polymère polyélectrolyte (PEl) ou (PE2) peut éventuellement être également porteur de groupements non ionisables, tels que des radicaux choisis parmi un radical hydroxyéthylamino-, un alkylène glycol ou un polyalkylène glycol;

La charge nette du polymère dépend de la valeur du pH par rapport au pH de demi- neutralisation du polymère. Ainsi pour un polyélectrolyte porteur de fonctions anioniques carboxyliques, la charge nette du polymère sera voisine de zéro à un pH deux unités au dessous du pH de demi-neutralisation. Quasiment toutes les fonctions anioniques seront ionisées deux unités de pH au dessus du pH de demi-neutralisation. Inversement, pour un polymère porteur de fonctions cationiques, la charge nette s'annule lorsque le pH dépasse de deux unités environ le pH de demi-neutralisation.

Dans la présente invention, le nombre de charges portées par le premier ou second polymère polyélectrolyte (PEl, PE2) dans les conditions de mélange à la valeur pHm du pH, est obtenue par la méthode classique de titration acido-basique :

Une solution de polyélectrolyte concentrée à 2 mg/ml et contenant 0,15 M de chlorure de sodium est portée à pH 3 par ajout d'acide acétique 1 M ou de soude 1 M. On procède ensuite à la titration de cette solution par une solution de soude 0,05 M en enregistrant l'évolution du pH en fonction du volume de soude ajouté. La détection du point d'équivalence (volume et pH), par exemple par la méthode de la double tangente, permet de détecter le pH pour lequel tous les groupements ionisables sont ionisés, c'est-à dire où le degré d'ionisation est égal à 1. On peut alors, à partir de ce point remonter au degré d'ionisation du polyélectrolyte pour toute valeur du pH. On peut alors définir le pH de demi-neutralisation, c'est-à-dire le pH pour lequel le degré d'ionisation est égal à 0,5. On peut aussi définir le degré d'ionisation du polyélectrolyte pour la valeur pHm du pH. Dans le cas particulier où le point d'équivalence est hors d'une gamme de pH compris entre 3 et 9, on considère que tous les groupements ionisables sont ionisés sur cette gamme de pH, c'est-à dire que le degré d'ionisation est égal à 1 pour des pH compris entre 3 et 9.

D'une manière avantageuse, les premier et second polymères polyélectrolytes (PEl, PE2) peuvent être des alpha polyaminoacides linéaires, en rappelant que si PEl est un polyaminoacide linéaire, PE2 n'est pas la polylysine ni la polyéthylène imine.

Au sens de l'invention et dans tout le présent exposé, le terme « polyaminoacide » couvre aussi bien les polyaminoacides naturels que les polyaminoacides synthétiques, ainsi que les oligoaminoacides comprenant de 2 à 20 résidus "acide aminé" au même titre que les polyaminoacides comprenant plus de 20 résidus "acide aminé".

De préférence, les polyaminoacides utilisés dans la présente invention sont des oligomères ou des homopolymères comprenant des unités récurrentes acide glutamique ou aspartique ou des copolymères comprenant un mélange de ces deux types de résidus "acide aminé". Les résidus considérés dans ces polymères sont des acides aminés ayant la configuration D ou L ou D/L et sont liées par leurs positions alpha ou gamma pour le résidu glutamate ou glutamique et alpha ou bêta pour le résidu aspartique ou aspartate.

Les résidus "acide aminé" préférées de la chaîne polyaminoacide principale sont celles ayant la configuration L et une liaison de type alpha.

Suivant un mode encore plus préféré de réalisation de l'invention, les premier et second polymères polyélectrolytes (PEl, PE2) sont des polyaminoacides, ou l'un de leurs sels pharmaceutiquement acceptables, dont la chaîne principale est formée par des résidus choisis dans le groupe comprenant les résidus aspartiques, les résidus glutamiques et leurs combinaisons, au moins une partie de ces résidus étant modifiée par greffage d'au moins un groupement hydrophobe (GH) pour au moins le premier polymère polyélectrolyte (PEl).

Il est possible que le polymère PE2 soit également porteur de groupes hydrophobes latéraux.

Selon une première variante, ces polyaminoacides sont du type de ceux décrits dans la demande de brevet PCT WO-A-00/30618, selon laquelle les groupements hydrophobes

(GH) sont identiques ou différents entre eux et sont sélectionnés dans le groupe comprenant : (i) les alkyles, les acyles ou les alcényles linéaires ou ramifiés, de préférence linéaires en Ci-C ₂₀ et, plus préférentiellement encore en C ₂ -Ci _S ;

(ii) les groupements hydrocarbonés contenant un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence ceux contenant de l'oxygène et/ou du soufre et, plus préférentiellement encore, ceux de formule suivante:

dans laquelle:

- R _6O est un radical alkyle, acyle ou alcényle linéaire ou ramifié, de préférence linéaire en Ci -C ₂₀ et, plus préférentiellement encore en C ₂ -Ci _S , - R ₆ ] et R ₆₂ sont identiques ou différents entre eux et correspondent à l'hydrogène ou à un radical alkyle, acyle ou alcényle linéaire ou ramifié, de préférence linéaire en C1-C20 et, plus préférentiellement encore en C ₂ -Ci _S , - q= l à 100 ;

(iii) les aryles, les aralkyles ou les alkylaryles, de préférence les aryles ; (iv) les dérivés hydrophobes, de préférence, le radical phosphatidyléthanolamino- ou les radicaux choisis parmi octyloxy-, dodécyloxy-, tétradécyloxy-, hexadécyloxy-, octadécyloxy-, 9-octadecenyloxy-, tocophéryloxy- ou cholestéryloxy-.

Par "groupements hydrocarbonés", on entend au sens de la présente invention, des groupements comprenant notamment des atomes d'hydrogène et de carbone.

De préférence, dans cette variante, les groupements hydrophobes sont sélectionnés dans le groupe de radicaux suivants : méthyle, éthyle, propyle, docédyle, hexadécyle, octadécyle.

D'une manière particulièrement préférée, les groupements hydrophobes (GH) sont choisis dans le groupe suivant :

• les alkyles linéaires ou ramifiés en Cs à C ₃₀ pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome,

• les alkylaryles ou arylalkyles en C ₈ à C ₃₀ pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome,

• et les (poly)cycliques en C ₈ à C ₃ o pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome.

Plus précisément, au moins l'un des groupements hydrophobes (GH) est obtenu par greffage, à partir d'un précurseur choisi dans le groupe comprenant: l'octanol, le dodécanol, le tétradécanol, l'héxadécanol, l'octadécanol, l'oléylalcool, le tocophérol ou le cholestérol.

Selon une variante de l'invention, l'un des polymères polyélectrolytes (PEl, PE2), ou l'un de leurs sels pharmaceutiquement acceptables, répond à la formule (I) suivante :

(I) dans laquelle :

R ¹ représente H, un alkyle linéaire en C ₂ à Cio, un alkyle ramifié en C ₃ à Cio, un benzyle, -R -[GH], ou R forme avec NH un résidu acide aminé terminal;

R représente H, un acyle linéaire en C ₂ à Cio, un acyle ramifié en C ₃ à Cio, un pyroglutamate ou -R ⁴ -[GH] ;

R ⁴ représente une liaison directe ou un "espaceur" à base de 1 à 4 résidus acide aminé ;

A ¹ et A ² représentent indépendamment -CH ₂ - (résidu aspartique) ou -CH ₂ - CH ₂ - (résidu glutamique) ;

• n/(n+m) est défini comme le taux de greffage molaire et sa valeur est suffisamment basse pour que le polymère mis en solution dans l'eau à pH 7 et à 25 ⁰ C, forme une suspension colloïdale de particules de polymère;

• n + m varie de 10 à 1000, de préférence entre 50 et 300 ;

• GH représente un groupement hydrophobe comportant 6 à 30 atomes de carbone ou est choisi dans le groupe comprenant les radicaux tels que définis ci-dessus dans les paragraphes (i), (ii), (iii) et (iv).

Pour plus de détails sur la préparation et la synthèse de polyaminoacides de formule (I), on se reportera utilement aux demandes de brevet FR 02 07008 et FR 03 50190.

Selon une autre possibilité, le polymère polyélectrolyte PE2, ou l'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables, répond à l'une des formules (II), (III) et (IV) suivantes :

dans lesquelles :

GH représente un groupement hydrophobe comportant 6 à 30 atomes de carbone ;

R ³⁰ est un groupement alkyle linéaire en C ₂ à C ₆ ; R ⁵⁰ est un alkyle, un dialcoxy ou un diamino en C ₂ à C ₆ ; R ⁴ représente une liaison directe ou un "espaceur" à base de 1 à 4 résidus acide aminé ;

A ¹ et A ² représentent indépendamment un radical -CH ₂ - (résidu aspartique) ou -CH ₂ -CH ₂ - (résidu glutamique) ;

• n' + m' ou n"est défini comme le degré de polymérisation et varie de 10 à

1000, de préférence entre 50 et 300.

Pour plus de détails sur la préparation et la synthèse de polyaminoacides de formule (I), (II) et (IV), on se reportera utilement à la demande de brevet FR 03 50641.

Selon une autre possibilité, l'un des polymères polyélectrolytes (PEl, PE2), ou l'un de leurs sels pharmaceutiquement acceptables, répond à la formule (V) suivante :

dans laquelle :

" E- représente indépendamment :

- un -NHR dans lequel R représente H, un alkyle linéaire en C ₂ à Ci ₀ , un alkyle ramifié en C ₃ à Cio ou un benzyle, un résidu acide aminé ou un dérivé d'acide aminé terminal de formule :

H ₇

-NH — C COR ⁷

dans laquelle

R ⁷ est OH, OR ⁹ ou NHR ¹⁰ , et R ⁸ , R ⁹ et R ¹ représentent indépendamment H, un alkyle linéaire en

C ₂ à Cio, un alkyle ramifié en C ₃ à C] ₀ ou un benzyle;

B est une liaison directe ou un groupement de liaison divalent, trivalent ou tétravalent, de préférence choisi parmi les radicaux suivants :

-O— , -NH-, — N(-Ci- ₅ alkyle)- , un résidu d'acide aminé (de préférence naturel), de diol, de triol, de diamine, de triamine, d'aminoalcool ou d'hydroxyacide comportant de 1 à 6 atomes de carbone, D représente H, un acyle linéaire en C ₂ à Cio, un acyle ramifié en C ₃ à C _1O , ou un pyroglutamate;

GH représente un groupement hydrophobe comportant 6 à 30 atomes de carbone; R ⁷⁰ représente un radical choisi dans le groupe suivant :

-NH-(CH ₂ ) _W -NH ₃ ⁺ avec w compris entre 2 et 6, et de préférence w est égal à 4,

- -NH-(CH ₂ ) ₄ -NH-C(=NH)-NH ₃ ⁺ ,

- -O-(CH ₂ ) ₂ -NH ₃ ⁺ ,

- -O-(CH ₂ ) ₂ -N ⁺ (CH ₃ ) ₃ ,

où un ester d' alkyle (de préférence -COOMe et -COOEt), -CH ₂ OH, -Q=O)-NH ₂ , -C(=0)-NH-CH ₃ ou -C(=O)-N(CH ₃ ) ₂ ; un résidu d'acide aminé ou dérivé d'acide aminé de formule :

dans laquelle :

X est un atome d'oxygène ou -NH-,

R ¹ est H, alkyle linéaire en C ₂ à Ci ₀ , alkyle ramifié en C ₃ à Cio ou benzyle,

-R ¹³ est -(CH ₂ ) ₄ NH ₃ ⁺ , -(CH ₂ ) ₃ -NH-C(=NH)-NH ₃ ⁺ , -{CH ₂ ) ₃ NH ₃ ⁺ ; le contre-anion de R ⁷⁰ est un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, de préférence un chlorure;

R représente un hydroxyéthylamino-, un résidu d'alkylène glycol ou un polyoxyalkylène ;

• p, q, r et s sont des entiers positifs;

• (p)/(p+q+r+s) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements hydrophobes GH varie de 2 à 99 % molaire, et de préférence entre 5 et 50 % sous condition que chaque chaîne de copolymère possède en moyenne au moins 3 greffons hydrophobes;

• (q)/(p+q+r+s) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements cationiques et varie de 1 à 99 % molaire;

" (p+q+r+s) varie de 10 à 1000, de préférence entre 30 et 500 ;

• (r)/(p+q+r+s) varie de 0 à 98 % molaire; " (s)/(p+q+r+s) varie de 0 à 98 % molaire.

Les dérivés de la lysine, de l'ornithine, et de l'arginine peuvent être par exemple des esters éthyliques et méthyliques, des amides, et des amides méthylés.

De préférence selon cette variante, les groupements hydrophobes GH et les groupements cationiques sont disposés de façon aléatoire en groupements pendants.

Il est par ailleurs préférable que le taux de greffage molaire en motif hydrophobe des polyglutamates soit compris entre 2 et 99 %, et de préférence entre 5 et 50 % sous condition que chaque chaîne de polymère possède en moyenne au moins 3 greffons hydrophobes. Le rapport (q)/(p+q+r+s) des polyglutamates signifie qu'ils peuvent contenir de 1 à environ 97 % molaire de groupements contenant une charge cationique.

Le rapport (s)/(p+q+r+s) des polyglutamates signifie qu'ils peuvent être anioniques, neutres ou cationiques à pH neutre.

Pour plus de détails sur la préparation et la synthèse de polyaminoacides de formule

(V) dérivés de lliistidine, on se reportera utilement à la demande de brevet FR 05 53302. Pour plus de détails sur la préparation et la synthèse de polyaminoacides de formule (V) autres que ceux dérivés de l'histidine, on se reportera utilement à la demande de brevet FR 07 03185.

Suivant une variante intéressante, le groupement R ⁴ ou B représenté dans les formules précédentes représente une liaison directe.

Selon une autre possibilité, l'un des polymères polyélectrolytes (PEl, PE2) comprend des résidus hydroxyalkyl (de préférence éthyl) glutamine et une multiplicité de groupements hydrophobes (GH) pendants et identiques ou différents entre eux. Les résidus hydroxyalkylglutamine sont également porteurs de groupements hydroxyalkylamine. Ces groupements hydroxyalkylamine sont, de préférence, liés au copolymère par l'intermédiaire d'une liaison amide. Les groupements hydroxyalkylamine utilisables pour

fonctionnaliser les résidus glutamates de ces résidus hydroxyalkylglutamine sont identiques ou différents entre eux et sont par exemple choisis parmi les groupements suivants: 2-hydroxyéthylamino, 3-hydroxypropylamino, 2,3-dihydroxypropylamino, tris(hydroxyméthyl)méthylamino et 6-hydroxyhexylamino. Avantageusement, au moins l'un des groupements hydrophobes GH utilisé dans la présente invention est inclus dans un greffon hydrophobe comprenant au moins une rotule (ou motif) d'espacement ("spacer") permettant de relier le groupement hydrophobe GH à une chaîne de copolyglutamates (par exemple une chaîne principale - squelette- copolyglutamates). Cette rotule peut comprendre, e.g. au moins une liaison covalente directe et/ou au moins une liaison amide et/ou au moins une liaison ester. Par exemple, la rotule peut être du type de celles appartenant au groupe comportant notamment: les résidus "acide aminé" différents de l'unité monomérique constitutive du copolyglutamate, les dérivés des aminoalcools, les dérivés des polyamines (par exemple les diamines), les dérivés des polyols (par exemple les diols) et les dérivés des hydroxyacides. Le greffage des GH sur la chaîne copolyglutamate ou polyalkylglutamine peut passer par la mise en œuvre de précurseurs de GH, aptes à se lier à la chaîne copolyglutamates ou aux résidus hydroxyalkylglutamines. Les précurseurs des GH sont, en pratique et sans que cela ne soit limitatif, choisis dans le groupe comprenant les alcools et les aminés, ces composés pouvant être fonctionnalisés facilement par l'homme de l'art. Pour plus de détails sur ces résidus hydroxyalkyl- (de préférence hydroxyéthyl-) glutamine, on se référera au FR 2.881.140.

Suivant une variante avantageuse, notamment selon au moins l'une des différentes possibilités susvisées, tout ou partie des groupements hydrophobes (GH) utilisés dans la présente invention sont choisis de façon indépendante dans le groupe de radicaux comportant :

" un alcoxy linéaire ou ramifié comportant de 6 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S) et/ou au moins une insaturation,

• un alcoxy comportant 6 à 30 atomes de carbone et ayant un ou plusieurs carbocycles annelés et contenant éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S), " un alcoxyaryle ou un aryloxyalkyle de 7 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S).

Suivant une autre variante avantageuse, notamment selon au moins l'une des différentes possibilités susvisées, le groupement hydrophobe (GH) est issu d'un précurseur alcoolique choisi dans le groupe comprenant: l'octanol, le dodécanol, le tétradécanol,

l'hexadécanol, l'octadécanol, l'oléylalcool, le tocophérol ou le cholestérol, et R représente une liaison directe.

Suivant une autre variante avantageuse, les groupements hydrophobes (GH), notamment selon au moins l'une des différentes possibilités susvisées, représentent chacun indépendamment les uns des autres un radical monovalent de formule suivante :

(GH) dans laquelle :

- R représente un méthyle (alanine), isopropyle (valine), isobutyle (leucine), secbutyle (isoleucine), benzyle (phénylalanine) ;

- R ⁶ représente un radical hydrophobe comportant de 6 à 30 atomes de carbone;

- 1 varie de 0 à 6.

Selon une caractéristique remarquable de l'invention, tout ou partie des radicaux hydrophobes R ⁶ des groupements hydrophobes (GH) sont choisis de façon indépendante dans le groupe de radicaux comportant :

• un alcoxy linéaire ou ramifié comportant de 6 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S) et/ou au moins une insaturation, " un alcoxy comportant 6 à 30 atomes de carbone et ayant un ou plusieurs carbocycles annelés et contenant éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S),

• un alcoxyaryle ou un aryloxyalkyle de 7 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins une insaturation et/ou au moins un hétéro- atome (de préférence O et/ou N et/ou S).

En pratique et sans que cela ne soit limitatif, ledit radical hydrophobe R ⁶ est issu d'un précurseur alcoolique choisi dans le groupe comprenant: l'octanol, le dodécanol, le tétradécanol, l'hexadécanol, l'octadécanol, l'oléylalcool, le tocophérol ou le cholestérol.

Avantageusement, la chaîne principale des polyaminoacides polyélectrolytes (PEl, PE2) utilisés dans l'invention est choisie parmi le groupe comprenant les homopolymères d'alpha-L-glutamate, les homopolymères d'alpha-L-glutamique, les homopolymères d'alpha-L- aspartate, les homopolymères d'alpha-L-aspartique, les copolymères d'alpha-L-aspartate/ alpha-L-glutamate et les copolymères d'alpha-L-aspartique/alpha-L-glutamique.

De manière remarquable, la distribution des résidus aspartiques et/ou glutamiques de la chaîne polyaminoacide principale du polymère polyélectrolyte PEl ou PE2 est telle que le polymère ainsi constitué est soit aléatoire, soit de type bloc, soit de type multibloc.

Selon un autre mode de définition, le polymère polyélectrolyte PEl ou PE2 a une masse molaire qui se situe entre 2 000 et 100 000 g/mole, et de préférence entre 5 000 et 40 000 g/mole.

Le degré de polymérisation des premier et second polymères polyélectrolytes (PEl, PE2) est compris entre 50 et 500, de préférence entre 70 et 300.

La fraction molaire des chaînons de la chaîne principale substitués par des groupements hydrophobes est comprise entre 1 et 40 % molaire, de préférence entre 3 et 30 % molaire.

Les polymères utilisés dans la présente invention sont choisis parmi les différentes familles décrites ci-dessus de sorte qu'ils sont globalement cationiques ou anioniques à la valeur de pH égale à pHm. Une caractéristique essentielle du premier polymère polyélectrolyte (PEl) porteur de groupements hydrophobes latéraux, est de pouvoir former spontanément dans l'eau une solution colloïdale.

Sans vouloir être lié par la théorie, on peut avancer que l'association supramoléculaire des groupements hydrophobes pour former des domaines hydrophobes, conduit à la formation de nanoparticules. Chaque nanoparticule est constituée par une ou plusieurs chaînes de polymères PEl plus ou moins condensées autour de ses domaines hydrophobes. Il convient de comprendre que les polymères utilisés dans l'invention contiennent des fonctions ionisables qui sont, selon le pH et la composition, soit neutres

(par exemple -COOH, -NH ₂ ), soit ionisées (par exemple -COO ^" , -NH ₃ ⁺ ). Pour cette raison, la solubilité dans une phase aqueuse est directement fonction du taux de fonctions ionisées et donc du pH. En solution aqueuse, dans le cas de fonctions carboxyliques, le contre-ion peut être un cation métallique tel que le sodium, le calcium ou le magnésium, ou un cation organique tel que la triéthanolamine, le tris(hydroxyméthyl)-aminométhane ou une polyamine telle que la polyéthylèneimine. Le contre-anion des groupements cationiques est de préférence choisi parmi le groupe comprenant un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate.

Connaissant le pH de demi-neutralisation, l'homme de l'art sait ajuster le pH afin que le degré d'ionisation du polymère soit suffisamment élevé et assure la stabilité de la solution colloïdale. Les polyélectrolytes de type polyaminoacide susceptibles d'être utilisés dans la présente invention sont obtenus, par exemple, par des méthodes connues de l'homme de l'art. Les polyaminoacides statistiques peuvent être obtenus par greffage du greffon hydrophobe, préalablement fonctionnalisé par "l'espaceur", directement sur le polymère

par une réaction classique de couplage. Les polyélectrolytes polyaminoacides blocs ou multiblocs peuvent être obtenus par polymérisation séquentielle des anhydrides de N- carboxy-aminoacides (NCA) correspondants.

On prépare par exemple un polyaminoacide, homopolyglutamate, homopolyaspartate ou un copolymère glutamate/aspartate, bloc, multibloc ou aléatoire selon des méthodes classiques.

Pour l'obtention de polyaminoacide de type alpha, la technique la plus courante est basée sur la polymérisation d'anhydrides de N-carboxy-aminoacides (NCA), décrite, par exemple, dans l'article "Biopolymers, 1976, 15, 1869 et dans l'ouvrage de H.R. Kricheldorf "alpha-Aminoacid-N-Carboxy Anhydrides and related Heterocycles" Springer Verlag (1987). Les dérivés de NCA sont de préférence des dérivés NCA-O-Me, NCA-O-Et ou NCA-O-Bz (Me = Méthyl, Et = Ethyle et Bz = Benzyle). Les polymères sont ensuite hydrolyses dans des conditions appropriées pour obtenir le polymère sous sa forme acide. Ces méthodes sont inspirées de la description donnée dans le brevet FR 2 801 226 de la demanderesse. Un certain nombre de polymères utilisables selon l'invention, par exemple, de type poly(alpha-L-aspartique), poly(alpha-L-glutamique), poly(alpha-D-glutamique) et poly(gamma-L-glutamique) de masses variables sont disponibles commercialement. Le polyaspartique de type alpha-bêta est obtenu par condensation de l'acide aspartique (pour obtenir un polysuccinimide) suivie d'une hydrolyse basique (cf. Tomida et al. Polymer 1997, 38, 4733-36).

Le couplage du greffon hydrophobe GH avec une fonction acide du polymère est réalisé aisément par réaction du polyaminoacide en présence d'un carbodiimide comme agent de couplage et optionnellement, un catalyseur tel que la 4-diméthylaminopyridine et dans un solvant approprié tel que le diméthylformamide (DMF), la N-méthylpyrrolidone (NMP) ou le diméthylsulfoxide (DMSO). Le carbodiimide est par exemple, le dicyclohexylcarbodiimide ou le diisopropylcarbodiimide. Le taux de greffage est contrôlé chimiquement par la stœchiométrie des constituants et réactifs ou le temps de réaction. Les greffons hydrophobes fonctionnalisés par un "espaceur" sont obtenus par couplage peptidique classique ou par condensation directe par catalyse acide. Le couplage des groupes cationiques et éventuellement neutres avec une fonction acide du polymère est réalisé simultanément dans une deuxième étape en présence d'un chloroformiate comme agent de couplage et dans un solvant approprié tel que le diméthylformamide, la N-méthylpyrrolidone (NMP) ou le diméthylsulfoxide (DMSO).

Dans le cas où le groupe cationique contient deux fonctions aminés non différenciées chimiquement (e.g. diamine linéaire), il peut être introduit sous une forme dans laquelle une des deux fonctions est protégée. Une dernière étape de clivage du groupement protecteur est alors ajoutée.

La chimie de polymérisation et les réactions de couplage des groupements sont classiques et bien connues de l'homme de l'art (voir par exemples les brevets ou demandes de brevet de la demanderesse cités précédemment).

Pour la synthèse de copolymère bloc ou multibloc, on utilise des dérivés NCA préalablement synthétisé avec le greffon hydrophobe. Par exemple, le dérivé NCA- hydrophobe est copolymérisé avec le NCA-O-Benzyl puis on enlève par hydrolyse sélectivement les groupements benzyliques.

Des exemples d'associations particulièrement préférées de polymères polyélectrolytes (PEl et PE2) selon l'invention sont décrits dans les exemples ci-après.

Une caractéristique essentielle des polymères utilisés dans l'invention est que le premier polymère polyélectrolyte (PEl) est sous forme de solution colloïdale, et que le second polymère polyélectrolyte (PE2) est sous forme de solution ou de solution colloïdale pour au moins une valeur, pHm, du pH comprise entre 3 et 8. Afin de remplir cette condition, le pH de demi-neutralisation du polymère cationique sera suffisamment élevé, par exemple supérieur à 5,5, de préférence supérieur à 6, ou encore supérieur à 8 ; et le pH de demi-neutralisation du polymère anionique sera suffisamment faible, par exemple inférieur à 6,5, de préférence inférieur à 6,0 ou encore inférieur à 5,5. Plus particulièrement, dans une variante selon laquelle le premier polymère polyélectrolyte (PEl) est anionique, ce dernier est choisi de sorte qu'il présente un pH de demi-neutralisation compris entre 3 et 6,5, et de préférence entre 4,5 et 6,5. Selon cette variante, le premier polymère polyélectrolyte (PEl) forme une solution colloïdale pour une valeur pHm du pH comprise entre 6 et 8. Un tel polymère PEl est notamment décrit dans l'exemple la).

Dans ce cas, et selon une première possibilité, le second polymère électrolyte (PE2) est cationique et forme une solution colloïdale à pH inférieur à 8. De préférence, le second polymère polyélectrolyte (PE2) est choisi de sorte que son pH de demi-neutralisation est supérieur à 8. Un tel polymère PE2 est notamment décrit dans l'exemple Id). Ainsi selon cette première possibilité, le premier polymère polyélectrolyte (PEl) forme une solution colloïdale et le second polymère polyélectrolyte (PE2) forme une solution ou une solution colloïdale pour la valeur pHm du pH comprise entre 6 et 8.

Dans ce cas, selon une caractéristique importante de l'invention, le rapport de la masse du premier polymère polyélectrolyte (PEl) à la masse du second polymère polyélectrolyte (PE2) est choisi afin que le rapport de charge Z, rapport du nombre de moles de groupements ionisés cationiques au nombre de moles de groupements ionisés anioniques, mesurés à pHm, soit compris entre 0,25 et 3, et de préférence compris entre 0,25 et 1,5.

Selon une deuxième possibilité, le second polymère polyélectrolyte (PE2) est cationique et forme une solution colloïdale à pH inférieur à 6 et un précipité à pH supérieur à 6,5. De préférence, le second polymère polyélectrolyte (PE2) est choisi de sorte que son pH de demi-neutralisation est compris entre 5,5 et 7. Un tel polymère PE2 est notamment décrit dans l'exemple Ic). Dans ce cas, selon une caractéristique importante de l'invention, le premier polymère polyélectrolyte (PEl) forme une solution colloïdale et le second polymère polyélectrolyte (PE2) forme une solution ou une solution colloïdale pour une valeur du pH, pHm, comprise entre 3 et 6. Le rapport de la masse du premier polymère polyélectrolyte (PEl) à la masse du second polymère polyélectrolyte (P E2) est choisi afin que le rapport de charge Z, mesuré à pHm, soit compris entre 3,5 et 30, de préférence compris entre 5 et 15, et plus préférentiellement encore compris entre 8 et 12.

Dans une autre variante selon laquelle le premier polymère polyélectrolyte (PEl) est cationique, ce dernier est choisi de sorte que son pH de demi-neutralisation est supérieur à 5. Dans ce cas, le second polymère électrolyte (PE2) est anionique et est choisi de sorte que son pH de demi-neutralisation est compris entre 3 et 6,5, et de préférence entre

4,5 et 6,5.

Les particules selon l'invention présentent, à pH physiologique, une taille, mesurée dans un test T, comprise entre 1 et 100 μm.

D'une manière avantageuse, les particules selon l'invention ne sont pas réticulées chimiquement.

Dans une réalisation particulière de l'invention, les particules ont, à pH physiologique, une densité apparente en polymère élevée, comprise entre 0,15 et 1,1, de préférence comprise entre 0,3 et 1 ,0, et plus préférentiellement encore comprise entre 0,5 et 1,0. Une densité en polymère élevée traduit l'existence au sein des particules d'un réseau dense de chaînes polymères. Sans vouloir être lié par la théorie, on peut supposer que ce réseau dense ralentit la diffusion du principe actif (PA) contenu dans les particules selon l'invention vers le milieu extérieur et contribue ainsi à ralentir sa libération. Un aspect surprenant des particules denses selon l'invention est que le réseau de chaînes de polymères qui les constitue permet de ralentir la libération du PA sans pour autant piéger ce même PA au cœur des particules. Ainsi le transporteur selon l'invention permet d'obtenir à la fois une libération prolongée du PA et une bonne biodisponibilité.

Dans certains cas, et en particulier dans le cas de peptides ou de protéines présentant une forte affinité avec les microparticules selon l'invention, il peut être avantageux de moduler la vitesse de libération du principe actif, pour en accélérer la libération, et/ou afin d'améliorer sa biodisponibilité. Après de nombreux essais, il a été démontré par la Demanderesse que la libération de la protéine ou du peptide peut être facilitée lorsque le polymère PEl ou PE2, d'une polarité donnée, est également porteur de

groupements ionisables de la polarité opposée et/ou de groupements non ionisables tels que des groupements substitués par un radical hydroxyéthylamino-.

Ainsi, dans une réalisation particulière de l'invention, l'un des deux polymères PEl ou PE2 comprend simultanément : - de l5 à 50 % molaire de monomères glutamate ;

- de 20 à 55 % molaire de monomères non ionisables tels que des groupements substitués par un radical hydroxyéthylamino- ; de 10 à 40 % molaire de monomères porteurs de groupements cationiques de pH de neutralisation supérieur à 8 ; - de 3 à 15 % molaire de monomères non ionisables substitués par un groupement hydrophobe.

Dans une autre réalisation particulière de l'invention, le polymère PEl ou PE2 est cationique et comprend simultanément : de 0 à 5 % molaire de monomères glutamate ; - de 50 à 85 % molaire de monomères non ionisables tels que des groupements substitués par un radical hydroxyéthylamino- ; de 10 à 40 % molaire de monomères porteurs de groupements cationiques de pH de neutralisation supérieur à 8 ; de 3 à 15 % molaire de monomères non ionisables substitués par un groupement hydrophobe.

Dans une réalisation particulière de l'invention, la concentration totale en polymère (PEl + PE2) contenue dans la formulation est comprise entre 4 et 15 mg/ml, notamment lorsque le principe actif est une protéine thérapeutique. Dans cette gamme de concentration, la formulation est aisément injectable par une aiguille de faible diamètre, par exemple une aiguille de Gauge 27, voire 29, et même 31. Les exemples 3 et 4 décrivent en détails de telles formulations.

Concernant le principe actif, il est de préférence choisi dans le groupe comprenant: les protéines, les glycoprotéines, les protéines liées à une ou plusieurs chaînes polyalkylèneglycol [de préférence polyéthylèneglycol (PEG) : "protéines-PEGylées"], les peptides, les polysaccharides, les liposaccharides, les oligonucléotides, les polynucléotides et leurs mélanges, et, plus préférentiellement encore, dans le sous-groupe des érythroproïétines, telles que l'époétine alpha, l'époétine bêta, la darbépoétine, le raffimère d'hémoglobine, leurs analogues ou leurs dérivés; ocytocine, vasopressine, hormone adrénocorticotropique, facteur de croissance épidermique, facteur de croissance des plaquettes (PDGF), les facteurs stimulants de Phématopoïèse et leurs mélanges, les facteurs sanguins, tels que alteplase, tenecteplase, facteur VιI(a), facteur VII; hémoglobine, les cytochromes, les albumines prolactine, lulibérine (hormone libération de l'hormone lutéinisante ou LHRH)

ou analogues, tels que leuprolide, goséréline, triptoréline, buséréline, nafaréline; antagonistes de la LHRH, les concurrents de la LHRH, les hormones de croissance (GH) humaine, porcine ou bovine, l'hormone de libération de l'hormone de croissance, l'insuline, la somatostatine, le glucagon, les interleukines ou leurs mélanges (IL-2, IL-I l, IL- 12), les interférons, tels que l'interféron alpha, alpha-2b, bêta, bêta- la, ou γ; la gastrine, la tétragastrine, la pentagastrine, l'urogastrone, la sécrétine, la calcitonine, les enképhalines, les endomorphines, les angiotensines, le facteur de libération de la thyrotropine (TRH), le facteur de nécrose tumorale (TNF), le facteur de croissance nerveux (NGF), les facteurs de croissance tels que béclapermine, trafermine, ancestime, le facteur de croissance des kératinocytes, le facteur stimulant les colonies granulocytes (G-CSF), le facteur stimulant les colonies de macrophages granulocytaires (GM-CSF), le facteur stimulant les colonies de macrophages (M-CSF), héparinase, la protéine morphogénique de l'os (BMP), hANP, le peptide ressemblant au glucagon (GLP-I), VEG-F, l'antigène recombinant de l'hépatite B (rHBsAg), la rénine, les cytokines, la bradykinine, les bacitracines, les polymixines, les colistines, la tyrocidine, les gramicidines, l'étanercept, l'imiglucérase, la drotrécogine alpha, les cyclosporines et analogies synthétiques, les modifications et fragments actifs pharmaceutiquement d'enzymes, de cytokines, d'anticorps, d'antigènes et de vaccins, les anticorps tels que rituximab, infiiximab, trastuzumab, adalimumab, omalizumab, tositumomab, efalizumab, et cetuximab. D'autres principes actifs sont les polysaccharides (par exemple, l'héparine) et les oligo- ou polynucléotides, ADN, ARN, iARN, antibiotiques, et cellules vivantes. Une autre classe de principes actifs comprend les substances pharmaceutiques agissant sur le système nerveux central, par exemple, rispéridone, zuclopenthixol, fluphénazine, perphénazine, flupentixol, halopéridol, fluspirilene, quétiapine, clozapine, amisulprid, sulpirid, ziprasidone, etc.

Selon une variante, le principe actif est une petite molécule organique hydrophobe, hydrophile ou amphiphile du type de celles appartenant à la famille des anthracyclines, des taxoïdes ou des camptothécines ou du type de celles appartenant à la famille des peptides telles que la leuprolide ou la cyclosporine et leurs mélanges. Au sens du présent exposé, une petite molécule est notamment une petite molécule non protéinique, par exemple exempte d'acides aminés.

Selon une autre variante, le principe actif est avantageusement choisi parmi au moins l'une des familles de substances actives suivantes : les agents de traitement de l'abus d'alcool, les agents de traitement de la maladie d'Alzheimer, les anesthésiques, les agents de traitement de Pacromégalie, les analgésiques, les antiasthmatiques, les agents de traitement des allergies, les agents anticancéreux, les anti-inflammatoires, les anticoagulants et antithrombotiques, les anti-convulsivants, les antiépileptiques, les antidiabétiques, les antiémétiques, les antiglaucomes, les antihistaminiques, les anti-

infectieux, les antibiotiques, les antifongiques, les antiviraux, les antiparkinsoniens, les anti-cholinergiques, les antitussifs, les inhibiteurs de Panhydrase carbonique, les agents cardiovasculaires, les hypolipémiants, les anti-arythmiques, les vasodilatateurs, les antiangineux, les anti-hypertenseurs, les vasoprotecteurs, les inhibiteurs de cholinestérase, les agents de traitement des désordres du système nerveux central, les stimulants du système nerveux central, les contraceptifs, les promoteurs de fécondité, les inducteurs et inhibiteurs du travail utérin, les agents de traitement de la mucoviscidose, les agonistes des récepteurs de la dopamine, les agents de traitement de l'endométriose, les agents de traitement des dysfonctionnements érectiles, les agents de traitement de la fertilité, les agents de traitements des troubles gastro-intestinaux, les immunomodulateurs et les immunosuppresseurs, les agents de traitement des troubles de la mémoire, les antimigraineux, les relaxants des muscles, les analogues de nucléosides, les agents de traitement de l'ostéoporose, les parasympathomimétiques, les prostaglandines, les agents psychothérapeutiques, les sédatifs, les hypnotiques et tranquillisants, les neuroleptiques, les anxiolytiques, les psychostimulants, les antidépresseurs, les agents de traitements dermatologiques, les stéroïdes et les hormones, les amphétamines, les anorexiques, les anti-douleurs non analgésiques, les anti-épileptiques, les barbituriques, les benzodiazépines, les hypnotiques, les laxatifs, les psychotropes et toutes les associations de ces produits. Selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet un procédé de préparation de particules pour la libération prolongée d'au moins un principe actif, ces particules étant en particulier celles décrites ci-dessus, ledit procédé comprenant les étapes suivantes:

1) la préparation, à une valeur pHm du pH comprise entre 3 et 8, d'une solution colloïdale aqueuse d'un premier polymère polyélectrolyte (PEl) à l'état chargé, porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit premier polymère polyélectrolyte (PEl) étant capable de former spontanément dans l'eau une solution colloïdale de particules à au moins une valeur, pHm, du pH comprise entre 3 et 8;

2) l'ajout d'au moins un principe actif (PA) au premier polymère polyélectrolyte (PEl) obtenu à l'étape 1, ledit principe actif s'associant de façon non covalente aux particules de la solution colloïdale dudit premier polymère polyélectrolyte (PEl);

3) la préparation d'un second polymère polyélectrolyte (PE2) de polarité opposée à celle du premier polymère polyélectrolyte (PEl), ledit second polymère polyélectrolyte (PE2) formant dans l'eau une solution ou une solution colloïdale à au moins ladite valeur, pHm, du pH; à la condition que, si le premier polymère électrolyte (PEl) est un polyaminoacide, alors le

second polymère polyélectrolyte (PE2) n'est ni la polylysine ni la polyéthylène imine;

4) le mélange à pH égal à pHm du premier polymère polyélectrolyte (PEl) sous forme de solution colloïdale de particules auxquelles est associé le principe actif (PA) obtenu à l'étape 2) avec le second polymère polyélectrolyte (PE2) sous forme de solution ou de solution colloïdale obtenu à l'étape 3).

L'invention a également pour objet un procédé de préparation de particules pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), ces particules correspondant en particulier à certaines décrites ci-dessus, comprenant les étapes suivantes:

1) la préparation, à une valeur pHm du pH comprise entre 3 et 8, d'une solution colloïdale aqueuse d'un premier polymère polyélectrolyte (PEl) à l'état chargé, porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit premier polymère polyélectrolyte (PEl) étant capable de former spontanément dans l'eau une solution colloïdale de particules à au moins une valeur, pHm, du pH comprise entre 3 et 8;

2) l'ajout d'au moins un principe actif (PA) au premier polymère polyélectrolyte (PEl) obtenu à l'étape 1, ledit principe actif s'associant de façon non covalente aux particules de la solution colloïdale dudit premier polymère polyélectrolyte (PEl);

3) la préparation d'un second polymère polyélectrolyte (P E2) de polarité opposée à celle du premier polymère polyélectrolyte (PEl), porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit second polymère polyélectrolyte (PE2) formant dans l'eau une solution ou une solution colloïdale à au moins ladite valeur pHm du pH;

4) le mélange à pH égal à pHm du premier polymère polyélectrolyte (PEl) sous forme de solution colloïdale de particules auxquelles est associé le principe actif (PA) obtenu à l'étape 2) avec le second polymère polyélectrolyte (PE2) sous forme de solution ou de solution colloïdale obtenu à l'étape 3).

Une caractéristique essentielle du procédé selon l'invention est de former des particules, spontanément, par simple mélange à pHm d'une solution colloïdale de particules du premier polymère polyélectrolyte (PEl) chargées en principe actif (PA) et d'une solution ou d'une solution colloïdale du second polymère polyélectrolyte (PE2) de polarité opposée.

Les principes actifs tels que des protéines, des peptides ou des petites molécules, peuvent s'associer spontanément au premier polymère (PEl) de type polyaminoacides. Le

chargement des nanoparticules du premier polymère polyélectrolyte (PEl) par le principe actif (PA) s'effectue par simple mélange d'une solution de principe actif (PA) avec une solution colloïdale du premier polymère polyélectrolyte (PEl). Cette association est purement physique et n'implique pas de création de liaison co val ente entre le principe actif (PA) et le polymère (PEl). Sans être lié par la théorie, on peut supposer que cette association non spécifique s'effectue par interaction hydrophobe et/ou électrostatique entre le polymère (PEl) et le principe actif (PA). Il est à noter qu'il n'est pas nécessaire, et souvent même non souhaitable, de lier le PA aux nanoparticules de PEl par des récepteurs spécifiques de nature peptidique ou de type antigène/anticorps ou encore enzyme/substrat. Dans un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, il n'est pas prévu d'étape de réticulation chimique des particules obtenues. Les particules selon l'invention ne sont donc pas réticulées chimiquement et libèrent néanmoins le principe actif (PA) sur une durée prolongée. Cette absence de réticulation chimique est un avantage décisif des particules selon l'invention. En effet, l'absence de réticulation chimique permet d'éviter la dégradation chimique du principe actif (PA) lors de l'étape de réticulation des particules contenant le principe actif (PA). Une telle réticulation chimique est en effet généralement conduite par activations d'entités polymérisables et met en jeu des agents potentiellement dénaturants tel que les rayonnements UV, ou le glutaraldéhyde.

Avantageusement, le procédé selon l'invention comprend une étape de déshydratation de la suspension de particules obtenues (par exemple par lyophilisation ou atomisation), afin de les obtenir sous forme de poudre sèche.

Selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet une formulation pharmaceutique pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), comprenant une suspension aqueuse de particules telles que décrites ci-dessus ou celles obtenues par le procédé décrit ci-dessus.

La présente invention concerne également une formulation pharmaceutique solide pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), comprenant une forme poudre sèche:

• à base de particules contenant au moins un principe actif (PA), ces particules étant celles décrites ci-dessus ou celles obtenues par le procédé décrit ci-dessus;

• ou obtenue à partir de la formulation comprenant une suspension en solution aqueuse évoquée ci-dessus.

Avantageusement, une telle formulation pharmaceutique solide est utilisée pour inhalation et administration pulmonaire. Selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet un procédé de préparation de médicaments, en particulier pour administration parentérale, muqueuse, sous-cutanée, intramusculaire, intradermique, transdermique, intrapéritonéale, intracérébrale ou dans une tumeur, voire par voie orale, nasale, pulmonaire, vaginale ou oculaire, ledit procédé

consistant essentiellement à mettre en œuvre au moins l'une des formulations décrites ci- dessus.

BRèVE DESCRIPTION DES FIGURES

Figure 1: Libération in vitro d'IFN-α à partir des formulations de particules de l'exemple 2 (ronds blancs), de l'exemple 3.1 (triangles noirs), de l'exemple 3.2 (losanges noirs), de l'exemple 3.3 (carrés noirs), de l'exemple 4 (ronds noirs) et de l'exemple 5 (traits).

EXEMPLES

1) Synthèses: a) Synthèse d'un polymère polyélectrolyte PEl-A porteur de groupements hydrophobes, anionique (polyglutamate greffé par l'alpha-tocophérol d'origine synthétique)

On solubilise 15 g d'un acide alpha- L-polyglutamique (de masse équivalente à environ 16900 Da par rapport à un standard en polyoxyéthylène et obtenu par polymérisation de NCA-GIuOMe suivie d'une hydrolyse comme décrits dans la demande de brevet FR-A-2 801 226) dans 288 ml de diméthylformamide (DMF) en chauffant à 80 ⁰ C jusqu'à solubilisation du polymère. On refroidit la solution à 15 ⁰ C et on ajoute successivement 2,5 g de D, L-alpha-tocophérol (> 98 % obtenu de Fluka®) préalablement solubilisé dans 8 ml de DMF, 280 mg de 4-diméthylaminopyridine préalablement solubilisée dans 1 ml de DMF et 1,6 g de diisopropylcarbodiimide préalablement solubilisé dans 6 ml de DMF. Après 3 h sous agitation, le milieu réactionnel est versé dans 1200 ml d'eau contenant 15 % de chlorure de sodium et d'acide chlorhydrique (pH = 2). Le polymère précipité est ensuite récupéré par filtration, lavé par de l'acide chlorhydrique 0,1 N, de l'eau et par de l'éther diisopropylique. Le polymère est ensuite séché à l'étuve sous vide à 40 ⁰ C. On obtient un rendement de l'ordre de 90 %. La masse molaire mesurée par la chromatographie d'exclusion stérique est de 15500 par rapport à un standard polyoxyéthylène. Le taux de tocophérol greffé, estimé par la spectroscopie RMN du proton, est de 5,1 % molaire.

b) Synthèse d'un polymère polyélectrolyte PEl-B anionique (polyglutamate de sodium)

On adapte la synthèse d'un acide alpha-L-polyglutamique comme décrit dans la demande de brevet FR- A-2 801 226.

La masse molaire mesurée par la chromatographie d'exclusion stérique est de 16900 Da par rapport à un standard en polyoxyéthylène.

c) Synthèse d'un polymère polyélectrolyte PE2-A cationique (polyglutamate greffé par l'alpha-tocophérol d'origine synthétique et par de l'histidinamide)

Indices et groupements : m = 11 , p = 209, q = 0, T = D,L-alpha-tocophéryl (T)

3 g d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'alpha-tocophérol racémique sont solubilisés par chauffage à 80 ⁰ C dans 38 ml de NMP. à cette solution refroidie à 0 ⁰ C, sont ajoutés 2,74 g d'isobutyl chloroformiate puis 2,2 mL de N-méthyl morpholine. Le milieu réactionnel est agité 10 min en maintenant la température à 0 ⁰ C. En parallèle, 8,65 g du dichlorhydrate d'histidinamide sont suspendus dans 108 mL de NMP. 10,6 ml de triéthylamine sont ensuite ajoutés et la suspension obtenue est agitée à 20 ⁰ C pendant quelques minutes puis refroidie à 0 ⁰ C. On procède ensuite à l'ajout de la solution de polymère activé sur la suspension d'histidinamide. Le milieu réactionnel est agité pendant 2 h à 0 ⁰ C, puis 1 nuit à 20 ⁰ C. On ajoute ensuite 0,62 mL d'HCl 35 %, puis 83 mL d'eau. On verse ensuite la solution obtenue dans 500 mL d'eau à pH compris entre 3 et 4. La solution est ensuite diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9% NaCl) et 4 volumes d'eau. La solution de polymère est ensuite concentrée jusqu'à un volume de 300 mL (la concentration en polymère est de 18 mg/g). Le pourcentage d'histidinamide greffée, déterminé par RMN ¹ H dans D ₂ O est de 95 %. d) Synthèse d'un polymère polyélectrolyte PE2-B cationique (polyglutamate greffé par l'alpha-tocophérol d'origine synthétique et par de l'arginine)

Indices et groupements : T = D,L-α-tocophéryl, p = s = 11 ,q = 198, r = O

Dix grammes d'un poly( acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'α-tocophérol racémique sont solubilisés dans 125 mL de NMP à 80 ⁰ C. Cette solution est refroidie à 0 ⁰ C, et 8,7 mL de chloroformiate d'ώo-butyle puis 7,35 mL de N-méthyl morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 15 minutes à 0 ⁰ C. En parallèle, 24,67 g de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans 308 mL de NMP et 14,7 mL de triéthylamine sont ajoutés. La suspension obtenue est agitée quelques minutes à 20 ⁰ C puis refroidie à 0 ⁰ C. La suspension laiteuse de polymère activé est alors additionnée à cette suspension, et le mélange réactionnel est agité pendant 2 h à 0 ⁰ C, puis une nuit à 20 ⁰ C. Après ajout de 2,1 mL d'une solution d'HCl 35 % puis 10O mL d'eau, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 1,6 L d'eau. La solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 250 mL. Le pourcentage d'argininamide greffée, déterminé par RMN du proton dans D ₂ O, est de 90 %.

e) Synthèse d'un polymère polyélectrolyte PE2-C cationique (polyglutamate greffé par l'alpha-tocophérol d'origine synthétique, de l'arginine et de l 'éthanolamine)

Indices et groupements : T = D,L-α-tocophérol, p = 11, q = 88, r = 99, s = 22

Dix grammes d'un poly( acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'α-tocophérol racémique sont solubilisés dans 125 mL de NMP à 80 ⁰ C. Cette solution est refroidie à 0 ⁰ C, et 9,1 mL de chloroformiate d'/so-butyle puis 7,71 mL de N-méthyl morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 15 min à 0 ⁰ C. En parallèle, 8,2 g de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans 103 mL de NMP et 9,31 mL de triéthylamine sont ajoutés. On ajoute encore 1,6 mL d'éthanolamine, et la suspension obtenue est agitée quelques minutes à 20 ⁰ C puis refroidie à 0 °C. La suspension laiteuse de polymère activé est alors additionnée à cette suspension, et le mélange réactionnel est agité pendant 2 h à 0 ⁰ C. On ajoute 1,2 mL d'éthanolamine, puis agite une nuit à 20 ⁰ C. Après ajout de 2,1 mL d'une solution d'HCl 35 % puis 200 mL d'eau, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 700 mL d'eau, tout en ajustant le pH vers 7,4. La solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 250 mL. Les pourcentages d'argininamide et d'éthanolamine greffées, déterminés par RMN du proton dans D ₂ O, sont respectivement de 40 et 45 %.

f) Synthèse d'un polymère polyélectrolyte PE2-D cationique (poly glutamate greffé par l'alpha-tocophérol d'origine synthétique, de l'arginine et de l'éthanolamine)

Indices et groupements : T = D,L-α-tocophérol, p = 11, q = 48, r = 150, s = 11

Dix grammes d'un poly( acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'α-tocophérol racémique sont solubilisés dans 125 mL de NMP à 80 ⁰ C. Cette solution est refroidie à 0 ⁰ C, et 8,7 mL de chloroformiate d'/so-butyle puis 7,3 mL de N-méthyl morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 15 min à 0 ⁰ C. En parallèle, 4,61 g de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans 58 mL de NMP et 2,9 mL de triéthylamine sont ajoutés. On ajoute encore 2,8 mL d'éthanolamine, et la suspension obtenue est agitée quelques minutes à 20 ⁰ C puis refroidie à 0 ⁰ C. La suspension laiteuse de polymère activé est alors additionnée à cette suspension, et le mélange réactionnel est agité pendant 4 h à 0 ⁰ C. On ajoute 1,2 mL d'éthanolamine, puis agite une nuit à 20 ⁰ C. Après ajout de 2,1 mL d'une solution d'HCl 35 %, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 730 mL d'eau, tout en ajustant le pH vers 7,4. La solution obtenue est diaflltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 300 mL. Les pourcentage d'argininamide et d'éthanolamine greffées, déterminés par RMN du proton dans D ₂ O, sont respectivement de 22 et 68 %

2) Exemple 1 (comparatif): préparation de particules avec des polyélectrolytes ne présentant pas de groupement hydrophobe

(1) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PEl-B:

On utilise le polymère PEl-B obtenu selon la synthèse b) ci-dessus. Ce polymère a un pH de demi-neutralisation égal à 5,985. Une solution colloïdale de polymère PEl-B est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH à 7,63 par ajout d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la solution est ajustée à 100 mOsm en introduisant la quantité nécessaire d'une solution aqueuse de NaCl. La concentration en polymère PEl-B est ajustée à 8,38 mg/g.

(2) Association de la protéine au polymère PEl-B:

On ajoute à la solution colloïdale de polymère PEl-B précédente de la protéine IFN-α concentrée à 2,4 mg/g. On obtient l'association ayant les caractéristiques suivantes :

L'association est réalisée pendant une nuit à 25 ⁰ C, sous agitation.

(3) Préparation d'une solution colloïdale de poly-L-arginine (Aldrich P7637):

Ce polymère a un pH de demi-neutralisation supérieur à 9. Une solution colloïdale de poly-L-arginine est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant premièrement le pH à 0,92 avec une solution de HCl, puis en le remontant à pH égal à 6,91 avec une solution de NaOH et en chauffant la solution à 45 ⁰ C pendant 15 min. La concentration en polymère poly-L-arginine est ajustée à 5,13 mg/g.

(4) Mélange pour obtenir les particules

On ajoute goutte à goutte sous agitation 1,37 g de la solution de poly-L-arginine sur 1,06 g de la solution de IFN-α/PEl-B, à 45 ⁰ C. On agite 15 min à 45 ⁰ C. Puis, on agite une nuit à 4 ⁰ C.

Le tableau I ci-dessous regroupe les caractéristiques des particules obtenues:

Le rapport de charge Z est le rapport du nombre de moles de groupements ionisés cationiques au nombre de moles de groupements ionisés anioniques, mesurés à pHm égal à 6,95. La taille des particules est mesurée selon le test T.

Tableau I

(5) Quantification de l'encapsulation de la protéine

On centrifuge la suspension 15 min à 8000 rpm et on dose l'IFN-α dans le surnageant par la méthode décrite dans la Pharmacopée européenne (dosage colorimétrique par absorbance UV).

Presque un tiers de la protéine introduite n'est pas encapsulé dans les microparticules formées. Cette proportion ne peut conduire à une libération contrôlée.

3) Exemple 2 : préparation de particules avec un seul polyélectrolyte (PEl) présentant des groupements hydrophobes

(1) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PEl-A: On utilise le polymère PEl-A obtenu selon la synthèse a) ci-dessus. Ce polymère a un pH de demi-neutralisation égal à 5,445.

Une solution colloïdale de polymère PEl-A est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH à 7,53 par ajout d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la solution est ajustée à 101 mOsm en introduisant la quantité nécessaire d'une solution aqueuse de NaCl. La concentration en polymère PEl-B est ajustée à 8,41 mg/g.

(2) Association de la protéine au polymère PEl-A:

On ajoute à la solution colloïdale de polymère PEl-A précédente de la protéine IFN-α concentrée à 2,4 mg/g. On obtient l'association ayant les caractéristiques suivantes :

L'association est réalisée pendant une nuit à 25°C, sous agitation.

(3) Préparation d'une solution colloïdale de poly-L-arginine (Aldrich P7637): On prépare la solution de façon identique à celle décrite dans l'exemple 1.

(4) Mélange pour obtenir les particules

On ajoute goutte à goutte sous agitation 1,24 g de la solution de poly-L-arginine sur 1,07 g de la solution de IFN-α/PEl-A, à 45 ⁰ C. On agite 15 min à 45°C. Puis, on agite une nuit à 4 ⁰ C.

Le tableau II ci-dessous regroupe les caractéristiques des particules obtenues:

Le rapport de charge Z est mesuré à pHm égal à 6,88. La taille des particules est mesurée selon le test T.

Tableau II

(5) Quantification de Pencapsulation de la protéine

On centrifuge la suspension 15 min à 8000 rpm et on dose PIFN-α dans le surnageant par la méthode décrite dans la Pharmacopée européenne (dosage colorimétrique par absorbance UV).

La totalité de la protéine introduite est encapsulée dans les microparticules formées.

4) Exemple 3: préparation de particules à base de PEl-A et de PE2-A, contenant de l'IFN-a

4.1) Exemple 3.1 : concentration finale en polymère environ égale à 10 mg/g, Z étant égal à 1 environ

(1) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PEl-A:

On utilise le polymère PEl-A obtenu selon la synthèse a) ci-dessus. Ce polymère a un pH de demi-neutralisation égal à 5,445.

Une solution colloïdale de polymère PEl-A est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH à 7,45 par ajout d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la solution est ajustée à 108 mOsm en introduisant la quantité nécessaire d'une solution aqueuse de NaCl. La concentration en polymère PEl est ajustée à 23,88 mg/g.

(2) Association de la protéine au polymère PEl-A:

On ajoute à la solution colloïdale de polymère PEl-A précédente de la protéine IFN-α concentrée à 2,4 mg/g et du NaCl à 89 mOsm. On obtient l'association ayant les caractéristiques suivantes :

L'association est réalisée pendant une nuit à 25 ⁰ C, sous agitation. L'association est ensuite ajustée à pH égal à 5,07.

(3) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PE2-A:

On utilise le polymère PE2-A obtenu selon la synthèse c) ci-dessus. Ce polymère a un pH de demi-neutralisation égal à 6,05.

Une solution colloïdale de polymère PE2-A est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH à 5,17. L'osmolarité de la solution est ajustée à 289 mOsm et la concentration en polymère PE2-A est ajustée à 5,70 mg/g.

(4) Mélange pour obtenir les particules

On ajoute goutte à goutte sous agitation 4,98 g de la solution de PE2-A sur 4,61 g de la solution de IFN-α/PEl-A. On agite une nuit à 4 ⁰ C.

Le tableau III ci-dessous regroupe les caractéristiques des particules obtenues:

Le rapport de charge Z est mesuré à pHm égal à 5,17.

La taille des particules est mesurée selon le test T.

Tableau III

4.2) Exemple 3.2: concentration finale en polymère égale à 5 mg/g, Z étant égal à 10 environ

(1) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PEl-A :

On utilise le polymère PEl-A obtenu selon la synthèse a) ci-dessus. Une solution colloïdale de polymère PEl est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH à 7,52 par ajout d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la solution est ajustée à 108 mOsm en introduisant la quantité nécessaire d'une solution aqueuse de NaCl. La concentration en polymère PEl est ajustée à 20,21 mg/g.

(2) Association de la protéine au polymère PEl-A :

On ajoute à la solution colloïdale de polymère PEl-A précédente de la protéine IFN-α concentrée à 2,4 mg/g et du NaCl à 89 mOsm. On obtient l'association ayant les caractéristiques suivantes :

L'association est réalisée pendant une nuit à 25 ⁰ C, sous agitation. L'association est ensuite ajustée à pH égal à 4,88.

(3) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PE2-A : On utilise le polymère PE2-A obtenu selon la synthèse c) ci-dessus. Une solution colloïdale de polymère PE2-A est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH à 5,07. L'osmolarité de la solution est ajustée à 287 mOsm et la concentration en polymère PE2-A est ajustée à 8,11 mg/g.

(4) Mélange pour obtenir les particules :

On ajoute goutte à goutte sous agitation 5,19 g de la solution de PE2-A sur 5,02 g de la solution de IFN-α/PEl-A. On agite une nuit à 4 ⁰ C.

Le tableau IV ci-dessous regroupe les caractéristiques des particules obtenues:

Le rapport de charge Z est mesuré à pHm égal à 4,81. La taille des particules est mesurée selon le test T.

Tableau IV

4.3) Exemple 3.3: concentration finale en polymère égale à 10 mg/g, Z étant égal à 10 environ

(1) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PEl-A : On utilise le polymère PEl-A obtenu selon la synthèse a) ci-dessus.

Une solution colloïdale de polymère PEl-A est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH à 7,52 par ajout d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la solution est ajustée à 108 mOsm en introduisant la quantité nécessaire d'une solution aqueuse de NaCl. La concentration en polymère PEl-A est ajustée à 20,21 mg/g.

(2) Association de la protéine au polymère PEl-A :

On ajoute à la solution colloïdale de polymère PEl-A précédente de la protéine IFN-α concentrée à 2,4 mg/g et du NaCl à 89 mOsm. On obtient l'association ayant les caractéristiques suivantes :

L'association est réalisée pendant une nuit à 25 ⁰ C, sous agitation. L'association est ensuite ajustée à pH égal à 5,07.

(3) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PE2-A : On utilise le polymère PE2-A obtenu selon la synthèse c) ci-dessus.

Une solution colloïdale de polymère PE2-A est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH à 5,08. L'osmolarité de la solution est ajustée à 288 mOsm et la concentration en polymère PE2-A est ajustée à 16,37 mg/g.

(4) Mélange pour obtenir les particules :

On ajoute goutte à goutte sous agitation 5,25 g de la solution de PE2-A sur 5,19 g de la solution de IFN-α/PEl-A. On agite une nuit à 4 ⁰ C.

Le tableau V ci-dessous regroupe les caractéristiques des particules obtenues:

Le rapport de charge Z est mesuré à pHm égal à 4,95. La taille des particules est mesurée selon le test T.

Tableau V

S) Exemple 4 : préparation de particules à base de PEl-A et de PE2-B, contenant de

I 'IFN- a, concentration finale en polymère égale à 5 mg/g, Z = I

(1) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PEl-A : On utilise le polymère PEl-A obtenu selon la synthèse a) ci-dessus.

Une solution colloïdale de polymère PEl-A est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH à 7,52 par ajout d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la solution est ajustée à 108 mOsm en introduisant la quantité nécessaire d'une solution aqueuse de NaCl. La concentration en polymère PEl-A est ajustée à 20,21 mg/g.

(2) Association de la protéine au polymère PEl-A :

On ajoute à la solution colloïdale de polymère PEl-A précédente de la protéine IFN-α concentrée à 2,4 mg/g et du NaCl à 89 mOsm. On obtient l'association ayant les caractéristiques suivantes :

L'association est réalisée pendant une nuit à 25 ⁰ C, sous agitation. L'association est ensuite ajustée à pH égal à 6,89.

(3) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PE2-B :

On utilise le polymère PE2-B obtenu selon la synthèse d) ci-dessus. Ce polymère a un pH de neutralisation supérieur à 9.

Une solution colloïdale de polymère PE2-B est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH à 6,98. L'osmolarité de la solution est ajustée à 288 mOsm et la concentration en polymère PE2-B est ajustée à 6,33 mg/g.

(4) Mélange pour obtenir les particules :

On ajoute goutte à goutte sous agitation 4,06 g de la solution de PE2-B sur 4,59 g de la solution de IFN-α/PEl-A. On agite une nuit à 4 ⁰ C.

Le tableau VI ci-dessous regroupe les caractéristiques des particules obtenues:

Le rapport de charge Z est mesuré à pHm égal à 6,85. La taille des particules est mesurée selon le test T.

Tableau VI

6) Exemple 5 (comparatif) : préparation de particules à base de PEl-A seul, contenant de VIFN a

On utilise le polymère PEl-A obtenu selon la synthèse a) ci-dessus. Une solution colloïdale de polymère PEl-A est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH à 7,52 par ajout d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la solution est ajustée à 108 mOsm en introduisant la quantité nécessaire d'une solution aqueuse de NaCl. La concentration en polymère PEl-A est ajustée à 29,05 mg/g.

On ajoute à la solution colloïdale de polymère PEl précédente de la protéine IFN-α concentrée à 2,4 mg/g. L'association est réalisée pendant une nuit à 25 ⁰ C, sous agitation.

Le tableau VII ci-dessous regroupe les caractéristiques des particules obtenues: La taille des particules est mesurée selon le test T'.

Tableau VII

7) Résultats in vitro pour les exemples 2, 3, 4 et 5

Pour cela, on mesure la libération du principe actif à partir des particules selon l'invention en utilisant le test L.

La figure 1 montre la libération dans le test L sous la forme du pourcentage de protéine libérée au cours du temps.

La formulation de l'exemple comparatif 2 où un seul des polymères est porteur de groupements hydrophobes présente un profil de libération très faible, avec 1 ,6 % de la protéine libérée au bout de 23 h.

La formulation de l'exemple comparatif 5, contenant 23 mg/g de particules de PEl présente un profil similaire aux particules de l'exemple 3.1 (PE1/PE2-A, Z=I à 10 mg/g)

(respectivement 93 % en 10 h et 72 % en 48 h).

Dans le cas des particules des exemples 3.2 (PE1/PE2-A, Z = 10 et 5 mg/g) et 3.3

(PE1/PE2-A, Z = 10 et 10 mg/g), on observe la création d'un flux constant de libération, qui n'est pas nul à la fin de l'expérience : respectivement 65 et 19 % de la protéine injectée en 48 h.

Dans le cas des particules de l'exemple 4 (PE1/PE2-B, Z = 1 et 5 mg/g), on observe la création d'un flux constant de libération, qui n'est pas nul à la fin de l'expérience, avec une libération de 7 % de la protéine injectée en 48 h.

8) Résultats in vivo pour les exemples 3, 4 et 5

44 rats ont été séparés en 5 groupes de 8 ou 12 animaux et ont reçu en parallèle une formulation à libération immédiate IR ou une formulation à libération prolongée correspondant à l'exemple comparatif 5 ou une des formulations des exemples de l'invention 3 et 4, à la dose de 300 μg/kg.

Les résultats pharmacocinétiques sont regroupés dans le tableau VIII ci-dessous:

Tableau VIII

C _max représente la concentration plasmatique maximale moyenne en protéine sur l'ensemble des animaux.

T _max médian représente la médiane du temps pour lequel la concentration plasmatique passe par son maximum. AUC représente l'aire moyenne sous la courbe de la concentration plasmatique en fonction du temps.

T50% _AUC représente le temps moyen au bout duquel l'aire sous la courbe atteint 50 % de sa valeur totale.

RBA représente le rapport de l'aire sous la courbe de la formulation considérée à l'aire sous la courbe de la formulation IFN IR.

Toutes les formulations présentent un profil de libération prolongée accompagné d'une baisse du C _max par rapport à l'IR.

A l'exception de la formulation de l'exemple 3.1 (PE1/PE2-A, Z=I à 10 mg/g) dont le profil de libération est proche de celle de la formulation de l'exemple comparatif 5, la pente terminale est plus faible, ce qui indique une absorption résiduelle prolongée.

On notera pour la formulation de l'exemple 3.3 (PE1/PE2-A, Z = 10 et 10 mg/g) une libération jusqu'à plus d'une semaine.

9) Exemple 6 : préparation de particules à base de PEl-A et de PE2-C, contenant de l'IFN-a, concentration finale en polymère égale à 5 mg/g, Z = I

(1) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PEl-A

On utilise le polymère PEl-A obtenu selon la synthèse a) ci-dessus. Une solution colloïdale de polymère PEl-A est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH à 7,15 par ajout d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la solution est ajustée à 145 mOsm en introduisant la quantité nécessaire d'une solution aqueuse de NaCl. La concentration en polymère PEl-A est ajustée à 3,10 mg/g.

(2) Association de la protéine thérapeutique au polymère PEl-A : On ajoute à la solution colloïdale de polymère PEl-A précédente de la protéine IFN-α concentrée à 2,7 mg/g. On obtient l'association ayant les caractéristiques suivantes :

L'association est réalisée pendant une nuit à 25°C, sous agitation. L'association est ensuite ajustée à pH égal à 7,0.

(3) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PE2-C:

On utilise le polymère PE2-C obtenu selon la synthèse e) ci-dessus. Une solution colloïdale de polymère PE2-C est obtenue en diluant et en ajustant le polymère PE2-C à pH 7,04, 288 mOsm et 7,96 mg/g dans du PBS 140 mOsm.

(4) Mélange pour obtenir les particules :

On ajoute goutte à goutte sous agitation 15,147 g de la solution de PE2-C sur 16,374 g de la solution de IFN-α/PEl-A. On agite une nuit à 4 ⁰ C.

Le rapport de charge Z est mesuré à pHm égal à 7. La taille des particules est mesurée selon le test T. Le tableau ci-dessous regroupe les caractéristiques des particules obtenues :

10) Exemple 7 : préparation de particules à base de PEl-A et de PE2-D, contenant de l'IFN-a, concentration finale en polymère égale à 5 mg/g, Z = 1

(1) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PEl-A : On utilise le polymère PEl-A obtenu selon la synthèse a) ci-dessus. Une solution colloïdale de polymère PEl-A est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH à

7,02 par ajout d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la solution est ajustée à 101 mOsm en introduisant la quantité nécessaire d'une solution aqueuse de NaCl. La concentration en polymère PEl-A est ajustée à 2.0 mg/g.

(2) Association de la protéine au polymère PEl-A :

On ajoute à la solution colloïdale de polymère PEl-A précédente de la protéine IFN-α concentrée à 2,7 mg/g. On obtient l'association ayant les caractéristiques suivantes :

L'association est réalisée pendant une nuit à 25 ⁰ C, sous agitation. L'association est ensuite ajustée à pH égal à 7,0.

(3) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PE2-D: On utilise le polymère PE2-D obtenu selon la synthèse f) ci-dessus. Une solution colloïdale de polymère PE2-D est obtenue en diluant le polymère PE2-D dans de l'eau et en ajustant à pH 7avec HCl 0,1 N ou NaOH 0,1 N. La concentration en polymère PE2-D est ajustée 8,82 mg/g.

(4) Mélange pour obtenir les particules :

On ajoute goutte à goutte sous agitation 1,2 g de la solution de PE2-D sur 1,2 g de la solution de IFN-α/PEl-A. On agite une nuit à 4 ⁰ C.

Le rapport de charge Z est mesuré à pHm égal à 7. La taille des particules est mesurée selon le test T. Le tableau ci-dessous regroupe les caractéristiques des particules obtenues :

11) Exemple 8 : (comparaison) vitesse de libération des particules à base PE1-A/PE2-D et de PE1-A/PE2-C contenant de l'IFN-a.

Les particules obtenues par les préparations décrites dans les exemples 6 et 7 ci-dessus sont comparées dans le test L de libération en cellule à flux continu décrit plus haut. Le tableau ci-dessous regroupe les résultats obtenus :

En conclusion, cet exemple montre qu'il est possible, notamment en sélectionnant un polymère cationique contenant plus ou moins de groupements neutres et/ou anioniques, de moduler la vitesse de libération du PA. Ainsi, à 12 h, la libération est de 9,5 % pour les microparticules obtenues à partir du polymère PE2-C et de 31 % pour les microparticules obtenues à partir du PE2-D.