INFECCIOSOS USANDO DICHO KIT

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a un kit de diagnóstico de fundamento molecular, de uso sencillo, para la detección de secuencias nucleotídicas de ADN, ADN copia y/o ARN de agentes patógenos ya sean de origen protozoario, virósico o bacteriológico, o bien para la detección de secuencias transgénicas o de un propio genoma que no requiere aislamiento previo del ADN o ARN que se pretende detectar. Asimismo, el kit es capaz de detectar la secuencia de interés en gran variedad de matrices, tales como tejidos y/o muestras animales o vegetales, tales como insectos, orina, sangre, suero, lágrimas, mucus, hojas, tallos, etc.

ANTECEDENTES

En la actualidad, la mayoría de los métodos de detección de secuencias transgénicas o de un propio genoma son de base molecular, o bien indirectos por evaluación de una función o rasgo fenotípico adquiridos, perdidos o modificados. Por otro lado, los métodos de diagnóstico de infecciones disponibles en el mercado son de fundamento serológico; es decir que se basan en la detección de anticuerpos, producidos por el organismo infectado en respuesta a la presencia del agente infeccioso. Dichos métodos tienen una sensibilidad del 84-98% y presentan una gran variación también en la especificidad, el costo y/o en la complejidad operativa. Los métodos serológicos actuales no son efectivos para casos de infecciones humanas congénitas hasta pasados aproximadamente los 9 meses de edad, pues detectan anticuerpos presentes en el caudal sanguíneo, pudiendo estos ser anticuerpos maternos que han pasado a través de la placenta independientemente de que el agente infeccioso haya sido o no transmitido al neonato. Diversos estudios demuestran que 9 meses es un tiempo suficiente para asegurar la eliminación de los anticuerpos maternos transferidos durante el embarazo.

Los métodos serológicos también pueden presentar comportamiento anómalo en personas inmunocomprometidas, cuya respuesta inmune está alterada.

Otra condición en que los métodos serológicos no resultan efectivos es en el seguimiento de una infección durante y posterior a un tratamiento, pues el agente infeccioso puede haber sido eliminado pero la reacción seguirá dando positiva mientras se conserven los anticuerpos contra dicho agente, en cualquier muestra en donde pueda haber anticuerpos.

Este es el inconveniente de diagnosticar infecciones a través de los anticuerpos que generan: la demora entre la eliminación del foco infeccioso y la eliminación de los anticuerpos.

Por estas limitaciones para casos de infecciones congénitas o en personas inmunocomprometidas, donde hay altas probabilidades de obtener falsos resultados, se recurre a otras técnicas, tales como las detalladas a continuación. i) El cultivo selectivo, técnica costosa, que insume tiempo, reviste riesgos biológicos como el manipuleo de muestras del patógeno, su conservación y su cultivo ampliando la población del patógeno, por lo tanto, la cantidad de agentes infecciosos, y presenta, además, una sensibilidad muy variable. ii) Para algunos tipos de agentes infecciosos, se recurre a la observación al microscopio en forma directa o mediante un enriquecimiento por concentración, técnicas que tienen una sensibilidad muy variable dependiendo del agente, la carga infecciosa, la localización del agente, el tipo de muestra, la habilidad del/a operador/a, etc. iii) Métodos moleculares, como el del presente invento, que se basan en la detección del material genético del patógeno. La técnica de amplificación por medio de la reacción en cadena de la polimerasa “PCR” (por sus siglas en inglés: “Polymerase Chain Reaction") y sus variantes“Nested PCR” y“Real Time - PCR” son consideradas más sensibles y específicas que las mencionadas anteriormente. Sin embargo, por sus características intrínsecas, esta técnica requiere de infraestructura y equipamientos complejos, así como de recursos humanos calificados.

El tipo de equipamiento que se requiere para los métodos moleculares de ciclado se han ido sofisticando, por lo cual mejoran su sensibilidad a costa de volverse más costosos, tanto en la adquisición de equipamiento como en su mantenimiento y, en muchos casos, de presentar vida media útil más corta. Por otro lado, muchos de los métodos de detección por PCR y técnicas relacionadas son“in house" y requieren de la manipulación de varios reactivos o bien de la preparación, también“in house”, de mezclas cuya estabilidad es variable y/o indefinida y, por lo tanto, no pueden ser almacenadas, por lo que una vez preparadas deben usarse a corto plazo. Todas estas preparaciones deben realizarse en ambientes controlados para evitar la contaminación con amplicones de reacciones anteriores y requieren del uso experto de micropipetas calibradas, tips con filtros, etc., por parte de personal especialmente calificado para tal fin. Aún bajo condiciones controladas, existe el riesgo de contaminación lo que exige suspender las reacciones, descartar los reactivos contaminados, descontaminar el área y reiniciar las tareas de preparación y amplificación. Por todo esto, dado el costo y la complejidad general y los riesgos de pérdida de sensibilidad por descalibrado de equipo y pipetas o la aparición de falsos positivos por contaminación, su aplicación queda restringida, en general, a pocos laboratorios de diagnóstico y/o investigación.

En el arte previo existen kits de diagnóstico que detectan fragmentos de cierta longitud de ADN o de ADN copia o de ARN por medio de una tecnología similar a la de esta invención: el uso de una enzima polimerasa que no requiere del cambio sucesivo de temperatura para poder progresar en la reacción.

La patente US 5830714 A de Molecular Biology Resources, Inc. divulga un “Fragmento biológicamente activo de ADN polimerasa de Bacillus stearothermophilus " y se trata de un ADN aislado y purificado que codifica un fragmento biológicamente activo de una enzima termoestable de Polimerasa I de ADN de longitud completa del Bacillus stearothermophilus. Más específicamente se refiere a un ADN que codifica una polimerasa de ADN de aproximadamente 66.000 daltons, a la que le faltan 273 aminoácidos del extremo N-terminal de la ADN Polimerasa I del B. stearothermophilus de aproximadamente 96.000 daltons, y a la proteína codificada por la misma que ha sido designada como fragmento de ADN Polimerasa I del B. stearothermophilus. Dicho fragmento de la enzima es útil en la secuenciación de ADN, preparaciones de ADN copia, amplificación por desplazamiento de hebra y otras aplicaciones de biología molecular. La patente US 8993298 B1 de New England Biolabs, Inc. y otros, divulga “Polimerasas de ADN”, y en este documento se describen proteínas novedosas con actividad de ADN polimerasa cuya capacidad de síntesis supera a la Bst Polimerasa I presentando, por ejemplo, una mayor actividad de transcriptasa inversa.

La patente CN 102925548 B de la Universidad Sichuan Agriculture y otro, divulga un“Kit de LAMP de Actinobacillus pleuropneumonia y su método de uso”, en donde se describe un kit para detectar A. faecalis, un agente infeccioso porcino y su método de uso. El kit contiene 8 U/mI de Bst ADN polimerasa 50 mI; 125 mI de Bst ADN polimerasa tampón; 0,1 mol/litro de Mg SÜ4 100 mI; 12,5 mmol/litro betaína 100 mI; 17,5 mmol/litro de dNTP 100 mI. Dicho kit puede detectar una pequeña cantidad de múltiples serotipos de A. pneumoniae en un recipiente a temperatura constante de 63 a 64 °C. Este método si bien no requiere equipos de ciclado aun requiere del dispensado de varios reactivos implicando el manejo de pipetas y sus tips. Además, el uso del kit implica un paso de purificación -que tiene la ventaja de ser simple- del ADN que se utilizará como templado. Aún con estas exigencias, se propone como un kit que puede satisfacer la necesidad de realizar pruebas in situ de bacilos porcinos ampulares infecciosos. Se puede utilizar para cuarentenas de importación y exportación, departamentos de higiene de alimentos, granjas de cría de animales. También puede utilizarse para pruebas in situ, especialmente adecuadas para el campo y la detección en tiempo real de Actinobacillus pleuropneumoniae en trabajadores de base veterinaria de cerdo.

RESUMEN DEL PRESENTE INVENTO La presente invención se refiere a un kit de diagnóstico de fundamento molecular, de uso extremadamente sencillo, para la detección de fragmentos de ADN y/o ARN de agentes patógenos ya sean de origen protozoario, virósico o bacteriológico, o bien de secuencias nucleotídicas, por ejemplo transgenes, alelos, o secuencias no codificantes; los templados funcionales para la amplificación molecular son secuencias nucleotídicas de cierta longitud, de ADN, ADN copia y ARN, independientemente de su grado de pureza, provenientes de distintas matrices biológicas del tipo orina, sangre, suero, lágrimas, mucus, hoja, etc.

A diferencia del arte previo, inesperadamente se ha logrado, con la presente invención, detectar con alta sensibilidad secuencias nucleotídicas de ADN, ADN copia y ARN sin necesidad de preparaciones previas o de aislamiento del material genético, ni de uso de un ciclador térmico para dar lugar a la reacción de multiplicación de los amplicones seleccionados, así como tampoco de pipetas y sus tips durante el uso del kit.

Este kit simplifica sustancialmente la detección de agentes patógenos o la presencia de secuencias nucleotídicas transgénicas, alélicas o no codificantes, conservando una alta sensibilidad adecuada para tal fin. La presentación del kit permite su uso directo, pues no requiere preparación previa de sus componentes ya que se coloca la muestra directamente sobre papel de filtro o tubo de reacción, ni equipamientos de laboratorio tal como termociclador, equipo de revelado o de lectura del resultado, ni de instrumentos de laboratorio, por ejemplo pipetas, así como tampoco de la adición de múltiples componentes, porque se han desarrollado mezclas de reactivos para detectar directamente los fragmentos de ADN o ADN copia sobre la muestra aún sin purificar. Tanto la formulación de las mezclas como su presentación les permiten mantenerse estables en condiciones refrigeradas a 2 - 8 grados (heladera común) por períodos de al menos 18 meses.

El presente kit responde a la necesidad concreta de la detección, sensible y específica, de un agente infeccioso o un transgén o un alelo o secuencia no codificante particular de interés, en cualquier tipo de muestra biológica, incluyendo especialmente casos de recién nacidos y personas inmunocomprometidas, de uso simple y factible en cualquier condición de infraestructura y de equipamiento, así como ideal para utilizar en condiciones de campo.

El presente kit usa un método que se basa en una amplificación isotérmica del templado nucleotídico en estudio mediante la técnica de“Loop Mediated Isothermal Amplification” (LAMP), desarrollada por Notomi y colaboradores (2000). Ver la patente US 6410278, Notomi T. y Hase T., "Process for synthesizing nucleic acid", publicada el 25 de junio de 2002. Esta técnica ya ha sido aplicada con éxito en diversos países para el diagnóstico de diferentes patologías tales como SIDA y Malaria, en la mayoría de los casos, mediante reactivos“in house". Se trata de una reacción isotérmica, por lo que no requiere de equipamientos complejos, sino de algún dispositivo térmico de cualquier tipo.

El método de detección de la presente invención es extremadamente específico y sensible pero también robusto y de uso extremadamente simple, por lo que no requiere equipamiento ni infraestructura compleja ni recursos humanos altamente calificados, por lo que se enmarca dentro de los diagnósticos“POC” (acrónimo del inglés:“Point of Care"). El kit de la presente invención, además, está especialmente orientado para resolver problemas de detección de secuencias de ácidos nucleicos en muestras donde los métodos serológicos no pueden aplicarse o no son suficientemente sensibles, como aquellas provenientes de pacientes inmunocomprometidos y neonatos.

La obtención de la muestra y su adaptación para utilizarla como templado molecular es extremadamente simple. Una gran innovación de este kit es que una muestra biológica del tipo sangre, lágrima, orina, etc., es dispuesta directamente en el tubo de reacción, con o sin dilución adicional, o es previamente dispensada en un soporte, por ejemplo un papel de filtro, y es introducida directamente en la reacción de amplificación sin pasos previos de purificación, evitándose de esta manera complejos pasos que implican un mayor tiempo para obtener el resultado, riesgo de perder o contaminar la muestra biológica en el proceso, la necesidad de contar con un laboratorio con cierto grado de complejidad y recursos humanos calificados así como mayores costos.

OBJETIVOS DEL PRESENTE INVENTO

Un objetivo del presente invento es proporcionar un kit sensible y específico de uso extremadamente sencillo para la detección de fragmentos de ADN o ADN copia o ARN de agentes patógenos, transgenes, alelos o secuencias no codificantes de interés, sin requerir preparación previa de aislamiento del material nucleotídico. Otro objetivo del presente invento es proporcionar un kit que no requiere del uso de pipetas automáticas, tips o de cicladores térmicos ni otros equipamientos sofisticados de laboratorio.

Otro objetivo del presente invento es proporcionar un kit de uso sencillo para la detección de fragmentos de ADN, ADN copia o ARN que permita ser utilizado en “POC” (acrónimo del inglés:“Point of Care’), en el campo y fuera de laboratorios con gran instrumental.

Otro objetivo del presente invento es proporcionar un kit de uso sencillo para la detección de fragmentos de ADN, ADN copia o ARN, donde la mezcla de reactivos presente los mismos o mayores niveles de sensibilidad que los actuales sistemas de extracción y amplificación de muestras.

Otro objetivo del presente invento es proporcionar un kit de uso sencillo para la detección de fragmentos de ADN, ADN copia o ARN cuyas mezclas de reactivos presentan formulaciones que permiten mantenerse estables en condiciones refrigeradas por períodos de al menos 18 meses.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 muestra la sensibilidad analítica del kit dirigido a detectar a Trypanosoma cruzi, el agente causal de la enfermedad de Chagas con ADN genómico purificado. La Figura 2 muestra el límite del kit de Chagas en muestras de sangre sin purificar. La Figura 3 muestra la especificidad analítica del kit con ADN de las seis DTUs de T. cruzi.

La Figura 4 muestra la sensibilidad analítica del kit para sífilis.

La Figura 5 muestra una visualización del resultado con luz visible y UV de la detección de treponema con diagnóstico confirmado para sífilis.

La Figura 6 muestra la sensibilidad analítica del kit para la detección de SARS- CoV-2, con lectura por visualización directa a ojo desnudo a partir de ARN genómico (muestra de referencia) aislado de hisopado nasofaríngeo de paciente confirmado por método de referencia (rt-PCR y cuadro clínico).

La Figura 7 muestra la especificidad analítica del kit para la detección de SARS- CoV-2 con muestra de referencia y muestras de templado genómico de virus filogenéticamente relacionados, virus de concomitancia espacial y genomas potencialmente contaminantes de la muestra.

La Figura 8 muestra la capacidad de detección de SARS-CoV-2 aplicando el kit en muestras de referencia, de hisopado buco/naso-faríngeo o de saliva, inactivadas por calor, directas y sin realizar pasos de purificación o extracción adicionales.

La Figura 9 muestra una perspectiva de cajas de muestra con cierre hermético.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención consiste en un kit de diagnóstico de fundamento molecular para la detección de secuencias específicas de nucleótidos tales como ADN, ADN copia y ARN, de uso extremadamente sencillo, con utilidad para detectar agentes infecciosos, transgenes, alelos específicos y secuencias no codificantes, y que comprende los siguientes componentes: un primer frasco gotero calibrado con sistema anticontaminación conteniendo una solución de la enzima polimerasa de funcionamiento isotérmico, los 4 tipos de deoxinucleótidos, i.e. dATP, dCTP, dGTP y dTTP, soluciones salina y tampón, el agente caotrópico betaína y un detergente no iónico;

un segundo frasco gotero calibrado con sistema anticontaminación conteniendo al menos un set de 4 o 6 iniciadores necesarios para que se multipliquen los fragmentos de ADN, ADN copia o ARN, siendo este último en un primer paso no distinguible dentro de la reacción pasado a ADN copia, secuencia específica que se pretende detectar, i.e. agente patógeno, transgén, alelo, etc.;

alternativamente a los dos goteros mencionados, puede haber un único gotero calibrado con sistema anticontaminación conteniendo una solución con los 4 tipos de deoxinucleótidos, i.e. dATP, dCTP, dGTP y dTTP, soluciones salina y tampón, el agente caotrópico betaína, un detergente y el set correspondiente de 4 o 6 iniciadores; en donde, la enzima polimerasa se encuentra liofilizada en el interior del soporte con cierre hermético donde se realizará la reacción de amplificación;

una presentación alternativa con un único gotero calibrado conteniendo una solución con los 4 tipos de deoxinucleótidos, i.e. dATP, dCTP, dGTP y dTTP, soluciones salina y tampón, el agente caotrópico betaína, un detergente, la enzima Bst y, en caso de tratarse de la detección de un virus de ARN, la retrotranscriptasa reversa; en donde, los iniciadores ( primers ) y el colorante indicador se encuentran deshidratados en el interior del soporte con cierre hermético donde se realizará la reacción de amplificación; presentación opcional: en una presentación opcional del kit pueden incluirse los tubos o soportes continente de cierre hermético, en donde se colocan los reactivos con la muestra y se realiza la reacción;

un tercer frasco gotero con solución reveladora;

tiras de cromatografía en capa delgada por flujo lateral o simplemente tiras reactivas de flujo lateral (LFD, acrónimo del inglés“Lateral Flow Dipsticks”);

para las presentaciones con lectura por color o fluorescencia se omiten las LFD; adicionalmente, cuando el compuesto colorante y/o fluorescente se encuentra en una de las mezclas de reacción de los goteros calibrados o bien deshidratado en el tubo de reacción, también se omite el gotero de revelado;

para confirmar el correcto funcionamiento del kit, se provee un juego de controles positivos y negativos, a saber:

- control positivo: compuesto por una secuencia patrón; es decir un templado de amplificación que consiste en una secuencia nucleotídica igual a la que se quiere detectar, y

- controles negativos: consistentes en el soporte de reacción vacío, tal como tubo o papel de filtro en tubo, sin templado específico; alternativamente, el soporte es inoculado con un genoma control que no contiene homología con la secuencia a detectar.

Los frascos goteros calibrados que se utilizan para las mezclas de reactivos deben cumplir las normas de diseño para que no pierdan esterilidad durante el uso.

Eventualmente, pueden reemplazarse por goteros comunes con gota calibrada siempre que se adicione un conservante al reactivo. Los conservantes pueden elegirse del conjunto de los conservantes actualmente utilizados u otros conocidos en el arte: alcohol bencílico, cetrimida, cloruro de benzalconio, cloruro de cetilpiridinio, cloruro de bencetonio, ácido benzoico y sus sales, ácido sórbico y sus sales, parabenos, fenoxitetanol, feniletanol, EDTA disódico y otros conocidos en el arte y sus mezclas, cuya selección se realiza según evaluación de desempeño en cada caso particular. En este kit se cuenta con una o dos mezclas de reactivos que se dispensan directamente con gotero de gota calibrada estéril. Esta tecnología, novedosa en kits de biología molecular o de diagnóstico molecular, permite el agregado de reactivos de modo simplificado y efectivo.

En la presente invención, particularmente adecuada para detectar agentes patógenos o bien secuencias transgénicas o propias, alélicas o no codificantes específicas de modo sensible, específico y sencillo, la muestra biológica se coloca en un soporte, se realiza una incubación durante 30 a 60 minutos y de 62 a 64 °C, y se revela el resultado, por métodos alternativos, dependiendo del tipo de muestra y la conveniencia del caso, tomando el procedimiento total un tiempo apenas mayor a una hora. Entre las opciones de lectura se encuentran aquellas por viraje de color y/o fluorescencia, o bien por agregado de una tira reactiva de cromatografía lateral LFD. La tira reactiva es una alternativa de revelado cuando la presencia de color de la muestra no procesada, o bien del soporte, pudiera interferir con la señal de color o fluorescencia de la reacción. Los primeros pasos de uso del kit de diagnóstico presentan pequeñas variaciones se acuerdo al soporte elegido, definiéndose como“soportes” a aquellos elementos donde se coloca la muestra que será analizada. En una presentación de la invención, el soporte es un tubo de reacción de material plástico clásico, por ejemplo, polipropileno o similar, con cierre hermético.

Un segundo soporte es una bandeja de reacción con cierre hermético, donde se colocan la muestra, opcionalmente con solución salina, y los reactivos; presenta una ranura lateral por la que se introduce el sistema de revelado por la tira reactiva. Está hecha de un material que admite su calentamiento para la incubación de la reacción.

Un tercer soporte es un papel de filtro tipo Guthrie o similar. Se embebe una porción del papel con la muestra y se introduce dentro del tubo o bandeja de reacción para continuar con el proceso de diagnóstico.

En los casos en que el soporte de la muestra es un tubo de reacción o una bandeja de reacción de cierre hermético, debe colocarse la muestra, i.e. sangre, saliva, lágrima, etc., dentro de dicho continente ya sea tubo o bandeja. Opcionalmente, dependiendo de la naturaleza y estado de la muestra a testear, por ejemplo, sangre líquida entera, puede colocarse un volumen de solución salina para dilución de la muestra, cuando dicha acción pudiera mejorar la sensibilidad de la reacción.

En el caso que el soporte de muestra es un papel de filtro tipo Guthrie o similar, debe impregnarse el papel de filtro o similar con la muestra, i.e. sangre, lágrima, saliva, etc. Se coloca la parte impregnada del papel de filtro dentro del tubo o bandeja de reacción, opcionalmente puede adicionarse un volumen de solución salina para dilución de la muestra, cuando dicha acción pudiera mejorar la sensibilidad de la reacción. Cualquiera haya sido el soporte elegido, para proceder con la reacción de amplificación de la presente invención, se colocan al menos una gota del primer gotero dentro del tubo o bandeja de reacción y -de corresponder- al menos una gota del segundo gotero dentro del tubo o bandeja de reacción. Se tapa herméticamente y se mezcla hasta homogeneizar los componentes de la solución. Con una fuente de calor se incuba a 63 - 65 °C durante 30 - 60 minutos, posteriormente se retira la fuente de calor.

En las presentaciones de la invención de revelado por tira reactiva LFD, una vez finalizada la incubación, se adiciona dentro del tubo o bandeja de reacción una gota del gotero de revelado y se introduce una tira reactiva LFD. En caso de tratarse de un tubo de reacción, la tira se introduce por la boca del tubo; en el caso de utilizarse la bandeja de reacción, la tira se introduce por una ranura lateral. Se deja que la mezcla de reacción avance por capilaridad a lo largo de la LFD por unos 2 - 5 minutos, se retira la LFD, y se lee el resultado, en donde: 2 líneas o bandas de precipitación es un resultado positivo al reactivo; 1 línea o banda de precipitación es un resultado negativo al reactivo; ninguna línea o banda de precipitación es un resultado inválido.

Cuando se trata de una muestra incolora tal como exudado, mucosa, suero, etc., el sistema de revelado por tiras reactivas puede ser sustituido por viraje de un compuesto cromóforo y/o fluoróforo. Para ello, se sustituye el sistema de LFD y su gotero por el sistema de lectura por color cuyo resultado puede detectarse a ojo desnudo y/o fluorescencia por irradiación con UV utilizando un compuesto cromogénico y/o fluorogénico. Dicho compuesto puede encontrarse: en uno de los goteros calibrados, presente durante la reacción de amplificación; en un gotero de revelado ad hoc, en donde la solución reveladora se agrega al final de la incubación; dispensado en forma deshidratada en el continente de reacción provisto por el kit, en su base o bien en la tapa, en cuyo caso será mezclado con el producto de reacción, por inversión, al finalizar la incubación.

En los casos en que el material a detectar sea de naturaleza ribonucleica, ARN, puede realizarse una reacción previa de retro-transcripción independiente al kit o bien, puede utilizarse la presentación del kit que está adaptada para dicho material biológico, pues ocurren la retro-transcripción seguida de la amplificación en un único paso operativo.

EJEMPLO 1

Kit de diagnóstico para detectar la presencia del Trypanosoma cruzi, agente etiológico de la enfermedad de Chagas en muestras biológicas.

La enfermedad de Chagas originalmente estaba confinada a determinadas zonas rurales en América Latina. Con el cambio climático y las corrientes migratorias actuales, el agente infeccioso se encuentra actualmente en zonas tradicionalmente no endémicas, rurales y urbanas, en todo el mundo.

La detección de Chagas en neonatos habitualmente se realiza por técnicas de visualización del parásito Trypanosoma cruzi en sangre tales como microhematocrito, microStrout, etc. Sólo en ciertos establecimientos con las condiciones apropiadas de infraestructura, RRHH y económicas, eventualmente se realizan también técnicas de PCR o Real time PCR, a partir de ADN puro. Procedimientos similares se aplican a la detección en personas inmunocomprometidas y en sospecha de casos agudos.

El presente kit desarrollado para detectar Chagas se ha adaptado a condiciones “Point of Care”, es decir con escasos recursos de laboratorio, y en condiciones de campo. El kit se ha adaptado para aplicarse a partir de una muestra de sangre obtenida del talón de neonato dispensada en un papel de filtro, o bien de sangre de paciente anticoagulada con Cloruro de Guanidinio - EDTA o sólo con EDTA. El kit también puede utilizarse con ADN puro o partiendo de otras muestras biológicas, por ejemplo, líquido cefalorraquídeo de paciente con Chagas reactivado. En este kit, la enzima polimerasa es Bst 2.0.

La familia de enzimas BST está formada por DNA polimerasas/helicasas, utilizándose en esta invención aquellas sin actividad exonucleasa tales como BST large fragment, Bst 2.0 y Bst 3.0, cuyas características pueden encontrarse en: FAQ: When should Bst DNA Polymerase be the enzyme of choice?, New England BioLabs Inc., 240 County Road, Ipswich, MA 01938-2732, EEUU (https://www.neb.com/faas/0001/01/Q1/when-should-bst-dna-pol vmerase-be-the- enzyme-of-choice), y Bst DNA Polymerase - Heat-resistant strand displacement DNA polymerase, Nippon Gene CO., Ltd., 2-7-18, Toiya-machi, Toyama 930-0834, Japón (http://nipponaene.com/enalish/product/modifying-enzvmes/bst -dna- polvmerase.html

En este kit para detectar al Trypanosoma cruzi, el conjunto de iniciadores ( primers ) está compuesto por 6 secuencias de oligonucleótidos:

1 - Iniciador Interno Hacia Adelante (FIP, acrónimo del inglés“Forward Inner Primer"). secuencia obtenida por ingeniería genética no encontrada en la naturaleza.

2- Iniciador Externo Hacia Adelante (F3, en inglés“Forward Outer Primer”). secuencia obtenida por ingeniería genética acoplado a una proteína inmunoreactiva, por ejemplo, biotina o fluoresceína, que no es la proteína acoplada en el B3. 3- Iniciador en Bucle Hacia Adelante (FLP, acrónimo del inglés“Forward Loop Primer”): secuencia presente en bucle {loop) formado en la región 5' del amplicón. En condiciones de reacción desfavorables -por ejemplo, por exceso de ciertas proteínas séricas en la muestra- la presencia de este iniciador mejora la sensibilidad, siendo en otras condiciones indistinta su presencia.

4- Iniciador Interno Hacia Atrás (BIP, acrónimo del inglés“Backward Inner Primer”): secuencia obtenida por ingeniería genética no encontrada en la naturaleza.

5- Iniciador Externo Hacia Atrás (B3, en inglés“Backward Outer Primer”): secuencia obtenida por ingeniería genética acoplada a una proteína inmunoreactiva, por ejemplo, biotina o fluoresceína, que no es la proteína acoplada en el F3.

6- Iniciador en Bucle Hacia Atrás (BLP, acrónimo del inglés“Backward Loop Primer”): secuencia presente en el loop formado en la región 3 ^' del amplicón. En condiciones de reacción desfavorables -por ejemplo, por exceso de ciertas proteínas séricas en la muestra- la presencia de este primer mejora la sensibilidad, siendo en otras indistinta su presencia.

En este kit el sistema de revelado es por tiras reactivas del tipo LFD, del tipo de las descritas en la patente US 6656744, con 2 zonas de interacción molecular, cada una de ellas con capacidad de interactuar excluyentemente con una u otra proteína inmunoreactiva acopladas a los iniciadores F3 y B3.

En este kit, la solución reveladora consiste en un buffer Tris salino, la cual aporta moléculas acopladas a oro coloidal en solución, complementarias a las proteínas inmunorreactivas acopladas a los iniciadores, y facilita el avance de la reacción sobre la tira reveladora por capilaridad y cuya fuerza iónica y pH facilitan la interacción de las proteínas inmunorreactivas acopladas a sendos iniciadores con las correspondientes moléculas complementarias de la tira y la solución.

Las pruebas analíticas han mostrado una sensibilidad de 0,1 femtogramos de ADN, equivalente a 0,001 parásitos, en solución o dispensados en papel de filtro tipo Guthrie o similar, así como la detección de un (1 ) parásito en una muestra de sangre artificialmente inoculada y dispensada en papel de filtro y utilizada directamente en la reacción. El kit mostró excelente desempeño en especificidad, no presentando reacción cruzada con material genético de otras especies filogenéticamente emparentadas, tales como Leishmania spp., Trypanosoma brucei, Trypanosoma rangeli, ni de otras que resultan contaminantes de la muestra, tales como ADN humano, ADN de levaduras.

En la Figura 1 se puede observar la sensibilidad analítica de este kit con ADN genómico purificado.

Se observa el límite de detección de la reacción con el kit utilizando diluciones seriadas al décimo desde 10 nanogramos a 0,01 femtogramos de ADN genómico purificado a partir de T. cruzi, cepa CL Brener, DTUVI (DTU, acrónimo del inglés “Discret Typing Unit”) unidad discreta de tipificación VI. Resultados similares se obtienen con cepas de todas las DTUs: a) Revelado mediante electroforesis en gel de Agarosa 1 ,5% p/v, TAE 1 X, Sybr Safe 1 X (método analítico). b) Revelado con el método POC utilizando las tiras LFD del kit.

La flecha superior remarca la línea o banda control, presente en todas las reacciones, tanto positivas como negativas, y la flecha inferior corresponde a la banda de amplificación positiva. En donde, Neg: control de reactivos sin ADN genómico, que debe ser negativo siempre.

En la Figura 2 se muestra el límite de detección del Trypanosoma cruzi, agente causal de la Enfermedad Chagas probado en muestras de sangre sin purificar dispensadas en papel tipo Guthrie o similar, inoculadas con un número controlado de parásitos.

A partir de aplicar el kit directamente en muestras sin purificar de sangre humana artificialmente inoculada con un número controlado de parásitos enteros, entre 1 y 1000 parásitos, dispensadas en papel tipo Guthrie o similar, se observa una óptima sensibilidad analítica, es decir la detección de un único parásito por reacción: a) Muestras inoculadas con epimastigotes de T. cruzi, cepa CL Brener. b) Muestras inoculadas con tripomastigotes de CL Brener.

Resultados similares se obtienen con todas las DTUs. En donde, P: número de parásitos inoculados; Neg: control de reactivos sin templado, que debe siempre ser negativo. En la Figura 3 puede observarse la especificidad analítica del kit evaluada con

ADN de las seis DTUs de T. cruzi, especies relacionadas y especies contaminantes.

Se realizaron pruebas del kit con ADN de las seis DTU de T. cruzi; células humanas (FIELA), por tratarse de un material presente en las muestras; levaduras Sacharomicies cereviciae (S. cere), un contaminante frecuente; y de especies relacionadas al parásito: Crithidia fasciculata (C.fasc), T. brucei (T. Br); Leishmania mexicana (L. Mex), Phytomonas spp (Phyto), T. rangeli cepa SC-58 (T. Rang Se) y T. rangeli cepa Choachi (T. Rang Ch). En donde, Neg: control de reactivos sin ADN genómico, siempre debe dar negativo; Pos: control de amplificación utilizando 1 pg de ADN genómico, siempre debe dar positivo.

Estos resultados confirman la especificidad del kit para reconocer todas las variantes genéticas del Trypanosoma cruzi y de no presentar reacción cruzada con otras especies, incluso aquellas muy similares por la proximidad filogenética.

EJEMPLO 2

Kit de diagnóstico para detectar la presencia del Treponema pallidum pallidum, agente etiológico de la Sífilis en muestras biológicas.

La Sífilis es una infección bacteriana de transmisión sexual (ITS), causada por el Treponema pallidum pallidum. A pesar de contar con medidas profilácticas seguras, como por ejemplo el uso de preservativo, y terapias eficaces y económicas, por ejemplo, usando penicilina, esta enfermedad constituye un problema a escala mundial, con al menos 12 millones de nuevos casos de infección cada año. Tanto en los casos de Sífilis en adultos como en Sífilis congénita, cuando el diagnóstico y el tratamiento son tardíos, se observa una diseminación de la bacteria en todo el organismo, pudiendo presentar cuadros neurológicos y cardiovasculares.

El diagnóstico para Sífilis actualmente se realiza por: i- observación microscópica del T. pallidum; ii- métodos serológicos del tipo “treponémicos”, con los que se detectan anticuerpos contra antígenos específicos de T. pallidum; y iii- métodos serológicos“no treponémicos”, con los que se detectan anticuerpos contra antígenos reagínicos, presentes en tejidos dañados, tanto por T. pallidum como por otras causas, por lo que su positividad no es confirmatoria. Estos métodos de detección para Sífilis, en términos generales, no resultan efectivos para neonatos/as, por lo que la mayoría de los/las recién nacidos/as vivos/as infectados/as (~80%) -que son asintomáticos/as al momento de nacer- no serán detectados tempranamente.

Los métodos de detección molecular desarrollados hasta el presente para Sífilis, al igual que para Chagas, no se ajustan a las condiciones generales encontradas en Salud Pública de Argentina, por lo que quedan restringidos sólo a ciertos centros de atención, y dejando una vacancia para nuevos métodos específicos, sensibles y aplicables a toda condición sanitaria.

El kit de la presente invención para detectar Sífilis se adapta a condiciones “Pointof Care”. En este kit, como se describió en el EJEMPLO 1 , la enzima polimerasa también es la Bst 2.0; y el set de primers está compuesto por 6 oligonucleótidos específicos de la secuencia del Treponema pallidum pallidum a detectar (FIP; F3; FL; BIP; B3 y BL).

En este kit para detectar el treponema en una muestra incolora de, por ejemplo, exudado, mucosa, suero, etc., el sistema de lectura del resultado se realiza por viraje de color que puede detectarse a ojo desnudo y/o fluorescencia por irradiación con UV, utilizando el compuesto intercalante“Sybr Green”. Para asegurar la estabilidad del sistema de lectura en esta presentación, dicho compuesto se ha dispensado en la tapa del tubo de reacción provisto en el kit, en estado deshidratado; y se mezcla con el producto de reacción al finalizar la incubación a 63 - 65 °C. Alternativamente, para la detección del treponema en muestras con opacidad o color propio, o bien dispensadas en un papel de filtro, el sistema de revelado es por tiras reactivas LFD como el kit del EJEMPLO 1 .

En la Figura 4 se puede observar la sensibilidad analítica del Kit para Sífilis en muestras de suero artificialmente inoculado, utilizando distintos métodos de visualización del resultado.

Se realizó la reacción con el kit para detectar el treponema en muestras de suero humano diluido 1 /100, artificialmente inoculado con un número controlado de copias del templado treponémico de interés (entre 1 y 100 copias) dispensadas en tubos de reacción. Se observa una óptima sensibilidad analítica, es decir la detección de una única bacteria, en los distintos métodos de lectura: a) método analítico, por electroforesis en gel de agarosa; b) viraje de color; y c) método de lectura por LFD.

De esta forma, calle 1 : control negativo correspondiente a 1 picogramo de ADN de E. coli, que representa aproximadamente 200 copias de genoma; calle 2: dilución del suero con 100 copias de la secuencia nucleotídica de T. palludum utilizada como templado; calle 3: dilución del suero con 10 copias del templado; y calle 4: dilución del suero con 1 copia del templado en la reacción.

En la Figura 5 se muestran los resultados obtenidos mediante un kit para detección del treponema en muestras de suero control y de un paciente con diagnóstico confirmado para Sífilis por medio de una visualización con luz visible y UV. En esta Figura 5 se observan 3 reacciones negativas, a saber 1 , 2 y 3: realizadas con suero no infectado, artificialmente inoculado con 1 picogramo de ADN de E. coli, aproximadamente 200 copias de genoma, y 3 reacciones positivas, a saber 4, 5 y 6: triplicados de una reacción realizada con una dilución 1 /1000 de una muestra de suero de un paciente con infección confirmada, visualizadas a ojo desnudo o bien por irradiación con luz UV. En condiciones controladas, el kit presenta, con ambas lecturas, un límite analítico de detección de una copia por reacción.

Para estimar el número de copias presentes en la muestra de suero del paciente, se realizaron ensayos moleculares complementarios por medio de Real Time PCR con diluciones seriadas de la muestra y de la secuencia clonada, utilizada como control positivo.

Estos resultados muestran que el kit presenta una amplificación específica para T. palludim pallidum, ya que no se obtienen falsos positivos en controles negativos o inoculados con ADN de otras bacterias, de humano o levaduras. El límite de detección obtenido, de una única copia de templado de ADN por reacción, es similar para los distintos métodos de lectura, siendo el método de viraje de color muy oportuno para condiciones POC. En la bibliografía se encuentra que el sistema de lectura con UV puede ser más sensible que por luz visible; sin embargo, al aplicar este kit en condiciones controladas no se observa la diferencia mencionada, posiblemente por la alta eficiencia de amplificación por lo que, teniendo una única copia inicial, el producto de amplificación es suficientemente alto como para ser detectado por ambas formas de lectura con sustancialmente la misma sensibilidad. EJEMPLO 3

Kit de diagnóstico para detectar la presencia de SARS- CoV-2, agente de COVID-19 en muestras biológicas.

Este kit detecta la infección causada por el SARS-CoV-2, agente etiológico de la neumonía atípica (COVID-2019, del inglés:“Corona Virus Disease 2019”), por la retrotranscripción seguida de la amplificación molecular de regiones específicas del del genoma de SARS-CoV-2, en un único paso, partiendo de ARN aislado o directamente a partir de una muestra clínica, sin pasos de extracción/purificación, de pacientes infectados, e inactivada a 65 °C - 30 min según indicación de American Type Culture Collection (ATCC) 10801 University Boulevard, Manassas, VA 201 10 USA (https://www.atcc.ora/en/Global/Products/VR-1986HK.aspx#char acteristics).

Este diagnóstico actualmente se realiza por: i) Métodos serológicos: estos métodos pueden ser convencionales tales como los realizados en un Laboratorio de Bioquímica con kits comerciales o“home - made”, o bien kits de configuración“rápida”. Estos test, además de rápidos, son relativamente económicos y no requieren complejidad de infraestructura o equipamiento. Sin embargo, pueden presentar casos de falsos negativos, por existir un período entre la infección y la aparición de anticuerpos específicos. ii) Métodos moleculares, por PCR de punto final y Real time - PCR: Estos métodos, como se ha mencionado en los apartados anteriores, requieren de cierto grado de infraestructura, equipamiento y RRHH especializados. El proceso de tomar la muestra, aislar el ARN viral, realizar la amplificación y analizar/informar el resultado conlleva, en los casos mejor optimizados unas 4-5 horas. A eso, debe sumarse en muchos casos, el tiempo del traslado de la muestra desde los centros primarios de atención, donde se realiza la toma de muestra, a los centros habilitados para realizar el diagnóstico por Real time - PCR. En el caso de Argentina, se han reportado demoras de 6 - 7 días, con el consecuente impacto negativo en la vida del paciente y en el entorno familiar de permanecer aislado preventivamente hasta tener el resultado.

Recientemente han surgido, alrededor del mundo, numerosos kits de base serológica y molecular; entre estos últimos, se encuentran 3 kits basados en LAMP, con distinta configuración.

Ben Assa et al. (“SARS-CoV-2 On-the-Spot Virus Detection Directly From Patients" Elect Jour Art, medRxiv, Coil Spring Harbor Laboratory Press, 10 1 101/2020.04.22.20072389 (2020)) revela un método molecular isotérmico similar al de la presente invención. Si bien se hipotetiza que puede usarse directamente con la muestra de ARN sin purificar, los valores de concordancia obtenidos en comparación con el método RT-PCR, método estándar para estas determinaciones, tienen un porcentaje muy elevado de falsos negativos de más de 15 % en todos los casos, aún con un protocolo mejorado. Esto podría deberse a que este kit tiene un límite de detección muy alto comparado con RT-PCR. Al comparar este método con el desarrollado con el kit descripto en la presente invención, se puede constatar el resultado inesperado obtenido en cuanto a la concordancia obtenida con un RT-PCR utilizado como método de referencia por ANLIS (Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud) Malbrán de la República Argentina.

Un kit de diagnóstico molecular basado en amplificación nucleica isotérmica para COVID-19 ha sido aprobado y ya está siendo comercializado por Abbott Laboratories. En este caso sólo se amplifica un gen del virus, lo cual implica que los negativos sólo puedan informarse como“presuntivos” y se requiera de otro kit para confirmarlos. Más aún, el límite de detección es de 312,5 copias, esto es 125 copias/mL en 2,5 ml_ de buffer de elución. Este kit, a diferencia del kit de la presente invención, requiere de un equipo provisto por Abbott. El kit de la presente invención no requiere de equipos especiales o de alta tecnología, sino sólo de un bloque térmico.

Por su parte, el documento US 2020/0048722 A1 de Nyan, D. revela una metodología multiplex de diagnóstico por amplificación nucleica isotérmica que detecta la presencia de un patógeno por medio de fluorometría. La presente invención no requiere fluorómetro ni otro tipo de equipamiento ya que la detección es visual por medio de un cambio de color a simple vista.

En resumen, estos kits disponibles actualmente, o bien requieren tecnología no disponible fácilmente o sofisticadas tal como cicladores, fluorómetros, etc., o bien tienen una sensibilidad muy inferior a los métodos moleculares estándar del tipo RT- PCR. Por ello, es muy útil poder contar con un kit rápido, sensible y específico que no requiera equipos de alta tecnología para poder realizar diagnósticos de enfermedades aún en centros de salud con menor equipamiento o a campo. La presente invención viene a cubrir esta necesidad particularmente imperiosa en el caso de pandemias donde escasean los instrumentos e insumos, y donde se requiere un reactivo de diagnóstico“ point-of-care" (POC) con una sensibilidad adecuada que permita tomar decisiones de aislamiento o mudanza de pacientes inmediata para evitar contagios y propagaciones de la enfermedad.

Con el kit de la presente invención, se detecta al SARS-CoV-2 mediante una reacción de retrotranscripción para obtener el ADNc viral seguido de una amplificación molecular en un solo paso operativo, a temperatura constante de 63 - 65 °C. La detección es múltiple pues se utilizan 4 juegos de iniciadores o cebadores que reconocen y amplifican 4 regiones específicas del genoma viral, asegurando la sensibilidad aún frente a una mutación que pudiera, potencial e improbablemente, afectar la hibridización de alguno de los cebadores. Para la lectura simplificada se utiliza el azul de hidroxinaftol (Hydroxynaphthol blue - HNB), un colorante indicador que vira de color violeta a color azul cuando la reacción de amplificación es positiva. Dicho viraje se debe al cambio de concentración del Mg ²⁺ libre en solución conforme disminuyen los dNTPs y aumenta el pirofosfato producto de la amplificación.

En este kit, el colorante HNB junto con los iniciadores se encuentran deshidratados en la base del tubo de reacción provisto en el kit. Estos componentes se resuspenden con la mezcla de reacción y el templado, y luego se realiza la incubación a 63 - 65 °C.

Las pruebas analíticas presentan una sensibilidad de 3,12 copias del genoma viral de SARS-CoV-2 a partir de ARN genómico purificado (muestra de referencia).

En la Figura 6 puede observarse la sensibilidad analítica del Kit de detección de SARS-CoV 2 según la presente invención por lectura directa a ojo desnudo.

Se realizaron diluciones sucesivas a partir de una muestra de referencia de ARN aislado de hisopado naso/buco-faríngeo. Tubo 1 : control negativo, sin templado; tubo 2: 40.000 copias; tubo 3: 4.000 copias; tubo 4: 400 copias; tubo 5: 200 copias; tubo 6: 100 copias; tubo 7: 50 copias; tubo 8: 25 copias; tubo 9: 12,5 copias; tubo 10: 6,25 copias; tubo 1 1 : 3,125 copias; y tubo 12: 1 ,56 copias de genoma.

El kit muestra una especificidad adecuada, pues no se observa reacción cruzada utilizando como potencial templado al material genético de otras especies filogenéticamente emparentadas, como por ejemplo un coronavirus canino; de virus de concomitancia espacial, tales como H1 N1 , Dengue, Zika, Chikungunya; ni con genomas potencialmente contaminantes de la muestra como bacterias, levaduras y de humano, utilizando en todos los casos una masa 1000 veces mayor a la utilizada para el SARS-CoV-2. En la Figura 7 puede observarse la especificidad analítica del Kit de detección de SARS-CoV 2 desafiado con muestras de genomas de especies relacionadas y especies contaminantes.

Se muestran en esta Figura 7 duplicados de la reacción con diversos templado: tubos 1 -2: SARS-CoV-2; tubos 3-4: coronavirus canino; tubos 5-6: Influenza (H1 N1 ); tubos 7-8: Dengue, mezcla de los 4 serotipos; tubos 9-10: Zika; tubos 1 1 -12: Chikungunya; tubos 13-14: templado bacteriano de E. coli; tubos 15-16: levaduras ( Saccharomyces cerevisiae); tubos 17-18: levaduras ( Saccharomyces pombe); y tubos 19-20: células humanas (FIELA).

Se realizaron pruebas del test utilizando como templado muestras clínicas de hisopado buco/naso-faríngeo y de saliva, incativadas a 65 °C - 30 minutos según indicación de ATCC, sin realizar pasos de extracción o purificación. El kit muestra capacidad de amplificación, tanto para muestras de hisopado como de saliva, por lo que puede inferirse que en muestras de esputo podría obtenerse del mismo modo un resultado positivo (ensayo no realizado). También se realizaron inactivaciones a 95 °C - 5 minutos según se indica para Ébola en Procedimientos Generales para Inactivación de Muestras Potencialmente Infecciosas con el Virus Ébola y Otros Agentes Virales Altamente Patógenos, 2014-cha-procedimientos-inactivacion-ebola (https://www.paho.org/hq/dmdocuments/2014/2014-cha-procedimi entos-inactivacion- ebola.pdf) lográndose el mismo resultado de inactivación.

En la Figura 8 puede observarse el resultado de la reacción con el Kit de detección de SARS-CoV 2 aplicando muestras clínicas directas, sin purificar, inactivadas por calor.

Un grupo de muestras de hisopado y de saliva de pacientes confirmados positivos y negativos, las muestras de estos últimos fueron usadas a modo de control negativo, se inactivaron por calor (65 °C - 30 minutos); y se utilizaron como templado para la reacción directa con el kit para COVID-19. Tubo 1 : muestra de hisopado de paciente negativo; tubo 2: muestra de hisopado de paciente positivo; tubo 3: muestra de saliva de paciente negativo, dilución 1 /10 en solución salina; tubo 4: muestra de saliva de paciente positivo, dilución 1 /10 en solución salina; tubo 5: control negativo, sin templado; y tubo 6: control positivo en base a ARN de SARS-CoV-2 de referencia.

EJEMPLO 4

Determinación del límite de detección del kit para detectar SARS CoV 2

Para determinar el límite de detección cada operador (en total dos) realizó repeticiones de la reacción del kit según la presente invención para COVID-19 con diferentes cantidades de ARN purificado correspondiente a la muestra de referencia para SARS-CoV-2. En paralelo, se realizaron repeticiones de una muestra de referencia negativa. Se obtuvieron los resultados resumidos a continuación en la siguiente Tabla:

Se concluye que el límite de detección del kit es 12,5 copias de ARN de SARS-

CoV-2.

EJEMPLO 5

Contrastación del kit de la presente invención para detectar SARS-CoV-2 versus kits RT-PCR con muestras provenientes del centro de referencia nacional de la República Argentina ANLIS Malbrán Definición de Parámetros

VP: Verdaderos Positivos; VN: Verdaderos Negativos; FP: Falsos Positivos; FN: Falsos Negativos.

Se definen en base a este cuadro los siguientes parámetros del kit:

Sensibilidad (%): VP / (VP+FN) x 100 Especificidad (%): VN / (VN+FP) x 100 Exactitud (%): (VN+VP) / total x 100

Estudio de muestreo en condiciones clínicas v de ensayo con el Kit de la invención COVID-19 en condiciones controladas

Se recibieron 150 muestras clínicas de referencia consistentes en ARN purificado de pacientes diagnosticados por la RT-PCR del método“gold estándar” de emergencia COVID-19 según la OMS, 100 provenientes de pacientes positivos y 50 de pacientes negativos. Al igual que para la RT-PCR, se utilizaron 5 ml del ARN purificado por medio de un kit comercial de extracción de ácidos nucleicos por microcolumna (microcolumnas identificadas como RNA spin Qiagen, o similar) como templado para la prueba con el kit de la presente invención COVID-19.

Los resultados obtenidos con ambos métodos se compararon en una tabla de contingencia de 2 x 2, definiéndose los parámetros de desempeño sensibilidad y especificidad del kit de la presente invención COVID-19.

Resultados

Los resultados obtenidos en las 150 muestras clínicas evaluadas por medio del kit de la presente invención COVID-19, tomando la RT-PCR como método Gold Estándar de emergencia COVID-19, presentan un 100% de concordancia, por lo que indican un 100% de sensibilidad y 100% de especificidad (Figura 5 A y B), tal como se presentan en la tabla a continuación:

Definición de parámetros

VP: Verdaderos Positivos; VN: Verdaderos Negativos; FP: Falsos Positivos; FN:

Falsos Negativos

Se definen en base a este cuadro los siguientes parámetros del kit: Sensibilidad (%): VP / (VP+FN) x 100 Especificidad (%): VN / (VN+FP) x 100 Exactitud (%): (VN+VP) / total x 100

Se encontró un 100 % de acuerdo en cuanto a las muestras negativas. En cuanto a las muestras positivas, hubo 6 que mostraron discordancia, siendo positivas para RT-PCR y negativas para el kit de la presente invención. Estas muestras fueron repetidas con el kit recomendado por el CDC (acrónimo del inglés: Centers forDisease Control and Prevention, Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades) de EEUU {“CDC 2019 -Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel”, CDC-006-00019, Revisión 04, CDC/DDID/NCIRD/ Divsion of Viral Diseases, 12/6/2020), concordando el resultado con el de la presente invención. De modo que se evidencia una conservación defectuosa de las muestras que produjo su degradación durante su almacenamiento de más de 1 semana. Teniendo esto en cuenta se confeccionó la siguiente Tabla:

Tabla de contingencia según resultados remitidos por el Referente ANLIS - Malbrán v verificados con CDC 2019-nCoV Real Time RT-PCR Diagnostic Panel

En estas condiciones, se obtienen los siguientes parámetros:

Sensibilidad: 100 %

Especificidad: 100 %

Exactitud : 100 %

EJEMPLO 6

Estudio inter-laboratorio con el kit de la invención para detectar SARS- CoV-2 con los obtenidos con kits RT PCR de varios centros de diagnóstico COVID19 de la República Argentina Participaron de este estudio inter-laboratorio los siguientes centros para diagnóstico de COVID19, los cuales utilizaron kits RT PCR:

Se registra el total de los resultados obtenidos en el estudio interlaboratorio, en la siguiente tabla de contingencia Tabla de contingencia

Sensibilidad: 96,6 %

Especificidad: 97,4 % Exactitud : 97,0 %

Este estudio inter-laboratorio muestra una concordancia extremadamente favorable y por encima del 95 % en los tres parámetros más relevantes de kits de diagnóstico. Esto es particularmente notable si tenemos en cuenta que en este estudio:

- Participaron varios centros de diagnóstico de Argentina.

- Se utilizaron métodos RT-PCR de distintas marcas comerciales aprobados por la autoridad sanitaria competente, i.e. Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica (ANMAT) de Argentina, tal como: GeneFinder RealAmp SARS-CoV-2; RT-PCR Light Mix® Modular SARS-CoV-2; o similares.

- Las muestras en general no pudieron ser analizadas por el kit de la invención en simultáneo con RT-PCR, por lo cual algunas de las discordancias o todas podrían explicarse por alguna alteración de la integridad de la muestra durante su almacenamiento. Existen, además, otras variables aleatorias como: inhomogeneidad de la muestra en cuanto a carga viral, error humano al realizar la determinación, etc.

SECUENCIAS DE PRIMERS ORIGINALES

httpswww.epo.org/applying/oniine-services/online-filing/auxi liary/bissap.html