Dans l'exposé qui suit, les références entre crochets [] renvoient à la liste de références à la fin de la description.

Les puces d'analyse visées par la présente invention sont plus particulièrement, mais non exclusivement, les biopuces et microsystèmes dédiés à l'analyse biologique. Elles se répartissent en trois catégories : les puces à ADN, les laboratoires sur puce ( « Lab-On-Chip ») et les puces à cellules ( « Cell-On-Chip »).

Actuellement, un nouveau type de biopuce émerge : la puce à sucre ( « Glycochip »). Cette biopuce est soit le résultat d'un dépôt d'une substance naturelle ou synthétique, soit le résultat d'une synthèse multiparallèle supportée (chimie combinatoire) de différentes séquences oligosaccharidiques,

représentatives de la diversité moléculaires de certaines grandes familles de glycoconjugués endogènes, par exemple les héparanes sulfates. La présente invention est particulièrement bien adaptée à ce nouveau type de biopuce en permettant notamment la fixation de ces molécules sur des supports de biopuces par un procédé de chimie efficace et simplifié par rapport à l'art antérieur.

Les molécules ou biomolécules, appelées dans la présente « unités moléculaires », qui peuvent être fixées sur un support solide par l'intermédiaire du bras espaceur de la présente invention peuvent être par exemple des acides nucléiques (ADN ou ARN), des sucres, des glycoprotéines, des glycolipides, etc. D'autres exemples encore sont donnés ci-dessous.

Art antérieur Dans la majorité des biopuces, un espaceur fait le lien entre le support solide [2] et, par exemple, les sondes d'oligopeptides, d'oligonucléotides [3] ou d'oligosaccharides [4]. Cet espaceur peut jouer plusieurs rôles à la fois : molécule liante, bras d'éloignement spatial, lieu de clivage de la sonde, etc.

La proximité du support avec les sites de reconnaissance des cibles par les sondes peut en effet gêner, voire empêcher la reconnaissance sonde/cible, et donc nuire à la finesse et à la qualité d'analyse des biopuces. Ceci est particulièrement vrai lorsque les

sondes sont petites, par exemple dans le cas des puces à sucres.

L'équation de principe ci-dessous indique le schéma général de la formation puis du clivage de l'espaceur, dans laquelle X'représente un support solide, et X''une unité moléculaire. Précurseur du bras espaceur Support rN X molécule à fixer accrochage Fixation de la molécule à fixer sur le support solide par l'intermédiaire du bras espaceurformé X" Xi clivage t f Rupture du bras espaceur XI--N-XI, a :'De nombreux bras espaceurs ont été réalisés à ce jour, mais ceux-ci présentent un certain nombre d'inconvénients non résolus. En effet, leur structure implique une limitation sévère des procédés chimiques utilisables pour leur fixation sur le support solide et/ou ils ne permettent de fixer facilement tout type de molécule biologique et/ou ils sont si stables chimiquement qu'une fois fixés sur le support solide leur clivage pour récupérer la molécule biologique ne peut pas se faire facilement, et peut entraîner la détérioration de cette dernière ou du support.

Le document [4] (US-A-6,579, 725) décrit un bras espaceur fixant des oligosaccharides. Ce bras espaceur,

bien que plus efficace que ceux de l'art encore plus antérieur, ne permet pas de résoudre en même temps tous les problèmes précités. On peut noter également, que sa longueur, sa fonctionnalité, sa réactivité et son encombrement ne peuvent pas toujours être générés à volonté.

Exposé de l'invention La présente invention permet précisément de résoudre en une seule fois les problèmes précités de l'art antérieur en fournissant un bras espaceur moléculaire de formule (I) suivante : (I) - dans laquelle les substituants X° ; Xl ; X2 ; X3 ; X4 ; Z1 ; Z2 ; R1 ; R2 ; et R3 sont tels que : X° et X4 sont chacun choisis indépendamment des autres substituants parmi C, 0, N, S, Se, P, As, Si ; x1 ; X2 ; et X3 sont chacun choisis indépendamment des autres substituants parmi C, O, N, S, Se, P, As, Si et parmi un aryle et un hétéroaryle comprenant par exemple chacun de 2 à 20 atomes de carbone ;

zi et et Z2 sont chacun choisis indépendamment des autres substituants parmi C-R, Si-R, C, N, P et As, où R est un alkyle comportant par exemple de 1 à 40 atomes de carbone ; Ri ; R2 ; et R3 sont chacun choisis indépendamment des autres substituants parmi H, un alkyle, un aryle et un hétéroaryle comprenant chacun de 2 à 20 atomes de carbone ; # [Gp] représente un groupement protecteur de l'amine secondaire-N-ou une molécule participant à la fonctionnalité du bras espaceur ; - dans laquelle n, m et p sont des nombres entiers, chacun supérieur ou égal à 1 et choisi indépendamment l'un de l'autre, de préférence de façon à ce que 1 < n, m et p < 40 ; - dans laquelle [Sup] représente H ou un support solide silanisé sur lequel ledit bras espaceur peut être fixé de manière covalente ; et - dans laquelle [mo] représente H ou une unité moléculaire destinée à être fixée de manière covalente par l'intermédiaire dudit bras espaceur sur ledit support solide silanisé.

Bien entendu, X° à X4 sont des atomes formant le squelette du bras espaceur de la présente invention, des radicaux choisis par exemple parmi H, 0, alkyle, aryle, et un hétéroaryle comprenant chacun de 2 à 20 atomes de carbone pouvant être fixés sur ces atomes.

Ce bras espaceur (I) est utilisable, de manière générale, pour fixer sur un support solide [Sup] une unité moléculaire [mo], par exemple pour fabriquer une

biopuce, ou plus avantageusement une puce à sucre, où [mo] est généralement une molécule fonctionnalisant ladite biopuce.

Selon l'invention, de préférence, dans le bras espaceur [1] tel que défini ci-dessus : X° et X4 peuvent être chacun choisis indépendamment des autres substituants parmi C, 0, N, S, Si ; et/ou Xl ; x2 ; et X3 peuvent être chacun choisis indépendamment des autres substituants parmi C, 0, N, S, Si et parmi un aryle et un hétéroaryle comprenant par exemple chacun de 2 à 10 atomes de carbone ; et/ou et z2 peuvent être chacun choisis indépendamment des autres substituants parmi C, N, C-R, Si-R, où R est un alkyle comportant de 1 à 30 atomes de carbone, de préférence de 1 à 20 atomes de carbone, de préférence de 1 à 10 atomes de carbone et/ou Ri ; R2 ; et R3 peuvent être chacun choisis indépendamment des autres substituants parmi H, un alkyle, un aryle et un hétéroaryle comprenant chacun de 2 à 10 atomes de carbone.

Selon l'invention, n, m et p peuvent aussi être choisis indépendamment l'un de l'autre de façon à ce que 1 # n, m et p S 30, de préférence de façon à ce que 1 : n, m et p < 20, et de préférence encore façon à ce que 1 # n, m et p < 10.

A titre d'exemple, selon l'invention, dans le bras espaceur [1] tel que défini ci-dessus, X° et X4

sont C x et X3 sont C ; Z1 et Z2 sont C X1 ; R2 et et R3 sont H.

Selon l'invention, le groupement protecteur [Gp] peut être l'un quelconque des groupements protecteurs d'amines secondaires connus de l'homme du métier. Il est choisi de préférence de manière à ce qu'il résiste à la chimie de synthèse du bras espaceur, de sa fixation sur le support et de sa fixation avec l'unité moléculaire [mo]. Il peut être choisi par exemple parmi Ac, Bn (benzyle), un groupement aryle (R) en Cl à 40, Troc, z, TCA, BOC, Fmoc, etc., pour former avec l'amine secondaire du bras espaceur (I) un des groupes chimiques suivants (>N-indique l'amine secondaire protégée) : >N-Ac : acétamide (>N-CO-Me) ; >N-Bn : benzylamide ; >N-R : arylamide en Ci à 40 >N-Troc : 2,2, 2-trichloroéthyl carbamate (>N- C (0) OCH2CCl3) ; >N-z : benzyl carbamate (>N-C (0) OCH2Ph) ; >N-TCA : trichloroacétamidate (>N-CO-CCl3) ; >N-BOC : t-butyl carbamate (>N-C (O) OCMe3) ; >N-Fmoc : 9-fluorènylméthyl carbamate : (Ph = phényle et Me = méthyle).

De préférence, selon l'invention, le groupement protecteur est choisi parmi Ac, BOC ou un groupement aryle en Cl à 40- Selon l'invention, la molécule [Gp] participant à la fonctionnalité du bras espaceur peut être par exemple un alkyle ou un aryle en Cl à 40, par exemple en Ci à 30 par exemple en Ci à 20 ou en Ci à 10. Il peut s'agir de tout substituant, pas forcément protecteur, qui peut participer à la fonctionnalité du bras espaceur lorsqu'il est utilisé. Il peut s'agir par exemple d'un groupement hydrophobe, permettant de rendre le bras espaceur plus spécifique et/ou plus sélectif vis-à-vis de la molécule [mo] à fixer, et/ou de son rôle lors de l'utilisation du bras espaceur, par exemple sur une puce à sucre ou à protéine.

Selon l'invention, le support solide peut être par exemple tout support pouvant être silanisé. Il peut s'agir par exemple de plaques, de billes ou de capillaires. Il peut être par exemple à base de silice, de verre, ou d'autres matériaux connus de l'homme du métier, par exemple pour fabriquer les supports ou surfaces de biopuces. La silanisation du support peut être réalisée par tout procédé connu de l'homme du métier.

Selon l'invention, l'unité moléculaire [mo] peut être une molécule naturelle ou synthétique. Il peut s'agir de toute molécule qui doit être fixée sur un support, par exemple pour des raisons analytiques.

Il peut s'agir d'une petite molécule, par exemple ayant un poids moléculaire allant d'environ 180 à 400000

g. mol-1. Lorsqu'il s'agit d'un sucre, [mo] peut avoir par exemple un poids moléculaire allant de 180 à 10000 g. mol-1. Lorsqu'il s'agit d'une protéine ou d'un peptide, [mo] peut avoir par exemple un poids moléculaire allant de 5500 à 400000 g. mol-1, généralement allant de 5500 à 220000 g. mol-1 (poids moléculaire de la plupart des protéines).

Cette unité moléculaire [mo] peut être par exemple choisie parmi les monosaccharides, les oligosaccharides, les poly-oligosaccharides, les glyco- conjugués, les peptides, les protéines, les enzymes, les glycoprotéines, les lipides, les acides gras, les glycolipides, les glycolipoprotéines, etc.

Parmi les monosaccharides, on peut citer le glucose, la glucosamine, azidoglucosamine, D-ribose, D- xylose, L-arabinose, D-glucose, D-galactose, D-mannose, 2-désoxy-D-ribose, L-fucose, N-acétyl-D-glucosamine, N- acétyl-D-galactosamine, acide N-acétylneuraminique, acide D-glucuronique, acide L-iduronique, D-sorbitol, D-mannitol, etc.

Parmi les oligosaccharides, on peut citer saccharose, lactose, fragments d'héparanes sulfates, fragments saccharidiques d'héparine, de chondroïtine, de dermatanes sulfates, antigènes Lewis, etc.

Parmi les poly-oligosaccharides, on peut citer parties saccharidiques des héparanes sulfates, de l'héparine, de la chondroïtine, les dermatanes sulfates, etc.

Parmi les glyco-conjugués, on peut citer héparanes sulfates, héparine, chrondroïtine, dermatanes sulfates, etc.

Parmi les peptides et les protéines, on peut citer chimiokines, cytokines, insuline, fibrinogène, myosine, hémoglobine, etc.

Parmi les enzymes, on peut citer oxydo- réductases, transférases, hydrolases, lyases, isomérases, ligases.

Parmi les glycoprotéines, on peut citer glycoprotéines, on peut citer immunoglobuline G, acide hyaluronique, etc.

Parmi les lipides, on peut citer lipides hydrolysables : les graisses (glycérol + 3 acides gras), les cires (acide gras + alcools gras), les esters de stérol (stérol + acides gras), phospholipides (acides phosphatidiques (glycérol, 2 acides gras + phosphate)), les phosphalides (glycérol + 2 acides gras + phosphate), les sphingolipides (sphingosine + acide gras + phosphate + aminoalcool) ; lipides non hydrolysables : alcanes, caroténoïdes, stérols (cholestérol), stéroïdes (estradiol, testostérone), acides (acides gras), eicosanoïdes, etc.

Parmi les acides gras, on peut citer acide arachidonique, acide linoléique, acide linolénique, acide laurique, acide nervonique, acide palmitique, acide oléique, etc.

Parmi les glycolipides, on peut citer galactosyl-céramique, glucosyl-céramide, gangliosides, les cérébrosides (acide gras + sphingosine + 1 sucre),

les gangliosides (acide gras + sphingosine + nombreux sucres, de l'acide neuraminique), etc.

Parmi les glycolipoprotéines, on peut citer MPB83 (marque de commerce), GLP19 (marque de commerce) et IRBP (marque de commerce).

La présente invention se rapporte également à un procédé de fixation covalente d'une unité moléculaire [mo] sur un support solide par l'intermédiaire d'un bras espaceur, avantageusement celui de la présente invention.

Le procédé peut comprendre les étapes suivantes : (i) réduction de la fonction nitrile d'un composé de formule : (ii) formation d'une fonction aldéhyde à partir d'une fonction allyle d'une molécule biologique de formule : (iii) amination réductrice entre ladite fonction nitrile réduite suivie d'une protection de l'amine secondaire formée et ladite fonction aldéhyde pour obtenir une molécule biologique activée pour sa fixation sur le support, ladite molécule biologique activée étant de formule : (iv) silanisation d'un support solide, et fonctionnalisation du support solide silanisé avec une molécule de formule :

(v) réaction de métathèse entre la molécule fonctionnalisant le support et la molécule biologique activée pour former un bras espaceur selon l'invention reliant la molécule biologique et le support.

Dans ce procédé, les substituants X° ; X1 ; X2 ; X3 ; X4 ; Z1 ; Z2 ; Ri ; R2 ; R3 ; et [mo] sont tels que définis ci-dessus.

Selon l'invention, le composé de formule

peut être par exemple un sucre allylé, [mo] étant ledit sucre. Ce sucre allylé peut être obtenu par tout procédé connu de l'homme du métier qui n'altère pas le sucre. Il peut s'agir par exemple du procédé décrit dans le document [5].

Selon l'invention, l'amine secondaire peut en outre être protégée par un groupement protecteur.

Ainsi, le procédé de l'invention peut comprendre en outre une étape de fixation d'un groupement protecteur [Gp] sur la fonction amine secondaire. Le groupement protecteur peut être tel que défini ci-dessus. Sa fixation sur l'amine secondaire peut se faire par tout procédé chimique connu de l'homme du métier, par exemple suivant un des procédés décrits dans le document [7].

Pour mettre en oeuvre les différentes étapes de ce procédé de l'invention, les procédés classiques de chimie organique connus de l'homme du métier peuvent être utilisés. Ainsi, à titre d'exemple, pour l'étape de réduction du nitrile, le procédé décrit dans le document [6] peut être utilisé. Pour l'étape de formation d'une fonction aldéhyde à partir d'une fonction allyle d'une molécule biologique, le procédé d'ozonolyse décrit dans le document [5] peut être utilisé. Pour l'étape d'amination réductrice suivie d'une protection de l'azote entre le nitrile réduit et ladite fonction aldéhyde pour obtenir une molécule biologique activée, le procédé décrit dans le document [7] peut être utilisé. Pour l'étape de silanisation du support solide et de sa fonctionnalisation, le procédé décrit dans le document [8] peut être utilisé. Pour la réaction de métathèse, le procédé décrit dans le document [10] peut être utilisé.

Le bras espaceur de la présente invention peut donc être créé à partir de trois parties qui sont liées

d'une part par amination réductrice suivie d'une protection de l'azote du côté de l'unité moléculaire, et d'autre part lors d'une réaction de métathèse de Grubbs. La méthatèse de Grubbs est par exemple décrite dans le document [11].

L'atome d'azote qui est inséré dans la chaîne carbonée présente plusieurs avantages : obtenu lors de l'accrochage de deux chaînons, il se trouve sous la forme d'une amine secondaire que l'on peut protéger de différentes manières pour conférer une réactivité particulière à l'espaceur. Cette fonction avantageusement modulable au cas par cas par différents groupements protecteurs ou par une molécule participant à la fonctionnalité du bras espaceur, permet de faire varier et de maîtriser l'hydrophilie ou l'hydrophobie du bras espaceur et de contrôler son encombrement stérique. Il est aussi avantageusement possible de moduler le caractère électrophile/nucléophile ou acide/basique de cette partie du bras espaceur : la nature des groupements protecteurs de l'atome d'azote est donc de préférence choisie dans le but d'optimiser des conditions de réactions, d'interactions, d'opérations de caractérisations ou d'analyses, et ce, que ce soit avant ou après clivage de l'espaceur pour libérer l'unité moléculaire. Par exemple avec un groupement acétyle on obtient du fait de sa petite taille un faible encombrement stérique, ce qui permet une optimisation de la reconnaissance moléculaire lors de l'utilisation du bras espaceur, par exemple sur une puce à molécules. Par exemple aussi, avec un groupement

butyle, on obtient un substituant carboné hydrophobe qui rend cette partie du bras espaceur hydrophobe, ce qui permet par exemple une reconnaissance de protéines hydrophiles plus spécifique, plus sélective, vis-à-vis des parties hydrophiles du bras espaceur ( [mo]).

La présente invention fournit donc un bras espaceur (ou « espaceur ») modulable, dont les différentes structures influencent la réactivité du bras, c'est-à-dire son comportement chimique et/ou électrochimique et/ou stérique.

La présente invention est réalisable de manière simple et efficace et l'espaceur présente avantageusement les trois propriétés suivantes, notamment lorsqu'il est mis en oeuvre pour la fabrication de puces à sucres : - tout d'abord, l'espaceur occupe bien la fonction de bras permettant d'éloigner la chaîne sucrée de la surface solide qui supporte cette chaîne.

- ensuite l'espaceur est un bras clivable : il est possible d'ouvrir facilement et de manière ciblée l'espaceur pour isoler le sucre de la phase supportée.

- enfin, l'espaceur, de par son faible taux de fonctionnalité chimique, reste inerte dans de nombreuses conditions de réactions réalisées lors de synthèses organiques sur des unités sucrées par exemple et lors de l'utilisation des puces à sucres.

Outre les avantages précités, les inventeurs ont noté les suivants lors des différentes expérimentations de mise en oeuvre de la présente invention : Le bras espaceur permet de pallier les problèmes stériques dus à la présence du support solide. Il permet d'étudier dans de bonnes conditions stériques les interactions protéines/sucres sur les puces à sucre obtenues. Il résout les problèmes d'encombrement stérique qui se présentaient dans l'art antérieur lors de l'approche de la protéine vers les ligands sucrés et nuisaient aux futures interactions potentielles.

La longueur du bras est modulable : un choix judicieux d'homologues fonctionnels de tailles différentes, en particulier par le choix des réactifs de départ, permet de préparer des espaceurs de tailles différentes.

Il est non seulement possible de choisir la distance entre la chaîne sucrée et le support solide mais aussi de contrôler le caractère hydrophile ou hydrophobe de cette partie de l'espace au moyen du groupement protecteur.

La simplicité de la structure chimique de l'espaceur lui confère des propriétés de non réactivité chimique lors des nombreuses réactions organiques lors de sa fabrication et lors de l'utilisation de la puce à sucre.

- L'espaceur, de par son absence de fonctions chimiques interactives n'a pas d'influence sur des

interactions potentielles avec d'autres molécules, lorsque le système est utilisé dans le cadre d'une puce à sucre ou plus généralement d'une puce à petites molécules.

L'espacer est clivable de manière précise et sélective au niveau de sa double liaison C=C, dans des conditions de réactions qui n'altèrent pas la molécule biologique, par exemple oligosaccharidique.

En effet, on peut utiliser commodément pour le clivage par exemple une ozonolyse (03), une métathèse de Grubbs (catalyseur de Grubbs), ou une dihydroxylation suivie d'une coupure oxydative de diolosmylation (Os04, NaIO), et d'autres réactions chimiques douces connues de l'homme du métier.

Le fait que l'espaceur soit aisément clivable, et que cette coupure ne modifie pas la structure du sucre, permet de réaliser des contrôles analytiques structuraux et conformationnels de la chaîne oligosaccharidique isolée. Il est en outre aisé de calculer la quantité de sondes sucrées accrochées ( « loading ») sur le support solide pendant la synthèse sucrée.

Un des intérêts de cet espaceur, en comparaison avec celui décrit dans le document [1] (l'octènediol par exemple) réside dans l'adaptabilité de sa longueur, de sa fonctionnalité, de sa réactivité et de l'encombrement stérique qui peuvent être générés à volonté.

Les inventeurs notent également que l'espaceur de la présente invention permet la liaison avec une

très grande gamme de saccharides, d'oligosaccharides ou polysaccharides qui sont très souvent présynthétisés et protégés en position anomérique de leur partie réductrice par un groupement allyle. En une étape, ces unités sucrées peuvent en effet être transformées pour se lier directement sur l'espaceur. Ainsi, cet espaceur est avantageusement compatible avec de nombreuses molécules sucrées déjà synthétisées et décrites dans la littérature, par exemple dans les documents [7], [12] et [13].

La présente invention peut par exemple être utilisée pour la fabrication d'une puce à sucres, par exemple d'une puce susceptible d'identifier par criblage des séquences oligosaccharidiques reconnaissant une protéine particulière, par exemple suivant la technique décrite dans le document [1]. Dans cette application, la présente invention permet d'optimiser les procédés de criblage et donc de disposer plus efficacement et plus rapidement de molécules à visée thérapeutique ou biotechnologique. On peut s'attendre à ce que cette capacité existe également dans les autres applications de la présente invention.

La présente invention peut également être utilisée sur les biopuces où un bras espaceur doit faire le lien entre le support solide et des sondes d'oligopeptides, d'oligonucléotides et/ou d'oligosaccharides. En particulier, le bras espaceur de la présente invention peut être utilisé sur une puce à oligopeptides telle que celle décrite dans le document

[3], sur une puce à oligosaccharides telle que celle décrite dans le document [4].

D'autres caractéristiques et avantages apparaîtront encore à l'homme du métier à la lecture des exemples qui suivent donnés à titre illustratif.

Exemples 1) A titre d'exemple, la synthèse d'un espaceur de longueur correspondant à une chaîne de quatorze carbones est exposée ci-dessous, en utilisant des protocoles opératoires choisis parmi ceux accessibles à l'homme du métier. Les références en caractères gras renvoient au schéma réactionnel ci-dessous.

Les composés choisis sont : un monosaccharide (1) du type glucose (1) (N-acéthylglucosamine (GlcNac) : sucre allylé en position 1) constituant l'unité moléculaire [mo] ; le 4-pentènenitrile (3) portant la fonction nitrile à réduire ; et le 7- octényltriméthoxysilane (8) pour la fonctionnalisation du support. Le support solide est constitué par des billes (6) Controlled Pore Glass (CPG) (marque de commerce) à base de silice.

Le schéma réactionnel ci-dessous résume l'ensemble des réactions chimiques entreprises dans ces exemples pour la fixation d'un oligosaccharide (1) sur un support (6) au moyen d'un bras espaceur conforme à la présente invention. Ces réactions chimiques sont indiquées par les lettres A à F. Un exemple d'une réaction de clivage du bras espaceur est présenté dans l'exemple G ci-dessous.

Sur ce schéma réactionnel, les groupements « R » indiqués sur le sucre n'ont pas été différenciés volontairement pour simplifier la représentation. Ces « R » représentent des substituants, identiques ou différents entre eux aux différentes positions sur le cycle formant le sucre, et pouvant les substituants rencontrés généralement sur les sucres. Dans l'exemple particulier présenté ici, le sucre utilisé étant le N- acéthylglucosamine, l'homme du métier n'a aucune difficulté pour identifier les substituants « R » aux différentes positions des composés (1), (2), (5) et (10).

Exemple A : Activation de l'oligosaccharide (réaction A) Une réaction d'ozonolyse est utilisée dans cet exemple. Le procédé utilisé est décrit dans le document [5] Le sucre allylé en position anomérique (1) (0,93 mmol) est dissous dans 5 ml d'un mélange de dichlorométhane et de méthanol (1/1) : le milieu est plongé dans un bain froid à une température de-78°C (acétone + carboglace). L'ozone 03 doit alors barboter dans la solution : dès l'apparition de la couleur bleue (caractéristique d'un excès d'ozone), l'ozone est remplacée par l'argon (ou l'azote). La réaction étant terminée, le milieu est rendu réducteur par ajout de diméthylsulfure Me2S (4,65 mmol, 5 éq) : il se forme alors du diméhtylsulfoxyde DMSO. Le milieu remonte lentement à température ambiante pendant une nuit, puis

est évaporé sous vide : le résidu organique est repris au diéthyléter Et20, et lavé à l'eau. Les phases organiques sont évaporées sous vide, puis co-évaporées au toluène. Le produit brut est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant : éther de pétrole/acétate d'éthyle : 8/2).

Ainsi, l'aldéhyde (2) est obtenu avec un rendement de 75%.

Exemple B : Réduction d'un nitrile (réaction B) Le procédé chimique utilisé est décrit dans le document [6].

L'hydrure de lithium aluminium LiAlH4 (381 mg, 10,03 mmol, 1 éq) est introduit dans le diéthyléther fraîchement distillé (20 ml).

Le 4-pentènenitrile (3) (814 mg, 1 ml, 10,03 mmol) est ajouté lentement au milieu réactionnel agité sous atmosphère d'azote, à une température de 0°C (bain de glace). L'agitation doit continuer environ 20 minutes à température ambiante.

Ensuite de l'eau (0,4 ml), puis une solution de soude à 20% dans l'eau (0,3 ml), et enfin une autre quantité d'eau (1,4 ml) sont additionnées : ces ajouts doivent être réalisés avec beaucoup de précaution car la neutralisation peut être violente. Lorsque la solution de diéthyléther est décantée du résidu blanc inorganique, le surnageant est extrait.

Le solide (résidu) blanc est lavé à deux reprises au diéthyléther, et les phases organiques sont réunies. Une solution d'acide chlorhydrique HC1 3 M est

ajoutée à cette phase organique pour obtenir un pH acide (pH<7) : le 4-pentènenitrile n'ayant pas réagi reste dans la phase éthérée, alors que l'amine passe en phase aqueuse.

Après extraction, la phase aqueuse est donc conservée et se voit ajouter une solution de soude NaOH 3 M pour passer à un pH basique (pH>7) : le produit aminé va alors passer dans la phase éthérée pendant cette nouvelle extraction. La phase éthérée ainsi extraite est séchée sur sulfate de magnésium (MgSO4), puis évaporée sous vide (évaporateur rotatif).

L'amine brute (4) est alors purifiée par distillation fractionnée (four à boules, T#96°C~9°C).

Analyse 1H RMN (Brücker AM 250) : 5,82 (ddt, 3Jtrans=18 Hz, 3Jcis=13 Hz, 3J (HI) =6, 5 Hz, 1H, CH=), 5, 00 (m, 2H, CH2=), 2, 70 (t, 3JII) =6,5 Hz, 2H, CHIII), 2,10 (ttd, 3J (HII) =6,5 Hz, 3J (HC) =6,5 Hz, 3J (H2C-) =1,5 Hz, 2H, CHI), 1,70 (s, 2H, NH2), 1,56 (quint., 3J (HII) =3J (HIII) =6,5 Hz, 2H, CHII).

Analyse 13C RMN (Brücker AM 250) : 138,6 (CH=), 114,6 (CH2=), 42,0 (CH2-N), 33, 1 (CH2, 31, 4 (CH2).

Exemple C : Amination réductrice (réaction C) Le procédé chimique utilisé est décrit dans le document [7].

L'aldéhyde (2) (20,87 mmol) est mis en solution dans le diméthylformamide (1,2 ml) fraîchement distillé

sur hydrure de calcium (CaH2) : le milieu est mis sous agitation et l'amine (4) (31,30 mmol, 2 éq) est additionnée. Après une vingtaine de minutes, le cyanoborohydrure de sodium NaBH3CN (83,47 mmol, 4 éq) est ajouté au mélange, qui est laissé sous agitation à température ambiante pendant une nuit.

Si la réaction n'est pas terminée, il est possible de rajouter du NaBH3CN (1 éq). Ensuite, lorsque la réaction est terminée, la pyridine (2, 4 ml) et l'anhydride acétique AC20 (83,47 mmol, 2 éq/amine) sont ajoutés au mélange.

Lorsque la réaction est terminée (environ 1 heure après l'addition), le composé brut est extrait au diéthyléther et à l'eau. Les phases organiques réunies sont séchées sur sulfate de magnésium (MgS04), puis filtrées, évaporées sous vide puis co-évaporées au toluène.

Le composé (5) est alors purifié par chromatographie sur gel de silice (gradient d'éluant cyclohexane/acétate d'éthyle de 7/3 à 5/5).

Exemple D : Fonctionnalisation du support solide (réactions D et E) Le procédé chimique utilisé est décrit dans le document [7].

Les billes Controlled Pore Glass (6) (CPG, 500 Å, 2 g) sont agitées de manière très douce pendant 2 heures à température ambiante dans une solution de soude NaOH (700 mg) dans l'eau désionisée EDI (6 ml) et l'éthanol EtOH à 99% (8 ml). Puis les billes sont

centrifugées, le surnageant est extrait, les billes sont lavées abondamment à l'EDI pour atteindre un pH neutre.

Les billes sont ensuite séchées sous vide (évaporateur rotatif), et restent 1 heure à température ambiante dans une solution d'acide chlorhydrique (HCl 0,2 N) avant d'être lavées à l'eau, centrifugées, séchées puis mises à l'étuve pendant 15 minutes à 80°C.

Elles sont alors lavées à l'éthanol, puis au toluène (centrifugeuse).

Elles sont ensuite séchées avant de participer à l'étape suivante de silanisation dont le mélange réactionnel aura été préparé juste avant l'emploi.

Les billes CPG (7) sont introduites dans un mélange de toluène (45 ml), triéthylamine Et3N (1,35 ml) et de 7-octényltriméthoxysilane (8) (C1lH2O3Si, M 232,39, 100 pi) : le milieu réactionnel est mis à 80°C pendant 16 heures (étuve).

Les billes sont extraites du mélange par centrifugation, et sont rincées à l'éthanol à plusieurs reprises puis séchées (évaporateur rotatif). Elles sont alors soumises à une température de 110°C pendant 3 heures pour réaliser l'étape de réticulation (étuve).

Les étapes de silanisation et de réticulation étant ainsi réalisées, il est nécessaire de neutraliser l'acidité et l'hydrophilie résiduelles des silanols de surface n'ayant pas réagi au cours de l'étape de silanisation ( « end-capping »). Une solution de chlorure de triméthylsilyle TMSC1 (109 mg, 130 pi) et de triéthylamine Et3N (506 mg, 700 ul) dans le

dichlorométhane DCM (10 ml) est ajoutée aux billes CPG silanisées, et le mélange est laissé sous agitation douce pendant 2 heures à 25°C.

Les billes sont alors rincées abondamment au dichlorométhane (centrifugeuse), puis à l'acétonitrile (centrifugeuse). Elles sont ensuite séchées sous vide (évaporateur rotatif), et mises à l'étuve (80°C) pour parfaire le séchage.

Les billes silanisées (9) sont ainsi obtenues.

Exemple F : Réaction de métathèse (réaction F) Le procédé chimique utilisé est décrit dans le document [9].

Les billes CPG silanisées (9) (2 g, 30 umol/g) sont mises sous agitation dans le dichlorométhane (20 ml), sous atmosphère d'azote. Le système sucre- espaceur (5) (300 umol, >5 éq) est alors additionné, au milieu, avec un catalyseur de Grubbs (6 mol, 5 mg, 0,1 éq). Le milieu réactionnel est alors porté à reflux, soit une température de 44°C.

Après 6 heures, une autre portion de catalyseur de Grubbs (6 mol, 5 mg, 0,1 éq) est ajoutée. Le mélange est maintenu à 44°C pendant encore 6 heures, puis est ramené à température ambiante.

Les billes sont filtrées, et lavées abondamment au dichlorométhane et à l'éthanol (centrifugeuse). Les billes sont ensuite évaporées sous vide pour être séchées.

Les billes sucrées (10) sont ainsi obtenues.

Schéma réactionnel des exemples A à F

Exemple G : Clivage de la sonde (réaction G) Le procédé chimique utilisé est décrit dans le document [10].

Lorsque le système (10) (support solide- espaceur de la présente invention-chaîne oligosaccharidique) a été obtenu, il est possible de cliver l'espaceur, sans dénaturer la chaîne sucrée.

Le protocole expérimental est décrit dans le document [5]. L'équation chimique est la suivante :

Les billes CPG sucrées (10) sont mises sous agitation lente dans un mélange dichlorométhane/méthanol 1/1. Le milieu est amené à une température de-78°C (acétone+azote liquide).

Ensuite, on fait buller l'ozone Os dans le milieu réactionnel jusqu'à ce qu'une couleur bleue apparaisse.

Ensuite, de l'argon bulle quelques minutes dans le mélange, avant de neutraliser le milieu avec du diméthylsulfure puis le milieu réactionnel est laissé pour remonter vers la température ambiante pendant une nuit.

Les billes sont reprises au diéthyléther, filtrées, rincées à plusieurs reprises au diéthyléther et à l'eau.

Les billes (12) sont alors mises de côté, et le surnageant est extrait (diéthyléther/eau), la phase organique est séchée sur sulfate de magnésium MgSO4, évaporée sous vide et co-évaporée au toluène.

Le produit (11) est alors obtenu.

2) D'autres molécules selon l'invention ont été fabriquées en utilisant les protocoles opératoires exposés ci-dessus (exemples A à F). Ces molécules sont détaillées dans les exemples suivants.

Exemple H : Dans cet exemple, [mo] est un peptide RGD (Arg- Gly-Asp) accroché au bras espaceur de l'invention par son extrémité C-terminale. Le support est le même que dans le protocole opératoire exposé ci-dessus. Ainsi, dans cet exemple, la molécule (1) du schéma réactionnel des exemples A à F est remplacée par RGD.

Des billes sur lesquelles le peptide RGD est accroché sont ainsi obtenues. Elles sont de formule :

[mo] : peptide RGD accroché par C-terminal (Arg-Gly-Asp) Exemple 1 : Cet exemple utilise la même [mo] que dans l'exemple H, mais accroché au bras espaceur de l'invention par son extrémité N-terminale. De plus, <BR> <BR> <BR> <BR> 1<BR> <BR> <BR> fxh<BR> <BR> <BR> <BR> dans n du bras espaceur de l'invention, X1 est C et n = 20. Par C, on entend bien entendu un carbone hydrogéné.

Les billes obtenues sont de formule :

[mo] est un peptide RDG accroché par l'extrémité N-terminale

Exemple J : Dans cet exemple, [mo] est un « sialyl- lewis a ». Le support est le même que dans le protocole opératoire exposé ci-dessus. Le groupement protecteur est Boc. Sa chimie de fixation est connue de l'homme du métier.

Des billes sur lesquelles le sialyl-lewis a est accroché sont ainsi obtenues. Elles sont de formule :

[mo] est un sialyl-lewis a, avec"1"= H ou CH3 Exemple K : Dans cet exemple, [mo] est un composé sulfaté.

Le support est le même que dans le protocole opératoire exposé ci-dessus.

Des billes sur lesquelles le composé sulfaté est accroché sont ainsi obtenues. Elles sont de formule :

[mo] est un composé sulfaté, Z étant un groupe protecteur (par exemple Gp défini dans la partie"exposé de l'invention) Dans un autre protocole, le carbone X4 a été remplacé par un atome de soufre. Les billes correspondantes ont été obtenues.

Exemple L : Dans cet exemple, [mo] est un sucre protégé. Le support est le même que dans le protocole opératoire exposé ci-dessus.

Des billes sur lesquelles le sucre protégé est accroché sont ainsi obtenues. Elles sont de formule :

sucre protège Exemple M : Dans cet exemple, [mo] est un acide sialique.

Le support est le même que dans le protocole opératoire exposé ci-dessus.

Des billes sur lesquelles l'acide sialique est accroché sont ainsi obtenues. Elles sont de formule :

Ac. siaiique

Références bibliographiques [1] WO-A-03/008927 : Dukler, N. Dotan, A. Shtavi, A.

Gargir.

[2] H. M. I. Osborn, T. H. Khan, Tetrahedron, 1999,55, 1807-1850.

[3] D. A. Stetsenko, M. J. Gai, Bioconjugate Chemistry, 2001,12, 576-586.

[4] US-A-6,579, 725 : P. H. Seeberger, R. B. Andrade.

[5] R. Roy, C. A. Laferrière, Canadian Journal of Chemistry, 1990, 68, 2045-2054.

[6] L. H. Amundsen, L. S. Nelson, Journal of the American Chemical Society, 1951, 73, 242-244.

[7] J. F. Tolborg, K. J. Jensen, Chemical Communication, 2000,147-148.

[8] F. Vinet, A. Hoang, EN 00 16940.

[9] K. Biswas, D. M. Coltart, S. J. Danishefsky, Tetrahedron Letters, 2002, 43, 6107-6110.

[10] C. Sylvain, A. Wagner, C. Miokowski, Tetrahedron Letters, 1997, 38, 1043-1044.

[11] Q. J. Plante, E. R. Palmacci, P. H. Seeberger, Science, 2001, 291, 1523-1527.

[12] P. H. Seeberger, Chem. Com., 2003,1115-1121.

[13] D. M. Ratner, E. R. Swanson, P. H. Seeberger, Org.

Lett. 2003,4717-4720.