実施例1
 まず、下記方法により、St-VBC-AAm共重合単分 散微粒子(SVA粒子)を得た。
SVA粒子の製造方法
 撹拌棒、アリーン式冷却管、セラムラバー� ��攪拌シールを取り付けた300ml四つ口丸底フ� �スコに、モノマーとしてスチレン(St)2.85g、4- ビニルベンジルクロリド(VBC)0.10g、アクリル� �ミド(AAm)0.05g、溶媒として水75gを入れ、70℃� �300rpmにて攪拌した。所定温度の恒温槽中で30 分間窒素置換を行った後、開始剤として過硫 酸カリウム(KPS)0.1gを水10gに溶解させたものを 注射器で系内に添加した。その後さらに30分� ��窒素置換を行い、集合反応を24時間行った� �重合終了後のラテックス分散液は13500rpm、12� ��間、15℃の条件で遠心分離を行い、上澄み� �デカンテーションにより除去した後、下層� �粒子を水で再分散させる操作を4回繰返して� ��製し、粒子分散液を得た。
 上記ソープフリー乳化共重合における転化� ��を重量法により求めたところ、83.5%であっ� �。

 続いて、上記で得たSVA粒子表面に、下記方� ��によりイニファータ基を導入した。
イニファータ基導入方法
 300ml三つ口丸底フラスコにSVA粒子を固形分� �2.0g入れ、全量が70gとなるように蒸留水を加� ��た。この反応容器に撹拌棒、攪拌シールを� ��りつけ氷冷下200rpmで攪拌した。N,N-ジエチル ジチオカルバミン酸ナトリウム三水和物(NaDC) 0.74gを30gの水に溶解させ、系内に少しずつ加� ��た。その後、室温にて一晩反応させた後、1 3500rpm、12分、15℃の条件で遠心精製を4回行い 、イニファータ基としてN,N-ジエチルジチオ� �ルバメート基を有するSVA-DC粒子を得た。

 上記にて得たイニファータ基導入SVA粒子に� ��し、その形態を以下の方法で確認した。
<イニファータ基の定量>
 NaDCはC=S結合(n→π ^* )に起因する紫外領域での吸収が352(nm)付近に� ��り、希薄な溶液ではLambert-Beerの法則に従い� ��濃度に比例して吸光度が上昇した。そこでS VA粒子とNaDCとの改質反応後、遠心精製の際に 得られる上澄み液(FT、W1~3)の352(nm)における吸 光度から粒子へ導入されたイニファータ量を 測定した。
 吸光度の測定は超純水を用いてベースライ� ��を引き、サンプルを分光光度計(BioSpec-1600 S eries、島津製作所製)に入れ、20℃にて行なっ� ��。1つのサンプルから得られた上澄みの吸光 度の和(FT+W1+W2+W3)を求め、母液から得た検量� �(図2)より上澄み液中に残存するNaDC量を求め� ��。さらに、仕込みイニファータ量から残存� ��を差引くことで、粒子への固定化量を算出� ��た。

 以上の上澄み定量から求めた粒子表面のイ� ��ファータ量は、2.6units/nm ² であった。したがって、上記イニファータ基 導入処理により、SVA粒子に十分な量の官能基 を導入できたことが示された。

<粒子の形態>
 透過型電子顕微鏡(TEM)において凹凸のある� �料に電子線を照射すると試料の厚さによっ� �吸収が起こり、濃淡のある像が得られる。� �た、対物絞りを焦面の位置に挿入して観察� �ると、試料によって散乱された電子のうち� �ある角度以上の角度で散乱されたものは遮� �される。このようにして生じるコントラス� �は試料の厚さによって異なる。
 試料はCuのTEM用グリッドにコロジオン膜を� �り付けて、支持膜の上に載せた。コロジオ� �とは、硝化度の低い(11~12%)=ニトロセルロー� �の酢酸アミル溶液である。コロジオン溶液� �、1.5~2%酢酸アミル溶液である。コロジオン� �液を水面上に一滴落とすと、水の表面張力� �よって液滴は水面上に広がる。そして、溶� �が蒸発すると水面上に100Å程度の薄膜がで� �る。コロジオン膜の厚さは水温でコントロ� �ルできるため、40℃程度の水面を利用して膜 を作製した。これを銅メッシュ上に貼り付け て乾燥させ、支持膜とした。

 作製した各ラテックス粒子を適当な濃度に� ��釈し、金属メッシュ上に支持されたコロジ� ��ン膜に沈着固定した。これをTEM(JSM-5200、日� ��電子製)にて適当な倍率にて撮影し、粒子径 体を観察した。TEMによって撮影したSVA(図3(A)� ��よびSVA-DC(図3(B))の写真を図3に示す。
 また、この写真の粒子径をノギスを用いて� ��定し、次式に従って乾燥状態における粒子� ��数平均粒子径(D _n )、および重量平均粒子径(D _w )を算出した。また、D _w /D _n の値から粒子径の単分散性を評価した。
   D _n =σN _i D _i /N _i
   D _w =σN _i D _i ⁴ /N _i D _i ³
*N _i :直径D _i である粒子数

 電子線が物質に衝突すると散乱を受ける� ��この散乱電子は対物レンズの絞りによって� ��ットされて像面に到着しないために暗いコ� ��トラストを生じる。この散乱に程度は重量� ��さに比例する。非晶質試料がコロジオン支� ��膜状に分散している場合のコントラストは� ��この散乱コントラストが支配的となる。し� ��がって、図3において、黒く写っている影が スチレンを主成分とするコア部分である。

 図3よりSVA粒子の乾燥粒径は数平均粒子径(D _n )が334.2(nm)、重量平均粒子径(D _w )が334.6(nm)、単分散性(D _w /D _n )は1.001となり、単分散コア粒子が作製できた ことが確認された。
 なお、一般に粒子懸濁液を平滑な基板上で� ��燥させると、媒体の流れによって粒子が移� ��し、蒸発速度の大きいところで粒子は基板� ��集積する。また、粒子と基板の相互作用が� ��い場合には、媒体の表面張力により粒子間� ��引力が働き、粒子は局所的に集積する。そ� ��ため、図3の各サンプルは粒子が密集した状 態となったと考えられる。
 図3および測定値より明らかなように、SVA粒 子は形およびサイズの均一な単分散粒子であ った。また、粒子表面へイニファータ基導入 した後も、同様に均一粒子を維持しているこ とが確認された。

<水中粒子径の測定>
 動的光散乱法とは微粒子分散液の散乱光の� ��らぎを測定することにより粒子径を求める� ��法である。懸濁溶液や溶液中に分散した微� ��子は常にミクロブラウン運動をしている状� ��にあり、その動きは大きな粒子ほど遅く、� ��さな粒子ほど速い。粒子間相互作用が無視� ��きるような十分希薄なラテックス中にレー� ��ー光(He-Neレーザー:632.8nm)を入射すると、粒� ��により光は散乱されるが、散乱される光の� ��長は粒子自体のミクロブラウン運動により� ��間とともにゆらぐ。この光の波長のゆらぎ� ��、それぞれの粒子の粒径に対応している。� ��ンホール系の光子検出装置によりこのゆら� ��を観察し、光子相関法を用いてその自己相� ��関数などを解析することにより、粒径やそ� ��分布についての情報を得ることができる。� ��の方法により求められた粒径は、流体力学� ��半径(d)であり、Stokes-Einsteinの式により算出� ��れる。
   d=kT/(6πηD)
D:拡散係数、k:ボルツマン定数、T:絶対温度

 実際の測定では、生成した各粒子を少量取� ��、蒸留水で適当な濃度に希釈して全透明セ� ��に入れ、PCS(Photon Correlation Spectroscopy:PAR III 、大塚電子製)を用いて、ラテックス粒子の� �中粒径を適当な温度にて測定した。また、� �分散性の指標となる分散度D _w /D _n を計算した。
 前記動的光散乱法により測定したSVA粒子の� ��体力学的半径は、370(nm)であり、分散度は1.0 14であった。
 以上の測定結果から、本発明にかかる分子� ��別材料において、ソープフリー乳化重合に� ��る単分散粒子が、形態的にもイニファータ� ��の導入に対しても、基材となる粒子として� ��適であると考えられる。

 続いて、上記製造方法によるSVA-DC粒子に鋳� ��分子(タンパク質)を吸着させ、その吸着状� �を分析した。まず、タンパク質の吸着方法� �説明する。
タンパク質の吸着方法
 上記方法で作製したSVA-DC粒子2.5mg(固形分)を 2mLマイクロチューブに取り、10mMリン酸ナト� �ウム緩衝液(SPB)(pH7.0)で3回バッファー置換を� ��て完全に上澄みを取り除いた。その後、500p pmのウシヘモグロビン(BHb)溶液を200μL加え、� �ーモミキサーで振り混ぜながら37℃で1時間� �粒子とタンパク質を作用させた。
 粒子とタンパク質を作用させた後、遠心分� ��にて上澄み180μLを除去し(非結合画分FT)、さ らに同バッファー180μLを加えて遠心分離を行 い、3回洗浄した(洗浄画分W1~W3)。

<タンパク質吸着量の定量>
 下記2つの定量法により、タンパク質吸着量 を定量した。
 一つはビシンコニン酸(BCA)法によるタンパ� �質吸着量である。
 96穴マイクロプレート(IWAKI製)に200μLのBCA溶� ��(ReagentA:ReagentB=50:1で混合)と、FT、W1~W3のサン プル溶液5μLを打ち、37℃で2時間インキュベ� �トした。測定はマイクロプレートリコーダ� �(MPR A4i、東ソー製)で行い、波長570nmでの吸� �度を測定した。また、このとき濃度既知の� �ンパク質溶液を調製し、検量線を作成した� �
 粒子へのタンパク質の吸着量は、仕込みの� ��ンパク質量から上澄み(FT、W1~W3)中の未吸着� ��ンパク質量を差引くことによって求めた。

 他方は、Soret吸収帯スペクトル測定による� �量である。
 BHbの構成成分であるヘムは、鉄-ポルフィリ ン錯体の構造をもつ。ポルフィリン環の吸収 スペクトルを測定すると、400nm付近にSoret吸� �帯スペクトルが観察される。この性質を利� �して、遠心分離により得た上澄み(FT、W1~W3)� �波長405.5での吸光度を測定した。また、この とき濃度既知のタンパク質溶液を調製し、検 量線を作成した。
 粒子へのタンパク質の吸着量は、BCA法と同� ��に、仕込みのタンパク質量から上澄み(FT、W 1~W3)中の未吸着タンパク質量を差引くことに� ��って求めた。

 上記両測定から求めたタンパク質吸着量を� ��時的に表したグラフを図4に示す。
 また、BHb溶液を500ppmとしたサンプルと、1000 ppmとしたサンプルについて、SVA-DC粒子へのBHb 吸着量の比較を行った。一粒子あたりのタン パク質吸着量(図5(A))、仕込みタンパク質を100 としたときの吸着した全タンパク質の割合(� �5(B))を図5に示す。

 図4より、タンパク質は反応開始後直ちに粒 子上へ吸着していることが明らかである。吸 着は反応時間15分で平衡に達し、その後吸着� ��はほぼ一定であった。
 したがって、イニファータ基を導入した単� ��散微粒子をタンパク質溶液中で作用させる� ��とにより、容易に吸着が可能であることが� ��かった。
 また、図5(A)より、鋳型分子タンパク質溶液 を500ppmとした際も、1000ppmとした際も、吸着� �はほぼ同じであったが、タンパク質濃度が50 0ppmあるいは1000ppmの場合、それぞれのBHb全量� ��対しての吸着率は約50%と25%であった(図5(B))� ��コア粒子1個あたりの表面のうちBHbにより被 覆されている割合(表面被覆率)は、どちらの� ��度においても3割程度であった。
 この結果から、タンパク質の粒子への吸着� ��には上限があり、本試験例においてSVA-DC粒� ��にBHbを吸着させた場合には、表面被覆率3割 が上限であると考えられる。また、タンパク 質濃度500ppmと1000ppmで粒子に吸着したタンパ� �質量が同じであったことから、より低濃度� �上限までの吸着が可能であることが示唆さ� �た。

 続いて、上記方法により鋳型分子(タンパク 質)を吸着させたSVA-DC粒子へ下記方法でシェ� �層を導入し、その粒子の状態を分析した。
シェル層の導入
 表面に光イニファータ基をもつSVA-DC粒子を� ��ア粒子とし、UV照射によるリビングラジカ� �重合によって表面にAAmシェル層を有するコ� �シェル粒子の作製を行った。
 上記方法により作製したSVA-DC(水中粒径360nm) 、モノマーとしてアクリルアミド(AAm)を2.0g、 アクリル酸(AAc)0.04g、架橋剤としてN,N’-メチ� ��ン-ビス-(アクリルアミド)(MBAAm)を0.36gに、溶 媒を全量が200gとなるように加え、反応容器� �入れた。前記反応容器にリービッヒ冷却管� �取り付け、スターラーチップにて攪拌、窒� �雰囲気下で、室温にて1時間、400Wの高圧UVラ� ��プにてUV照射を行った。UV照射後の反応液は 、13500rpmで35分、15℃の条件で上澄みが透明に なるまで遠心分離、デカンテーション、再分 散を3回繰り返して精製を行った。これによ� �、表面にAAmシェル層を有するSVA-A粒子を得た 。

 下記表1に示すようなSVA-DCの添加量(x)、溶 媒の種類、SVA-DC粒子上へのタンパク質(BHb)吸� ��の有無の条件とした試験例1~3について、シ� ��ル層導入後の動的光散乱およびTEMによる粒� ��径、導入前後での粒径の増大をそれぞれ評� ��した。結果を下記表1に示す。また、下記試 験例2のシェル層形成後のTEM画像を図6に示す� ��

 図6の画像から、コアシェル型粒子が形成 されていることが明らかである。中央の黒い 影がコア部分であり、その周囲の灰色の影が シェル部分である。ポリアクリルアミド(PAAm) シェル層の厚さは150nm程度であり、イニファ� ��タ法によるUVグラフト重合が十分に進行し� �といえる。

 表1に示すとおり、いずれの試験例において も粒径の増大が認められ、PAAmシェル層の導� �が達成されたことが示唆された。また、粒� �添加量が減少するにつれ、得られるSVA-A粒子 の粒径が増大する傾向にあった。これは、粒 子添加量の違いはすなわち反応系内の重合開 始点濃度の違いであることから、重合開始点 濃度が低いほど一つの開始点に取り込まれる モノマー量が増加するため、結果として粒径 が増大したものと考えられる。
 また、溶媒を水としてもリン酸バッファー( SPB)としても重合の進行は十分に認められ、� �ンパク質を吸着させたSVA-DC粒子においても� �しい粒径の増加、すなわちPAAmによるシェル� ��の形成が認められた。
 以上のことから、鋳型分子を吸着させたコ� ��粒子表面において、イニファータ法によるU Vグラフト重合を行うことにより、シェル層� �導入が可能であることが確認された。
 また、コア粒子の添加量の調整により、前� ��シェル層の層厚の制御が可能であることが� ��唆された。

 続いて、シェル層を導入したSVA-A粒子から� �鋳型分子(タンパク質)を溶出し、得られた分 子識別材料を評価した。
タンパク質の溶出
 上記したシェル層の導入例において、SVA-DC0 .5g、AAm0.5g、MBAAm0.09g、AAc0.01gとし、溶媒とし� �SPBを全量が200gとなるように加えて作製した� ��ンプルを用い、シェル層からのタンパク質� ��溶出を行った。
 ここで用いたSVC-DC粒子は、タンパク質(BHb)� �着反応を行った後のものである。また、高� �UVランプの照射によるグラフト重合の開始か ら10分、20分に定量送液ポンプを用いてサン� �リングを行い、30分で重合反応を終了した。 これにより、所定の重合時間に応じたコアシ ェル(SVA-A)粒子を得た。それぞれのサンプル� �ついて上記の方法で遠心精製を行い、下記� �ャラクタリゼーションを行った。

 前記各コアシェル粒子サンプル2.5mg(固形� ��)は、2mLマイクロチューブに入れ、コア粒子 表面に吸着させたBHbの溶出を行った。すなわ ち、前記マイクロチューブに、タンパク質溶 出液として10wt%SDSを含む10%AcOH溶液(SDS:AcOHaq)を 180μL加え再分散させた後に、13500rpm、10分、5� ��の条件で遠心分離を行い、上澄み180μLを除� ��する操作を3回繰り返した(溶出画分R1~R3)。� �ンパク質溶出後のサンプルは10mM SPB(pH7.0)で� ��分に洗浄し、インプリント空隙を有する粒� ��(分子識別粒子)を得た。

<コアシェル粒子のキャラクタリゼーショ� �>
 上記で得たコアシェル粒子は、PCS(動的光散 乱法による水中粒径)、TEM、および電気泳動� �動度の測定により行なった。PCSおよびTEMに� �る測定は前述の方法と同様とした。以下、� �気泳動移動度の測定方法を説明する。

 コンパクトゼータ電位測定装置(ZEECOM、マイ クロテック・ニチオン社製:セル厚み0.76nm、� �止層0.15nm、電極間距離9cm)を用いて各粒子の� ��気泳動移動度を測定した。1mMのKCl水溶液に� ��散させた各粒子(SVA-DC粒子および重合時間を 10分、20分、30分とした各SVA-A粒子)をセル内に 満たし、循環水を用いてセル内を所定の温度 に保った。ここに電圧をかけ静止面に浮遊し ている粒子の移動度を測定し、次式を用いて 電気泳動移動度を算出した。測定はそれぞれ 20個の粒子について行い、その平均値を用い� ��。
   μ=v×d/V
v:移動速度、d:電極間距離、V:電圧
 電気泳動移動度(EPM)およびPCSの測定結果を� �7に示す。また、SVA-DC粒子および重合時間20� �としたSVA-A粒子のTEM画像を図8に示す。

 図7において、重合前後の各サンプルの水中 粒径に大きな変化は見られなかった。動的光 散乱法による測定値は±25nm程度の標準偏差を 含んでおり、この範囲内における粒径変化を 正確に測定することは困難であると考えられ る。一方、電気泳動移動度では、重合の進行 に伴い、移動度が負へ増大する傾向が認めら れた。
 コア粒子はアニオン性開始剤であるKPSを用� ��て作製しているため、その表面はKPS由来の� ��電荷を帯びている。重合に伴い負方向へ移� ��度が増大する理由としては、PAAmシェル層導 入の際、モノマーとして微量のAAcを用いてい ることに起因すると考えられる。AAcは構造中 にビニル基とカルボキシル基を有しており、 このカルボキシル基がpH依存的に解離し負電� ��をもつ。すなわち、本測定は1mMのKCl中で行� ��ったため、AAcを有するシェル層が導入され� ��ほど、コアシェル型粒子表面の電荷はコア� ��子と比較して負方向に強くなったと考えら� ��る。
 以上から、電気泳動移動度により、鋳型分� ��を吸着したコア粒子上にシェル層が形成さ� ��たことが定性的に確認された。また、重合� ��応時間に比例して重合度合いに変化が見ら� ��たことから、反応時間によるシェル層の層� ��制御の可能性が示唆された。

 さらに、図8より、重合前後で粒子の様子 が明らかに変化していることが観察された。 SVA-DC粒子においては、一つ一つの粒子の表面 がはっきりとしているのに対し、グラフト重 合を20分行なったSVA-A粒子においては、各粒� �の輪郭が不明瞭であり、表面にぼんやりと� �いスキン層が存在する様子が伺えた。この� �とからも、コア粒子の表面へ薄いPAAmシェル� ��が導入されていることが示唆された。

<タンパク質溶出量の定量>
 定量は、前述のSoret吸収帯スペクトル測定� �同様に行った。ただし、遠心分離により得� �上澄み(R1~R3)の波長395.0nmでの吸光度を測定し た。また、溶出液に所定のタンパク質(BHb)を� ��かした濃度既知のBHb-SDS:AcOHaqを調製し、検� �線を作成した。
 前記方法により、上澄み(R1~R3)中のタンパク 質量として算出される値として、粒子から溶 出されたタンパク質量を得た。SVA-A一粒子あ� ��りのBHb吸着量および溶出量を図9に示す。な お、各サンプルにおける吸着量とは、コア(SV A-DC)粒子表面にもともと吸着していたBHb量を� ��し、溶出量とはPAAmシェル層のグラフト重合 反応後に得られたコアシェル(SVA-A)粒子から� �出されたBHb量を表す。

 図9によれば、重合時間10分のサンプルにお� ��ては、ほぼ完全にBHbが溶出された。一方、� ��合時間20分および30分のサンプルでは、吸着 量の7割程度のBHbが溶出した。このことから� �重合時間が長くなるほど、導入されるPAAmシ� ��ル層の厚さは増大し、コア粒子表面に存在� ��るBHbの溶出量は減少すると推察された。
 以上より、表面に鋳型分子を吸着し、シェ� ��層を導入したコアシェル粒子から、十分量� ��鋳型分子の溶出が可能であることが明らか� ��なるとともに、該粒子表面において、鋳型� ��子溶出量に相当する程度のインプリント空� ��が形成されたことが示唆された。

<ターゲット分子の捕捉>
 上記したタンパク質の溶出工程により得た� ��重合時間の異なる各分子識別粒子(MIP)につ� �て、ターゲットタンパク質の捕捉能を検討� �た。
 すなわち、各粒子2.5mgに200μLのBHb溶液(500ppm) を加え、37℃において1時間インキュベートを 行い、粒子へのBHbの捕捉を試みた。粒子に捕 捉されたタンパク質の定量は、上記したタン パク質溶出量の定量と同様の方法による。
 また、コントロールとして、タンパク質未� ��出の各コアシェル(SVA-A)粒子についても、重 合時間の異なるサンプル毎に同様の試験を行 った。結果を図10に示す。

 ここで、図10において、各MIPは図9の各サ� ��プルに相当し、SVA-A粒子からのBHb溶出量に� �当する程度のインプリント空隙を有すると� �えられる。一方、コントロールの粒子にお� �ては、コア粒子表面に吸着させたBHbはその� �まシェル層内に存在しており、インプリン� �空隙は存在しない。すなわち、コントロー� �におけるBHb吸着量は、シェル層表面に不可� �的に吸着したBHb量を示す。MIPのシェル層表� �にもこれと同程度のBHbの吸着が起きている� �考えられる。このことから、MIPの再捕捉量� �、各重合時間におけるMIPへのBHbの全吸着量� �らコントロールへのBHbの吸着量を差引いた� �とした。再捕捉量として有意な値が得られ� �ことは、すなわち、MIP表面にインプリント� �隙が存在し、その空隙に対して位置選択的� �BHbの吸着が起きていることを定性的に裏付� �るものである。

 図10によれば、どの重合時間のMIPにおい� �も再捕捉が認められ、シェル層表面にBHbの� �ンプリント空隙を有する微粒子が得られた� �とが示唆された。

実施例2
 下記MIP製造例における製造過程、及び製造� ��れた分子識別粒子(MIP)について、以下記載� �る各試験を行った。
MIP製造例
(1)St-VBC-AAm共重合単分散微粒子(SVA粒子)にイニ ファータ基としてN,N-ジエチルジチオカルバ� �ート基を導入し、SVA-DC粒子(コア粒子)を得た 。
(2)500ppm BHb溶液40mLに前記SVA-DC 0.5gを添加し、 pH7.0及び37℃の条件下で1時間インキュベート� ��た。その後、遠心分離により粒子を分離し� ��これを洗浄してBHbを表面に吸着させたSVA-DC� ��子を得た。
(3)続いて、前記SVA-DC粒子 0.5g、アクリルアミ ド(AAm) 0.25g、N,N’-メチレン-ビス-(アクリル� �ミド)(MBAAm) 0.045g、アクリル酸(AAc) 0.005gに10m M SPB(リン酸バッファー、pH7.0)を加え、合計20 0gの混合液とした。この混合液にUVを照射し� �室温で1時間重合反応させた。反応後、遠心� ��離及び洗浄を繰り返して表面にAAmのシェル� ��を有するSVA-A粒子(コア-シェル粒子)を得た� �
(3)10wt%SDS:10%AcOH溶液(pH2.8)に前記SVA-A粒子を加� �、室温下で遠心分離を3回繰り返して粒子に� ��着したBHbを溶出させ、固形分としてBHbをイ� ��プリントしたMIPを得た。

<コア粒子表面へのターゲット分子の吸着&g t;
 上記MIP製造例の(2)工程において、SVA-DC粒子� ��吸着したBHb量を定量した。500ppm BHb溶液中� �BHb量(投入量)に対する実際のBHb吸着量(吸着� �)を図11に示す。
 図11に示すとおり、BHb投入量の43%がSVA-DC粒� �への吸着に消費され、これらはSVA-DC粒子表� �の約30%を被覆していた。

<シェル層の形成>
 上記MIP製造例において、(2)工程で得たSVA-DC� ��子、(3)工程で得たSVA-A粒子、(2)工程を経ず� �(3)工程を行なったコントロール粒子(BHb未吸� ��)のそれぞれについて、DLSによる水中粒径測 定及び電気泳動移動度測定を行なった。結果 を図12に示す。
 図12に示すとおり、各サンプルの水中粒径� �SVA-DC粒子で342nm、SVA-A粒子で350nm、コントロ� �ル粒子で352nmとなり、(3)工程によりシェル層 が形成され、粒径が増大していることが明ら かである。また、電気泳動移動度測定の結果 から、SVA-DC粒子表面にアクリル酸を含むシェ ル層ができたことがわかる。

<BHbの除去>
 上記MIP製造例において、(2)工程でSVA-DC粒子� ��吸着したBHb量(吸着量)と、(3)工程でSVA-A粒子 から溶出したBHb量(溶出量)をそれぞれ定量し� ��。SVA-DC粒子のBHb量については、(3)工程と同� ��に10wt%SDS:10%AcOH溶液(pH2.8)に溶出させたもの� �定量した。結果を図13に示す。
 図13に示す結果から、コア粒子に吸着させ� �BHb粒子の約60%が(3)工程において除去され、� �ンプリント空隙が形成されていることが分� �る。

<ターゲット分子の吸着>
 上記MIP製造例により得たMIPと、(2)工程を経� ��に(3)工程を行なったコントロール粒子(イン プリント空隙未形成)について、各粒子2.5mgを 異なる濃度(0~500ppm)のBHb溶液(10mM SPB(pH7.0))200μ Lに添加し、37℃の条件下で1時間反応させた� �これらの結果から得られたBHbの吸着等温線� �図14に示す。
 図14に示すとおり、BHbのインプリント空隙� �有するMIPは、空隙をもたないコントロール� �子に比べ、同じ濃度下でほぼ倍のBHb吸着量� �示した。また、両粒子ともBHb溶液の濃度に� �じてBHb吸着量は上昇するが、吸着量が飽和� �達するとほぼ一定となった。すなわち、MIP� �用いることで、より多くのターゲット分子� �補足することができる。

<ターゲット分子の識別>
 上記製造例により得たMIPの各種タンパク質� ��対する吸着量を検討した。
試験方法
 ウシヘモグロビン(BHb)、ミオグロビン(Mb)、� ��シ血清アルブミン(BSA)、α-ラクトアルブミ� �(α-LA)、免疫グロブリンG(IgG)、リゾチーム(LZM ))のそれぞれについて、前記タンパク質を500p pmの濃度で含む10mM SPB(pH7.0)を調製し、吸着系 溶媒とした。MIP2.5mgを前記吸着系溶媒200μLへ� ��加し、37℃で1時間反応させた。反応後、各� ��ンプルのMIPに吸着したタンパク質量を定量� ��た。結果を図15に示す。なお、図14中のイン プリント空隙の量は、前記MIP調製例において コアシェル粒子から溶出されたタンパク質の 量を示し、MIPのインプリント空隙へのターゲ ットタンパク質の吸着許容量を表す。

 図15に示すとおり、BHbをインプリントしたMI Pは、ほぼインプリント空隙の吸着許容量に� �るまで該空隙にBHbを捕捉した。しかしなが� �、IgG及びLZMにも、MIPに吸着が認められた。� �れは、MIPの表面電荷が負であり、IgG及びLZM� �pH7.0において正に荷電しているため、静電引 力によって該タンパク質がMIP表面に吸着した と考えられた。また、IgG及びLZMの吸着には、 その特性から疎水性相互作用も関係している と考えられる。
 一方、pH7.0において中性を示すMb、負に荷電 するBSA及びα-LAとのようなタンパク質につい� ��は、いずれも負に荷電するMIPにほとんど吸� ��しなかった。なお、BHbもまたpH7.0において� �性を示すタンパク質であることを考慮すれ� �、インプリント部が特定タンパク質に対し� �極めて高い捕捉力を有していることが示唆� �れる。
 したがって、本発明にかかる分子識別材料� ��あるMIPをもって、インプリントされた分子� ��識別し、捕捉させることが可能である。

 さらに、下記の吸着系溶媒(PBS)を用い、BHb� �びIgGについて上記と同様の方法で試験を行� �た。結果を図16に示す。
 なお、図16において、インプリント空隙の� �は、前記MIP調製例においてコアシェル粒子� �ら溶出されたタンパク質の量を示し、MIPの� �ンプリント空隙へのターゲットタンパク質� �吸着許容量を表す。また、「SPB」は上記試� �における結果を示し、「PBS」は下記吸着系� �媒を用いた本試験の結果を示す。
吸着系溶媒の調製
 10mM SPBへ150mM NaClを加えてpH7.0に調整し、吸 着系溶媒(PBS)を得た。

 図16に示すとおり、塩を添加した吸着系溶� �(PBS)を使用したサンプルでは、SPBを吸着系溶 媒としたものに比べ、MIPへのIgG吸着量が大幅 に低減されていた。一方で、インプリント分 子であるBHbの捕捉量は、吸着系溶媒における 塩の有無に係わらず良好であった。
 IgG吸着量の低減は、吸着系溶媒へ添加した� ��の作用によって、MIPとIgGの間の静電引力が� ��蔽されたことによると考えられる。
 したがって、本発明にかかる分子識別材料� ��適用において、吸着系溶媒に塩を添加する� ��とにより、識別性の精度を向上させること� ��可能である。

 次に、インプリント分子を含むタンパク質2 成分系において、MIPへの吸着挙動を以下の試 験方法により検討した。
試験方法
 ウシヘモグロビン(BHb)及び競合させるタン� �ク質(competitor)の1:1(w/w)混合物を500ppmの濃度で 含む10mM SPB(pH7.0)を調製し、吸着系溶媒とし� �。MIP2.5mgを前記吸着系溶媒200μLへ添加し、37� ��で1時間反応させた。反応後、各サンプルの MIPに吸着したタンパク質を定量した。タンパ ク質の定量は、上記したタンパク質溶出量の 定量と同様の方法による。
 ウシ血清アルブミン(BSA)、ミオグロビン(Mb)� ��α-ラクトアルブミン(α-LA)、フィブリノーゲ ン(FBG)、免疫グロブリンG(IgG)、リゾチーム(LZM )をそれぞれcompetitorとして用いた結果を図17� �示す。
 図17に示すとおり、競合するタンパク質の� �類に係わらず、MIPはインプリント分子に対� �て優れた捕捉性を示した。

 さらに、BSA、FBG、IgGをcompetitorとする上記2� �分系吸着試験において、反応時間によるタ� �パク質吸着量の変化を調査した。
 BHb及びcompetitorのMIP吸着試験は上記方法にし たがい、反応時間のみを0.5、1、4、6、24時間� ��変えてそれぞれ行った。結果を図18に示す� �
 図18に示すとおり、インプリント分子(BHb)の 吸着は、1~4時間の反応で飽和に至り、反応時 間が4時間を越えると吸着量はほぼ一定とな� �た。この吸着量変化は、いずれのcompetitorを� ��いたサンプルにおいても同様であることか� ��、MIPのインプリント分子に対する反応は、c ompetitorの吸着挙動にほとんど影響を受けてい ないと推察された。