DOMAINE DE L’INVENTION

[0001]La présente invention concerne la synthèse d’unenouvelle classe des molécules poly hétérocycliques dérivés du thiazolylbenzimidazole contenant le motif triazolique via plusieurs étapes de synthèse, ainsi que G utilisation de ces molécules dans le domaine de la santé pour le traitement du cancer.

ETAT DE L’ART

[0002] Les composés hétérocycliques biologiquement actifs occupent aujourd'hui une place prépondérante dansnotre société puisqu'elles sont à la base de nombreux principes actifs utilisés en médecine, biologie, pharmacologie et d'autres points de vue industriels.

[0003] L'origine de ces molécules peut être naturelle, semi-synthétique outotalement synthétique. Ce sont des unités structurelles indispensables pour les pharmaciens et les biochimistes. Ils ont été utilisés depuis longtemps et leur utilisation et qui se poursuie jusqu'à nos jours.Parmi les différentes classes de ces composés, le thiazolylbenzimidazole et ses dérivés jouent un rôleimportant comme squelette de base pour la synthèse de beaucoup d'autres produits pharmacologiquement et biologiquement actifs.

[0004] La recherche et le développementde nouvelles molécules chimiques contenant le noyau thiabendazoleattire l'attention des chimistes organiciensdepuis longtemps en raison de leurs propriétés améliorées dans des domaines variés. En effet les dérivés du thiazolylbenzimidazolegrâce à leurs structures polyhétérocycliquesspécifique et leur teneur en azote, elles présentent différentes activités biologiques intéressantes. Les complexes de cette molécule avec le cobalt(II) ont relativement montré une haute activitéantibactérienne spécialement contre Escherichia coli et Bacillus subtilis{ Mothilal, Karunakaran, Rajendran, & Murugesan, 2004, Journal of Inorganic Biochemistry, 98 (2), 322-332), aussi quelques dérivés du thiazolylbenzimidazoleontune activité antifongique remarquable(Lôpez-Garcia, Veyrat, Pérez-Payâ, Gonzâlez-Candelas, & Marcos, 2003, International Journal of Food Microbiology, 89(2-3), 163-170).

[0005] Les recherches ont montré, aussi que les dérivés du thiazolylbenzimidazolepossèdent des applications importantesdans le domaine de l’agriculture comme des fongicidescontre les maladies des tubercules de la pomme de terre(Bica et al., 2011, Green Chemistry, 13(9), 2344), etcertains de ses dérivés ont des applications dans le domaine de la santé pour le traitement du cancer(Wisniewski, Glowiak, Opolski, & Wietrzyk, 2001 Melalbased Drugs, 8(4), 189-194).

[0006] Les motifs 1, 2, 3-triazole sont des hétérocyclesà cinq chaînons comprenant trois atomes d’azotes. Dans ces dernières années, la chimie des l,2,3-triazoles,a connu unregain considérable et un intérêt plus prononcé, à cause desdiverses propriétés biologiques et pharmacologiques intéressantesenregistrées.Les propriétésbiologiques des 1 ,2,3- triazolescomprennent un large spectre. Elles sont antimicrobiennes(Vijai Kumar Reddy et al., 2016, European Journal of Médicinal Chemistry, 118, 98-106), anti-malariques(Kumar, Pradines, Madamet, & Kumar, 2014, European Journal of Médicinal Chemistry, 86, 113— l2l),cytotoxiquescontreplusieurstumeurs(Petrova et al., 2015, Carbohydrate Research, 417, 66-7l),antibactérien(Reddy, Kamala Prasad, Manjunath, & Venkata Ramana, 2016, Annales Pharmaceutiques Françaises, 74(5), 350-357). Ce motif a été préparéevia l’approche de click chemistry par une réaction de cycloaddition l,3-dipolaire en présenced’un coupleazide- alcyne(Lal, Kumar, Pavan, & Kaushik, 2012, Bioorganic and Médicinal Chemistry Letters, 22(13), 4353-4357). Cependant, la condensation du 1,2, 3-triazole avec le thiazolylbenzimidazoleen utilisant 4-( l -(prop-2-yn- 1 -yl)-l /7-bcnzo[d]imidazolc-2-yl)thiazolc avec l’azide correspondant dans les conditions de la chimie clic, permet l’obtention des composés bioactifs puissants pour des applications pharmacologiques et biologiques. En effet ces molécules d'après leurs propriétés remarquables dans le domaine biologique sont conçuesà être exploitée dans le domaine médicale comme des anticancéreux.

[0007] Le cancer demeure un problème de santé publique, puisqu’il constitue la deuxième cause de décès dans le monde avec plus de 8.8 millions de morts en 2015. Près d’un décès sur 6 dans le monde est dû au cancer. En 2012, on comptait approximativement 14 millions de nouveaux cas (OMS, Aide-mémoire N°297, 2017). Le nombre de nouveaux cas devrait augmenter de 70% environ au cours des 2 prochaines décennies. [0008] Le cancer se caractérise principalement par la prolifération anarchique et incontrôlée avec un échappement à la mort cellulaire programmée ou l’apoptose des cellules malignes. Actuellement, le traitement de cette pathologie vise à éradiquer les cellules cancéreuses par différentes stratégies thérapeutiques utilisées seules ou combinées : la chirurgie d’exérèse, la radiothérapie externe ou interne et les traitements médicamenteux. Parmi ces derniers nous trouvons la chimiothérapie cytotoxique, l’immunothérapie, l’hormonothérapie et les thérapies ciblées.

[0009]Malgré le développement de nouvelles molécules anticancéreuses et ayant fait preuve d’efficacité. L’apparition de certaines formes de résistance de quelques cancers comme la résistance multi-drogue (Multi Drug Résistance, MDR) par surexpression d’une glycoprotéine P conférant une résistance croisée vis-à-vis de plusieurs types de médicaments par un mécanisme d’expulsion de la molécule anticancéreuseen dehors de la cellule, ou par la production d’enzymes réparant des lésions spécifiques de la cellule tumorale.

[0010] Le but de ce travail est la préparation et la caractérisation de nouvelles molécules dérivéesde thiazolylbenzimidazolecontenant le motif triazole via plusieurs étapes, ainsi que l’évaluation de l’activité cytotoxique in-vitrodeœs, molécules contre deuxlignées cellulairescancéreuses.

[0011] A notre connaissance, aucune étude précédente n’a été réalisée pour la synthèse de ces nouvelles molécules polyhétérocycliques à base du thiazolylbenzimidazoleni pour leur effet anticancéreux notamment contre le cancer du sein et le cancer colorectal.

DESCRIPTION DE L’INVENTION

[0012] L’objectif de cette invention est de préparer de nouvelles molécules poly hétérocycliques à base duthiazolylbenzimidazole comme précurseur de départ. Cettepréparation a été divisée en quatre étapes de synthèse, puis une demièreétapeconcernerapplication de ces molécules dans le domaine de la santé comme des agents anticancéreux contre un panel de cellules cancéreuses humaines. [0013] Le développement desnouvelles molécules anticancéreusesselon la présente invention.

Les dérivés du thiazolylbenzimidazoleont été synthétisés en plusieurs étapes selon le schéma 1 suivant :

R = -CgH- _{| 3} , -CeH-i ₇ , -C -| QH 21 _J -C 12 H _{25 >} -C ₁₄ H ₂₉ , -C _{1 6} H ₃₃ , -C ₁₈ H ₃₇

Schéma I

Premièrement, la synthèse de la 4-(l-(prop-2-yn-l-yl)-l//-benzo[d]imidazole-2-yl)thiazole(l) par uneréaction d’alkylation de thiazolylbenzimidazole dans les conditions de la catalyse par transfert de phase avec le bromure de propargyle. Deuxièmement, préparation des azides avec l’azoture de sodium et le bromure d’alkyle. Troisièmement, la synthèse dc4-( l -(( l -alkyl- l /7- l,2,3-triazol-4-yl)méthyl)-l -benzo[d]imidazol-2-yl)thiazole par une réaction de cycloaddition 1,3 -dipolaire dans les conditions de la chimie clic. Quatrièmement, la quaternisation des cycloadduits avec iodométhane à reflux, à fin d’augmenter la solubilité de ces produits. [0014] Synthèse de la 4-(l-(prop-2-yn-l-yl)-lA-benzo[d]imidazole-2-yl)thiazole

24.85 mmoles de la thiazolylbenzimidazole sont dissoutes dans 100 ml de A,A- diméthylformamide (DMF), 74.54 mmoles de bromure de propargyle y sont ajoutées avec une quantité catalytique du bromure de t é t ra - H - b u t y 1 a m m o n i u m c t 32.30mmoles de carbonate de potassium. Le mélange est agité pendant 24 heures à température ambiante. Après filtration des sels, le solvant est éliminé sous pressionréduite, et le résidu est repris par le dichlorométhane pour faire précipiter les sels restants. Après une deuxième filtration et évaporation du solvant, le produitest recristallisé dansl’éthanol et récupéré avec un bon rendement de 84%.

[0015] Préparation des azides

A une solution du bromoalcane correspondant (1 éq) dans l'éthanol, on a ajouté de l'azoture de sodium NaN ₃ (1 éq). Le mélange réactionnel a été chauffé à 80 ⁰ C pendant 24 heures. Après transformation complète, le mélange réactionnel a été filtré et le résidu a été lavé avec du dichlorométhane. Après élimination du solvant le résidu organique a été extrait avec de l’eau et del’ éther éthylique, la phase organique est séchée sur le sulfate de sodium, puis concentrée sous pression réduite pour donner l’azide avec un rendement de 65%.

[0016] Préparation des cycloadduits

Une solution de 4-( 1 -(prop-2-yn- 1 - y 1 - 1 /7-bcnzo[d]imidazolc-2-yl)thiazolc (4. l8mmol) a été ajouté à une solution de l’azidoalcaneen présence de l’ascorbate de sodium avec de sulfate de cuivre, dans l’eau et le i-butanol (1: 1) comme solvant à température ambiante pendant 48 heures. On évapore le solvant sous pression réduite puis on effectue un lavage du résidu avec le dichlorométhane et l’eau. On récupère le produit après évaporation du dichlorométhane et le résidu est cristallisé dans l’éthanol absolu, les cycloadduits sont récupérées avec un rendement entre 52-88%.

[0017] Quaternisation des cycloadduits

La quaternisation a été effectué par la condensation de cycloadduits correspondant avec l’iodométhane dans le A, A-di et h y form a m i de D M F) , le mélange réactionnel porte à reflux pendant 24h. L’évolution de la réaction est suivie par chromatographie sur couche mince. Le mélange est concentré sous pression réduite et le résidu obtenu est recristallisé dans l’éthanol pour donner le produit désiré avec un bon rendement entre 53 et 65%.

BREVE DESCRIPTION DES FIGURES :

[0019] Figure 1 : Etude de l’activité antiproliférative in-vitro des molécules synthétisées vis- à-vis des cellules cancéreuses issues du cancer colorectal (lignée cellulaire HT29).

[0020] Figure 2 : Etude de l’activité antiproliférative in-vitrodes, molécules synthétisées vis- à-vis des cellules cancéreuses issues du cancer du sein (lignée cellulaires MDA-MB-231)

[0021] Figure 3 : Activité antiproliférative in-vitrode la molécule P3’, la plus active vis-à-vis de cellules cancéreuses issues du cancer du colorectal (lignée cellulaire HT29).

[0022] Figure 4 : Activité antiproliférative in-vitrode la molécule P3’ , la plus active vis-à-vis de cellules cancéreuses issues du cancer du sein (lignée cellulaires MDA-MB-231).

Exemple : Etude de l’activité antiproliférative in-vitrodes, molécules synthétisées.

[0023] Après la description détaillée de l’invention, un exemple spécifique cité ci-dessous est donné pour illustrer certains aspects non limitatifs de l’invention.

[0024] Afin d’évaluer l’activité antiproliférative in vitro des molécules synthétisées (Tableau 1), nous avons testé ces molécules à différentes concentrations vis-à-vis de deux lignées cellulaires cancéreuses humaines issues d’un cancer du sein MDA-MB-231 (ATCC® HTB- 26™) et d’un adénocarcinome colorectal (HT-29 ATCC® HTB-38™).

Tableau 1 : Listes des molécules synthétisées et évaluées pour leurs activités antiprolifératives in-vitro.

[0025] Le milieu de culture utilisé pour la croissance des cellules est le milieu MEM, supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal et un mélange d’antibiotiques Pénicilline/Streptomycine/Néomycine. Les lignées cellulaires sont maintenues à 37°C dans une atmosphère saturée en humidité et contenant 5% de C0 ₂ . Les molécules à tester sont solubilisés dans le diméthylsulfonide (DMSO) avant d'être incorporés dans le milieu complet. La concentration finale du DMSO dans les différentes solutions est inférieure à 0.01%. Ces molécules ont ététestées à des concentrations variant de 100 à l2.5pg/ml et pour les molécules ayant présentées des activités importantes des concentrations de 25 à 0.2 pg/ml ont été réalisée.

[0026] La viabilité cellulaire est déterminée par la technique du MTT (3-(4,5-diméthylthiazol- 2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium bromide). L’absorbance de la solution sera alors quantifiée au spectrophotomètre à 550 nm. Les valeurs de densité optique (DO) sont directement corrélées aux concentrations de MTT intracellulaire métabolisé et sont donc proportionnelles au nombre de cellules vivantes.

[0027] Les cellules sont ensemencées dans des plaques de 96 puits pendant 24 h à 37°C. Après incubation pendant 72h à 37°C. Un test de 4 heures avant la fin de l’incubation, 10 pl d’une solution de MTT (5 mg/ml) sont ajoutés dans les puits. Les plaques sont mises à incuber pendant 4 heures à 37°C, 5% de C0 ₂ . Le milieu de culture est ensuite éliminé et un même volume de DMSO est ajouté dans chaque puits. L'absorbance est déterminée à 570nm dans un lecteur de microplaques et les résultats sont exprimés en pourcentage de viabilité des cellules traitées par rapport à celles non traitées. L'indice de cytotoxicité (IC) est calculé à l'aide de la formule suivante, avec T et C : moyenne des densités optiques des fractions testées et des contrôle.

%IC = (1- (T/Q) X 100.

[0028] L’ évaluation de l’activité antiproliférative in-vitrodes, molécules dérivées de thiazolylbenzimidazole synthétisées a montré que la molécule de base, thiazolylbenzimidazole seul (Pl) ne présente aucune activité inhibitrice de la croissance des cellules cancéreuse des deux lignées HT29 et MDA-MB-231. De même, le produit P2 issu de la substitution par alkylation du thiazolylbenzimidazole (Pl) par le groupement propargylique, n’a pas montré d’activité antiproliférative des cellules des deux lignées.

[0029] La formation du cycle triazolique liée à différentes chaînes alkylées par réaction de cycloadditiondu l,3-dipolairea affecte l’activité antiproliférative des cellules cancéreuses par rapport à la molécule de départ P2. Les molécules P4, P5, et P6 dans lesquelles le groupement triazole contenant une chaîne carbonée qui varie de (C16H33, C14H29, C12H25 et C _Ô H _B ) n’ont pas montré une activité inhibitrice de la croissance cellulaire des deux lignées cellulaires HT29 et MDA-MB-231. Cependant, le produit P3 dans lequel le groupement triazole contient une chaîne carbonée de (C _l8 H3 ₇ ) n’est pas soluble dans le DMSO (solvant utilisé pour la solubilisation des molécules à tester).

[0030] Les molécules P7, P8 dans lesquelles le groupement triazole contenant des chaînes carbonées de (C10H21) et (C ₈ H _l7 ) présentent un effet inhibiteur modéré de la croissance des cellules cancéreuses des deux lignées avec des valeurs d’IC50 comprises entre (44 et 94mM) (Tableau 2).

[0031] Afin d’ améliorer la solubilité du cycloadduit P3 dont la chaîne carboné lié au groupement triazoleest de (C _l8 H3 ₇ ), une réaction de quaternisation en utilisant de l’iodométhane a été réalisé. De plus, la même réaction a été réalisée avec le produit P8 qui avait montré une activité antiproliférative modérée vis-à-vis des deux lignées. Le traitement des cellules cancéreuses des deux lignées cellulaires cancéreuses par ces dernières molécules a montré que le produit thiazolylbenzimidazole P3’ dont la chaîne carboné lié au groupement triazole est de (C _l8 H3 ₇ ) sous forme cationique, montre une activité inhibitrice importante de la croissance des deux lignées cellulaires comparable à celle des médicaments anticancéreux de référence à savoir la Doxorubicine et l’Etoposide utilisés comme contrôle positif. Les valeurs d’IC50 de 1.28+0.32 mM et 3.45±0.25mM, respectivement pour les lignées HT29 et MDA- MB-231 (Tableau 2). Cependant, le produit thiazolylbenzimidazole P8’ dont la chaîne C ₆ H _{| 3} n’a pas montré d’effet inhibiteur de la croissance des deux lignées cellulaires canceureuses. De ce fait, la molécule thiazolylbenzimidazole P3’ dont la chaîne carboné lié au groupement triazole est Ci ₈ H ₃₇ sous forme cationique, présente une activité anticancéreuse intéressante notamment contre le cancer du sein et le cancer colorectal.

Tableau 2 : Valeurs des IC50 de molécules synthétisées vis-à-vis des différentes lignées cellulaires cancéreuses.