PUISSEGUR, Marion (4 Allée des Genêts, Le Vesinet, F-78110, FR)
BEDOUET, Laurent (65 rue Croulebarbe, Paris, F-75013, FR)
LOPEZ, Evelyne (23 avenue de la Bourdonnais, Paris, Paris, F-75007, FR)
ROBERT WAN LUXURY LIMITED (Flat/RM 2/F China Resources, Building 26 Harbour RoadHong Kong, Wanchai, Wanchai, CN)
DUPLAT, Denis (150 rue du Faubourg St-Denis, Paris, F-75010, FR)
PUISSEGUR, Marion (4 Allée des Genêts, Le Vesinet, F-78110, FR)
BEDOUET, Laurent (65 rue Croulebarbe, Paris, F-75013, FR)
LOPEZ, Evelyne (23 avenue de la Bourdonnais, Paris, Paris, F-75007, FR)
REVENDICATIONS -
1) Protéine, désignée sous le nom de calconectine, caractérisée en ce qu'elle est capable de lier un cation bivalent et a une séquence polypeptidique présentant au moins 80% d'identité avec la séquence SEQ ID N 0 I
2) Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins un domaine EF-hand de liaison aux cations bivalents.
3) Protéine, selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comporte un premier domaine ayant une structure en boucle hélice et un second domaine ayant une structure en hélice boucle hélice.
4) Protéine selon la revendication 3, caractérisée en ce que ses domaines EF-hand présentent au moins 50% d' identité à l'une et/ou l'autre des séquences SEQ ID N°4 et SEQ ID N°5.
5) Polynucléotide isolé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi a- un polynucléotide codant pour une protéine selon la revendication 1 b- un polynucléotide complémentaire du polynucléotide a) c- un polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes avec le polynucléotide a) ou b) d- un polynucléotide représenté par la séquence SEQ ID N 0 2 '6) Polynucléotide constitué par un fragment d'au moins 10 pb d'un polynucléotide selon la revendication 5
7) Polynucléotide isolé codant pour une protéine selon la revendication 1, susceptible d'être obtenu par criblage d'une banque d'ADN génomique ou d'ADNc d'un mollusque à l'aide d'au moins une sonde d'acide nucléique et/ou d'au moins un couple d'amorces d'amplification obtenus à partir d'un polynucléotide selon la revendication 5. |
* Protéine de mollusque se liant à des cations bivalents notamment en vue d'une biominêralisation, et polynucléotides correspondants
La présente invention a pour objet une protéine, ci-dessous désignée par le terme « calconectine », impliquée dans les processus de biominéralisation, ainsi que ses utilisations dans la synthèse des tissus squelettiques et de la peau.
Dans la suite du texte, on entend par biominéralisation, le processus de formation de nacre ou d'os par dépôt et cristallisation des ions calcium et magnésium en association avec la matrice organique. La biominéralisation peut s'effectuer in vivo, par exemple lors de la fabrication de la nacre chez les mollusques nacriers tels que l'huître, l'ormeau ou le nautile ou bien lors de la construction ou de la reconstitution d'un os de vertébré après une fracture ou suite à une greffe. La biominéralisation peut aussi être réalisée in vitro. Par exemple, elle peut être utilisée pour synthétiser un complexe d'apatite et de collagène (ACC pour Apatite Collagen Complex) comme le décrivent Shibutani T et al. (2000 J Biomed Mater Res . 50(2) :153-9) .
ARRIERE-PLAN DE L'INVENTION
La couche interne de la coquille des mollusques « nacriers » est constituée de nacre qui présente une structure composite pouvant être comparée à des briques liées par un mortier. Les briques sont constituées par de fines tablettes d'aragonite de 400 nra d'épaisseur sur 5 à 10 μm de longueur, cristallisées dans le système
o ' rthorhombique, gui s'alignent parallèlement à la surface de la coquille (95 à 99% de la masse totale de la nacre) . Le mortier est représenté par une matrice organique d'environ 30 nra d'épaisseur (1 à 5 % de la masse). La matrice organique, notamment en raison de sa composition particulière (protéines, polysaccharides, glycoprotéines) et de sa structure (réseau tridimensionnel fibreux) , joue 1 un rôle primordial dans le contrôle de la biominéralisation. En particulier, la matrice organique guide le dépôt et la cristallisation du carbonate de calcium sous forme d'aragonite grâce aux protéines (de structure ou enzymatiques) contrôlant la biominéralisation.
De même que la nacre, l'os est un tissu minéralisé ayant une structure composite minérale et organique. La phase minérale, est constituée de phosphate de calcium cristallisé sous forme de très petits cristaux (250 à en moyenne) d' hydroxyapatite et représentant 60-65% de la masse totale de l'os associés à une matrice organique, représentant 30-35% de la masse totale de l'os et d'environ 5% de cellules spécialisées. Comme pour la nacre, la matrice organique de l'os sert de support et de guide à la biominéralisation. La matrice organique forme un réseau fibreux à base de collagène de type I (90% des protéines totales) , associé à diverses protéines non fibreuses fonctionnelles comme la Bone Sialo-Protéine (ou BSP) , 1 'ostéopontine et l'ostéocalcine capables de lier le calcium avec une très haute affinité, l'ostéonectine, ayant des rôles multiples sur l'os (prolifération et croissance des ostéoblastes , biominéralisation de la matrice) ou des
protéoglycannes, comme la décorine et le " biglycan, dont les fonctions exactes sont encore mal connues.
Compte tenu des similitudes entre la nacre et l'os, il a été proposé d'utiliser la nacre comme biomatériau dans les greffes osseuses. Ainsi, des pièces de nacre taillées ont été implantées dans le fémur d'un mouton (Atlan G et al. 1999 Biomaterials 20:1017-1022). Dix mois après l'implantation, le greffon de nacre apparaît soudé à l'os et a stimulé l'ostéogénèse . De surcroît, il semble que la nacre ait un effet ostéoconducteur (migration des composants biologiques et cellulaires de l'os jusqu'à son lieu de synthèse) puisqu' il a été observé à la surface de l'implant de nacre et dans son environnement une accumulation des éléments constitutifs de l'os (ions calcium et phosphate) .
La production artificielle de tissu osseux ou de matériel pouvant être utilisé comme greffon en chirurgie orthopédique, en chirurgie réparatrice traumatologique ou esthétique, en neurochirurgie ou en carcinologie reste encore difficile et peu efficace (Hing KA 2004 Philos Transact A Math Phys Eng Sci 362 (1825) : 2821-50 et Cornell CN 2004 Bull Hosp Jt Dis. 62 (1-2) : 13-7. ) ) . Il a été proposé, notamment dans le document WO93/08265 d'utiliser la nacre réduite en poudre ou en fragments en présence d' ostéoblastes pour induire la fabrication d'os. Cependant, les molécules présentes dans la poudre de nacre et susceptibles d' induire une telle fabrication ne sont pas identifiées dans ce document et ne peuvent donc pas être reproduites autrement que par ce procédé d'extraction.
OBJET DE L'INVENTION
L'invention a pour objet une protéine isolée capable de lier des cations bivalents, impliquée dans les processus de biominéralisation, des séquences nucléotidiques et polypeptidiques codant pour ladite protéine et l'utilisation de ladite protéine aux fins de réaliser une synthèse de tissus squelettiques ou de peau.
DESCRIPTION DE L'INVENTION
En vue de la réalisation de ce but, on propose, selon l'invention, une nouvelle protéine, ci-dessous appelée calconectine, dont la séquence polypeptidique présente au moins 80%, de préférence au moins 90% et de manière tout à fait préférée au moins 95% d' identité avec la séquence polypeptidique SEQ ID N 0 I. Par ailleurs, la protéine conforme à la séquence polypeptidique SEQ ID N 0 I comprend deux domaines EF-hand de liaison aux cations bivalents comme le calcium ou le magnésium, constitués chacun d'un motif de 12 acides aminés capable de former une boucle permettant la liaison au calcium (Kretsinger RH 1976 Int Rev Cytol 46:323-393) ou au magnésium (Lewit-Bentley A and Rety S 2000 Curr Opin Struct Biol . 10 (6) : 637-43) . Avantageusement, les domaines EF-hand de la calconectine objet de l'invention présentent au moins 50%, de manière préférée 60%, de manière plus préférée 70%, et de manière encore plus préférée 80% et de manière tout à fait préférée 90% d'identité à l'une et/ou l'autre des séquences SEQ ID N°4 et SEQ ID N°5, codant pour les domaines EF-hand. Sauf précision contraire, les pourcentages d'identité de séquence indiqués ici pour les séquences nucléotidiques
'ou peptidiques se réfèrent à la valeur obtenue, sur une fenêtre de comparaison constituée par la totalité de la séquence de référence, avec la suite logicielle BLAST (ALTSCHUL et al., (1997) Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402) en utilisant les paramètres par défaut, sur une fenêtre de comparaison constituée par la totalité de la séquence de référence .
La protéine conforme à la séquence polypeptidique SEQ ID N 0 I a été identifiée à partir d'une banque d'ADN enrichie en séquences spécifiques du manteau et des cellules productrices de nacre, comme détaillé plus loin. Une telle protéine possède une masse moléculaire apparente de 10,4 kDa et son point isoélectrique est de 6,28. La prédiction du profil d'hydrophobicité par la méthode de Kyte and Doolittle (Kyte J and Doolittle F 1982 J Mol Biol . 157:105-32) indique que la protéine est majoritairement hydrosoluble (absence de domaines transmembranaires) . Par ailleurs, comme elle ne possède pas de peptide signal dans sa séquence protéique, ladite protéine est cytosolique. Contrairement aux protéines de nacre hydrosolubles obtenues par le procédé décrit dans la demande de brevet WO 97/2413, la calconectine objet de la présente invention n'est excrétée ni dans le milieu extracellulaire, ni dans le fluide extrapalléale et est donc absente de la matrice organique de la coquille.
Ainsi, la protéine de l'invention appartient à la famille des protéines à domaines EF-hand. Dans les protéines connues de ce type, les domaines EF-hand en général sont présents par paires et présentent une structure en hélice-boucle-hélice de 29 acides aminés
'(Kretsinger, RH 1976 précédemment cité ' et Moncrief ND et al. 1990 J Mol Evol . 30:522-562).
La calconectine, objet de l'invention comporte au moins un domaine EF-hand de liaison à un cation bivalent. Prêférentiellement , la calconectine, objet de la présente invention comporte deux domaines EF-hand de liaison au calcium et/ou au magnésium. Ces deux domaines représentent 28% de la séquence polypeptidique totale.
Le premier domaine de liaison à un cation bivalent se situe entre le 37 ème et le 50 ème acide aminé à partir de la méthionine (premier acide aminé) , tel que représenté sur la figure 1. De manière étonnante, ce domaine n'a pas, comme dans les protéines connues, une structure en hélice-boucle- hélice mais seulement une structure boucle-hélice. Le second domaine de liaison avec un cation bivalent se situe entre le 66 eme et le 79 eme acides aminés de la séquence, en comptant la méthionine comme premier acide aminé (figure 1) et possède une structure en hélice-boucle-hélice. C'est au niveau des 12 acides aminés constituant la boucle que se fait la liaison au calcium ou au magnésium suivant les différents acides aminés présents (Lewit-Bentley A and Rety S 2000 cité précédemment) .
Ainsi, bien que possédant deux domaines de type EF- hand, la calconectine, objet de la présente invention ne peut pas se classer, en se basant sur ses structures primaires et secondaires, dans une des 66 sous-familles de protéines à motif EF-hand précédemment décrites (Nakayama N, Kawasaki H, Kretsinger R, 2000 Topics Biol Inorg Chem 3:29-58) . II apparaît donc que les inventeurs ont identifié une nouvelle protéine, la calconectine, capable de lier aussi
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bien le calcium que le magnésium et " impliquée dans la formation de la nacre.
A cet égard, il est connu que, durant la biominéralisation, la présence de Mg 2+ facilite la stabilisation du carbonate de calcium sous forme amorphe, c'est-à-dire non cristallisée (Aizenberg, J., et al. J Am Chem Soc (2002) 124, 32-39) . De même, il est connu que la biominéralisation des couches d'aragonite de la coquille des mollusques nacrier apparaît lorsque la teneur en Mg 2+ est élevée dans le fluide extrapalléale (Kitano Y and Hood DW, 1962 J. Oceanogr. Soc. Japan. 18:141-145). Il est donc probable que le processus de biominéralisation soit dépendant des concentrations respectives en Ca 2+ et en Mg 2+ . La faculté de liaison de la calconectine aux deux principaux cations indispensables à la formation de la nacre ou de l'os semble donc constituer la raison de son implication dans le processus de biominéralisation.
La présente invention concerne également une composition protéique comprenant de la calconectine et favorisant les processus de biominéralisation, ainsi que la synthèse de tissus squelettiques ou de peau.
Avantageusement, la composition protéique comporte en plus de la calconectine, des substances présentant une activité biologique de stimulation et/ou de prolifération et/ou de différenciation de cellules, comme par exemple des ostéoblastes, des chondrocytes, des kératinocytes, des fibroblastes .
La présente invention concerne également des anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés spécifiquement contre un
polypeptide codant pour la calconectine . Les méthodes permettant de produire des anticorps sont connues en elles- mêmes, à titre d'exemple, on peut citer les méthodes qui consistent à injecter un polypeptide chez un mammifère (par exemple, le lapin ou le rat) et d'en recueillir le sérum contenant les anticorps. Les anticorps anti-calconectine pourront alors être utilisés pour identifier ladite protéine dans un mélange protéique in vitro en utilisant des techniques bien connues de l'homme de métier telles que les méthodes ELISA ou Western Blot . Les anticorps peuvent aussi être utilisés pour identifier la calconectine in situ par immunocytologie, par hybridation in-situ sur la coquille, sur les corps mous de mollusques, ou sur l'os. En outre, les anticorps anti-calconectine peuvent aussi être utilisés pour isoler la calconectine d'un mélange protéique en utilisant par exemple, les anticorps pour réaliser une chromâtographie d'affinité.
La présente invention a également pour objet un polynucléotide isolé choisi parmi : a- un polynucléotide codant pour une calconectine dont la séquence polypeptidique présente au moins 80%, de préférence au moins 90% et de manière tout à fait préférée au moins 95% d' identité avec la séquence polypeptidique SEQ ID N°l. b- un polynucléotide complémentaire du polynucléotide a) c- un polynucléotide capable de s ' hybrider sélectivement , en conditions stringentes avec le polynucléotide a) ou b) d- un polynucléotide de séquence SEQ ID N 0 2
On définit comme polynucléotide « " codant pour » un polypeptide donné, tout polynucléotide contenant l'information génétique permettant la synthèse dudit polypeptide . Ainsi, des polynucléotides conformes à l'invention codant pour un polypeptide intervenant dans la biominéralisation de la nacre ou de l'os comprennent notamment le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 2, qui correspond à la séquence d'ADNc de la calconectine . De manière plus précise, la séquence codante correspondant à la séquence SEQ ID N 0 I correspond à un fragment de la séquence d'ADNc de SEQ ID N°2 de 279 pb, compris entre le 154ème nucléotide et le 433ème nucléotide de la séquence SEQ ID N°2, telle qu' illustrée par la figure 2. La séquence codante est représentée par la séquence SEQ ID N°3.
La présente invention inclut également tout fragment d'au moins 10 pb, de préférence au moins 20 pb, de manière préférée au moins 50 pb, et de manière tout à fait préférée au moins 200 pb d'un polynucléotide a) ou b) ci-dessus, ou capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec un polynucléotide a) ou b) ci-dessus. Des fragments préférés sont représentés par l'une quelconque des séquences SEQ ID N°6 ou SEQ ID N°7. D'autres fragments peuvent être également obtenus à partir du polynucléotide de séquence SEQ ID NO : 2. L'homme du métier définira les fragments isolés les plus adaptés à l'usage qu'il souhaite en faire. Ces fragments seront définis pour s'hybrider sélectivement en conditions stringentes avec l'un des polynucléotides objets de l'invention ou son complémentaire .
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Selon des méthodes bien connues en elles-mêmes, les conditions stringentes d'hybridation, pour un polynucléotide donné, peuvent être identifiées en fonction de la taille et de la composition en bases du polynucléotide concerné, ainsi que de la composition du mélange d'hybridation (notamment pH et force ionique) . Généralement, des conditions stringentes, pour un polynucléotide de taille et de séquence données, sont obtenues en opérant à une température inférieure d'environ 0 0 C à 1O 0 C, de manière préférée inférieure à 4°C, à la température de fusion (Tm) de l'hybride formé, dans le même mélange réactionnel, par ce polynucléotide et son complémentaire .
On définit ici comme polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement avec un polynucléotide a) ou b) conforme à l'invention tout polynucléotide qui lorsqu'il est hybride en conditions stringentes avec une banque d'acides nucléiques de mollusque et en particulier d'huîtres perlières comme par exemple Pinctada margaritifera (notamment une banque soustractive d'ADNc enrichie en séquences du manteau et de cellules formatrices de nacre) produit un signal d'hybridation détectable
(c'est-à-dire au moins 2 fois supérieur, de préférence au moins 5 fois supérieur au bruit de fond) avec ledit polynucléotide, mais ne produit aucun signal détectable avec d'autres séquences de ladite banque.
L'invention comprend également le polynucléotide de séquence SEQ ID N 0 2 correspondant à 1 7 ADNc pleine longueur,
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•codant pour la calconectine de séquence -polypeptidique SEQ ID N 0 I.
La présente invention a également pour objet des sondes polynucléotidiques ou des amorces d'amplification obtenues à partir de polynucléotides a) ou b) conformes à l'invention ou des fragments de ceux-ci. L'invention concerne en particulier les fragments de séquences SEQ ID N 0 6 et SEQ ID N 0 7. La présente invention englobe également tout polynucléotide codant pour un polypeptide intervenant dans la biominéralisation de nacre ou d'os et pouvant être obtenu à partir d'une banque d'ADN gënomique ou d'ADNc de mollusques par criblage de ladite banque à l'aide de sondes ou d'amorces conformes à l'invention. L'homme du métier est également capable d'utiliser les sondes ou amorces objet de l'invention pour détecter et isoler à partir d'un extrait polynucléotidique, comme par exemple et de manière non limitative, à partir d'ADN extrait du manteau d'un mollusque ou de l'ADN extrait de tissu osseux disponible ou non sous forme de banque d'acides nucléiques.
La présente invention comprend également des constructions nucléotidiques comprenant un polynucléotide codant pour une calconectine telle que définie ci-dessus. De préférence, le polynucléotide utilisé sera celui de séquence SEQ ID N°2. Cette construction nucléotidique pourra ensuite être introduite dans un vecteur d'expression dans le but de transformer un organisme procaryote ou eucaryote capable d'exprimer la calconectine. En particulier, L 'ADNc de la calconectine correspondant à la SEQ ID N 0 2 peut être sous clone dans un
• vecteur d'expression plasmidique procàryote tel que le vecteur pLP-PROTet-6xHN Bacterial Expression System de Clontech par la méthode utilisant le système Cre-Lox par exemple. En plus de la construction nucléotidique comprenant un polynucléotide codant pour la calconectine, le vecteur comprendra également un gène de sélection, à titre d'exemple, il peut s'agir de gènes de résistance à des antibiotiques . Le plasmide recombinant est ensuite transformé dans une bactérie compétente E. coli souches BL21 PRO ou DH5aPR0, par exemple. La bactérie ainsi transformée est ensuite mise en culture sur un milieu gélose avec des antibiotiques pour identifier les transformants ayant reçu la construction nucléotidique comprenant une séquence codant pour la calconectine.
Conformément à l'invention, les séquences polypeptidiques et polynucléotidiques décrites dans la présente invention sont avantageusement utilisées pour améliorer la formation de tissus squelettiques ou de peau. De manière plus précise, la calconectine ou toute composition protéique la comprenant sont utilisées pour activer les processus de biominéralisation de l'os.
On entend par activation du processus de biominéralisation un dépôt de nacre ou d'os quantitativement identique mais réalisé dans un temps plus court ou un dépôt quantitativement supérieur d'os ou de nacre pendant une même durée .
Selon un premier mode de mise en œuvre, la calconectine ou une composition la comprenant peut être mise en présence de cellules productrices d'os comme des ostéoblastes . La calconectine contribue ainsi à faciliter la régénération in
•vitro ou in vivo des tissus notamment osseux, cartilagineux ou cutanées .
Selon un second mode de mise en œuvre, la calconectine ou une composition la comprenant peut être utilisée en complément alimentaire afin de réguler éventuellement la fixation du calcium ou du magnésium dans le sang dont un dérèglement (hypocalcémie ou une hypomagnésémie) peut être à l'origine de tétanie ou spasmophilie.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide des figures et exemples qui suivent .
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : La figure 1 représente la séquence d' acides aminés codant pour la calconectine. Les acides aminés soulignés représentent les domaines de liaisons aux cations bivalents, ceux encadrés les sites potentiels de phosphorylation.
Figure 2 : La figure 2 représente la séquence d'ADNc pleine longueur du gène codant pour la calconectine. Les nucléotides soulignés correspondent à la séquence codante.
EXEMPLES Exemple 1 ; Identification de la calconectine
Obtention d'une banque soustxactive
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•A partir de tissus d'huître Pinctada margaritifera incluant les cellules productrices de nacre, le manteau et le muscle, l 'ARN a été extrait en utilisant le kit d'isolement d'ARNm FastTrack 2.0 (Invitrogen) selon les recommandations du fournisseur. Les quantités isolées d'ARNm ont été quantifiées par densité optique (DO260nm) et la pureté par le rapport DO260nm/DO280nm. La banque soustractive est réalisée grâce au kit Clontech PCR-select cDNA substraction selon les recommandations du fournisseur (Clontech) .
L'ADNc des cellules productrices de nacre et celui du muscle sont synthétisés respectivement à partir de l,6μg d'ARN et de 3,2μg. Les quantités d'ADNc des deux origines
(NFC et muscle) sont égalisées et enrichies en séquences différentiellement exprimées par deux hybridations successives (soustraction) entre les deux types d'ADNc d'origines différentes.
Les séquences différentiellement exprimées issues de la soustraction sont amplifiées par PCR puis clonées dans un vecteur T/A pGEM-T easy (Promega) et transformées dans des E. coli JM109.
466 séquences ont ainsi été obtenues et clonées, dont 387 permettent d'obtenir une séquence exploitable d'une taille moyenne de 371 pb . Une comparaison des 387 séquences entre elles en utilisant les logiciels Multalin (Corpet F, 1988 Nucleic Acids Res . 16:10881-10890) et BLAST2 (Tatusova TA, Madden TL, 1999 FEMS Microbiol Lett . 174:247-250) a permis d'isoler 72 séquences uniques d'une taille moyenne de 450 pb. La comparaison de ces séquences avec les bases de données GenBank et ExPASy montre que la séquence du clone E- 85
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présente des homologies avec une séquence de Calmodulin- related protein d' Arabidopsis thaliana.
Dessin d'amorces spécifiques de la séquence du clone E85. Deux amorces gènes spécifiques ont été mises au point à partir de l 'ADNc partiel du clone E85 en utilisant le logiciel Primo
(http : //changbioscience . com/primo/primo .html)
L'amorce forward (Gl) est représentée par la séquence SEQ ID N°6 :
5'- CAGATGTCTTTCTCCGAC -3'
L'amorce reverse (G2) est représentée par la séquence
SEQ ID N°7 :
5 ' - CATCGGCCGGTGCTCCAACAGG 3 '
Obtention de la ségjience complète de la calconectine
L'ARN total du manteau est extrait en utilisant du TriZOL (SIGMA) . Une amplification rapide des extrémités 3' et 5' de 1 'ADNc est réalisée en utilisant le kit GeneRacer
(Invitrogen) et en suivant les recommandations du fournisseur. Les produits d'amplification une fois obtenus sont purifiés sur gel d'agarose et clones dans le vecteur pCR4-TOPO en utilisant le kit de clonage TOPO TA d' Invitrogen. Les plasmides recombinants sont ensuite séquences .
Un oligonucléotide fourni par le kit, le GeneRacer™ RNA Oligo, est ligué en 5 ' de 1 'ARNm par la T4 RNA ligase. Le GeneRacer™ RNA Oligo fournit un site d'amorçage connu, l'amorce F, après la rétro-transcription de l 'ARNm en ADNc.
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•L'ARNm ainsi ligué est rétro-transcrit avec la SuperScript™
III Reverse Transcriptase et une amorce oligo dT adaptée de l'oligo dT fourni par le kit. Les ADNc simple brin ainsi obtenus possèdent des sites d'amorces connus en 3 ' et 5'. L'amplification par PCR en 3' avec l'amorce Gl permet d'obtenir un fragment de 297pb d'ADNc du manteau. Un mélange réactionnel (réactifs INVITROGEN) d'un volume final de 20μl est réalisé avec les produits suivants: Tampon PCR
(10X) : Iμl; dNTP (4x4mM) : 0 , 5 μl ; MgCl 2 (50 mM) : 0,3 μl ; Amorce Gl (10 μM) : 0,5 μl; Amorce oligo dT adaptée (10 μM) ; 0,5 μl; ADNc (30 ng/μl) : 1,0 μl ; Taq polymerase (5U/μl) : 0,2 μl; Eau ultra pure : 6 , 0 μl .
Le mélange réactionnel est introduit dans le thermocycler (STRATAGENE) et mis à incuber avec le programme PCR suivant: une dénaturation à 94 0 C pendant 2 min; 30 cycles à 94°C pendant 30 sec (dénaturation) puis 50 0 C pendant 1 min (hybridation) et 72 0 C pendant 1 min (élongation) ; et une élongation finale à 72 0 C pendant 5 min. L'amplification en 5' avec l'amorce G2 permet d'obtenir un fragment de 233pb. Le même mélange réactionnel que précédemment est effectué avec les amorces F et G2. Le programme PCR est le même excepté pour la température d'hybridation de 70 0 C et la durée d 1 élongation de 2 min pendant les 30 cycles.
Les deux fragments ont ensuite été assemblés pour donner une séquence d'ADNc pleine longueur de 496pb (34pb sont chevauchantes) . Cette séquence est décrite par la séquence SEQ ID N°2. Elle comprend une phase ouverte de lecture de 279 nucléotides, 154 nucléotides en 5'UTR (en amont de la phase
ouverte de lecture) un codon stop, 90 nucléotides en 3'UTR incluant un signal de polyadénylation 17 nucléotides en amont de la queue polyA qui commence à la position 496pb.
Exemple 2 ; Analyse de la structure de la protéine
La protéine est représentée par la séquence SEQ ID N 0 I, déduite de la séquence SEQ ID N°2. Elle se compose de 92 acides aminés et a une masse moléculaire d'environ 10,4 kDa avec un point isoélectrique de 6,28.
Cette protéine comprend deux domaines de liaisons au calcium EF-hand, le premier situé entre le 37 ème et le 50 ème acide aminé et le second entre le 66 ème et le 79 ême acides aminés de la séquence SEQ ID N 0 I. Elle ne comprend qu'un seul résidu tyrosine et aucun résidu histidine ou tryptophane. Elle est majoritairement composée de lysine (16%) et d'asparagine (14%) .
Selon la méthode de Kyte and Doolittle, la calconectine est hydrophile sauf à son extrémité C-terminal . Elle ne possède pas de peptide signal. Elle comprend 7 sites potentiels de phosphorylation, des feuillets β, des hélices α et des enroulements au hasard (random coiled) .
Le premier domaine EF-hand a une structure en boucle- hélice. Le second domaine possède une conformation en hélice-boucle-hélice. Ces deux structures sont typiques de la liaison aux ions Mg 2+ et Ca 2+ .
Bien entendu, l'invention n'est pas limitée à ce qui vient d'être décrit mais au contraire englobe toute variante entrant dans le cadre défini par les revendications. En particulier, bien que l'invention ait été décrite en
-relation avec les processus de biominéralisation de nacre ou d'os, elle peut également s'appliquer à la biominéralisation d'autres tissus ou supports tels que la corne, le cartilage, la peau, les phanères, les dents. D'une façon plus générale, l'invention peut être utilisée dans tous les processus impliquant une liaison à un cation tel que le calcium ou le magnésium, par exemple, le stockage intracellulaire.
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