Das Vitamin B2, auch Riboflavin genannt, ist für Mensch und Tier essentiell. Bei Vitamin-B2-Mangel treten Entzündungen der Mund-und Rachenschleimhäute, Risse in den Mundwinkeln, Juckreiz und Entzündungen in den Hauffalten u. a. Hautschäden, Bindehautent- zündungen, verminderte Sehschärfe und Trübung der Hornhaut auf. Bei Säuglingen und Kindern können Wachstumsstillstand und Gewichts- abnahme eintreten. Das Vitamin B2 hat daher wirtschaftliche Bedeutung insbesondere als Vitaminpräparat bei Vitaminmangel sowie als Futtermitteizusatz. Daneben wird es auch als Lebensmittelfarbstoff, beispielsweise in Mayonnaise, Eiscreme, Pudding etc., eingesetzt.

Die Herstellung von Riboflavin erfolgt entweder chemisch oder mikrobiell. Bei den chemischen Herstellungsverfahren wird das Riboflavin in der Regel in mehrstufigen Prozessen als reines Endprodukt gewonnen, wobei allerdings auch relativ kostspielige Ausgangsprodukte-wie beispiels- weise D-Ribose-eingesetzt werden müssen.

Eine Alternative zur chemischen Herstellung des Riboflavins bietet die Herstellung dieses Stoffes durch Mikroorganismen. Die mikrobielle Herstellung des Riboflavins eignet sich insbesondere für solche Fälle, in denen eine hohe Reinheit dieser Substanz nicht erforderlich ist. Dies ist beispielsweise dann der Fall, wenn das Riboflavin als Zusatz zu Futtermittelprodukten eingesetzt werden soll. In solchen Fällen hat die mikrobielle Herstellung des Riboflavins den Vorteil, daß diese Substanz in einem einstufigen Prozeß gewinnbar ist. Auch können als

Ausgangsprodukte für die mikrobielle Synthese nachwachsende Rohstoffe, wie beispielsweise pflanzliche Ole, eingesetzt werden.

Die Herstellung von Riboflavin durch Fermentation von Pilzen wie Ashbya gossypii oder Eremothecium ashby : ist bekannt (The Merck Index, Windholz et al., eds. Merck & Co., Seite 1183,1983, A. Bacher, F.

Lingens, Augen. Chem. 1969, S. 393) ; aber auch Hefen, wie z. B. Candida oder Saccharomyces, und Bakterien wie Ciostridium, Bacilles und zurRiboflavinproduktiongeeignet.Corynebakteriumsind Zudem sind Verfahren mit der Hefe Candida famata beispielsweise in der US 05231007 beschrieben.

Riboflavin-überproduzierende Bakterienstämme sind beispielsweise in der EP 405370 beschrieben, wobei die Stämme durch Transformation der ausBacillussubtiliserhaltenwurden.DieseRiboflavin-Biosynthes e-Gene Prokaryonten-Gene waren aber für ein rekombinantes Riboflavin- Herstellungsverfahren mit Eukaryonten wie Saccharomyces cerevisiae oder Ashbya gossypii ungeeignet. Daher wurden gemäß der WO 93/03183 für die Riboflavin-Biosynthese spezifische Gene aus einem Eukaryonten, nämlich aus Saccharomyces cerevisiae, isoliert, um damit ein rekombinantes Herstellungsverfahren für Riboflavin in einem eukaryontischen Produktionsorganismus bereitzustellen. Derartige rekombinante Herstellungsverfahren haben für die Riboflavin-Produktion jedoch dann keinen oder nur begrenzten Erfolg, wenn die Bereitstellung von Substrat für die an der Riboflavin-Biosynthese spezifisch beteiligten Enzyme unzureichend ist.

1967 fand Hanson (Hanson AM, 1967, in Microbial Technology, Peppler, HJ, pp. 222-250 New York), daß der Zusatz der Aminosäure Glycin die Riboflavin-Bildung von Ashbya gossypii steigert. Ein derartiges Verfahren

ist jedoch nachteilig, weil Glycin ein sehr teurer Rohstoff ist. Aus diesem Grunde war man bestrebt, durch Herstellung von Mutanten die Riboflavin- Produktion zu optimieren.

Aus der DE 19545468.5 A1 ist ein weiteres Verfahren zur mikrobieiien Herstellung von Riboflavin bekannt, bei dem die Isocitratlyase-Aktivität oder die lsocitratlyase-Genexpression eines Riboflavin produzierenden Mikroorganismus erhöht ist. Darüber hinaus ist aus der DE 19840709 A1 ein ein-oder mehrzelliger Organismus insbesondere ein Mikroorganismus zur biotechnischen Herstellung von Riboflavin bekannt. Dieser zeichnet sich dadurch aus, daß einen derart veränderten Glycinstoffwechsel aufweist, daß seine Riboflavinsyntheseleistung ohne externe Zufuhr von Glycin mindestens gleich derjenigen eines Wildtyps der Species Ashbya gossypii ATCC10892 ist.

Aber auch im Vergleich zu diesen Verfahren besteht noch ein Bedarf zu einer weiteren Optimierung der Riboflavin-Herstellung.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es demgemäß, einen ein-oder mehrzelligen Organismus, vorzugsweise einen Mikroorganismus, für die biotechnische Herstellung von Riboflavin zur Verfügung zu stellen, der eine weitere Optimierung der Riboflavin-Bildung ermöglicht. Insbesondere sollte ein Organismus zur Verfügung gestellt werden, der eine Produktion ermöglicht, die gegenüber dem bisherigen Stand der Technik wirtschaftlicher ist. Vor ailem soll der Organismus eine im Vergleich zu den bisherigen Organismen erhöhte Riboflavin-Bildung erlauben.

Diese Aufgabe wird durch einen ein-oder mehrzelligen Organismus gelöst, dessen Enzymaktivität der bezüglich NAD (P) H-Bildung höher ist als derjenige eines Wilcityps der Species Ashbya gossypii ATCC10895.

Das Ziel einer beschleunigten intrazellulären NAD (P) H-Versorgung kann durch Erhöhung der Aktivität eines NAD (P) H-bildenden bzw. Senkung der Aktivität eines NAD (P) H verbrauchenden Enzyms bzw. eine Änderung der Sapez erreicht werden. Dies täßt sich mit den bekannten Methoden der Stammverbesserung von Organismen erreicht werden. D. h. im einfachsten Falle lassen sich entsprechende Stämme nach der in der Mikrobiologie üblichen Selektion mittels Screening herstellen. Ebenso ist die Mutation mit anschließender Selektion einsetzbar. Die Mutation kann hierbei sowohl mittels chemischer als auch mittels physikalischer Mutagenese ausgeführt werden. Eine weitere Methode ist die Selektion und Mutation mit anschließender Rekombination. Schließlich lassen sich die erfindungsgemäßen Organismen mittels Genmanipulation herstellen.

Erfindungsgemäß, wird der Organismus derart verändert, daß er intrazellulär NAD (P) H in einer Menge erzeugt, die grö#er als sein Bedarf für die Aufrechterhaltung seines Metabolismus ist. Diese Erhöhung der intrazellulären NAD (P) H-Erzeugung lä#t sich erfindungsgemäß vorzugsweise dadurch erreichen, daß ein Organismus hergestellt wird, bei dem die Enzymaktivität der lsocitrat-Dehydrogenase erhöht ist. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, daß durch Veränderung des katalytischen Zentrums ein erhöhter Substratumsatz erfolgt oder indem die Wirkung von Enzyminhibitoren aufgehoben wird. Auch kann eine erhöhte Enzymaktivität der lsocitrat-Dehydrogenase durch Erhöhung der Enzymsynthese, beispielsweise durch GenampMkation oder durch Ausschaltung von Faktoren, die die Enzym-Biosynthese reprimieren, hervorgerufen werden.

Die isocitrat-Dehydrogenase-Aktivitat kann erfindungsgemäß vorzugsweise durch Mutation des lsocitrat-Dehydrogenase-Gens erhöht werden. Derartige Mutationen können entweder nach klassischen Methoden ungerichtet erzeugt werden, wie beispielsweise durch UV-

Bestrahlung oder mutationsauslösende Chemafien, oder gezielt mittels gentechnologischer Methoden, wie Deletion Insertion und/oder Nukeotid- Austausch.

Die lsocitrat-Dehydrogenase-Genexpression kann durch Einbau von lsocitrat-Dehydrogenase-Genkopien undloder durch Verstärkung regulatorischer Faktoren, die die lsocitrat-Dehydrogenase-Genexpression positiv beeinflussen, erreicht werden. So kann eine Verstärkung regulatorischer Elemente vorzugsweise auf Transcriptionsebene erfolgen, indem insbesondere die Transcriptionssignaie erhöht werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der m-RNA verbessert wird.

Zur Erhöhung der Genkopienzahl kann beispielsweise das lsocitrat- Dehydrogenase-Gen in ein Genkonstrukt bzw. in einen Vektor eingebaut werden, der vorzugsweise dem Isocitrat-Dehydrogenase-Gen zugeordnete regulatorische Gensequenzen enthält, insbesondere solche, die die Genexpression verstärken. Anschließend wird ein Ftiboflavin- produzierender Mikroorganismus, mit dem das lsocitrat-Dehydrogenase- Gen enthaltenden Genkonstrukt transformiert.

Erfindungsgemäß kann die Überexpression der isocitrat-Dehydrogenase auch durch Austausch des Promotors erzielt werden. Hierbei ist es möglich, die höhere enzymatische Aktivität alternativ durch Einbau von Genkopien oder durch Austausch des Promotors zu erzielen.

Gleichermaßen ist es jedoch auch mögtich, durch gleichzeitigen Austausch des Promotors und Einbau von Genkopien die gewünschte Änderung der Enzymaktivität zu erzielen.

Die Veränderung des fsocitrat-Dehydrogenase-Gens führt zu einer beschieunigten NAD (P) H-Biidung und zugleich zu einer überraschend

hohen Steigerung der Riboflavin-Bildung, wie sie bisher nicht erreichbar war.

Das Isocitrat-Dehydrogenase-Gen wird vorzugsweise aus Mikroorganismen, besonders bevorzugt aus Pilzen, isoliert. Dabei sind Pilze der Gattung Ashbya wiederum bevorzugt. Höchst bevorzugt ist die Spezies Ashbya gossypii.

Für die Isolierung des Gens kommen aber auch alle weiteren Organismen, deren Zellen die Sequenz zur Bildung der Isocitrat-Dehydrogenase enthalten, also auch pflanzliche und tierische Zellen, in Betracht. Die Isolierung des Gens kann durch homologe oder heterologe Komplementation einer im Isocitrat-Dehydrogenase-Gen defekten Mutante oder auch durch heterologes Probing oder PCR mit heterologen Primern erfolgen. Zur Subklonierung kann das insert des komplementierenden Plasmids anschließend durch geeignete Schritte mit Restriktionsenzymen in der Grö#e minimiert werden. Nach Sequenzierung und Identifizierung des putative Gens erfolgt eine paßgenaue Subklonierung durch PCR. Plasmide, die die so erhaltenen Fragmente als Insert tragen, werden in die tsocitrat-Dehydrogenase-Gen-DeSkte Mutante eingebracht, die auf Funktionalität des Isocitrat-Dehydrogenase-Gens getestet wird. Funktionelle Konstrukte werden schließlich zur Transformation eines Ribofiavin-Produzenten eingesetzt.

Nach Isolierung und Sequenzierung sind die isocitrat-Dehydrogenase- Gene mit Nukleotidsequenzen erhältlich, die für die angegebene Aminosäure-Sequenz oder deren Allelvariationenkodieren. umfassen insbesondere Derivate, die durch Deietion, insertion und Substitution von Nuideotiden aus entsprechenden Sequenzen erhältlich sind, wobei die socitrat-Dehydrogenase-Aktivität erhalten bleibt. Eine

entsprechende Sequenz ist in Figur 2b von Nukleotid 1 bis 1262 angegeben.

Den Isocitrat-Dehydrogenase-Genen ist insbesondere ein Promotor der Nukleotidsequenz von Nukleotid-661 bis-1 gem. Fig. 11 oder eine im wesentlichen gleich wirkende DNA-Sequenz vorgeschaltet. So kann beispielsweise dem Gen ein Promotor vorgeschaltet sein. der sich von dem Promotor mit der angegebenen Nukleotidsequenz durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion und/oder Ddetion unterscheidet, ohne daß aber die Funktionalität bzw. die Wirksamkeit des Promotors beeinträchtigt wird. Des weiteren kann der Promotor durch Veränderung seiner Sequenz in seiner Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksame Promotoren ausgetauscht werden.

Dem lsocitrat-Dehydrogenase-Gen können des weiteren regulatorische Gen-Sequenzen bzw. Regulatorgene zugeordnet sein, die insbesondere die lsocitrat-Dehydrogenase-Gen-Aktivität erhöhen. So können dem Isocitrat-Dehydrogenase-Gen beispielsweise sog."enhancer"zugeordnet sein, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA- Polymerase und DNA eine erhöhte isocitrat-Dehydrogenase-Expression bewirken.

Dem Isocitrat-Dehydrogenase-Gen mit oder ohne vorgeschaltetem Promotor bzw. mit oder ohne Regulator-Gen können ein oder mehrere DNA-Sequenzen vor-und/oder nachgeschaltet sein, so daß das Gen in einer Gen-Struktur enthalten ist. Durch Klonierung des lsocitrat- Dehydrogenase-Gens sind Plasmide bzw. Vektoren erhältlich. die das Isocitrat-Dehydrogenase-Gen enthalten und zur Transformation eines Riboflavin-Produzenten geeignet sind. Die durch Transformation erhältlichen Zellen enthalten das Gen in replizierbarer Form, d. h. in zusätzlichen Kopien auf dem Chromosom, wobei die Genkopien durch

homologe Rekombination an beliebigen Stellen des Genoms integriert werden und'oder auf einem Plasmid bzw. Vektor.

Bei den erfindungsgemäß erhaitenen ein-oder mehrzelligen Organismen kann es sich um beliebige für biotechnische Verfahren einsetzbare Zelien handeln. Hierzu zählen beispielsweise Pilze, Hefen. Bakterien sowie pflanzliche und tierische Zellen. Erfindungsgemäß handelt es sich vorzugsweise um transformierte Zellen von Pilzen, besonders bevorzugt von Pilzen der Gattung Ashbya. Hierbei ist die Spezies Ashbya gossypii besonders bevorzugt.

Im folgenden wird die Erfindung näher anhand von Beispielen erläutert, ohne daß damit eine Begrenzung auf den Gegenstand der Beispiele verbunden sein soll : Das Gen der socitrat-Dehydrogenase (IDP3) wurde durch PCR kloniert und dann sequenziert (Sequenz siehe Fig. 11). Die gentechnisch durchgeführte partielle De ! etion des Gens durch Austauschmutagenese mit einem Geneticinresistenz-Gen (Fig. 1) wurde durch Southem Blot (Fig.

2) bestätigt. Diese Disruption, d. h. Zerstörung des Gens im Genom des Pilzes, führt dazu, daß der Pilz die davon kodierte Isocitrat- Dehydrogenase nicht mehr bilden kann. Fig. 3 zeigt die Abnahme der Enzymaktivität im Disruptionsstamm AgADP3b im Vergleich zum Wildtyp ATCC 10895. In Präparationen der Peroxisomen konnte gezeigt werden, da# dieses Enzym in diesen Organellen lokalisiert ist (Fig. 10). Während die Enzymaktivität in Wildtyp-Peroxisomen deutlich messbar ist. findet sich in den Peroxisomen des Disruptionsstamms keine Aktivität mehr.

Die Disruption des Gens führt zu einer deutlichen Verminderung der Vit- aminbildung im Vergleich zum Elternstarnm (Fig. 4). Wird das Gen dagegen unter Steuerung des starken TEF-Promotors auf einem Plasmid

(Fig. 6) in zusätzlicher Kopie in die Ashbya-Zellen gebracht, ist ein deutlicher Anstieg in der Enzymaktivität und der Riboflavinbildung me#bar (Fig. 5).

Fig. 7 zeigt, daß bei der Verstoffwechsdung ungesättigter Fettsäuren NADPH bei znei von drei alternativen Reaktionswegen als Reduktionsmittel benötigt wird. Die darin involvierte 2,4-Dienoyl-CoA- Reduktase konnte in Zellen von Ashbya ebenfalls in Peroxisomen lokalisiert werden (Fig. 8). Die Disruption des IDP3-Gens sollte nun zu einem verringerten Wachstum der Zellen auf Linolsäure oder Linolensäure führen. Das konnte auch gemessen werden (Fig. 9). Damit zeigt sich, daß die Bedeutung der IDP3 für den Stoffwechsel der Zelle in der NADPH- Bildung liegt.

Beschreibung der Figuren Fig. 1 : Schema der Konstruktion des Vektors piDPkan für den Gen- austausch des chromosomalen Ag/DP3-Gens gegen eine durch Deletion und Insertion des G418R-Gens inaktive Genkopie.

Fig. 2 : Überprüfung der partiellen Deletion und gleichzeitigen Insertion der Geneticin-Resistenz-Kassette am AglDP-Lokus mittels Southern-Blot-Analyse. Genomische, Sphl-gespaltene DNA wurde mit einer Digoxygenin-markierten Sonde hybridisiert.

Fig. 3 : Vergleich der Enzymaktivitäten der NADP-spezifischen ICDH vom Ashbya-Wildtyp, der Mutante A. g. A/DP3b und den AgIDP- Überexprimierern A. g. pAGIDP3a und A. g. pAGIDP3b bei Wachstum auf Glucose-Vollmedium.

Fig. 4 : Vergleich des Wachstums und der Riboflavinbildung vom Ashbya-Wildtyp und der Mutante A. g. AIDP3b bei Wachstum auf Sojaöl-Vollmedium.

Fig. 5 : Vergleich des Wachstums, der Riboflavinbildung und der NADP-spezifischen ICDH vom Ashbya-Wildtyp und den Ag/DP3-Überexprimierern A. g. pAGIDP3a und A. g. pAGIDP3b bei Kultivierung auf Sojaöl-Vollmedium.

Fig. 6 : Plasmid zur Überexpression des Ag/DP3-Gens unter Kontrolle von TEF-Promotor und TEF-Terminator.

Zur Einführung der Sphl-Schnittstelle war eine Änderung der für die zweite Aminosäure kodierenden Nukleotidsequenz notwendig. Es wurde ein konservativer Austausch der Aminosäure Glycin in Leucin vorgenommen.

Fig. 7 : Abbauwege ungesättigter Fettsäuren mit Doppelbindungen an geraden (A) und ungeraden (B, C) C-Atomen in Peroxisomen nach Henke et al. (1998).

Fig. 8 Trennung von aus Ashbya-Wildtyp isolierten Organellen im Percoll-Dichtegradienten : Aktivitäten [U/ml] der Markerenzyme Katalase (Peroxisomen) und Fumarase (Mitochondrien), der NAD-und der NADP- spezifischen ICDH und der für den Abbau ungesättigter Fett- säuren notwendigen 2,4-Dienoyl-CoA-Reduktase und jazz #2- Enoyl-CoA-lsomerase Fig. 9 : Vergleich des radialen Wachstums von Asbya-Wildtyp, der Mutanten A. g. A/DP3a und A. g. A/DP3b und den Überexprimierern A. g. pAGIDP3a und A. g. pAGIDP3b auf verschiedene Fettsäuren (A : 18 : 1 cis9 ; b : 18 : 2 cis9,12 ; C : 18 : 3 cis9,12,15).

Fig. 10 : Verteilung der Enzyme Katalase und ICDH im Percoll-Dichte- gradienten nach Zentrifugation von Organellen aus Myzel des Wildtyps (A) und der Mutante A.G. #IDP3b (B).

Beschreibung der Sequenz Nukleotidsequenz und daraus abgeleitete Aminosäuresequenz des für die peroxisomale NADP-spezifische Isocitrat-Dehydrogenase codierenden Ag/DP3-Gens aus A. gossypii.