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Title:
MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST C-KIT
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/1992/021766
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention concerns monoclonal antibodies against the human c-kit receptor which are obtainable from the DSM ACC 2007, DSM ACC 2008 and DSM ACC 2009 cell lines or can be bound to the c-kit receptor in a way which is equivalent to the antibodies produced by the DSM ACC 2007, DSM ACC 2008 or DSM ACC 2009 cell lines. The invention also concerns a method of demonstrating the malignity of tumours of haematopoietic cells, seminomas or small-cell lung carcinomas. In this method, a tissue sample is incubated with at least one monoclonal antibody against the c-kit receptor as proposed by the invention, the presence of bound antibodies subsequently being demonstrated by prior art methods.

Inventors:
Bartke, Ilse (Von-Hillern-Weg 2, Tutzing, D-8132, DE)
Kostka, G�nter (Barerstr. 74, M�nchen 40, D-8000, DE)
Naujoks, Kurt (Buchenstr. 3, Penzberg, D-8122, DE)
Ullrich, Axel (Adalbertstra�e, M�nchen 40, D-8000, DE)
Application Number:
PCT/EP1992/001117
Publication Date:
December 10, 1992
Filing Date:
May 20, 1992
Export Citation:
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Assignee:
BOEHRINGER MANNHEIM GMBH (Sandhoferstr. 116, Mannheim, D-68298, DE)
Bartke, Ilse (Von-Hillern-Weg 2, Tutzing, D-8132, DE)
Kostka, G�nter (Barerstr. 74, M�nchen 40, D-8000, DE)
Naujoks, Kurt (Buchenstr. 3, Penzberg, D-8122, DE)
Ullrich, Axel (Adalbertstra�e, M�nchen 40, D-8000, DE)
Max V, Planck Gesellschaft Zur F�rderung Der Wissenschaften E. (Bunsenstr. 10, G�ttingen, D-3400, DE)
International Classes:
C12N15/02; C07K14/705; C07K16/00; C07K16/28; C07K16/32; C12N5/10; C12N5/18; C12N5/20; C12P21/08; G01N33/53; G01N33/574; G01N33/577; C12R1/91; (IPC1-7): C12N5/20; C12N15/06; C12N15/12; C12P21/08; G01N33/574; G01N33/577
Domestic Patent References:
WO1989001973A21989-03-09
Other References:
EMBO JOURNAL Bd. 6, Nr. 11, November 1987, OXFORD, GB Seiten 3341 - 3351; Y. YARDEN ET AL.: 'Human proto-oncogene c-kit: a new cell surface receptor tyrosine kinase for an unidentified ligand.' in der Anmeldung erwähnt
JOURNAL OF CELLULAR BIOCHEMISTRY Bd. SUP 0, Nr. 15F, 1991, NEW YORK, USA Seite 89; L. ASHMAN: 'A murine monoclonal antibody to the human c-kit proto-oncogene product SCF receptor effect on the growth of hemopoietic ürogenitor cells in-vitro and expression of c-kit in AML.'
LEUKEMIA RESEARCH Bd. 14, Nr. 7, 1990, Seiten 637 - 644; L. ASHMAN ET AL.: 'A monoclonal antibody that inhibits the action of GM-CSF on normal but not leukaemic progenitors.'
CLINICAL RESEARCH Bd. 39, Nr. 2, 1991, Seite 210A; V. BROUDY ET AL.: 'Isolation and characterization of a monoclonal antibody SR-1 that recognizes the stem cell factor receptor c-kit.'
Attorney, Agent or Firm:
Weber, Manfred (Boehringer Mannheim GmbH, Sandhoferstr. 116, Mannheim 31, D-6800, DE)
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Claims:
ISP a t e n t a n s p r ü c h e
1. Monoklonaler Antikörper gegen den humanen ckitRezep¬ tor, erhältlich aus den Zellinien DSM ACC 2007, DSM ACC 2008 oder DSM ACC 2009 oder in äquivalenter Weise an den ckitRezeptor bindefähig wie die von den Zellinien DSM ACC 2007, DSM ACC 2008 oder DSM ACC 2009 produzierten • Antikörper.
2. Monoklonaler Antikörper gegen den humanen ckitRezep¬ tor, welcher die Bindung von Wachstumsfaktoren an den c kitRezeptor inhibiert und erhältlich ist durch Immuni¬ sierung mit Säugerzellen, die mit einer in diesen Zellen exprimierbaren ckitSequenz transfiziert wurden, Immor¬ talisierung der Milzzellen der immunisierten Tiere, Identifizierung derjenigen Hybridomzellen, die den gewünschten Antikörper produzieren, über die Bestimmung der Bindung des erhaltenen Antikörpers an den ckit Rezeptor, sowie die Bestimmung der Wirkung dieses Anti¬ körpers auf die Bindung von Wachstumsfaktoren an den c kitRezeptor, Identifizierung solcher Hybridomzellen, deren Kulturüberstand dabei eine hemmende Wirkung auf¬ weist, Klonierung dieser Hybridomzellen und Isolierung des von diesen Klonen produzierten Antikörpers nach bekannten Verfahren.
3. Monoklonaler Antikörper gegen den humanen ckitRezep¬ tor, welcher die Stimulierung der Proliferation lympho¬ ider Zellen durch SCF inhibiert und erhältlich ist durch Immunisierung mit Säugerzellen, die mit einer in diesen Zellen exprimierbaren ckitSequenz transfiziert wurden. Immortalisierung der Milzzellen der immunisierten Tiere, Identifizierung derjenigen Hybridomzellen, die den gewünschten Antikörper produzieren, über die Bestimmung der Bindung des erhaltenen Antikörpers an den ckit Rezeptor, sowie die Bestimmung der Wirkung dieses Anti¬ körpers auf die Proliferation lymphoider Zellen, Identi¬ fizierung solcher Hybridomzellen, deren Kulturüberstand dabei eine hemmende Wirkung aufweist, Klonierung dieser Hybridomzellen und Isolierung des von diesen Klonen produzierten Antikörpers nach bekannten Verfahren.
4. Monoklonaler Antikörper gegen den humanen ckit Rezeptor, welcher die SCFinduzierte Proliferation lymphoider Zellen stimuliert und erhältlich ist durch Immunisierung mit Säugerzellen, die mit einer in diesen Zellen exprimierbaren ckitSequenz transfiziert wurden, Immortalisierung der Milzzellen der immunisierten Tiere, Identifizierung derjenigen Hybridomzellen, die den gewünschten Antikörper produzieren, über die Bestimmung der Bindung des erhaltenen Antikörpers an den ckit Rezeptor, sowie die Bestimmung der Wirkung dieses Anti¬ körpers auf die Proliferation lymphoider Zellen, Klonie¬ rung der auf diese Weise identifizierten gewünschten Hybridomzellen und Isolierung des von diesen Klonen produzierten Antikörpers nach bekannten Verfahren.
5. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen den humanen ckitRezeptor durch Immunisierung mit Säugerzellen, die mit einer in diesen Zellen exprimier¬ baren ckitSequenz transfiziert wurden, Immortalisie¬ rung der Milzzellen der immunisierten Tiere, Klonierung von solchen Hybridomzellen, die Antikörper gegen den humanen ckitRezeptor produzieren und Isolierung der von diesen Klonen produzierten Antikörper nach bekannten Verfahren.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man solche Hybridomzellen kloniert, deren Kulturüber¬ stand solche Antikörper enthält, die mit dem Paraffin behandelten ckitRezeptor reagieren und die von diesen Klonen produzierten Antikörper nach bekannten Verfahren isoliert.
7. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen den humanen ckitRezeptor, welche die Bindung von Wachstumsfaktoren an den ckitRezeptor inhibieren durch Immunisierung mit Säugerzellen, die mit einer in diesen Zellen exprimierbaren ckitSequenz transfiziert wurden, Immortalisierung der Milzzellen der immunisierten Tiere, Identifizierung derjenigen Hybridomzellen, die den gewünschten Antikörper produzieren, über die Bestimmung der Bindung des erhaltenen Antikörpers an den ckit Rezeptor, sowie die Bestimmung der Wirkung dieses Anti¬ körpers auf die Bindung von Wachstumsfaktoren an den c kitRezeptor, Identifizierung solcher Hybridomzellen, deren Kulturüberstand dabei eine hemmende Wirkung auf¬ weist, Klonierung dieser Hybridomzellen und Isolierung der von diesen Klonen produzierten Antikörper nach bekannten Verfahren.
8. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen den humanen ckitRezeptor, welche die Stimulierung der Proliferation lymphoider Zellen durch SCF inhibieren durch Immunisierung mit Säugerzellen, die mit einer in diesen Zellen exprimierbaren ckitSequenz transfiziert wurden, Immortalisierung der Milzzellen der immunisier¬ ten Tiere, Identifizierung derjenigen Hybridomzellen, die den gewünschten Antikörper produzieren, über die Bestimmung der Bindung des erhaltenen Antikörpers an den ckitRezeptor, sowie die Bestimmung der Wirkung dieses Antikörpers auf die Proliferation lymphoider Zellen, Identifizierung solcher Hybridomzellen, deren Kul¬ turüberstand dabei eine hemmende Wirkung aufweist, Klonierung dieser Hybridomzellen und Isolierung der von diesen Klonen produzierten Antikörper nach bekannten Verfahren.
9. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen den humanen ckitRezeptor, welche die SCFinduzierte Proliferation lymphoider Zellen stimulieren durch Immu¬ nisierung mit Säugerzellen, die mit einer in diesen Zellen exprimierbaren ckitSequenz transfiziert wurden, Immortalisierung der Milzzellen der immunisierten Tiere, Identifizierung derjenigen Hybridomzellen, die den gewünschten Antikörper produzieren, über die Bestimmung der Bindung des erhaltenen Antikörpers an den ckit Rezeptor, sowie die Bestimmung der Wirkung dieses Anti¬ körpers auf die SCF induzierte Proliferation lymphoider Zellen, Klonierung der auf diese Weise identifizierten gewünschten Hybridomzellen und Isolierung der von diesen Klonen produzierten Antikörpern nach bekannten Verfah¬ ren.
10. Zellinie, die einen monoklonalen Antikörper gegen den humanen ckitRezeptor produziert, ausgewählt aus der Gruppe DSM ACC 2007, DSM ACC 2008 und DSM ACC 2009.
11. Verfahren zum Nachweis der Malignität von Tumoren der hämatopoietischen Zellen, von Seminomen oder kleinzelli gem Lungenkarzinom, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Gewebeprobe mit mindestens einem monoklonalen Antikör¬ per gegen den ckitRezeptor inkubiert und anschließend gebundene Antikörper mittels bekannter Methoden nach¬ weist.
Description:
Monoklonale Antikörper σeσen c-kit

Die Erfindung betrifft monoklonale Antikörper gegen den huma¬ nen c-kit-Rezeptor sowie ein Verfahren zum Nachweis der Mali- gnität von Tumoren der hämatopoietischen Zellen, von Seminomen oder kleinzelligem Lungenkarzinom über den Nachweis einer veränderten Expression des c-kit-Rezeptors.

Entwicklung, Differenzierung und StoffWechselfunktionen der Zellen eines mehrzelligen Organismus werden durch Hormone und Wachstumsfaktoren reguliert. Der erste Schritt ist in vielen Fällen die Bindung dieser Faktoren an einen Rezeptor an der Zelloberfläche. Diese Bindung löst bei einer Reihe dieser Re¬ zeptoren die Phosphorylierung von Tyrosinresten verschiedener Zellproteine aus. Für diese Rezeptor-Tyrosinkinasen konnte ein entscheidender Einfluß auf das Wachstumsverhalten von Zellen nachgewiesen werden (Yarden und Ullrich, Ann. Rev. Biochem. 57 (1988), 443 - 478). Autokrine Regelsysteme unter Beteiligung von Rezeptor-Tyrosinkinasen spielen eine wichtige Rolle bei der Transformation von Zellinien, die als Tumor-Mo¬ dellsystem dienen, sowie auch in primärem Tumorgewebe. Für bestimmte Rezeptor-Tyrosinkinasen, wie z.B. den EGF-Rezeptor und den her2/neu-Rezeptor, konnte ein direkter Zusammenhang zwischen der Überexpression des Rezeptors und der Aggressivi¬ tät des Tumorgeschehens bewiesen werden (Slamon et.al., Science 244, 1989, 707 - 712; Di Fiore et.al., Cell 51, 1987, 1063 - 1070).

Ein weiteres Mitglied der Rezeptor-Tyrosinkinasen-Familie ist c-kit, das als zelluläres Homolog des viralen Onkogens v-kit (felines Leukämie-Virus HZ4-FeSV) entdeckt, kloniert und se¬ quenziert wurde (Yarden et.al. EMBO-Journal 6 (1987), 3341 -

3351). Es weist eine weitgehende Homologie mit dem PDGF-Re- zeptor und dem CSF-1-Rezeptor (c-fms) auf. Untersuchungen mit Hilfe der Northem-Blot-Technik weisen auf eine charakteri¬ stische Verteilung des Rezeptors in den unterschiedlichen Ge¬ weben hin. Eine hohe Expression des c-kit-Gens konnte in hämatopoietischen Zellen und vor allem in Hirngeweben, Mela- noblasten, Ovarien und in Stammzellen der Testis nachgewiesen werden (Orr-Urtreger et.al., Developement 109 (1990), 911 - 923). Untersuchungen an verschiedenen erythroiden und myelo- iden Zellinien weisen auf eine Expression des c-kit-Gens in frühen Differenzierungsstufen hin (Andre et.al., Oncogene 4 (1989), 1047 - 1049). Bestimmte Tumoren, wie z.B. Glioblasto- mazellen zeigen ebenfalls eine deutliche Expression des c-kit-Gens.

Als natürlicher Ligand des c-kit Rezeptors wurde inzwischen ein etwa 30kD großes Protein aus dem Kulturüberstand von mu- rinen Fibroblasten isoliert und als MGF = mast cell growth- factor (Williams et.al., Cell 63 (1990), 167 - 174) oder hä- matopoietischer Wachstumsfaktor KL (Huang et.al., Cell 63, (1990), 225 - 233) bezeichnet. Ein entsprechendes Protein wurde auch aus Rattenleberzellen isoliert und SCF = stem cell factor genannt (Zsebo et.al., Cell 63 (1990), 195 - 201). Der entsprechende humane Faktor wurde von Martin et al. kloniert und wird synonym als SCF, MGF oder Steel Factor (SF) bezeich¬ net (Cell 63 (1990), 203-211).

Die Expression des c-kit-Gens wurde bislang nur auf der Ebene der Transkription über den Nachweis der c-kit-mRNA, insbeson¬ dere mit Hilfe der Northern-Blot-Technik bestimmt. Dieses Verfahren kann jedoch nur indirekt Hinweise auf die Menge des exprimierten Proteins geben, da z.B. Regulationsvorgänge auf Translationsebene oder die Stabilität des gebildeten c-kit- Rezeptor-Proteins hierbei überhaupt nicht erfaßt werden. Für die Diagnostik ist es daher von entscheidender Bedeutung, di-

2 rekt die Menge des exprimierten Proteins zu bestimmen. Dies ist mit der erforderlichen Spezifität der Aussage nur mit Hilfe monoklonaler Antikörper gegen den c-kit-Rezeptor mög¬ lich.

Von N. Lerner et.al. (Blood 77 (1991), 1876-1883) wurde gezeigt, daß der monoklonale Antikörper YB5.B8 von Gadd et.al. (Leuk.Res. 9 (1985), 1329), der gegen leukämische Blasten eines Patienten mit akuter myeloischer Leukämie gerichtet ist, wahrscheinlich mit dem c-kit Protein reagiert. Ein monoklonaler Antikörper gegen den c-kit-Rezeptor kann jedoch mit eindeutiger Sicherheit nur durch Immunisierung mit einem definierten c-kit Antigen erhalten werden.

Es war daher die Aufgabe der Erfindung, monoklonale Antikör¬ per gegen den c-kit-Rezeptor sowie ein Verfahren zu deren Herstellung zur Verfügung zu stellen, sowie ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das es ermöglicht, mit Hilfe dieser Antikörper eine veränderte Expression dieses c-kit-Rezeptors nachzuweisen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch monoklonale Antikörper gegen den humanen c-kit-Rezeptor, die aus den Zellinien DSM ACC 2007, DSM ACC 2008 oder DSM ACC 2009 erhältlich sind oder in äquivalenter Weise an den c-kit-Rezeptor bindefähig sind, wie die von den Zellinien DSM ACC 2007, DSM ACC 2008 oder DSM ACC 2009 produzierten Antikörper.

Unter dem Begriff "in äquivalenter Weise bindefähiger Anti¬ körper" werden Antikörper verstanden, bei denen eine Epi¬ topüberlappung mit dem definierten, bekannten Antikörper nachweisbar ist. Diese Epitopüberlappung kann mit Hilfe eines kompetitiven Testsystems leicht nachgewiesen werden. Dazu wird zum Beispiel mit Hilfe eines Enzym-Immunoassays über¬ prüft, inwieweit ein Antikörper mit dem bekannten Antikörper um die Bindung an ein definiertes Antigen bzw. ein spezielles

Epitop konkurriert. Dazu inkubiert man das entsprechende Antigen mit dem bekannten monoklonalen Antikörper in markier¬ ter Form und einem Überschuß des in Betracht gezogenen Anti¬ körpers. Durch Immobilisierung der gebildeten Komplexe, Trennung der festen von der flüssigen Phase und Nachweis der gebundenen Markierung in einer der beiden Phasen kann dann leicht festgestellt werden, inwieweit der in Betracht gezoge¬ ne Antikörper den definierten Antikörper aus der Bindung verdrängen kann. Ist eine Verdrängung von mindestens 50 % bei 10 5 -fächern Überschuß gegeben, so liegt eine Epitopüberlappung vor.

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß die erhaltenen Antikörper spezifisch nur mit Seminomen (DSM ACC 2008) bzw. Seminomen und kleinzelligem Lungenkarzinom (DSM ACC 2007 und DSM ACC 2009) reagieren, nicht aber mit gesundem Lungehgewe- be.

Es hat sich weiterhin überraschenderweise gezeigt, daß der monoklonale Antikörper DSM ACC 2007 die Stimulierung der Proliferation lymphoider Zellen durch den Stammzellfaktor SCF inhibiert. Dieser Antikörper hemmt zudem auch die Bindung von Wachstumsfaktoren wie SCF an den c-kit-Rezeptor und damit auch die SCF-induzierte Phosphorylierung des c-kit-Rezeptors, sowie die SCF induzierte Abnahme der Expression von c-kit- Rezeptormolekülen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein monoklo¬ naler Antikörper gegen den humanen c-kit-Rezeptor, welcher die Bindung von Wachstumsfaktoren an den c-kit-Rezeptor inhibiert und erhältlich ist durch Immunisierung mit Säuger¬ zellen, die mit einer in diesen Zellen expri ierbaren c-kit- Sequenz transfiziert wurden, Immortalisierung der Milzzellen der immunisierten Tiere, Identifizierung derjenigen Hybridom- zellen, die den gewünschten Antikörper produzieren, über die Bestimmung der Bindung des erhaltenen Antikörpers an den c- kit-Rezeptor, sowie die Bestimmung der Wirkung dieses Anti-

körpers auf die Bindung von Wachstumsfaktoren an den c-kit- Rezeptor, Identifizierung solcher Hybridomzellen, deren Kulturüberstand dabei eine hemmende Wirkung aufweist, Klonie- rung dieser Hybridomzellen und Isolierung des von diesen Klonen produzierten Antikörpers nach bekannten Verfahren.

Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein monoklonaler Antikörper gegen den humanen c-kit-Rezeptor, welcher die Stimulierung der Proliferation lymphoider Zellen durch SCF inhibiert und erhältlich ist durch Immunisierung mit Säu¬ gerzellen, die mit einer in diesen Zellen exprimierbaren c- kit-Sequenz transfiziert wurden, Immortalisierung der Milz¬ zellen der immunisierten Tiere, Identifizierung derjenigen Hybridomzellen, die den gewünschten Antikörper produzieren, über die Bestimmung der Bindung des erhaltenen Antikörpers an den c-kit-Rezeptor, sowie die Bestimmung der Wirkung dieses Antikörpers auf die Proliferation lymphoider Zellen, Identi¬ fizierung solcher Hybridomzellen, deren Kulturüberstand dabei eine hemmende Wirkung aufweist, Klonierung dieser Hybridom¬ zellen und Isolierung des von diesen Klonen produzierten Antikörpers nach bekannten Verfahren.

Die Immunisierung wird in den hierfür üblicherweise verwende¬ ten Tieren, wie z.B. Mäusen oder Ratten durchgeführt. Vor¬ zugsweise werden Mäuse verwendet.

Als Immunogen werden vorzugsweise NIH-3T3 Zellen verwendet, die mit einer für das c-kit Protein codierenden cDNA transfi¬ ziert wurden. Die Klonierung dieser cDNA wurde wie von Yarden et. al., (EMBO J. 6 (1987), 3341 - 3351) beschrieben, durch¬ geführt. Die für die Immunisierung verwendete transfizierte NIH-3T3 Zellinie c-kit wurde am 23.05.1991 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC 2006 hinterlegt.

(o Die Immortalisierung der Milzzellen der immunisierten Tiere erfolgt vorzugsweise durch Fusionierung mit der Myelomzelli- nie P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580) gemäß der Methode nach

J.of.Imm. Meth. 39 (1980) 285 - 308. Daneben können aber auch andere, dem Fachmann geläufige Verfahren zur Immortalisierung der Milzzellen (z.B. EBV-Transformation) verwendet werden.

Zur Klonierung werden die Zellen z.B. mittels eines Fluores- zenz-aktivierten Zellsorters vereinzelt. Zum Nachweis von im- mortalisierten Zellen, die den gewünschten Antikörper gegen c-kit produzieren, wird eine Probe des KulturüberStandes in einem ELISA-Test auf Reaktivität mit dem c-kit-Rezeptor gete¬ stet. Um solche Antikörper zu erhalten, welche die Bindung von Wachstumsfaktoren an den c-kit-Rezeptor bzw. die Stimu¬ lierung der Proliferation lymphoider Zellen durch SCF inhi¬ bieren, wird der Kulturüberstand derjenigen Klone, die an den c-kit-Rezeptor bindende Antikörper produzieren, zusätzlich auf die Hemmung der Bindung von Wachstumsfaktoren an den c- kit-Rezeptor bzw. die Hemmung der SCF stimulierten Prolifera- ton lymphoider Zellen untersucht.

Die Hemmung der Bindung von Wachstumsfaktoren an den c-kit- Rezeptor ergibt sich in üblicher Weise durch Inkubation eines markierten Wachstumsfaktors mit dem c-kit-Rezeptor in Gegen¬ wart des zu untersuchenden Antikörpers und anschließender Bestimmung von Rezeptor-gebundenem Wachstumtsfaktor.

Die Hemmung der SCF induzierten Proliferation lymphoider Zellen wird in üblicher Weise bestimmt, vorzugsweise über die Fluoreszenzmarkierung von Lymphozyten, deren Proliferation mit SCF stimuliert wurde.

Diejenigen Klone, deren Kulturüberstand eine positive Reakti¬ on ergibt, werden expandiert und die von diesen Klonen produ¬ zierten Antikörper nach bekannten Verfahren isoliert.

7

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß der Antikörper DSM ACC 2007 an den mit Paraffin behandelten c-kit-Rezeptor ebenso bindet wie an den nicht mit Paraffin behandelten c- kit-Rezeptor.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden solche Hybridomzellen kloniert, deren Kulturüberstand solche Antikörper enthält, die auch mit dem paraffin-behandelten c-kit-Rezeptor reagieren und die von diesen Klonen produzier¬ ten Antikörper nach bekannten Verfahren isoliert.

Der Nachweis von immortalisierten Zellen, die den gewünschten Antikörper gegen c-kit produzieren, erfolgt bei dieser be¬ vorzugten Ausführungsform über die Inkubation einer Probe des Kulturüberstandes mit einem paraffin-behandelten Gewebe¬ schnitt und Nachweis des an den in diesem Gewebeschnitt ent¬ haltenen c-kit-Rezeptor gebundenen Antikörpers.

Der monoklonale Antikörper DSM ACC 2009 fördert überraschen¬ derweise synergistisch die durch den Stammzellfaktor SCF induzierte Proliferation lymphoider Zellen. Er stimuliert zudem die SCF induzierte Phosphorylierung des c-kit-Rezeptors und bewirkt eine geringe Verzögerung der SCF induzierten Abnahme der c-kit-Rezeptor Expression.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein monoklo¬ naler Antikörper gegen den humanen c-kit-Rezeptor, welcher die SCF induzierte Proliferation lymphoider Zellen stimuliert und erhältlich ist durch Immunisierung mit Säugerzellen, die mit einer in diesen Zellen exprimierbaren c-kit-Sequenz transfiziert wurden, Immortalisierung der Milzzellen der immunisierten Tiere, Identifizierung derjenigen Hybridomzel¬ len, die den gewünschten Antikörper produzieren, über die Bestimmung der Bindung des erhaltenen Antikörpers an den c- kit-Rezeptor, sowie die Bestimmung der Wirkung dieses Anti-

i körpers auf die Proliferation lymphoider Zellen, Identifizie¬ rung solcher Hybridomzellen, deren Kulturüberstand dabei eine stimulierende Wirkung aufweist, Klonierung dieser Hybridom¬ zellen und Isolierung des von diesen Klonen produzierten Antikörpers nach bekannten Verfahren.

Die Stimulierung der SCF induzierten Proliferation lymphoider Zellen wird in üblicher Weise bestimmt, vorzugsweise über Fluoreszenzmarkierung von Lymphozyten, deren Proliferation mit SCF stimuliert wurde.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur- Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen den humanen c- kit-Rezeptor durch Immunisierung mit Säugerzellen, die mit einer in diesen Zellen exprimierbaren c-kit-Sequenz transfi- ziert wurden und Immortalisierung der Milzzellen der immuni¬ sierten Tiere, wobei man solche Hybridomzellen kloniert, die Antikörper gegen den humanen c-kit-Rezeptor produzieren und die von diesen Klonen produzierten Antikörper nach bekannten Verfahren isoliert.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen den humanen c-kit-Rezeptor, welche die Bindung von Wachstums¬ faktoren an den c-kit-Rezeptor inhibieren und erhältlich sind durch Immunisierung mit Säugerzellen, die mit einer in diesen Zellen exprimierbaren c-kit-Sequenz transfiziert wurden, Immortalisierung der Milzzellen der immunisierten Tiere, Identifizierung derjenigen Hybridomzellen, die den gewünsch¬ ten Antikörper produzieren, über die Bestimmung der Bindung des erhaltenen Antikörpers an den c-kit-Rezeptor, sowie die Bestimmung der Wirkung dieses Antikörpers auf die Bindung von Wachstumsfaktoren an den c-kit-Rezeptor, Identi¬ fizierung solcher Hybridomzellen, deren Kulturüberstand dabei eine hemmende Wirkung aufweist, Klonierung dieser Hybridom¬ zellen und Isolierung der von diesen Klonen produzierten Antikörper nach bekannten Verfahren.

Ein besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen den humanen c-kit-Rezeptor, welche die Stimulierung der Proliferation lymphoider Zellen durch SCF inhibieren und erhältlich sind durch Immunisierung mit Säugerzellen, die mit einer in diesen Zellen exprimierbaren c-kit-Sequenz transfi- ziert wurden, Immortalisierung der Milzzellen der immunisier¬ ten Tiere, Identifizierung derjenigen Hybridomzellen, die den gewünschten Antikörper produzieren, über die Bestimmung der Bindung des erhaltenen Antikörpers an den c-kit-Rezeptor, sowie die Bestimmung der Wirkung dieses Antikörpers auf die Proliferation lymphoider Zellen, Identifizierung solcher Hybridomzellen, deren Kulturüberstand dabei eine hemmende Wirkung aufweist, Klonierung dieser Hybridomzellen und Iso¬ lierung der von diesen Klonen produzierten Antikörper nach bekannten Verfahren.

Ein besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist wei¬ terhin ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Anti¬ körpern gegen den humanen c-kit-Rezeptor, welche die SCF induzierte der Proliferation lymphoider Zellen stimulieren und erhältlich sind durch Immunisierung mit Säugerzellen, die mit einer in diesen Zellen exprimierbaren c-kit-Sequenz transfiziert wurden und Immortalisierung der Milzzellen der immunisierten Tiere, Identifizierung derjenigen Hybridomzel¬ len, die den gewünschten Antikörper produzieren, über die Bestimmung der Bindung des erhaltenen Antikörpers an den c- kit-Rezeptor, sowie die Bestimmung der Wirkung dieses Anti¬ körpers auf die Proliferation lymphoider Zellen, Identifizie¬ rung solcher Hybridomzellen, deren Kulturüberstand dabei eine stimulierende Wirkung aufweist, Klonierung dieser Hybridom¬ zellen und Isolierung der von diesen Klonen produzierten Antikörper nach bekannten Verfahren.

Weiterhin sind Gegenstand der Erfindung die Zellinien DSM ACC 2007, DSM ACC 2008 und DSM ACC 2009.

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß mit den erfin¬ dungsgemäßen monoklonalen Antikörpern gegen c-kit eine Beur¬ teilung der Malignität von Tumoren im Bereich der hämatopoietischen Zellen, von Seminomen sowie von kleinzelli- gem Lungenkarzinom erreicht werden kann, die wertvolle Hin¬ weise für eine Therapie liefert.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Nachweis der Malignität von Tumoren der hämatopoietischen Zellen, von Seminomen und kleinzelligem Lungenkarzinom bei dem man eine Gewebeprobe mit mindestens einem monoklona¬ len Antikörper gegen den c-kit-Rezeptor inkubiert und an¬ schließend gebundene Antikörper mittels bekannter Methoden nachweis .

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Gewebeprobe mit einem erfindungsgemäßen Antikörper gegen den c-kit-Rezeptor inkubiert. Vorzugsweise wird dabei ein Antikörper vom IgG- Isotyp verwendet. Es können aber auch Fab oder F(ab') 2 Frag¬ mente verwendet werden.

Zum Nachweis von gebundenem Antikörper gegen den c-kit-Rezep¬ tor wird beispielsweise mit einem vor oder nach der Bindung an den c-kit-Antikörper markierten zweiten Antikörper gegen murines Fctf inkubiert. Als Markierung wird üblicherweise ein Enzym, ein Floureszenz- oder Chemilumineszenzfarbstoff ver¬ wendet.

Maligne Tumoren der hämatopoietischen Zellen, maligne Semi- nome sowie bei Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die in äquivalenter Weise wie die von den Zellinien DSM ACC 2007, oder DSM ACC 2009 produzierten Antikörper an den c-kit-Rezep¬ tor binden, auch kleinzellige Luπgenkarzinome zeigen dabei ein positives Signal.

Eine weitere Verwendung von erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers gegen den humanen c-kit-Rezeptor, welche die Stimulierung der Proliferation lymphoider Zellen durch SCF inhibieren, ist die Verwendung zur Herstellung eines Therapeutiku s zur Behandlung einer myeloischen Leukämie.

Die erfindungsgemäßen Zellinien DSM ACC 2006, DSM ACC 2007, DSM ACC 2008 und DSM ACC 2009 wurden am 23.05.1991 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-3300 Braunschweig hinterlegt.

Die Erfindung wird durch folgende Beispiele in Verbindung mit der Abbildung erläutert.

Figur 1 zeigt die Stimulierung der SCF-induzierten Prolifera¬ tion lymphoider Zellen durch den monoklonalen Antikörper DSM ACC 2009, sowie die Hemmung der SCF-induzierten Proliferation lymphoider Zellen durch den monoklonalen Antikörper DSM ACC 2007. Gezeigt wird jeweils der Anteil proliferierender Zel¬ len nach Inkubation von AML-Zellen bei 37°C mit Medium (•), 100 μg/ml SCF (7), 2 μg/ml der monoklonalen Antikörper DSM ACC 2007 (ψ) bzw. DSM ACC 2009 (Δ) , sowie nach Vorinkubation mit den monoklonalen Antikörpern DSM ACC 2007 (D) bzw. DSM ACC 2009 (A) für 30 Minuten bei 4°C vor der Stimulierung mit SCF.

Beispiel 1

Gewinnung monoklonaler Antikörper gegen den humanen c-kit-Re¬ zeptor

Das humane c-kit-Gen wird wie von Yarden et. al., (EMBO- Journal, volu e 6 (1987), 3341 - 3351) beschrieben, kloniert und in NIH-3T3-Zellen expri iert. Mit 5.000.000 dieser trans- fizierten, c-kit-exprimierenden NIH-3T3-Zellen werden Balb/c-

I

Mäuse intraperitoneal immunisiert. Diese Immunisierung wird in ca. 4-wöchigen Abständen wiederholt. Die Immunisierungs¬ dauer beträgt insgesamt 6 Monate. Anschließend werden die Tiere noch zweimal mit wheat germ agglutinin angereichertem c-kit (s. Beispiel 2) immunisiert, die letzte Immunisierung wird dabei intravenös durchgeführt. Drei Tage nach dieser letzten Immunisierung erfolgt die Immortalisierung von Milz¬ zellen der immunisierten Tiere mit der Myelomzellinie P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580).

Die Fusion der Milzzellen mit der Myelomzellinie wird nach dem Standardverfahren gemäß J. of Imm. Meth., 39 (1980), 285 - 308 durchgeführt. Das Fusionsverhältnis Milzzellen:Mye- lomzellen ist dabei 1:1. Die Fusionsprodukte werden auf 24er . Kulturschalen der Firma Greiner mit 5xl0 4 Peritonealexsudat- zellen der Maus ausgesät. Positive Primärkulturen (Bestimmung gemäß Beispiel 3) werden zwei Wochen nach Fusion mit Hilfe eines Floureszenz-aktivierten Zellsorters (Becton Dickinson) kloniert. Die Zellen werden dabei einzeln in 96er Mikrotiter- platten abgelegt und mit HECS-Medium (Tecnomara) gefüttert. Als Kulturmedium wird anschließend handelsübliches RPMI-1640- Medium mit 10%igem fötalem Kälberserum verwendet.

Zur Gewinnung der monoklonalen Antikörper werden die so er¬ haltenen Hybridom-Zeilklone in vivo expandiert. Dazu werden 5 x 10 6 Hybridom Zellen intraperitoneal in mit Pristan (Sig- ma) vorbehandelte Mäuse inokkultiert. Nach 10 - 15 Tagen werden je Maus 2 - 3 ml Ascites entnommen und daraus der monoklonale Antikörper nach herkömmlichen Methoden gewonnen. Die Ausbeute beträgt etwa 5 mg IgG/ml Ascites.

Beispiel 2 °

Anreicherung des c-kit-Rezeptor-Proteins über wheat germ agglutinin Agarose

Die c-kit exprimierende transfizierte NIH-3T3 Zellinie c-kit wird in DMEM/F12 (1:1) Medium, das 10 % FKS und 2 mmol/1 Glutamin enthält, bis zur Konfluenz in Rollerflaschen kulti¬ viert. Anschließend werden die Zellen in 20 ml Lysepuffer lysiert. Der Lysepuffer enthält 50 mraol/1 Hepes pH 7,5; 150 mmol/1 Natriumchlorid; 1,5 mmol/1 MgCl 2 ; lmmol/1 EGTA; 1 % Triton X-100; 10 % Glycerin und 4 μg/ml PMSF. Das Lysat wird 1 Stunde bei 100.000 g zentrifugiert, der Überstand 1:1 mit Her2x-Puffer verdünnt und über Nacht bei 40°C im Batch-Ver- fahren an wheat germ agglutinin-Agarose (Sig a) gebunden (Her2x-Puffer: 50 mmol/1 Hepes pH 7,2; 150 mmol/1 Natrium¬ chlorid; 1 % Triton X-100; 10 % Glycerin und 4 μg/ml PMSF). Anschließend wird die wheat germ agglutinin-Agarose mit 10 Volumen Her2x-Puffer gewaschen und schließlich c-kit-Rezep- tor-Protein mit 0,3 mol/1 N-Acetyl-glucosamin in Her2x-Puffer eluiert.

Beispiel 3

Bestimmung der Spezifität der produzierten Antikörper

Um die Spezifität der Antikörper im Kulturüberstand der Hy¬ bridomzellen zu erfassen, wird ein Enzyme-Linked Immuno- Sorbent-Assay (ELISA) angewendet.

Dazu werden 96er Mikrotiterplatten (Nunc) mit 100 μl c-kit- Antigen (Isolierung nach Beispiel 2; 5 μg/ml in Carbonatpuf- fer, Boehringer Mannheim, Katalog Nr. 726559) beschichtet, mit 100 μl Kulturüberstand (1:25 mit PBS (nach Dulbecco und Vogt, J.Exp.Med. 99 (1954), 167 - 182) verdünnt) 2 Stunden

bei Raumtemperatur inkubiert und mit 3 x 350 μl PBS/0,05% Tween 20 gewaschen. Danach wird mit POD markiertem Schaf- Anti-Maus IgG (10 mU; Boehringer Mannheim, Katalog Nr. 1317377) 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, mit 3 x 350 μl PBS/0,05% Tween 20 gewaschen und die Nachweisreaktion mit 100 μl ABTS® (1 mg/ml, Boehringer Mannheim Katalog Nr. 756 407) in 40 mmol/1 Citrat-Puffer pH 4,4, der 3,25 mmol/1 Natriumperborat enthält (Boehringer Mannheim, Katalog Nr. 1204 530) ausgelöst. Nach 20 Minuten Inkubation bei Raumtem¬ peratur werden die Extinktionen in einem Photometer bei 405 nm bestimmt.

Beispiel 4

Bestimmung der Wirkung der produzierten Antikörper auf die. SCF induzierte Proliferation lymphoider Zellen und die Bindung von Wachstumsfaktoren

Lymphozyten werden durch Dichtegradientenzentrifugation (Lymphozyten-Trennmedium Boehringer Mannheim GmbH, Katalog- Nr. 295 949) isoliert und in RPMI 1640 komplett (10 % fötales Kälberserum, 2 mmol/1 Glutamin, 1 % Vitaminlösung (Boehringer Mannheim GmbH, Katalog-Nr. 210 307), 100 IU/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin) auf einen Zelltiter von 1 x 10 6 Zellen/ml eingestellt. 100 μl dieser Zellsuspension werden zusammen mit 10 μl rekombinantem menschlichen SCF (Amgen Thousand Oaks USA; Endkonzentration 100 ng/ml), sowie in Parallelansätzen mit 2 μg/ml des zu untersuchenden monoklona¬ len Antikörpers für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. In zwei weiteren Parallelansätzen wird zunächst mit 2 μg/ml des zu untersuchenden monoklonalen Antikörpers für 30 Minuten bei 4°C vorinkubiert und anschließend 100 ng/ml SCF zugesetzt. Anschließend werden diejenigen Zellen, die einen zu untersu¬ chenden monoklonalen Antikörper gebunden haben, durch Fluor¬ eszenzmarkierung mit FITC gekoppeltem Anti-Maus-Immunglobulin aus dem Schaf angefärbt (Boehringer Mannheim GmbH, Katalog- Nr. 821 462), sowie die DNA dieser Zellen durch Behandlung

der Zellen mit einer hypotonen Lösung von 0,05 mg/ml Propi- diumjodid (Sigma) und 0,1 % Natriumeitrat angefärbt und die Markierungen in einem FACS IV Zellsorter (Becton Dickinson) untersucht. Die Anregung erfolgt bei 488 nm , die Messung der FITC-markierten Zellen bei 530 nm, und die der Propi- diumjodid-markierten Kerne bei 610 nm. Der prozentuale Anteil von proliferierenden Zellen ergibt sich aus der Summe der mit Propidiumjodid-markierten Anteile von Zellen, die sich in der S-Phase, sowie in der G2- bzw. M-Phase befinden (%S + %G2/M) . Die Figur 1 zeigt den stimulierenden Effekt des monoklonalen Antikörpers DSM ACC 2009 auf die SCF-induzierte Proliferation lymphoider Zellen, sowie den hemmenden Effekt des monoklona¬ len Antikörpers DSM ACC 2007 auf die SCF-induzierte Prolife¬ ration lymphoider Zellen.

Der monoklonale Antikörper DSM ACC 2007 bewirkt zusätzlich eine Hemmung der Bindung von SCF an den c-kit-Rezeptor. Zum Nachweis dieser Wirkung werden die wie oben beschriebenen isolierten Lymphozyten 30 Minuten auf Eis in PBS mit 0,01 % NaN und 2 μg/ml des monoklonalen Antikörpers DSM ACC 2007 inkubiert. Anschließend werden 125 ng/ml biotinylierter SCF zugegeben und die Zellen mit Streptavidin-Phycoerythrin (Dianova) gefärbt. Die Auswertung erfolgt in einem FACS IV Cellsorter (Becton Dickinson) mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Messung bei 570 nm. Im Vergleich zu einem Kontrollsatz ohne Inkubation mit dem monoklonalen Antikörper DSM ACC 2007 ergibt sich eine 98 %-ige Hemmung der SCF-Bindung an Lymphozyten durch den monoklonalen Antikörper DSM ACC 2007.

Medium (RPMI 1640 komplett)

440 ml RPMI 1640 (Boehringer Mannheim BM 209 945)

50 ml fötales Kälberserum (FKS) (BM 210 471)

5 ml Glutaminlösung, 200 mmol/1 (BM 210 277)

5 ml Vitaminlösung (1 %) (BM 210 307)

1 ml Penicillin (50 000 IU) und Streptomycin (50 mg)

ΛQ>

Vitaminlösung (BM 210 307):

mg/100 ml mg/100 ml

Beispiel 5

Bestimmung der Epitopüberlappung von Antikörpern gegen c-kit

Zum Nachweis der Epitopüberlappung eines Antikörpers mit dem monoklonalen Antikörper DSM ACC 2007 wird ein ko petetiver Enzym-Immunoassay durchgeführt. Dazu wird das nach Beispiel 2 angereicherte c-kit-Rezeptor Protein zunächst mit D-Biotinyl- €-amidocaponsäure-N-hydroxysuccinimidester (Boehringer Mann¬ heim, Katalog-Nr. 1008960) gemäß Angaben des Herstellers biotinyliert. Von diesem biotinylierten Antigen werden 300 ng in einem Volumen von 100 μl PBS durch einstündige Inkubation bei Raumtemperatur an eine mit Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatte (Herstellung nach EP-A 0 344 578) gebunden. Nach viermaligem Waschen mit PBS/0,05 % Tween 20 wird 90 Minuten bei Raumtemperatur simultan inkubiert mit dem mono¬ klonalen Antikörper DSM ACC 2007, der mit Peroxidase markiert wurde (Endkonzentration 250 mU/ml) und dem zu beurteilenden Antikörper. Nach erneutem viermaligem Waschen mit PBS/0,05 % Tween 20 wird mit der Enzymsubstratlösung ABTS® in Natrium¬ perborat enthaltendem Puffer 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend die Extinktion bei 405 nm als Maß

AI- für die Menge des gebundenen, POD markierten, monoklonalen Antikörpers DSM ACC 2007 gemessen. Dieser Wert wurde vergli¬ chen mit der Extinktion, die erhalten wurde, bei Inkubation mit dem monoklonalen Antikörper DSM ACC 2007 allein. Wenn bis zu einem 10 5 -fachen Überschuß an zu beurteilendem Antikörper gegenüber dem monoklonalen Antikörper DSM ACC 2007 Enzymkon- jugat (250 mU/ml) mindestens 50 % Kompetition zu erkennen sind, liegt eine Epitopüberlappung vor.

Beispiel 6

Bestimmung der Expression des c-kit-Rezeptor Proteins in verschiedenen Geweben und Tumoren

Der zu untersuchende Gewebeschnitt wird 2 Stunden bei 4°C mit einem monoklonalen Antikörper gegen c-kit (DSM ACC 2007, DSM ACC 2009 bzw. DSM ACC 2008, jeweils 20 μg/ml) inkubiert. Nach einem Waschschritt (3 x 5 Minuten in PBS/0,05% Tween-20) wird der Gewebeschnitt mit Schaf-Anti-Maus IgG (100 μg/ml, Boeh¬ ringer Mannheim, Katalog Nr. 1092618) 1 Stunde bei Raumtempe¬ ratur inkubiert. Gebundener Antikörper wird über einen Komplex aus Peroxidase und murinem Anti-Peroxidase-Antikörper (250 mU/ml, Boehringer Mannheim, Katalog Nr. 1092 626, 1 Stunde Inkubation bei Raumtemperatur) nachgewiesen. Die Nachweisreaktion wird mit Diaminobenzidin (1 mg/ml) ausgelöst und an einem Mikroskop ausgewertet.

Die folgende Tabelle zeigt die nach dieser Methode bestimmte Reaktivität der aus den Zellinien DSM ACC 2007, DSM ACC 2008 und DSM ACC 2009 erhaltenen monoklonalen Antikörper.

monoklonale Antikörper