技术领域

本发明涉及一种狂犬病病毒单克隆抗体、 狂犬病病毒的抗原蛋白、 编 码它们的基因以及它们的用途。 背景技术

目前国际上通用的检测狂犬病病毒 rabies virus 的快速荧光灶抑制试 验 (Rapid fluorescence focus inhibition test, RFFIT )方、法： 每固定量的病毒 与系列稀释的待测血清和已知滴度的对照血清 一起 37 °C温育， 加入敏感细 胞悬液。 再经温育后， 细胞形成单层， 这时用冷的丙酮固定， 用荧光标记 的狂犬病病毒核蛋白 （NP ) 单克隆抗体染色， 以检测未被中和的病毒的存 在 （荧光灶） ， 继而计算每种待测血清中的抗体的效价。 进行 RFFIT检测 都需要荧光标记的 NP抗体，敏感高效的荧光标记狂犬病病毒核蛋� ��单克隆 抗体诊断试剂是该技术的关键因素。

狂犬病病毒在细胞培养中的产量较低， 不易从狂犬病病毒颗粒获得大 量纯化的 NP , 加之狂犬病病毒的 NP不含糖基， 本身免疫较弱， 不易制备 抗 NP抗体。目前这种关键试剂在国内尚无获得正� ��批准文号的荧光标记的 狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体诊断试剂， 而进口产品则价格昂贵、 周期长， 所以快速检测狂犬病病毒抗原和抗体的方法在 国内一直未能建立， 严重影 响了狂犬病的临床诊断、 疫苗质量控制和流行病学调查等项工作的进行 。 因此， 获取新的狂犬病病毒抗体具有重大的意义。 发明内容

本发明的目的是提供一种新的狂犬病病毒单克 隆抗体、 相应能够用于 制备高效价的单克隆抗体的抗原蛋白与编码它 们的基因以及它们的用途。 为了实现上述目的， 第一方面， 本发明提供了一种单克隆抗体， 该单 克隆抗体具有氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1所示的轻链可变区以及氨基酸序 列如 SEQ ID NO: 2所示的重链可变区。

第二方面， 本发明提供了一种杂交瘤细胞， 该杂交瘤细胞的保藏号为

CGMCC No. 7956。

第三方面， 本发明提供了一种单克隆抗体， 该单克隆抗体由保藏号为 CGMCC No. 7956的杂交瘤细胞产生。

第四方面， 本发明提供了第一方面和 /或第三方面所述的单克隆抗体在 制备检测狂犬病病毒的试剂中的用途。

第五方面， 本发明提供了第一方面和 /或第三方面所述的单克隆抗体在 制备检测狂犬病病毒抗体的试剂中的用途。

第六方面， 本发明提供了一种用于检测待检样本中狂犬病 病毒抗体的 试剂盒， 该试剂盒含有荧光标记的单克隆抗体和固定液 ， 所述单克隆抗体 为第一方面和 /或第三方面所述的单克隆抗体。

其中， 所述待检样本一般为血清。

所述固定液可以为 75-85% (v/v) 的丙酮水溶液。

所述荧光标记可以为本领域常用的各种荧光标 记， 例如异硫氰酸荧光 素 （FITC)、 四乙基罗丹明 （RB200) 和羧基四甲基罗丹明 （TAMRA) 等。

本发明的试剂盒还可以含有抗体稀释液、 洗液、 标准品和封闭液等， 本领域技术人员能够根据需要对此进行选择， 在此不再赘述。

第七方面， 本发明提供了一种抗原蛋白， 该抗原蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 3所示。

第八方面， 本发明提供了一种编码第七方面所述的抗原蛋 白的基因。 优选地， 本发明中编码上述抗原蛋白的基因的碱基序列 如 SEQ ID NO: 4 所示。 第九方面， 本发明提供了一种重组载体， 该重组载体具有第八方面所 述的基因。

第十方面， 本发明提供了一种转化子， 该转化子含有第九方面所述的 重组载体。

第十一方面， 本发明还提供了编码第一方面所述的单克隆抗 体的轻链 和 /或重链的基因。

编码第一方面所述的单克隆抗体的轻链的基因 的碱基序列可以如 SEQ ID NO: 11所示。

编码第一方面所述的单克隆抗体的重链的基因 的碱基序列可以如 SEQ ID NO: 12所示。

本发明的单克隆抗体与国外同类产品的效价相 当， 用于 RFFIT检测中 时能够表现出荧光强度和持久性均较高的特性 。 此外， 以本发明的抗原蛋 白作为抗原进行免疫而制得的单克隆抗体的效 价较高。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施 方式部分予以详细说 明。 生物保藏

本发明的杂交瘤细胞为鼠杂交瘤细胞 (Mouse Hybridoma ) , 于 2013年 7月 12日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会� ��通微生物中心 （缩写 为 CGMCC, 地址： 北京市朝阳区北辰西路 1号院 3号， 中国科学院微生物 研究所， 邮政编码： 100101 ) ， 保藏编号为 CGMCC No. 7956。 具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。 应当理解的是， 此处所 描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明 ， 并不用于限制本发明。

以下实施例中， 使用的狂犬病病毒由中国疾病预防控制中心从 北京市 患狂犬病的病犬大脑中分离得到， DMEM和胎牛血清（fetal serum of bovine, FBS) 均购自 Thermo公司。 实施例中， 未注明具体条件的实验方法的， 均 按照常规条件进行。 实施例 1

(1) 抗原蛋白的制备

参照 《分子克隆实验指南》第三版 α萨姆布鲁克等人， 科学出版社，

2002) 第 7-8章， 提取狂犬病病毒感染细胞的全 RNA (该操作委托中国疾 病预防控制中心完成）、 逆转录得到相应的 cDNA、 以逆转录得到的 cDNA 为模板进行 PCR扩增， PCR使用的上游引物如 SEQIDNO: 5所示， 下游 引物如 SEQIDNO: 6所示。

上游引物： 5，-GAACCATATGGATGCCGACAAGATTGTG-3， （SEQIDNO: 5) 下游引物： 5，-ACCTCGAGTTATGAGTCATTCGAATACG-3， （SEQIDNO: 6) 委托华大基因对 PCR扩增获得的基因进行测序， 得到其碱基序列如 SEQIDNO: 4所示。

参照 《分子克隆实验指南》第三版 α萨姆布鲁克等人， 科学出版社，

2002 ) 第 1章和第 15章， 将碱基序列如 SEQ ID NO: 4所示的基因连接到 pET28a ⁺ (带有 His-tag)的 Ndel酶切位点与 Xhol酶切位点之间， 得到重组 质粒 pET28a ⁺ -RV， 将重组质粒 pET28a ⁺ -RV转化入原核表达菌株大肠杆菌 BL21中，筛选阳性克隆并通过 PCR (引物如 SEQ ID NO: 5和 SEQ ID NO:

6所示） 验证目的基因的成功导入， 从而制备能够表达上述基因的转化子， 培养转化子并超声破碎菌体而获得含有抗原蛋 白的溶液， 纯化后得到浓度 为 12.5mg/ml的抗原蛋白 （氨基酸序列如 SEQ ID NO: 3所示） 溶液， -80 °0保存备用 （纯化的具体操作为： 取含有抗原蛋白的溶液， 0.45um滤膜过 滤后用 DEAE离子亲和层析对相应的抗原蛋白做纯化处� �， 纯化后对样品 进行 SDS-PAGE电泳检测， 选择含有抗原成分的最佳的洗脱溶液， 进一步 进行镍柱亲和纯化）。

ARPNSFAEFLNKTYSNDS ( SEQ ID NO: 3)

(2) 杂交瘤细胞的获得

根据 《精编免疫学实验指南》 （科利根等人， 科学出版社， 2009) 中第 2章记载的方法， 用步骤（1 )得到的抗原蛋白对雌性 Balb/c小鼠进行免疫， 采用有限稀释法进行亚克隆， 并通过 ELISA (可以参照 《精编免疫学实验 指南》（科利根等人， 科学出版社， 2009 )第 1章单元 1.1的基本方案部分) 筛选阳性克隆子， 最终选取阳性结果最好， 即抗体表达量最佳的克隆细胞 株，经培养后保藏于中国普通微生物菌种保藏 管理中心，保藏号为 CGMCC No. 7956， 保藏日期为 2013年 7月 12日。 (3) 单克隆抗体的制备

参照 《精编免疫学实验指南》 （科利根等人， 科学出版社， 2009) 第 1 章培养步骤 （2) 获得的杂交瘤细胞 CGMCCNo.7956, 并参照 《精编蛋白 质科学实验指南》 （科利根等人， 科学出版社， 2007)第 8章从培养液中提 取纯化单克隆抗体， 获得纯化的单克隆抗体 （或参照 CN 101560255A中权 利要求 2记载的方法获得）。

(4) 单克隆抗体可变区氨基酸序列的确定

参照 《分子克隆实验指南》第三版 （J.萨姆布鲁克等人， 科学出版社， 2002)第 7-8章或《精编免疫学实验指南》（科利根等人 ，科学出版社， 2009) 中记载的方法， 从杂交瘤细胞中提取 mRNA, 采用逆转录 PCR方法分析编 码单克隆抗体的基因序列， 进而分析相应的单克隆抗体的氨基酸序列， 使 用的引物如表 1所示，测得 cDNA序列分别如表 2中的 SEQIDNO: 11 (轻 链） 和 SEQIDNO: 12 (重链） 所示， 从而获得单克隆抗体可变区氨基酸 序列分别如表 2中的 SEQIDNO: 1 (轻链） 和 SEQIDNO: 2 (重链） 所

表 1

表 2

(5 ) 单克隆抗体效价的测定

首先， 参照文献 "抗狂犬病毒单克隆抗体的纯化及标记"（刘文� ��等， 中国兽药杂质， 2011 ) 对单克隆抗体进行 FITC标记， 获得 FITC标记的抗 体， 用于 RFFIT检测。 同时， 取 FITC标记的抗体置于荧光显微镜下观察， 荧光的持续时间可长达 20min，说明本发明的单克隆抗体能够表现出较� ��的 荧光特性。

分别采用购自 Millipore 的 LIGHT DIAGNOSTICS™ Rabies DFA Reagent中提供的 FITC标记的单克隆抗体和本发明 FITC标记的抗体进行 RFFIT试验， 从而检测 7种抗体样品的效价， RFFIT试验的具体操作如下：

1 ) 100μΙ7孔完全培养液（含 10% FBS的 DMEM)平铺一整板（96孔）；

2)将 7种样品 （厂家如表 3所示， 分别编号为 Saml-7)和国标（GB, NIBSC代码： RAI)进行连续三倍稀释， 具体操作 （以 Saml为例）： A1孔 加入 Saml样品 50μΙ^， 连续吹打 5次 （混匀）； 抽取 50μΙ^加入 Α2孔， 连 续吹打 5次； 依次稀释至 A12孔， 抽走 50μΙ^， 其他样品 （包括 Sam2-GB (24.4IU) ) 均全部按照此方法进行稀释；

3 ) 加入狂犬病病毒 （1.12χ10 ⁸ 个 /孔） （80%感染量： 原始病毒 16倍稀 释）：原始病毒 0.5mL加入到 7.5mL的完全培养液中（10%),混匀后， 50μΙ7 孔加入到上述 96孔板中；

4) 37°C下孵育 lh， 加入提前准备好的 BHK细胞， 50μΙ7孔。 ΒΗΚ细 胞 （BHK-21[C-13]， ATCC®CCL-10™, 密度： 70%左右， 75cm ² FLASK, 12mL完全培养液混匀）；

5 ) 24h后， 将培养板中的培养液抽走， 用 PBS洗一遍， 抽走。 80%冷 丙酮（-20°C )固定 15分钟，分别加入 LIGHT DIAGNOSTICS™ Rabies DFA Reagent中提供的 FITC标记的单克隆抗体和本发明 FITC标记的抗体， 37 °C下孵育 30min。

6) 弃抗体， 每孔加 20(^L的 PBS连续洗 3次； 每孔滴加 2滴 80%甘 油， 铺满孔底， 置于倒置荧光显微镜下观察， 取两种抗体反应体系中 50% 感染量分界点的荧光灶数量结果进行比较， 计算样品的效价。 FITC标记的 抗体的 RFFIT检测结果如表 3所示， FITC标记的 LIGHT DIAGNOSTICS™ Rabies DFA Reagent中提供的 FITC标记的单克隆抗体的 RFFIT检测结果如 表 4所示。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 样品效价

Sam 1 (购自河南

A 华兰生物工程股 10% 75% 63.53 IU 份有限公司）

Sam 2 (购自山东

B 米歇尔生物生化 15% 65% 23.24 IU 制品有限公司）

Sam 3 (购自武汉

C 生物制品研究所 5% 55% 86.84 IU 有限责任公司）

Sam 4 (购自深圳

D 卫武光明生物制 5% 65% 73.65 IU 品有限公司）

Sam 5 (购自武汉

中原瑞德生物制

E 15% 75% 183.98 IU 品有限责任公

司）

Sam 6 (购自山东

F 泰邦生物制品有 25% 80% 159.71 IU 限公司）

Sam 7 (购自四川

G 远大蜀 药 股 45% 95% 36.06 IU 份有限公司）

H GB(24.4IU) 25% 65% 表 4

从本实施例的结果可以看出， 本发明获得的单克隆抗体具有较高效价。 具体地， 本发明的单克隆抗体与国外同类抗体 （LIGHT DIAGNOSTICS™ Rabies DFA Reagent中提供的单克隆抗体）的效价相当，用� � RFFIT检测时 获得的结果相近， 可以作为替代产品。 测试例 1

本测试例用来说明本发明的抗体在检测待检血 清中狂犬病病毒抗体中 的用途。

委托河南省疾病预防控制中心分别使用 RFFIT 试剂盒 （LIGHT DIAGNOSTICS™ Rabies DFA Reagent, Cat No: 5100， Millipore) 和 RFFIT 试剂盒中 FITC标记的抗体替换为实施例 1中步骤（5 )获得的 FITC标记的 抗体的待验试剂盒（除 FITC标记的抗体外，其他试剂均与 RFFIT试剂盒相 同）对 50份血清样品中狂犬病病毒抗体进行检测， 50份血清样品中， 未接 种狂犬病疫苗者血清 3份， 未全程接种狂犬病疫苗者血清 12份（接种 4针 后采血 11人， 接种 3针后采血 1人）， 全程接种狂犬病疫苗者血清 35份， 接种疫苗均为辽宁成大生物股份有限公司生产 的 Vera细胞培养纯化人用狂 犬病疫苗 （产品批号： 201109269 )， 样品采集符合国家相关法规， 患者在 采样前均签署了知情同意书。具体检测步骤参 照试剂盒说明书， 结果如表 5 所示。

检测结果 （IU) 样品编 接种针次

号 本发明的抗体 商购抗体

01 第 4针 16.68 1.40

02 第 4针 170.38 115.37

03 第 4针 50.03 3.96

04 第 4针 6.68 0.84

05 第 4针 16.68 4.55

06 第 4针 14.94 3.96

07 第 4针 4.22 0.84

08 第 4针 38.01 9.04

09 第 4针 38.01 3.62

10 第 4针 167.52 72.87

11 第 4针 4.22 0.72

12 第 5针 12.67 2.17

13 第 5针 33.79 6.87

14 第 5针 20.03 9.04

15 第 5针 17.73 3.01

16 第 5针 16.68 2.29

17 第 5针 16.68 1.56

18 第 5针 38.01 7.52

19 第 5针 58.12 10.85

20 第 5针 6.68 0.72

21 第 5针 78.12 19.50

22 第 5针 38.01 6.50

23 第 5针 33.79 9.04

24 第 5针 33.79 3.01

25 第 5针 25.18 9.04

26 第 5针 7.89 1.32

27 第 5针 8.52 3.01

28 第 5针 50.03 9.04

29 第 5针 4.63 1.00

30 第 5针 33.79 12.57

31 第 5针 170.38 115.37

32 第 5针 2.23 0.68

33 第 5针 18.61 7.52

34 第 5针 16.68 4.09

35 第 5针 50.03 18.31

36 第 5针 22.63 3.62

37 第 5针 38.01 8.35

38 第 5针 14.94 4.67 39 第 5针 70.97 27.11

40 第 5针 21.95 3.01

41 第 5针 55.84 10.85

42 第 5针 50.03 10.85

43 第 5针 20.60 11.89

44 第 5针 65.84 20.60

55 第 5针 4.98 2.29

59 第 5针 38.01 11.89

45 死亡 0.74 0.68

54 未接种 0.28 0.24

52 第 3针 0.67 0.76

53 未接种 0.28 0.26

46 未接种 0.24 0.24

SR 标定 33.79 20.60

PC 标定 8.52 6.87

NC 标定 0.10 0.14 采用 FITC标记的商购抗体的方法与使用本发明的 FITC标记的抗体的 方法的检测结果基本一致。 由此可以进一步看出， 本发明获得的单克隆抗 体的效价较高， 使用其进行 RFFIT试验能够获得准确的检测结果。 从以上实施例和测试例的结果可以看出， 本发明的单克隆抗体可以代 替现有的抗体作为诊断试剂使用， 荧光强度和持久性均较高， 结果可靠。

以上详细描述了本发明的优选实施方式， 但是， 本发明并不限于上述 实施方式中的具体细节， 在本发明的技术构思范围内， 可以对本发明的技 术方案进行多种简单变型， 这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是， 在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术 特 征， 在不矛盾的情况下， 可以通过任何合适的方式进行组合， 为了避免不 必要的重复， 本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外， 本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行 任意组合， 只要 其不违背本发明的思想， 其同样应当视为本发明所公开的内容。