本発明の「マウスpIgRに反応するモノクロ ーナル抗体」は、マウスpIgRに反応するモノ� �ローナル抗体であればいずれのものも該当� �るが、天然型マウスpIgRに反応するものが好� ��しく、感度が高いものが特に好ましい。ま� ��、本発明の「マウスpIgRに反応するモノクロ ーナル抗体」は、マウスpIgRの細胞外領域に� �応するモノクローナル抗体であることが好� �しい。

 本発明の「マウスpIgRに反応するモノクロー ナル抗体」は、配列表配列番号1に記載のア� �ノ酸配列または配列番号2に記載の塩基配列� ��コードされるアミノ酸配列を含むポリヌク� ��オチドと反応するモノクローナル抗体であ� ��ことが好ましい。
 マウスpIgRをコードする塩基配列は、「マウ スpIgRに反応するモノクローナル抗体」を得� �れる塩基配列であればいずれの塩基配列で� �ってもよく、マウスpIgRをコードする塩基配� ��の一部であってもよい。例えば、マウスpIgR の細胞外領域をコードする塩基配列を用いる ことが好ましい。また、配列表配列番号1に� �載のアミノ酸配列または配列番号2に記載の� ��基配列にコードされるアミノ酸配列を含む� ��リヌクレオチドを用いることが好ましい。

 本発明のマウスpIgRをコードする塩基配列は PCR法等、一般的に知られているいずれの方法 でもクローニングする事ができる。例えば、 次のように行うことができる。
 マウスの組織または細胞から、例えばクロ� ��ホルム/フェノール/イソアミルアルコール/� ��アニジニウム/CsCl法等公の知のRNA調製法に� �全RNAを調製する。オリゴdTセルロースカラム クロマトグラフィー処理にて、この全RNAから ポリA(+)RNA(mRNA)を取得し、逆転写酵素の存在� �でcDNA合成を行うことができる。cDNA合成およ びクローニングキットは、Amersham社、Invitrogen 社等から市販されているものを用いることが できる。このようにして合成されたcDNAを鋳� �にして、プライマーを用いてPCRを行い、pIgR� ��コードするcDNAを増幅する。
 プライマーはマウスpIgRのセンス鎖およびア ンチセンス鎖に対してアニーリングすること ができるプライマーであればいずれのものも 用いることができる。例えば、データバンク 等に記載されているマウスpIgRのcDNA塩基配列� ��基づいて設計し、合成することができる。� ��ライマーは15~25塩基程度のサイズを有して� �り、マウスpIgRのcDNA塩基配列の5″末端およ� �3″末端側の配列からなることが好ましい。� ��ライマーの合成は、市販のDNA自動合成機を� ��いて行うことができる。

 PCRは、市販のサーマルサイクラー(例えばPer kin Elmer-9600,Eppendorf-Master cycler gradientなど)を 使用して行うことが好ましい。PCR条件として 、例えば10×PCR buffer(100mM Tris(pH8.3),500mM KCl,15 mM MgCl ₂ および0.1%(W/V)ゼラチン)、dNTPs 2mM、プラーマ� ��2.5μM~10μM中、Taqポリメラーゼなどの耐熱性D NAポリメラーゼ(1~2.5単位;rTaq(Takara、京都、日� ��),Ampli Taq(Promega)など)を添加して反応を行う ことができる。PCRは、例えば95℃、2~5分での1 回の変性サイクルの後、95℃、0.2~1分での変� �、50~65℃、0.5~1分でのアニーリング、および7 2℃、0.5~2分での伸長を1サイクルとして15~40サ イクルを行い、最後に、72℃、5分の伸長を行 う方法等が挙げられる。
 これらのcDNAクローニングおよびPCRについて は、公知の文献(例えば、Sambrookら、Molecular C loning A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Labora tory (1989)、Ausubelら,Current Protocols in Molecular� �Biology (1989)等)を参照できる。

 上記のようにして得られたマウスpIgRをコ ードする塩基配列を組み込むベクターとして 、プラスミド、ウイルス、ファージ等の一般 的に知られているいずれのベクターをも用い ることができる。このうち動物細胞発現ベク ターを用いる事が好ましく、例えば昆虫細胞 発現ベクターまたは哺乳動物細胞発現ベクタ ーが挙げられ、哺乳動物細胞発現ベクターを 用いることが特に好ましい。哺乳動物細胞発 現ベクターとしては、アデノウイルスベクタ ー、ワクシニアウイルスベクターなどのウイ ルスベクター、pcDNA3.1(Invitrogen)、pCI(Promega)等� ��プラスミドベクター等が挙げられる。これ� ��のベクターは市販のものを用いることがで� ��る。

 本発明で用いることができるベクターに� ��いて、プロモーター、エンハンサー、複製� ��始点、リボソーム結合部位、ポリアデニル� ��部位、またはターミネーター等の調節配列� ��含むことができる。これらの配列を含むこ� ��によって、宿主の細胞内でプロモーターにR NAポリメラーゼが結合することによって転写� ��開始され、目的のタンパク質またはペプチ� ��に翻訳される。プロモーターとしては、例� ��ばCMV(サイトメガロウイルス)プロモーター� �RSV(呼吸器多核体ウイルス)プロモーター、EBV (Epstein-Barrウイルス)等のウイルスプロモータ� ��を含むことが好ましい。また、これらのベ� ��ターには、免疫増強シグナルおよび局在シ� ��ナルを含むペプチドをコードする塩基配列� ��含むことが好ましい。

 免疫増強シグナルは、免疫増強エレメン� ��とも称し、マウスpIgRの免疫原活性または抗 原活性を高めるための任意のペプチドのこと をいう。このようなペプチドとして、免疫ア ジュバント活性を有するペプチドやT細胞エ� �トープ等が挙げられる。このうちT細胞エピ� ��ープは、T細胞レセプターを認識し、これに 結合することができるものである。また、種 々のウイルス抗原、種々の細菌毒素などのエ ピトープやキーホールリンペットヘモシアニ ン(KLH)、オボアルブミン(OVA)、ウシ血清アル� �ミン(BSA)などのT細胞依存性抗原のエピトー� �などが含まれる。本発明において、これら� �免疫増強シグナルは、1つまたは複数を組み� ��わせて用いることができる。

 局在シグナルは、細胞内で発現、翻訳され� ��マウスpIgRを細胞膜に移行し、かつ分泌され たマウスpIgRを細胞膜上にアンカーする働き� �有する任意のペプチドのことをいう。局在� �グナルは、発現されたマウスpIgRを細胞表面� ��一定時間高濃度で留まらせることができ、� ��感度のマウスpIgR抗体を得るために有用であ る。
 このような局在シグナルとして、例えばGPI( グリコシルフォスファチジルイノシトール)-� ��ンカー等が挙げられる。GPIアンカーは、タ� ��パク質の疎水性のC末端の32アミノ酸残基が3 位のAsp残基の直後でトランスアミナーゼによ り切断されAsp残基の後ろに付与される。これ により、3位のAsp残基を介してターゲットタ� �パクを細胞膜上にアンカーさせることを可� �とする。本発明で使用可能な局在シグナル� �、上記のようなアンカー作用を示すもので� �ればいずれも用いることができ、上記のシ� �ナルに限定されない。

 本発明の発現ベクターの作成にあたり、� ��れらの免疫増強シグナル、マウスpIgRと局在 シグナルは、N末端側からこの順序で連結す� �ことが好ましく、それぞれのシグナル間に1~ 数個の任意のアミノ酸からなるリンカーが結 合してもよい。また、各配列間は、1~数個の� ��意のアミノ酸からなるリンカーを介在させ� ��、マウスpIgRまたはその機能性断片を連結す るように配置してもよい。さらに、本発明の 発現ベクターには細胞内で発現したマウスpIg Rまたはその機能性断片を細胞膜に輸送する� �めの分泌シグナルペプチドをコードする塩� �配列を連結することが好ましい。このよう� �泌シグナルペプチドとして、マウスpIgRのシ� ��ナルペプチドを用いる事が好ましい。

 本発明の発現ベクターの作成にあたり、N末 端側からプロモーターの下流に、分泌シグナ ルペプチド、免疫増強シグナルペプチド、マ ウスpIgR、局在シグナルペプチドと並べ、こ� �順序でこれらをコードする塩基配列を並べ� �発現ベクターを用いる事が好ましい。細胞� �で発現されたタンパク質は、細胞膜に移行� �、シグナルペプチドから切断されて分泌さ� �、細胞膜にアンカーとして留まるため、マ� �スpIgRに反応する抗体が生成されやすくなる� ��めである。
 さらに本発明の発現ベクターには、必要に� ��じて、目的の塩基配列の発現を検出するた� ��のFLAGタグ、ヒスチジンタグ(例えばHis6~His10) などのタグをコードする塩基配列を、目的塩 基配列の5″端または3″端に結合することが� ��きる。これらのタグは、発現の目的とする� ��ンパク質の検出のために有用である。

 マウスpIgRをコードする塩基配列を含むベ クターを免疫する動物としては、脊椎動物で あればいずれのものも用いることができるが 、鳥類または非ヒト哺乳動物を用いる事が好 ましい。例えばマウス、ラット、ハムスター 、モルモットなどのげっ歯類、ウシ、ウマ、 ヒツジ、ブタ、ヤギなどの有蹄類、ウサギ等 が好ましい。 動物への免疫にあたり、マウ� ��pIgRをコードする塩基配列を含むベクターを 動物の身体部分、例えば皮下等に注入するこ とが好ましい。注入は免疫できる回数および 量であればいずれでもよいが、例えば、約1~2 週間置きに数回、約1~2ヶ月にわたって行うこ とができる。ベクターの注入量は、例えば17. 5μg抗原/回であってもよい。

 本発明の「マウスpIgRに反応するモノクロー ナル抗体」は、マウスpIgRをコードする塩基� �列を含むベクターをマウス等の動物に免疫� �ることで作製することができる。本発明の� �体の作製にあたり、一般に用いられている� �ずれの方法を用いることもできるが、DNA免� �法を用いることが特に好ましい。
 本発明のDNA免疫法は、例えば、上記のよう� ��作成したマウスpIgRをコードする塩基配列を 含むベクターを動物に免疫することで行うこ とができる。これによって、動物体内におい てマウスpIgRをコードする塩基配列が発現す� �ことでマウスpIgRが得られ、これに反応する� ��体が産生される。
 本発明のベクターを用い、動物体内で発現� ��れるマウスpIgRは天然型であるため、天然型 マウスpIgRに反応する抗体が産生され得る。� �然型とは、ジスルフィド結合、糖鎖等を有� �るマウスpIgRの天然型高次構造を採ることを� ��味する。したがって、本発明で作製される� ��体は、マウスpIgRの天然型高次構造を特異的 に認識する、天然型マウスpIgRに反応し、か� �高親和性の抗体であるため有用性が高い。

 また、本発明の抗体の作製にあたり、DNA免� ��法で免疫された動物から脾臓細胞、B細胞ま たはリンパ細胞等を取り出し、これと骨髄腫 細胞(ミエローマ細胞)とを融合してハイブリ� ��ーマを作成することで本発明の抗体を作製� ��ることができる。
 ハイブリドーマの作製に用いる骨髄腫細胞� ��しては、本発明の抗体を産生できるハイブ� ��ドーマの作製に有用なものであればいずれ� ��ものも用いることができる。マウス骨髄腫� ��胞等を用いる事が好ましい。これらの細胞� ��合のために、公知の細胞凝集性媒体であれ� ��いずれのものも用いることができるが、例� ��ばポリエチレングリコールなどの細胞凝集� ��媒体を用いることが好ましい。

 本発明のハイブリドーマは、マウスpIgR、 好ましくは天然型マウスpIgRを特異的に認識� �る抗体を産生できるものであることが好ま� �い。このハイブリドーマを得るためには、� �合細胞の選抜を行うことが好ましく、この� �抜にはフローサイトメトリーが有用である� �フローサイトメトリーを用いた天然型マウ� �pIgRを特異的に認識する抗体を産生するハイ� ��リドーマの検出には、ヒトまたはマウスの� ��疫グロブリンと特異的に結合する蛍光標識� ��次抗体を用いることが好ましい。

 このようにして得たハイブリドーマをヌ� ��ドマウスに腹腔内注射し、腹水を採取し、� ��水をプロテインAまたはプロテインGセファ� �ースカラムに通して、高純度の目的のモノ� �ローナル抗体を回収することができる。こ� �ようなモノクローナル抗体の作製法につい� �は、公知の文献(例えば、Kohlerら,Nature,256:495� �(1975)、Ausubelら,Current Protocols in Molecular Biol ogy (1989)、Kozborら,Immunology Today 4:72 (1983)、Co leら,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,77-96 (1 985),Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor  Laboratory,Chapter 8,1988等)を参照することができ る。

 本発明の「ハイブリドーマ」には、マウスp IgRに反応するモノクローナル抗体を産生する ハイブリドーマであれば、いずれのものも含 まれるが、フローサイトメトリー等によって 選抜されたマウスpIgRに反応する感度の高い� �体を産生するものであることが好ましい。
 このようなハイブリドーマとして、本発明� ��NUD-001 No.3、NUD-001 No.4、NUD-001 No.7、NUD-001 N o.8、NUD-001 No.15、NUD-001 No.17、NUD-001 No.19、NUD -001 No.23、NUD-001 No.24、NUD-001 No.26、NUD-001 No. 27、NUD-001 No.29、NUD-001 No.32、NUD-001 No.33、NUD- 001 No.35、NUD-001 No.41、NUD-001 No.43、NUD-001 No.4 4、NUD-001 No.45、NUD-001 No.46、NUD-001 No.50、NUD-0 01 No.51、NUD-001 No.56、NUD-001 No.57、NUD-001 No.60 、NUD-001 No.65、NUD-001 No.67、NUD-001 No.69、NUD-00 1 No.72またはNUD-001 No.73等が挙げられる。
 このうち特に、NUD-001 No.7(NITE-BP423)、NUD-001  No.19(NITE-BP424)、NUD-001 No.24(NITE-BP425)、NUD-001 No .41(NITE-BP426)またはNUD-001 No.46(NITE-BP427)等のハ� ��ブリドーマが好ましい。

 本発明の「マウスpIgRに反応するモノクロー ナル抗体」は、検出の対象とする試料に存在 するマウスpIgRの検出に用いることができる� �試料としては、マウスから摘出した肝臓、� �管組織、唾液、血清、糞便などが挙げられ� �。
 本発明の「マウスpIgRを検出する方法」には 、従来知られている抗体を用いるタンパク質 の検出方法であればいずれの物も用いる事が できる。例えば、本発明の抗体を用いたウェ スタンブロッティング、ELISA、免疫沈降やaffi nity columnを用いることができる。
 以下、本発明の詳細を実施例等で説明する� ��、本発明はこれらに限定されるものではな� ��。