La présente invention se rapporte au domaine des matériaux organiques monolithiques poreux. L'invention concerne également les différents procédés de préparation de ces matériaux. Ces matériaux monolithiques possèdent certains avantages par rapport aux matériaux macroporeux plus traditionnels, liés notamment à l'absence d'espaces interstitiels à l'état tassé.

Une méthode générale pour l'élaboration de matériaux organiques monolithiques et poreux dans les éléments que l'on souhaite à l'intérieur d'une cavité simple (colonne, capillaire), ou d'un microsystème (canaux, réservoirs, chambres, points de dérivation) est basée sur la polymérisation in situ par voie thermique, photochimique ou radiochimique de monomères dissous dans un mélange de solvants porogènes.

Différents matériaux monolithiques pour microsystèmes analytiques et leurs procédés de préparation ont été décrits dans la littérature. Parmi ces méthodes, celles qui utilisent la voie thermique se caractérisent par des temps de polymérisation relativement longs (16 à 26h) et des températures de polymérisation élevées (60 à 90 ⁰ C). Par ailleurs, les phases poreuses obtenues sont le plus souvent optimisées pour un seul type d'application. Surtout, les matériaux monolithiques connus ne possèdent pas d'aptitude à la fonctionnalisation ou bien leur teneur en groupes fonctionnalisables est faible. De plus, la réactivité des groupes fonctionnalisables utilisées à ce jour (époxy, azlactone) est faible et nécessite des traitements longs et/ou dans des conditions sévères. La présente invention a pour but de proposer, d'une part, de nouveaux matériaux monolithiques fonctionnalisables sur mesure, après ajustement des caractéristiques de porosité-perméabilité et, d'autre part, des procédés de préparation de ces matériaux monolithiques, caractérisés par une mise en œuvre simplifiée.

Selon un premier aspect, l'invention a pour objet des matériaux monolithiques polymères comprenant des fonctions anhydride maléique aptes à être fonctionnalisées.

Selon un deuxième aspect, l'invention a trait à un procédé de préparation de matériaux monolithiques fonctionnalisables, ledit procédé comprenant une étape préalable de traitement de la surface des parois qui servent de support auxdits matériaux monolithiques, caractérisé en ce qu'il consiste en une réaction de polymérisation radicalaire thermique, photochimique ou radiochimique d'une composition comprenant une composition de base comportant: - de l'anhydride maléique comme monomère de base, connu pour son caractère accepteur d'électrons favorable à la formation de complexes à transfert de charge avec des monomères à caractère donneur d'électrons, associé à des comonomères éthyléniques à caractère donneur d'électrons et/ou à d'autres monomères éthyléniques à caractère donneur ou accepteur d'électrons;

- un mélange de solvants porogènes, ladite composition de base étant éventuellement additionnée d'un photoamorceur ou d'un amorceur thermique.

Selon un troisième aspect, l'invention se rapporte aux compositions à base d'anhydride maléique, de comonomères et/ou autres monomères et de solvants porogènes mises en œuvre pour l'élaboration de matériaux monolithiques selon l'invention.

Selon un quatrième aspect, l'invention concerne des matériaux monolithiques dans lesquels les fonctions anhydride maléique sont fonctionnalisées par réaction avec des composés nucléophiles. Les propriétés qui résultent de cette fonctionnalisation sont extrêmement variées : balance hydrophile/hydrophobe ajustable, présence de charges électriques positives ou négatives, de groupements organiques fonctionnels variés, éventuellement optiquement actifs, de substrats spécifiques, de sites catalytiques artificiels ou enzymatiques, etc.

Cette diversité de propriétés accessibles permet d'ajuster les propriétés fonctionnelles des matériaux poreux comme phase pour la chromatographie par interaction hydrophobe, d'affinité, ionique, électrochromatographie, électrophorèse capillaire, comme réacteur, comme support pour l'absorption et l'analyse de composés chimiques, comme capteur au sein d'un dispositif de détection. Selon un cinquième aspect, l'invention se rapporte donc aux diverses utilisations des matériaux monolithiques fonctionnalisés pour microsystèmes analytiques.

L'invention va maintenant être décrite en détail.

Selon un premier aspect, l'invention a pour objet un matériau monolithique polymère à groupes fonctionnalisâmes caractérisé en ce que ceux-ci sont des unités anhydride maléique.

Le choix du demandeur s'est porté sur des monolithes à forte teneur en anhydride maléique car celui-ci présente notamment deux particularités :

- une tendance à former des copolymères alternés par réaction radicalaire avec des monomères éthyléniques à caractère donneur d'électrons (éthers de vinyle, dérivés N-vinyliques),

- une aptitude à amorcer sa copolymérisation photochimique avec des monomères éthyléniques à caractère donneur d'électrons (éthers de vinyle, dérivés N-vinyliques) sans avoir recours à un photoamorceur radicalaire spécifique.

Les différentes applications nécessitent le plus souvent l'élaboration de phases monolithiques poreuses de caractéristiques fonctionnelles et fluidiques optimales. L'expérience montre que la microstructure et la porosité des monolithes sont très dépendantes de la composition du mélange réactionnel précurseur (nature et quantité des monomères, nature et composition du mélange porogène) ainsi que des conditions de l'élaboration (température, nature et cinétique des réactions d'amorçage, durée du traitement thermique, photochimique ou radiochimique).

Ces deux caractéristiques sont interdépendantes, chaque changement de propriété chimique par une modification de la composition du mélange réactionnel

précurseur nécessitant un ajustement des conditions de traitement en vue d'un optimum des propriétés fonctionnelles et fluidiques.

Afin de s'affranchir de cette difficulté inhérente à la méthode d'élaboration classique, le demandeur a développé une approche basée sur l'élaboration de monolithes à forte teneur en sites réactifs, pouvant être modifiés chimiquement après leur élaboration, par réaction avec des composés apportant certaines des propriétés fonctionnelles désirées.

A cet effet et selon un deuxième aspect, l'invention a trait à un procédé de préparation de matériaux monolithiques fonctionnalisables, ledit procédé comprenant une étape préalable de traitement de la surface des parois qui servent de support auxdits matériaux monolithiques, caractérisé en ce qu'il consiste en une réaction de polymérisation radicalaire thermique, photochimique ou radiochimique d'une composition comprenant une composition de base comportant: - de l'anhydride maléique comme monomère de base, associé à des comonomères éthyléniques à caractère donneur d'électrons et/ou à d'autres monomères éthyléniques à caractère donneur ou accepteur d'électrons;

- un mélange de solvants porogènes, ladite composition de base étant éventuellement additionnée d'un photoamorceur ou d'un amorceur thermique.

Les matériaux monolithiques ont été élaborés dans des corps ou objets creux de dimensions et de formes variées, comportant une cavité délimitée par des surfaces constituées de matériaux divers, ci-après désignés par l'expression «objets contenants ». Exemples de tels objets contenants sont :

- des tubes et capillaires de verre ou de silice fondue (diamètre de 50 μm à 10 mm) se prêtant à l'élaboration des monolithes par polymérisation thermique, photochimique ou radiochimique ;

- des systèmes et dispositifs de géométries diverses, constitués de verre, de silice, de silicium, de métaux, de matériaux polymères (thermoplastiques, réseaux, résines lithographiables) ou encore de la combinaison de ces divers types de

matériaux, comportant des canaux ou des chambres dont le diamètre est compris entre 100 nm et 5 cm.

Ces objets contenants sont plus particulièrement adaptés à l'élaboration des matériaux monolithiques par photopolymérisation lorsque la cavité est délimitée sur une de ses surfaces par un matériau transparent au rayonnement UV-visible.

Dans les autres cas, l'élaboration des matériaux monolithiques est réalisable par polymérisation thermique ou radiochimique.

Dans une variante de réalisation, le procédé de préparation de matériaux monolithiques comprend une réaction de polymérisation thermique d'une composition A comprenant, en plus de la composition de base, un amorceur thermique, ladite réaction étant réalisée à une température de 40 à 90 ⁰ C pendant une durée comprise entre 1 à 6h.

Dans une autre variante de réalisation, le procédé de préparation de matériaux monolithiques comprend une réaction de polymérisation photochimique d'une composition B comprenant, en plus de la composition de base, un photoamorceur.

Le choix de la nature et de la quantité de l'amorceur introduit dans la formulation, du domaine spectral utilisé et de la puissance de la source lumineuse revêt une grande importance pour l'obtention des caractéristiques morphologiques et fluidiques souhaitées. La formulation des monomères et des solvants avec un photoamorceur est dégazée pendant 5 min sous azote. Les objets contenants sont ensuite remplis avec la solution et placés sous une source de rayonnement ultraviolet d'intensité variable (0,01 à 100 mW/cm ² ) pendant un temps optimisé (selon le support et l'application). En général ce temps varie de 1 min jusqu'à 60 min environ. Le monolithe est ensuite lavé avec un solvant organique inerte pendant un temps correspondant à environ 100 volumes de colonnes. Des solvants organiques inertes appropriés au lavage des monolithes sont par exemple un alcane ou un mélange d'alcanes en Cs à C ₈ , le toluène, le tétrahydrofurane, l'acétate d'éthyle. Par ailleurs il est possible de réaliser un photoamorçage de la polymérisation sans emploi de photoamorceur ajouté à la composition de base : il

s'agit d'une caractéristique spécifique des mélanges d'anhydride maléique et de monomères à caractère électro-donneur comme les éthers de vinyle ; la formation d'un complexe à transfert de charge absorbant dans le proche UV serait à l'origine de ce comportement. Ces formulations peuvent être polymérisées sous UV selon la même procédure que celle décrite plus haut mais sans ajout de photoamorceur. Le temps de polymérisation varie entre 20 min et 2h30 environ. Le monolithe est ensuite lavé avec un solvant organique inerte pendant un temps correspondant à environ 100 volumes de colonne.

Dans une autre variante de réalisation, le procédé de préparation de matériaux monolithiques comprend une réaction de polymérisation sous rayonnement ionisant, notamment sous faisceau d'électrons (amorçage radiochimique), de la composition de base. Les objets contenants remplis de précurseurs sont irradiés sans amorceur, avec des doses comprises entre 10 et 1000 kGy à des débits de dose variés : de 0,01 à 100 kGy/s. Le monolithe est ensuite lavé avec un solvant organique inerte pendant un temps correspondant à environ 100 volumes de colonnes.

Le traitement de surface préalable des parois de l'emplacement où l'on souhaite réaliser le monolithe est un élément essentiel pour obtenir un ancrage satisfaisant des monolithes et il est réalisé par greffage de ces surfaces avec des composés nucléophiles. Par ailleurs, la présence dans les monolithes de fonctions anhydride maléique rend particulièrement efficace le greffage des surfaces avec des nucléophiles, telle les fonctions aminé du garnma-aminopropyltriméthoxysilane (gamma-APS) fixé sur la surface de substrats en verre ou en silice, ou les fonctions aminé introduites à la surface de substrats en matériaux polymères, notamment ceux utilisés dans les microsystèmes analytiques, par exemple la résine lithographiable SU-8 après traitement avec l'ammoniac ou un composé organique aminé.

Une étude des paramètres influençant la polymérisation des monolithes à base d'anhydride maléique a été réalisée, dont les résultats sont présentés ci- après.

Effet de la durée de la polymérisation et de la dose

L'effet d'une augmentation de la durée de la polymérisation sur la perméabilité des monolithes est présenté sur la Figure 1 annexée. Le graphe représente l'influence de temps de polymérisation sur la perte de charge induite par la présence de monolithe à base d'anhydride maléique polymérisé sous rayonnement UV dans un capillaire avant (points A) et après la modification des unités anhydride maléique avec de la n-hexylamine (points B). De même, on a effectué la polymérisation de mélanges précurseurs de monolithes contenant de l'anhydride maléique sous faisceau d'électrons avec des doses de 10 kGy à 500 kGy et avec des débits de dose variés : de 0,01 kGy/s à 100 kGy/s et observé la formation de monolithes avec une augmentation de la perte charge induite en fonction de la dose appliquée.

Effet du pourcentage des monomères sur la polymérisation On a effectué des polymérisations dans des colonnes de diamètres variables de 50 μm à 1 mm avec des phases contenant de 10% jusqu'à 40% de monomères. Effet de la diminution de diamètre de colonne sur la polymérisation On a effectué des polymérisations dans des colonnes de diamètres variant de 50 μm à 1 mm. Les études de morphologie ne démontrent pas un effet spectaculaire de la diminution de diamètre sur la morphologie de nos monolithes. La Figure 2 annexée présente des clichés de microscopie électronique à balayage montrant la morphologie de monolithes à base d'anhydride maléique dans des capillaires de différents diamètres (diamètre interne haut lmm, diamètre interne bas 75 μm, polymérisés sous rayonnement UV) avant modification (Figure 2a, diamètre 1 mm) et après modification (Figure 2b, diamètre 75 μm). Selon un troisième aspect, l'invention se rapporte aux compositions à base d'anhydride maléique, de comonomères et/ou autres monomères et de solvants porogènes mises en œuvre pour l'élaboration de matériaux monolithiques selon l'invention.

D'une manière générale, le procédé d'élaboration de matériaux monolithiques met en œuvre une composition de base comprenant :

- de l'anhydride maléique comme monomère de base, associé à des comonomères éthyléniques à caractère donneurs d'électrons et/ou à d'autres monomères éthyléniques à caractère donneur ou accepteur d'électrons;

- un mélange de solvants porogènes, ladite composition de base étant ou non additionnée d'un amorceur thermique ou d'un photoamorceur.

Dans certains modes de réalisation de l'invention, le procédé d'élaboration de matériaux monolithiques met en œuvre une composition A comprenant, en plus de la composition de base, un amorceur thermique. Dans ce cas, la teneur molaire en anhydride maléique, évaluée relativement au nombre de moles de fonctions polymérisables dans le mélange de monomères est comprise entre 0,1 et 0,5, préférablement comprise entre 0,2 et 0,5, alors que le ratio monomères : solvants porogènes est compris entre 10-90% et 40-60% en poids ; l'amorceur thermique est présent à un taux compris entre 0,05 et 5% en poids. Dans d'autres modes de réalisation de l'invention, le procédé d'élaboration de matériaux monolithiques met en œuvre une composition B comprenant, en plus de la composition de base, un photoamorceur. Dans ce cas, la teneur molaire en anhydride maléique, évaluée relativement au nombre de moles de fonctions polymérisables dans le mélange de monomères est comprise entre 0,1 et 0,5, préférablement comprise entre 0,2 et 0,5, alors que le rapport monomères : solvants porogènes est compris entre 10-90% et 40-60% en poids et le photoamorceur est présent à une concentration comprise entre 0,2 et 5% en poids.

De préférence, les comonomères entrant dans ces compositions sont sélectionnés dans le groupe: styrène et dérivés styréniques mono ou multifonctionnels, éthers de vinyle mono- ou multifonctionnels (cyclohexyl vinyléther, divinyl éther du l,4-bis(hydroxyméthyl)cyclohexane), dérivés N- vinyliques (N-vinyl pyrrolidone, N-vinyl carbazole), esters acryliques et méthacryliques mono- ou multifonctionnels (acrylate de butyle, méthacrylate de méthyle, diacrylate d'hexanediol, diacrylate de tripropylèneglycol), amides

acryliques et méthacryliques mono- ou multifonctionnels, N-alkyl ou N-aryl maléimides mono- et multifonctionnels.

Le mélange de solvants porogènes entrant dans les compositions de l'invention comprend au moins deux solvants sélectionnés de préférence dans le groupe : pentane, hexane, cyclohexane, éther de pétrole, toluène, dioxane, tétrahydrofurane, dichlorométhane, acétate d'éthyle, alcools.

De préférence, l'amorceur thermique est sélectionné dans le groupe : azo- bis-isobutyronitrile, chlorhydrate de 2,2-azobis(2-amidinopropane), 2,2- azobis(isobutyramide)dihydrate, peroxyde de benzoyle, dipropylperoxodicarbonate.

La solubilité limitée de l'anhydride maléique dans certains solvants et la réactivité de sa fonction anhydride dans certains solvants ou en présence d'autres monomères nécessitent de déterminer les compositions qui conviennent à la bonne mise en œuvre du procédé. Par un choix judicieux des réactifs on peut, dans des conditions variées d'amorçage (thermique, photochimique ou radiochimique (faisceau d'électrons)), obtenir des monolithes présentant la perméabilité désirée. Parmi les diverses compositions qui ont été évaluées de manière systématique, il a été possible de retenir plusieurs formulations précurseurs de monolithes présentant des caractéristiques de porosité (i.e. perte de charge à débit donné) dans la gamme de valeurs souhaitée.

L'une des formulations de base pour former un gel d'anhydride maléique avec un éther de vinyle contient de l'anhydride maléique (AM) associé au divinyl éther du triéthylèneglycol (DVE3) ou au divinyléther du bis(hydroxyméthyl)-l,4- cyclohexane (CHVE) avec un rapport en moles des insaturations maléiques et vinyliques de 1 :1 dans un mélange des solvants : acétate d'éthyle cyclohexane (50-50% en poids).

L'utilisation de deux molécules d'anhydride maléique pour une de ce type de diéther assure un nombre de fonctions anhydride plus important que dans d'autres matériaux monolithiques fonctionnalisables connus. La copolymérisation est alternée et espace les groupements fonctionnalisables.

Le comportement fluidique de ces monolithes a été étudié dans des capillaires ou des canaux de microsystèmes de diamètre interne 75 μm avec un débit de tétrahydrofurane (THF) variant de 1 μl/min à 4 μl/min. Les mesures de pression présentées sur la Figure 3 annexée montrent que l'augmentation de la perte de charge avec le débit se produit de manière linéaire dans une colonne constituée d'un monolithe à base d'anhydride maléique et de divinyléther du triéthy lèneg lycol polymérisé dans un capillaire de diamètre interne 75 μm, par exposition à un rayonnement UV pendant 2 min (Figure 3a) et pendant 3 min (Figure 3b). Ces phases sont facilement polymérisables sous rayonnement UV avec et sans emploi d'un photoamorceur.

Pour chaque ratio monomères : solvants (pourcentages en poids): 40%- 60%; 25-75% ; 20%-80%; 10%-90%, diverses formulations de solvants porogènes ont été évaluées. La perméabilité des monolithes à base d'anhydride maléique peut être ajustée par des variations de la composition des formulations, en termes de proportion de monomères dans le mélange précurseur, et de composition du mélange de solvants porogènes. La Figure 4 annexée représente l'influence de la composition en termes de teneur pondérale en monomères (anhydride maléique et diéther de vinyle équimolaires en fonctions insaturées) et d'acétate d'éthyle dans le mélange précurseur du monolithe sur la perte de charge par unité de longueur pour un débit de 1 μL/min après polymérisation sous rayonnement UV (3 min, diamètre interne du capillaire 75 μm).

D'autres formulations évaluées comprennent comme monomères de l'anhydride maléique et du diacrylate d'hexanediol, le rapport molaire entre les molécules de monomères étant de 2 :1 alors que le rapport en poids est de 1 :1,15. Ces formulations permettent d'obtenir un autre type de phase avec une forte teneur en l'anhydride maléique, une perméabilité adaptée et une morphologie homogène.

Les formulations suivantes ont été mises au point pour obtenir des phases avec des perméabilités plus importantes que dans les exemples précédents en introduisant un mono-acrylate de type acrylate de butyle ou un diacrylate associé à un éther de vinyle :

- AM:TPGDA, le rapport molaire entre les molécules de monomères étant de 2 :1 alors que le rapport en poids est de 1 : 1,53 ;

- AM:BMA:DVE3, le rapport molaire entre les molécules de monomères étant de 1 :1 :1 alors que le rapport en poids est de 1 11,45: 1,7 ; - AM:BMA:CHVE, le rapport molaire entre les molécules de monomères étant de 1 :1 :1 alors que le rapport en poids est de 1: 1,45: 1,7;

- AM:DVE3:HDDA, le rapport molaire entre les molécules de monomères étant de 4 :1 :1 alors que le rapport en poids est de 2: 1: 1,13 ;

- AM:DVE3:TPGDA, le rapport molaire entre les molécules de monomères étant de 4 :1 :1 alors que le rapport en poids est de 2: 1: 1,5 ;

- AM:CHVE:HDDA, le rapport molaire entre les molécules de monomères étant de 4 :1 :1 alors que le rapport en poids est de 2,3: 1: 1,3;

- AM: BMA: HDDA, le rapport molaire entre les molécules de monomères étant de 1 :1 :1 alors que le rapport en poids est de 1: 1,45: 2,3 ; - AM:BMA:TPGDA, le rapport molaire entre les molécules de monomères étant de 1 :1 :1 alors que le rapport en poids est de 1: 1,45: 3 ;

- AM:BMA:DVE3:HDDA, le rapport molaire entre les molécules de monomères étant de 2 :2 :1 :1 alors que le rapport en poids est de 1: 1,45: 1: 1,15 ;

- AM:BMA:DVE3:TPGDA, le rapport molaire entre les molécules de monomères étant de 2 :2 :1 :1 alors que le rapport en poids est de 1: 1,45: 1: 1,5 ;

- AM: BMA: CHVE: H DDA, le rapport molaire entre les molécules de monomères étant de 2 :2 :1 :1 alors que le rapport en poids est de 1,17: 1,7: 1: 1,3;

- AM:BMA:CHVE:TPGDA, le rapport molaire entre les molécules de monomères étant de 2 :2 :1 :1 alors que le rapport en poids est de 1,17:1,7:1:1,8. Les abréviations utilisées sont : AM pour anhydride maléique, BMA pour méthacrylate de butyle, CHVE pour divinyl éther de bishydroxymethyl-1,4- cyclohexane, DVE3 pour divinylether de triethyleneglycol, HDDA pour diacrylate de 1,6-hexanediol, TPGDA pour diacrylate de tripropylène glycol.

La combinaison judicieuse de la composition des mélanges précurseurs et des conditions de polymérisation permet l'obtention de matériaux monolithiques possédant une perméabilité bien définie. Ainsi, des colonnes à but

chromatographique élaborées dans ces conditions et parcourues par du THF à un débit de 1 μL/min conduisent à une perte de charge comprise entre 3 bars et 150 bars, pour une longueur de 20 cm et un diamètre interne de 75 μm.

Selon un quatrième aspect, l'invention concerne des matériaux monolithiques dans lesquels les fonctions anhydride maléique sont fonctionnalisées par réaction avec des composés nucléophiles.

La fonctionnalisation est réalisée par addition de nucléophiles par perfusion ou sous forme de solution aqueuse, organique, hydro-organique d'émulsion, de mini ou microémulsion. La nature chimique de ces composés peut être très variée : composés organiques simples porteurs d'au moins une fonction nucléophile (comme des aminés aliphatiques ou aromatiques, des alcools, phénols, phosphines, et composés à hydrogène activé), des composés à squelette hydrocarboné plus complexe et/ou porteurs de fonctions chimiques multiples, neutres ou ioniques, des oligomères et des polymères synthétiques, des protéines, des enzymes, des anticorps, des acides nucléiques etc.

Les propriétés qui résultent de cette fonctionnalisation sont en conséquence extrêmement variées : balance hydrophile/hydrophobe ajustable, présence : de charges électriques positives ou négatives, de groupements organiques fonctionnels, éventuellement optiquement actifs, de substrats spécifiques, de sites de reconnaissance, de sites catalytiques artificiels ou enzymatiques.

Les monolithes contenant les fonctions anhydride maléique présentent en outre l'avantage de posséder des fonctions ioniques de type carboxylate, qui sont générées soit par le couplage avec le nucléophile fonctionnel, soit par hydrolyse de la totalité ou du reliquat de fonctions anhydride maléique. Ces fonctions ionisées peuvent s'avérer très utiles pour réaliser de l'électrochromatographie capillaire, ou pour générer un flux électro-osmotique pour le transport de solvants ou de solutions dans les microsystèmes.

Les conditions de la modification chimique des différents monolithes contenant des fonctions anhydride maléique ont été étudiées : effet de la concentration, de la nature du solvant (aqueux ou non), du pH. Il est notamment

possible de réaliser avec une grande efficacité le couplage de nucléophiles en solution aqueuse, en certaines conditions de pH.

L'homme du métier peut imaginer le couplage simultané de différents nucléophiles : par exemple un composé biologique actif et du polyéthylène glycol qui porte une fonction aminé (peg-Nhb) pour ajuster le caractère hydrophile du matériau poreux fonctionnalisé. L'hydrolyse ultérieure permet de désactiver les fonctions anhydride maléique qui n'auraient pas réagi.

Fonctionnalisation avec des aminés aliphatiques possédant de 4 à 18 atomes de carbone La fonctionnalisation est effectuée en dynamique, dans des conditions douces, en perfusant au travers de la colonne une solution de concentration variable entre 0,5% jusqu'à 50% (en poids) de l'aminé dans le THF, le toluène ou l'acétonitrile (selon la nature de l'aminé) pendant une durée comprise entre 1 h et 4 h. Une fois la modification terminée, la colonne est lavée avec du THF, puis les fonctions résiduelles d'anhydride maléique sont neutralisées pendant 1 h environ par perfusion d'une solution tampon de tris(hydroxyméthyl)aminométhane (TRIS) à pH 8.

Fonctionnalisation avec des enzymes : la trypsine La modification avec la trypsine est effectuée en dynamique pendant un temps qui varie de 1 h à 4 h selon la température choisie, le plus souvent entre 4°C et 25°C. La gamme des concentrations choisie pour immobilisation de la trypsine a été définie entre 0,02 mg/ml jusqu'à 1 mg/ml de trypsine dans du tampon phosphate selon le volume de réacteur. Le réacteur est ensuite lavé avec une solution de tampon phosphate (PBS) et ensuite avec du tampon TRIS pour conditionner la colonne.

Fonctionnalisation avec un peptide : la streptavidine

Le protocole d'immobilisation est analogue à celui présenté dans l'exemple d'immobilisation de la trypsine ; la concentration de la streptavidine est de 0,01 mg/ml avec une durée d'immobilisation de 1 à 8 h à température ambiante.

Fonctionnalisation avec des polymères synthétiques : à fonction aminé primaire terminale

La modification est réalisée par perfusion du monolithe avec une solution dans le

THF d'un polymère possédant une extrémité aminé primaire (poly(N- 5 isopropylacrylamide) ou polyéthylène glycol) et d'une aminé tertiaire telle que la triethylènediamine, pendant 1 h à 4 h, selon la concentration de la solution du polymère fonctionnel à greffer, selon le degré de polymérisation de ce dernier, et selon la concentration en aminé tertiaire.

Les matériaux monolithiques à base d'anhydride maléique fonctionnalisés 10 selon l'invention ont été caractérisés par plusieurs méthodes, comme exemplifié ci-après.

Caractérisation par spectroscopie infrarouge

Des monolithes fonctionnalisés avec des aminés aliphatiques et avec des polymères ont été caractérisés par la spectroscopie infrarouge (IR) après lavage et 1.5 séchage. Les analyses ont été effectuées en mode transmission après réalisation d'une pastille de poudre de monolithe avant et après modification avec du KBr.

Dans le spectre du monolithe modifié, on observe l'apparition des bandes amides à 1654 cm ^"1 et 1556 cm ^"1 , ainsi que la disparition des bandes caractéristiques de la fonction anhydride à 1855 cm ^"1 et 1780 cm ^"1 . Un exemple est présenté sur la 20 Figure 5 annexée, qui illustre les modifications du spectre IR de poudres préparées à partir de monolithes à base d'anhydride maléique, avant et après modification avec de la n-dodécylamine.

Caractérisation par fluorescence

Des monolithes modifiés avec des récepteurs d'interactions spécifiques ont été 25 caractérisés par la fluorescence à 532 nm du marqueur porté par de la streptavidine-Cy3 excitée à 580 nm. On observe une nette fluorescence des échantillons modifiés avec de la streptavidine et aucune sur des monolithes témoins.

Caractérisation par l'analyse élémentaire d'azote

Des monolithes modifiés avec des diverses molécules (comme la trypsine) ont été caractérisés par l'analyse élémentaire de l'azote. Mesure de la perte de charge Les modifications structurales induites par la fonctionnalisation chimique s'accompagnent de modifications limitées de la perméabilité des monolithes. Le colmatage de la structure poreuse est évité. Des mesures de pression à différents débits de solvants imposés ont révélé des augmentations limitées de la perte de charge. Les résultats présentés dans la Figure 1 illustrent les changements modifiés obtenus après traitement avec la n-hexylamine. Hydrolyse de BAEE sur des réacteurs trypsiques

L'activité enzymatique des phases monolithiques fonctionnalisées avec de la trypsine a été mesurée en étudiant la cinétique d'hydrolyse de l'ester éthylique de la N-benzoyl arginine (BAEE). Des réacteurs trypsiques préparés selon différents protocoles ont été alimentés par une solution de substrat au moyen d'un pousse- seringue et reliés en aval à une cellule à circulation placée dans spectromètre UV. L'efficacité de l'hydrolyse a été suivie en continu par la mesure de l'absorbance à 253 nm.

Les propriétés fluidiques des matériaux monolithiques à base d'anhydride maléique selon l'invention ont été caractérisées selon différentes méthodes présentées ci-après.

Caractérisation fluidique à basse pression

Des monolithes possédant une perméabilité élevée, préparés à partir de certaines formulations à base d'anhydride maléique par polymérisation thermique, photochimique ou radiochimique, ont fait l'objet de mesures de débit sous faible pression de (THF, toluène à pression constante inférieure à 0,05 bar). La Figure 6 annexée présente les propriétés d'écoulement du toluène à travers une phase composée des monomères AM/BMA/CHVE, polymérisée sous rayonnement UV pendant 1 h dans une colonne de 1 mm et non modifiée (faible perte de charge, de 3 bars sur une colonne de 20 cm longueur et de 75 μm diamètre interne).

Caractérisation fluidique à haute pression

Des monolithes à base d'anhydride maléique de plus faible perméabilité, préparés à partir de certaines formulations à base d'anhydride maléique par polymérisation thermique, photochimique ou radiochimique dans des capillaires de diamètre interne compris entre 75 μm et 1 mm, ont fait l'objet de mesures de perte de charge. L'écoulement d'un solvant est imposé par une pompe HPLC (Waters) à un débit variant de lμl/min jusqu'à quelques dizaines de μl/min ou par un pousse- seringue haute pression (Harvard Instrumentation). Des pressions pouvant atteindre 150 bars ont ainsi été mesurées pour du THF s'écoulant avec un débit de lμL/min dans un capillaire de longueur 20 cm et de diamètre interne 75 μm. Caractérisation fluidique des microsystèmes

La caractérisation fluidique des microsystèmes comportant des monolithes à base d'anhydride maléique élaborés à l'intérieurs de canaux de résine photolithographiée SU-8, recouverts d'un capot en pyrex a été effectuée à des débits de THF compris entre 1 μl/min et 10 μl/min. Les courbes notées C et D reportées sur le graphe de la Figure 1 annexée présentent l'effet du temps de polymérisation sur les propriétés fluidiques d'un microsystème possédant un canal de largeur lOOμm et de hauteur 150μm, contenant un monolithe à base d'anhydride maléique sur une longueur de 4 cm, avant (points C) et après fonctionnalisation (points D) avec la n-hexylamine. Caractérisation morphologique des monolithes

Les matériaux monolithiques à base d'anhydride maléique préparés selon l'invention ont été caractérisés par microscopie électronique à balayage. La Figure 7 annexée présente quatre phases monolithiques à forte teneur en anhydride maléique: Figure 7a : Mélange de monomères AM/CHVE/BMA, dont 28% des fonctions polymérisables proviennent de l'anhydride maléique, le porogène contenant de l'acétate d'éthyle ; Figure 7b : Mélange de monomères AM/CHVE/BMA, dont 28% des fonctions polymérisables proviennent de l'anhydride maléique, le porogène contenant du toluène ; Figure 7c : Mélange de monomères AM/CHVE, dont 50% des fonctions polymérisables proviennent de l'anhydride maléique, le porogène contenant de l'acétate d'éthyle ; Figure 7d : Mélange de

monomères AM/DVE3, dont 50% des fonctions polymérisables proviennent de l'anhydride maléique, le porogène contenant de l'acétate d'éthyle. L'analyse de la macroporosité et de la taille de grains a été effectuée avec un logiciel d'analyse d'image SCION Image. Selon un cinquième aspect, l'invention se rapporte aux diverses utilisations des matériaux monolithiques fonctionnalisés pour microsystèmes analytiques. De préférence, les matériaux monolithiques fonctionnalisés selon l'invention sont utilisés :

- comme phase pour la séparation des molécules par une méthode chromatographique sélectionnée dans le groupe : d'affinité, par interaction hydrophobe, ionique, électrochromatographie, électrophorèse capillaire ;

- comme réacteur support de réactif ou de catalyseur de réaction chimique ou enzymatique ;

- comme support pour l'absorption, l'analyse et la détection de composés chimiques.

L'invention sera mieux comprise à la lecture des exemples de réalisation suivants non limitatifs de l'invention.

Exemple 1. Réacteur de séparation obtenu par fonctionnalisation avec la n- hexylamine Des analyses de type nanochromatographie liquide (nano-LC) ont été réalisées pour évaluer les performances chromatographiques des colonnes obtenues de monolithes à base d'anhydride maléique élaborés dans des capillaires et fonctionnalisés par réaction avec des alkylamines. Les essais de séparation des peptides contenus dans des digestats de cytochrome C et de β-galactosidase ont été réalisés en injectant de 0,1 μl à 1 μl de solution de digestat de concentration comprise entre 80 fmol/μl et 800 fmol/μl sur des colonnes de diamètre interne 75 μm et de longueur comprise entre 5 et 20 cm, avec élution par gradient linéaire eau-acétonitrile.

Un capillaire en verre de longueur 20 cm, revêtu de polyimide et de 75 μm diamètre interne, dont la surface interne a été modifiée avec un silane comme le gamma-aminopropyltriméthoxysilane (gamma-APS), a été remplie avec une

solution contenant 20% (en poids) de monomères et le porogène composé de toluène et cyclohexane. Cette colonne a été ensuite polymérisée sous faisceau d'électrons avec une dose de 100 kGy et à un débit de 0,68 kGy/s par des passages de 25 kGy. Après la polymérisation la colonne a été lavée au THF pendant Ih à lμl/min, ensuite modifiée par une aminé C6 dans THF (10% en poids) pendant 2 h, lavée par perfusion de THF pendant 1 h et de tampon TRIS pendant 1 h. Avant la séparation, la colonne a été stabilisée par perfusion d'un mélange eau : acétonitrile (50-50% en poids). La pression en cours d'analyse n'a pas excédé 49 bars pour une longueur de colonne de 20 cm. La faisabilité de la séparation des principaux peptides a été démontrée sur des colonnes de 5 cm longueur contenant un monolithe fonctionnalisé par la n- hexylamine. La trace obtenue par spectrométrie de masse couplée à la nanochromatographie liquide lors de la séparation de digestat de cytochrome C (80 fmol/μl) sur une colonne de longueur de 8 cm et un diamètre interne de 75 μm est présentée dans la Figure 8 annexée. Les peptides les plus hydrophobes de cytochrome C ont été séparés et présentent un temps de rétention de plus de 15 min.

Exemple 2. Réacteur de digestion trvpsique La digestion trypsique a été réalisée sur une colonne de 8 cm de long et 75 μm de diamètre interne. Le monolithe a été polymérisé sous rayonnement UV pendant 10 min, ensuite lavé pendant 1 h et modifié avec de la trypsine dans le tampon phosphate PBS à 0,01 mg/ml pendant Ih à 4°C. La colonne a été ensuite lavée au tampon PBS puis au tampon TRIS. La digestion de 20 pmol de Cytochrome C a été effectuée en continu avec un débit de 3,5 μl/min sur un capillaire de longueur 8 cm de diamètre de 75 μm contenant un monolithe à base d'anhydride maléique fonctionnalisé par de la trypsine. Le spectre de masse MALDI TOF obtenu à partir de 50 μl de solution de digestat est présenté sur la Figure 9 annexée. L'exploitation des données permet l'identification de la protéine avec un recouvrement de 65 % de la séquence.

Exemple 3. Réacteur de digestion

L'hydrolyse de l'ester éthylique de la N-benzoyl arginine (BAEE) a été réalisée sur une colonne de 10 cm de long et 1 mm de diamètre interne. Le monolithe a été polymérisé UV pendant 1 h, ensuite lavé avec du THF et modifié avec de la trypsine dans le tampon PBS à 0,01 mg/ml, par perfusion pendant 4 h à 4°C. La colonne est ensuite a été lavée au tampon PBS puis au tampon TRIS. L'hydrolyse de BAEE (0,25 mM) a été effectuée par perfusion en dynamique avec détection par spectrométrie UV à 253 nm. L'hydrolyse du BAEE approche 91% de rendement, lorsque le temps de résidence dans la colonne est correctement choisi, comme le montre le graphe présenté sur la Figure 10 annexée (capillaire de longueur 10 cm de diamètre de lmm contenant un monolithe à base d'anhydride maléique fonctionnalisé par de la trypsine). Exemple 4. Réacteur d'affinité La streptavidine a été immobilisée sur des phases monolithes à base d'anhydride maléique préparés par polymérisation sous rayonnement UV. Une interaction spécifique a été réalisée avec un fluorophore portant de la biotine. L'efficacité du couplage a été démontrée par imagerie de la fluorescence du marqueur biotinylé- Cy5. Exemple 5. Valve thermique Des phases poreuses ont été préparées dans des microsystèmes fluidiques comportant des canaux passant au travers de chambres de même section et de longueur 100 μm remplies de monolithe fonctionnalisé par du poly(NIPAM) à fonction aminé terminale. La température des chambres peut être modifiée au moyen de résistances chauffantes insérées dans la structure du microsystème. L'efficacité de la fonctionnalisation et de la réponse stimulée par une élévation contrôlée de la température a été démontrée par des essais d'écoulement de l'eau dans le canal à température variable, en imposant une pression de 1 bar le débit mesuré est 6 μl/min à 20 ⁰ C et passe à une valeur comprise entre 20 et 40 μl/min à 40 ⁰ C selon les conditions de la modification effectuée.